Determinación y Cuantificación de Proteínas en Leche en Polvo
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66 Boletín Médico del Hospital Infantil de México Determinación y cuantificación de subpoblaciones de linfocitos T y células natural killer en sangre periférica de individuos sanos por citometría de flujo Israel Parra-Ortega 1 , Karen S. Salceda-Rangel 1 , Noemi Nájera-Martínez 1 , Briceida López-Martínez 1 , Vianney Ortiz-Navarrete 2 e Irlanda Olvera-Gómez 3,4 * 1 Laboratorio Clínico, Hospital Infantil de México Federico Gómez; 2 Biomedicina Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV); 3 Universidad Anáhuac México Norte; 4 Hospitales Federales de Referencia, Secretaría de Salud (SSA); Hospital Nacional Homeopático, Unidad 160. Ciudad de México, México ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Resumen Introducción: La determinación de las diferentes subpoblaciones de los linfocitos T en las diversas patologías y el monitoreo postratamiento ayuda a que el médico tome decisiones terapéuticas teniendo como referencia la cinética de los linfocitos T localizados en sangre periférica. Métodos: Se realizó la estandarización de un perfil de moléculas de superficie para la caracterización de subpoblaciones de linfocitos T: naϊve, activados y de memoria, así como las células natural killer o ase- sinas naturales (CD3− CD56+) en sangre periférica de individuos clínicamente sanos. Resultados: Se identificaron las subpoblaciones de linfocitos: naïve (CD3+, CD4+ o CD8+, CD45RA+, CD62L+, CCR7+), activados (CD3+, CD4+ o CD8+, CD45RA+ o CD45RO+, CD69+ y/o CRTAM+), efectores (CD3+, CD4+ o CD8+, CD45RA+, CD62L−, CCR7−), de memoria central (CD3+, CD4+ o CD8+, CD45RO+, CD62L+, CCR7+) y de memoria efectora (CD3+, CD4+ o CD8+, CD45RO+, CD62L−, CCR7−) en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+. Se integraron los datos obtenidos con estadística descriptiva (valores mínimos, valores máximos, media, mediana). Conclusiones: Este panel será de gran utilidad para monitorear pacien- tes en quienes se requiera valorar el estado inmunológico desde el punto de vista celular. Particularmente, puede apoyar en el seguimiento de los pacientes en los que se requiera evaluar la reconstitución inmunológica (componente celular de estirpe T). Palabras clave: Linfocito T. Subpoblación de linfocitos. Citometría de flujo. Detection and quantification of T-cell subpopulations and NK cells in peripheral blood from healthy individuals Abstract Background: The knowledge of the participation of different subpopulations of T lymphocytes in various pathologies helps to make therapeutic decisions, having as reference the presence of the different subpopulations of the T lymphocytes asso- ciated with the disease. Methods: A profile standardization of surface molecules for the characterization of subpopulations of T cells was conducted: naϊve, activated and memory, as well as natural killer (CD3− CD56+) cells in peripheral blood of Correspondencia: Irlanda Olvera-Gómez E-mail: [email protected] Disponible en internet: 18-03-2019 Bol Med Hosp Infant Mex. 2019;76:66-78 www.bmhim.com Fecha de recepción: 17-07-2018 Fecha de aceptación: 28-11-2018 DOI: 10.24875/BMHIM.18000083 1665-1146/© 2019. Hospital Infantil de México Federico Gómez, impreso por Permanyer México SA de CV, todos los derechos reservados.
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Boletiacuten Meacutedico del Hospital Infantil de Meacutexico
Determinacioacuten y cuantificacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T y ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica de individuos sanos por citometriacutea de flujoIsrael Parra-Ortega1 Karen S Salceda-Rangel1 Noemi Naacutejera-Martiacutenez1 Briceida Loacutepez-Martiacutenez1 Vianney Ortiz-Navarrete2 e Irlanda Olvera-Goacutemez341Laboratorio Cliacutenico Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez 2Biomedicina Molecular Centro de Investigacioacuten y de Estudios Avanzados del Instituto Politeacutecnico Nacional (CINVESTAV) 3Universidad Anaacutehuac Meacutexico Norte 4Hospitales Federales de Referencia Secretariacutea de Salud (SSA) Hospital Nacional Homeopaacutetico Unidad 160 Ciudad de Meacutexico Meacutexico
ARTIacuteCULO DE INVESTIGACIOacuteN
Resumen
Introduccioacuten La determinacioacuten de las diferentes subpoblaciones de los linfocitos T en las diversas patologiacuteas y el monitoreo postratamiento ayuda a que el meacutedico tome decisiones terapeacuteuticas teniendo como referencia la cineacutetica de los linfocitos T localizados en sangre perifeacuterica Meacutetodos Se realizoacute la estandarizacioacuten de un perfil de moleacuteculas de superficie para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naϊve activados y de memoria asiacute como las ceacutelulas natural killer o ase-sinas naturales (CD3minus CD56+) en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos Resultados Se identificaron las subpoblaciones de linfocitos naiumlve (CD3+ CD4+ o CD8+ CD45RA+ CD62L+ CCR7+) activados (CD3+ CD4+ o CD8+ CD45RA+ o CD45RO+ CD69+ yo CRTAM+) efectores (CD3+ CD4+ o CD8+ CD45RA+ CD62Lminus CCR7minus) de memoria central (CD3+ CD4+ o CD8+ CD45RO+ CD62L+ CCR7+) y de memoria efectora (CD3+ CD4+ o CD8+ CD45RO+ CD62Lminus CCR7minus) en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ Se integraron los datos obtenidos con estadiacutestica descriptiva (valores miacutenimos valores maacuteximos media mediana) Conclusiones Este panel seraacute de gran utilidad para monitorear pacien-tes en quienes se requiera valorar el estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular Particularmente puede apoyar en el seguimiento de los pacientes en los que se requiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica (componente celular de estirpe T)
Palabras clave Linfocito T Subpoblacioacuten de linfocitos Citometriacutea de flujo
Detection and quantification of T-cell subpopulations and NK cells in peripheral blood from healthy individuals
Abstract
Background The knowledge of the participation of different subpopulations of T lymphocytes in various pathologies helps to make therapeutic decisions having as reference the presence of the different subpopulations of the T lymphocytes asso-ciated with the disease Methods A profile standardization of surface molecules for the characterization of subpopulations of T cells was conducted naϊve activated and memory as well as natural killer (CD3minus CD56+) cells in peripheral blood of
Correspondencia Irlanda Olvera-Goacutemez
E-mail irlandaolverasaludgobmx
Disponible en internet 18-03-2019
Bol Med Hosp Infant Mex 20197666-78
wwwbmhimcom
Fecha de recepcioacuten 17-07-2018
Fecha de aceptacioacuten 28-11-2018
DOI 1024875BMHIM18000083
1665-1146copy 2019 Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez impreso por Permanyer Meacutexico SA de CV todos los derechos reservados
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I Parra-Ortega et al Subpoblaciones de linfocitos T
Introduccioacuten
Los linfocitos T son ceacutelulas del sistema inmune adapta-tivo que maduran en el timo a partir de progenitores linfoi-des comunes provenientes de la meacutedula oacutesea Las sub-poblaciones de linfocitos T CD4 y CD8 egresan del timo y viajan a traveacutes del sistema linfaacutetico para poblar los oacuterganos linfoides secundarios bazo ganglios linfaacuteticos12
Desde hace varias deacutecadas ha incrementado el nuacuteme-ro de moleacuteculas que permiten identificar distintas subpo-blaciones de linfocitos T desde el fenotipo naiumlve hasta los compartimentos de memoria central y efectora incluyen-do el estado de activacioacuten y efector de los linfocitos que son detectables en sangre perifeacuterica3 A continuacioacuten se describen las poblaciones identificadas en la periferia
Linfocitos T naiumlve o viacutergenes
Los linfocitos maduros que egresan del timo se alojan principalmente en los oacuterganos linfoides secundarios La expresioacuten de la isoforma CD45RA (isoforma de mayor peso molecular puesto que conserva la expresioacuten de los 3 exones de CD45) es uno de los principales y maacutes an-tiguos marcadores para su seleccioacuten Ademaacutes la expre-sioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten como CD62L (que se une a E-selectina) y receptores de quimiocinas como CCR7 (se han identificado dos ligandos para este recep-tor CCL19 y CCL12) conforman el fenotipo naiumlve Se localizan en los oacuterganos linfoides secundarios donde las ceacutelulas presentadoras de antiacutegeno (ceacutelulas dendriacuteticas) profesionales presentan a los peacuteptidos en el contexto de moleacuteculas del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) clase I si son antiacutegenos intracelulares principal-mente Activan a los linfocitos T CD8 o CPH clase II (si son antiacutegenos extracelulares generalmente) que a su vez activaraacuten a los linfocitos T CD43-6
Linfocitos T activados
El reconocimiento de los peacuteptidos presentados con-duce a cambios intracelulares como liberacioacuten de las
reservas de calcio translocacioacuten de factores de trans-cripcioacuten al nuacutecleo entre otros ademaacutes de la modifica-cioacuten de la expresioacuten de moleacuteculas en la superficie Este estado llamado activacioacuten se asocia con una disminucioacuten en la expresioacuten de la isoforma CD45RA la aparicioacuten de la moleacutecula CD45RO (isoforma de me-nor peso molecular que se une a CD22 que es una proteiacutena que se encuentra en la membrana de los lin-focitos B) la disminucioacuten de CD62L y la aparicioacuten de la moleacutecula asociada a ceacutelulas T restringida al CPH de clase I conocida como CRTAM (por sus siglas en in-gleacutes class-I MHC-restricted T cell associated molecu-le) y CD69 Estas dos moleacuteculas tienen un patroacuten de expresioacuten similar aproximadamente de 16 a 18 horas postactivacioacuten se alcanza el maacuteximo nivel de expresioacuten y es de caraacutecter transitorio (es decir las ceacutelulas dejan de expresar las moleacuteculas despueacutes de cierto tiempo) por lo que se refieren como marcadores de activacioacuten temprana La expresioacuten de esta moleacutecula en humanos y ratones se presenta exclusivamente en linfocitos T activados7-9 En el caso del receptor de quimiocina CCR7 (asociado con la retencioacuten de los linfocitos T en oacuterganos linfoides) se ha reportado de baja a nula ex-presioacuten en los linfocitos T activados principalmente10 Sin embargo se ha encontrado que los linfocitos T CD8+ despueacutes de una activacioacuten en modelo antiacutegeno especiacutefico (es decir una activacioacuten monoclonal) ex-presaban CCR711 Una de las caracteriacutesticas de la activacioacuten in vivo es que es un evento donde influye tanto el microambiente (las citocinas en el medio ex-tracelular) como la intensidad de activacioacuten recibida (afinidad y avidez) Tal seriacutea el caso de CCR7 ya que se pueden encontrar ceacutelulas antiacutegeno especiacutefico pos-tactivacioacuten que expresan dicha moleacutecula
Los linfocitos activados migran de los oacuterganos linfoi-des secundarios al resto del organismo principalmente al sitio donde se detecte la sentildeal de dantildeo o peligro (generalmente una zona con presencia de inflamacioacuten) ademaacutes de estar presentes en sangre perifeacuterica12 Los linfocitos T activados se pueden encontrar tanto en la
clinically healthy individuals Results Naiumlve (CD3+ CD4+ or CD8+ CD45RA+ CD62L+ CCR7+) activated (CD3+ CD4+ or CD8+ CD45RA+ or CD45RO+ CD69+ andor CRTAM+) effectors (CD3+ CD4+ o CD8+ CD45RA+ CD62Lminus CCR7minus) cen-tral memory (CD3+ CD4+ o CD8+ CD45RO+ CD62L+ CCR7+) memory effectors (CD3+ CD4+ or CD8+ CD62RO+ CD62Lminus CCR7minus) subpopulations were analyzed by flow cytometry Descriptive statistics parameters were calculated (minimum values maximum values mean values median) Conclusions This panel can be very useful for monitoring patients in whom the immunological status from a cellular perspective is needed Particularly it can support the follow-up of patients who require an immunological reconstitution (T-cell component) evaluation
Key words T lymphocyte Lymphocyte subpopulation Flow cytometry
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poblacioacuten CD45RA+ que seriacutean los recientemente ac-tivados como en la poblacioacuten CD45RO+ que seriacutea la de memoria por una reactivacioacuten
Linfocitos T efectores
Posterior a la activacioacuten los linfocitos T adquieren funciones efectoras En el caso de los linfocitos T CD4+ se detecta la produccioacuten de citocinas que pueden pola-rizar el resto de la respuesta inmunoloacutegica Se pueden determinar poblaciones que producen principalmente interferoacuten gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Th1 proinflamatorias) IL-17 (Th17) IL-9 (Th9) e IL-4 e IL-10 (Th2 anti-inflamatorias)
Los linfocitos T CD8+ producen citocinas como TNF-α e IFN-γ y poseen capacidad citotoacutexica que les permite eliminar ceacutelulas infectadas o tumorales a tra-veacutes de moleacuteculas como granzima B y perforina(11) El fenotipo de los linfocitos T efectores es CD45RA+ CD62Lminus CCR7minus La ausencia de expresioacuten de moleacutecu-las asociadas a la retencioacuten de las ceacutelulas en los oacuter-ganos linfoides CCR7 y CD62L favorece que las ceacute-lulas migren al sitio de inflamacioacuten para realizar sus funciones efectoras
Linfocitos T de memoria
Si la activacioacuten de los linfocitos T naiumlve es apropiada entonces se induciraacute la generacioacuten de una poblacioacuten de memoria Estas ceacutelulas se localizan principalmente en los oacuterganos linfoides secundarios y en sangre perifeacuterica
En el humano se utiliza la moleacutecula CD45RO como un marcador para seleccionar la poblacioacuten de ceacutelulas que son progenie de un linfocito T naiumlve activado a traveacutes de su receptor receptor de ceacutelulas T1314
La presencia o ausencia de las moleacuteculas CCR7 y CD62L en la superficie proporcionan en conjunto dos fenotipos1) TCM (del ingleacutes central memory T cells ceacutelulas T de
memoria central) CD45RO+ CD62L+ CCR7+2) TEM (del ingleacutes effector memory T cells ceacutelulas T
de memoria efectora) CD45RO+CD62LminusCCR7minus15
Las TCM son ceacutelulas que se encuentran principal-mente en los oacuterganos linfoides secundarios y son las que mantienen el compartimento de linfocitos T de memoria efectora16 En cambio las TEM son aquellas que ante un encuentro subsecuente con el patoacutegeno responden de manera inmediata con una mayor capacidad efectora (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) en comparacioacuten con
las ceacutelulas efectoras provenientes de la primera dife-renciacioacuten de las ceacutelulas naiumlve activadas Estas ceacutelulas se encuentran principalmente circulando en el organis-mo14-17 debido a la ausencia de las moleacuteculas CCR7 y CD62L
Ceacutelulas natural killer
Las ceacutelulas natural killer (NK) tambieacuten llamadas ase-sinas naturales son linfocitos generados a partir de un precursor linfoide comuacuten cuya funcioacuten efectora estaacute me-diada por la produccioacuten de citocinas especialmente altas cantidades de IFN-γ y actividad citotoacutexica para eliminar ceacutelulas infectadas o tumorales Se localizan en sangre perifeacuterica en los ganglios linfaacuteticos piel intestino hiacutega-do pulmones uacutetero y otros tejidos Morfoloacutegicamente son similares a los linfocitos T pero sus marcadores en superficie son CD16+ CD56+ en ausencia de CD3
Para identificar las diferentes poblaciones y subpo-blaciones de linfocitos se han desarrollado teacutecnicas como la centrifugacioacuten en gradientes18 Sin embargo no es posible diferenciar las ceacutelulas naiumlve o activadas simplemente por su densidad o morfologiacutea por lo que se han utilizado meacutetodos a traveacutes de los cuales se detectan proteiacutenas de membrana que se utilizan como marcadores19
El desarrollo de la tecnologiacutea de hibridomas permitioacute la produccioacuten de anticuerpos monoclonales capaces de reconocer epiacutetopos uacutenicos de las moleacuteculas de su-perficie celular y con ello un gran avance en la iden-tificacioacuten de fenotipos celulares ya sea por teacutecnicas manuales o automatizadas ademaacutes de tinciones muacutel-tiples20 La citometriacutea de flujo tiene gran importancia en los campos de la hematologiacutea e inmunologiacutea para el anaacutelisis completo y la caracterizacioacuten detallada de las ceacutelulas sanguiacuteneas21 Entre las aplicaciones cliacuteni-cas maacutes frecuentes de estos meacutetodos se encuentran la caracterizacioacuten de leucocitos en estados de inmu-nodeficiencia primaria o secundaria como en el caso de infeccioacuten por el virus de inmunodeficiencia adquiri-da2223 y en enfermedades oncohematoloacutegicas24 A esto se debe agregar el desarrollo de un gran nuacuteme-ro de fluorocromos utilizados para unirse covalente-mente a los anticuerpos monoclonales que se emplean en estas teacutecnicas y asiacute marcar muacuteltiples moleacuteculas para su determinacioacuten precisa en una suspensioacuten ce-lular heterogeacutenea2526
Por lo anterior es relevante implementar la determi-nacioacuten y cuantificacioacuten de las diferentes subpoblacio-nes de los linfocitos T asiacute como conocer su asociacioacuten con el estado cliacutenico del paciente De esta forma el
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meacutedico podraacute integrar los resultados signos y siacutento-mas para la toma de decisiones terapeacuteuticas conside-rando la presencia de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T asociados con el padecimiento
En el presente trabajo se estandarizoacute un perfil de moleacuteculas de superficie para la caracterizacioacuten de sub-poblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria central y efectora ademaacutes de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos a traveacutes de citometriacutea de flujo
Meacutetodos
Muestras
Se utilizaron muestras de sangre perifeacuterica recolec-tadas en tubos con anticoagulante aacutecido etilendiami-notetraaceacutetico (EDTA) obtenidas por puncioacuten venosa de 20 individuos cliacutenicamente sanos (ICS) de naciona-lidad mexicana quienes no cursaban con un proceso inflamatorio (por ejemplo infecciones neoplasias o que estuvieran bajo tratamiento farmacoloacutegico) A los participantes se les realizoacute un estudio meacutedico para determinar su estado de salud considerando los valo-res de una citometriacutea hemaacutetica y quiacutemica sanguiacutenea que proporcionan los paraacutemetros baacutesicos para la eva-luacioacuten de la funcioacuten hepaacutetica renal y del metabolismo de los carbohidratos y liacutepidos
Para el fenotipo de activacioacuten se utilizoacute la muestra de una paciente (8 antildeos) con diagnoacutestico de infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr con una carga viral de 26000 copiasml en plasma determinada por reac-cioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real
Se realizoacute el conteo celular mediante una citometriacutea hemaacutetica de cada muestra en el equipo LH 780 Beck-man Coulterreg
Inmunofenotipo
Para la tincioacuten de las muestras se utilizaron tres tubos de ensayo de 12 x 75 mm uno para cada panel Se colocaron 5 microl de cada anticuerpo del panel (los anti-cuerpos provienen de BD Biosciencesreg excepto el an-ticuerpo anti-CRTAM de Biolegendreg) y se adicionoacute sangre perifeacuterica completa Para las muestras con una cuenta de leucocitos totales entre 2000 y 13000 ceacutelmicrol se colocaron 50 microl de sangre perifeacuterica completa con EDTA para obtener una cantidad de ceacutelulas apropiada para el nuacutemero de eventos que seraacuten adquiridos
La mezcla se incuboacute por 15 min a temperatura am-biente en oscuridad Posteriormente se agregaron 2 ml
de solucioacuten FACS Lysing (BD Biosciencesreg) y se incu-boacute por 10 min a temperatura ambiente en oscuridad Al finalizar el tiempo se centrifugaron los tubos 5 min a 1800 rpm se decantaron y se lavoacute dos veces el botoacuten celular con 2 ml de FACS Flow Al finalizar se agrega-ron 350 microl de FACS Flow friacuteo (BD Biosciencesreg) para obtener una suspensioacuten celular homogeacutenea
La lectura de las muestras se realizoacute en el citoacutemetro de flujo BD FACS Canto II siguiendo el procedimiento que marca el manual de usuario y cumpliendo los es-taacutendares de calidad establecidos en el laboratorio cliacuteni-co del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez para los ensayos analiacuteticos con fines de diagnoacutestico Breve-mente previo a la adquisicioacuten de las muestras se cali-broacute el equipo y se compensoacute con tinciones independien-tes con cada uno de los fluocromos para su correcta lectura asiacute como ceacutelulas sin tentildeir para ajustar la auto-fluorescencia Se contabilizaron 50000 eventos para la caracterizacioacuten de las diversas poblaciones celulares
Paneles para la fenotipificacioacuten de los linfocitos T
Se seleccionaron los fluorocromos considerando que no se generara ninguacuten traslape en su lectura aprove-chando los tres rayos laacuteser que posee el equipo De la misma manera se seleccionaron los anticuerpos monoclonales
Para el anticuerpo monoclonal CRTAM se seleccio-noacute el fluorocromo ficoeritrina Al ser una moleacutecula de bajos niveles de expresioacuten se prefirioacute utilizar un fluo-rocromo de mayor intensidad para su deteccioacuten
Se realizaron tres paneles celulares diferentes para determinar linfocitos T naiumlve activados efectores de memoria central y memoria efectora (Tabla 1)
Tabla 1 Panel de anticuerpos utilizados en la caracterizacioacuten de las subpoblaciones de linfocitos T
Fluorocromo Panel 1Linfocitos T naiumlve
y de memoria
Panel 2Linfocitos T activados
Panel 3Linfocitos
NK
FITC CD45RA CD45RA
PE CRTAM CRTAM CD16
Percp- Cy 55 CD45RO CD45RO
APC CD62L CD69 CD56
APC H7 CD4 CD4
V450 CD3 CD3 CD3
PE Cy7 CCR7 CD8
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Anaacutelisis de datos
Los resultados fueron analizados en el programa BD FACsDIVAreg Se realizaron los graacuteficos para la identifi-cacioacuten de cada poblacioacuten y una copia electroacutenica de respaldo asiacute como la plantilla del panel
Se construyoacute una base de datos con la cual median-te conversiones de los porcentajes en relacioacuten con los leucocitos totales y linfocitos obtenidos del valor pro-porcionado por el equipo LH 780 Beckman Coulterreg se calcularon los valores absolutos (ceacutelml)
En el caso de las ceacutelulas NK se obtuvo el porcentaje de ceacutelulas CD3minus CD16+ CD56+ en la poblacioacuten de
leucocitos totales y se calculoacute el nuacutemero absoluto de la misma manera Para el anaacutelisis estadiacutestico de las diferentes poblaciones celulares se utilizoacute el programa GraphPad Prismreg 601 para Mac OS X
Resultados
Se analizaron 20 muestras de sangre perifeacuterica pro-venientes de individuos en un rango de edad de 8 a 18 antildeos (con una media de 10 antildeos y 6 meses y una mediana de 10 antildeos) mestizos mexicanos el 75 (15) de sexo masculino
Figura 1 Fenotipificacioacuten de linfocitos T de sangre perifeacuterica A partir de una aliacutecuota de muestra de sangre perifeacuterica se delimitoacute la poblacioacuten de singletes (A) Se determinaron basaacutendose en su tamantildeo (FSC dispersioacuten frontal por sus siglas en ingleacutes forward scatter) y complejidad (SSC dispersioacuten lateral por sus siglas en ingleacutes side scatter) las distintas poblaciones de sangre perifeacuterica linfocitos monocitos y granulocitos (B) Se determinoacute la poblacioacuten CD3+ (C) A partir de esta poblacioacuten se determinaron los linfocitos T CD4+ y CD8+ (D) Se analizoacute la expresioacuten de las moleacuteculas CD45RA (E) y CD45RO (G) como marcadores de naiumlve y memoria respectivamente en la poblacioacuten de linfocitos CD4+ (F) De la poblacioacuten CD45RA (E) aquellas ceacutelulas que expresaran CD62L y CCR7 fueron identificadas como naiumlve y aquellas CD62L- CCR7- como efectoras (F) Mientras que el anaacutelisis de la expresioacuten de ambas moleacuteculas en las ceacutelulas CD45RO+ (G) permitioacute la identificacioacuten de las ceacutelulas de memoria central (TCM) y memoria efectora (TEM) (H) El mismo anaacutelisis se realizoacute para los linfocitos CD8+ (I-L) Las imaacutegenes mostradas provienen de un individuo y son representativas del resto de participantes incluidos en el estudio
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Tabla 4 Valores (ceacutelulasml) de las subpoblaciones de linfocitos T CD8+ en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutesticofenotipo celular
Linfocitos CD8+ Cel
mL
Linfocitos CD8+ CD45RA+
CelmL
Linfocitos CD8+ naiumlve
CelmL
Linfocitos CD8+ efectores
CelmL
Linfocitos CD8+ CD45RO+
CelmL
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CelmL
Linfocitos CD8+ TEM
CelmL
Valor miacutenimo 36186 23232 13219 2741 12738 446 979
Percentil 25 78397 41514 17440 1882 19731 719 11024
Mediana 109396 68644 35240 6974 35035 1931 25275
Percentil 75 196850 154529 63307 11171 53473 4201 38052
Valor maacuteximo 542299 380694 148283 33882 157267 14592 125656
Media 155947 110535 51990 9625 43701 3218 30863
Desviacioacuten estaacutendar 126536 102996 45445 9910 33907 3607 29568
Error estaacutendar 28294 23031 10712 2216 7582 8064 6612
IC 95 valor bajo 96725 62331 29390 4987 27832 1530 17024
IC 95 valor alto 215168 158739 74589 14262 59570 4906 44701
IC intervalo de confianza TCM ceacutelulas T de memoria central TEM ceacutelulas T de memoria efectora
El fenotipo de linfocitos T activados se definioacute como aquellas ceacutelulas que expresaran CD69 un marcador de activacioacuten temprana y CRTAM una moleacutecula reciente-mente descrita y asociada con el estado de activacioacuten La determinacioacuten de este fenotipo se realizoacute tanto en las poblaciones CD45RA+ como CD45RO+ con la fina-lidad de calcular las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) activadas recientemente y las activadasmemoria (CD45RO+) pos-terior a su reactivacioacuten El anaacutelisis de las ceacutelulas con fenotipo de activacioacuten mostroacute que en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ existe una poblacioacuten discreta de ceacutelulas CD45RA+ y CD45RO+ que expresan CD69 y escasas ceacutelulas CRTAM+ (Fig 2) Cabe destacar que no se detectaron ceacutelulas que mostraran coexpresioacuten de CD69 y CRTAM (Fig 2 y Tabla 6)
Considerando que las muestras proveniacutean de indivi-duos cliacutenicamente sanos se analizoacute ademaacutes una muestra de un paciente que cursaba con una infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr (VEB) Se observoacute que en la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ en el com-partimento CD45RA+ existiacutea un aumento de 285 ve-ces de ceacutelulas CD69+ (Figs 2A y 2E) mientras que en la poblacioacuten CD45RO+ este aumento fue de 21 veces (Figs 2B y 2F) comparado con lo observado en los ICS Por otro lado en las ceacutelulas CRTAM+ se observoacute un incremento muy importante de aproximadamente 89 veces en las ceacutelulas CD45RA+ (Figs 2A y 2E) y de 76 veces en la poblacioacuten CD45RO+ (Figs 2B y 2F) con respecto a lo observado en los ICS mostrando una diferencia importante en presencia de un estiacutemulo
A partir de la delimitacioacuten de los eventos sencillos (Fig 1A) se consideraron las caracteriacutesticas de tamantildeo y complejidad para seleccionar las ceacutelulas vivas (Fig 1B) Posteriormente se definioacute la poblacioacuten de linfocitos T basaacutendose en la expresioacuten de la moleacutecula CD3 (Fig 1C) a partir de esta se realizoacute la comparta-mentalizacioacuten de ceacutelulas CD4+ y CD8+ (Fig 1D) La mediana del porcentaje de linfocitos T CD3+ fue del 20 inferior a lo reportado en poblacioacuten pediaacutetrica27 En esta regioacuten las poblaciones CD4+ y CD8+ fueron del 553 y 475 respectivamente y se obtuvo una relacioacuten CD4CD8 de 124 similar a lo reportado anteriormente25
Se analizaron los diferentes perfiles celulares en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ esto es lin-focitos naiumlve efectores memoria central y memoria efectora (Figs 1E-L) Utilizando un perfil de expresioacuten de CD45RA+ CCR7+ CD62L+ se determinoacute la fre-cuencia y el nuacutemero absoluto de linfocitos T naiumlve y los valores de la mediana obtenidos de 9260 y 6780 para los linfocitos T CD4+ y CD8+ respectivamente (Tablas 2 a 5) Los valores de porcentaje de las pobla-ciones naiumlve y efectores se obtuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RA+
Utilizando el mismo panel de tincioacuten es posible de-finir las ceacutelulas efectoras CD45RA+ CCR7minus CD62Lminus en cada una de las subpoblaciones Se calculoacute un por-centaje de 146 y 88 de la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresan CD45RA+ respectiva-mente (Tablas 3 y 5)
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I Parra-Ortega et al Subpoblaciones de linfocitos T
cliacutenico del paciente como puede ser el monitoreo de receptores de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacuteticas
La diferencia en los porcentajes obtenidos en el pre-sente trabajo en comparacioacuten con otros radica princi-palmente en que las subpoblaciones fueron calculadas en la poblacioacuten parental es decir CD45RA+ CD4+ o CD8+ naiumlve activados efectores y CD45RO+ CD4+ o CD8+ TCM y TEM y el valor absoluto calculado ba-saacutendose en los leucocitos totales
La presencia de ceacutelulas activadas es escasa en am-bos compartimentos tanto CD45RA como CD45RO para las poblaciones CD4+ y CD8+ Esto era esperado pues los participantes no presentaban signos ni siacutento-mas asociados a procesos infecciosos agudos Esta observacioacuten es congruente con la presencia discreta de la poblacioacuten de ceacutelulas efectoras La deteccioacuten de estas ceacutelulas en ICS se debe al contacto continuo con microorganismos (aun en ausencia de signos y siacutento-mas cliacutenicos que sugieran un proceso infeccioso agu-do) que induce la respuesta inmunitaria adaptativa y despueacutes de limitar la infeccioacuten a traveacutes de sus funcio-nes efectoras su eliminacioacuten mediante apoptosis Cabe destacar que la frecuencia de ceacutelulas efectoras es ma-yor en la poblacioacuten CD8+ que en las ceacutelulas CD4+
El anaacutelisis de las poblaciones de memoria TCM y TEM en las ceacutelulas CD4+ mostroacute un mayor porcentaje de las primeras Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observa un mayor porcentaje de TEM comparado con las TCM En la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ la presencia de una mayor subpoblacioacuten de TCM permitiriacutea tener una reserva de precursores de TEM que cooperariacutea con los linfocitos B para generacioacuten de anticuerpos y el desempentildeo de su capacidad efectora per se En las ceacutelulas CD8+ la poblacioacuten de ceacutelulas TEM se encuen-tran en mayor nuacutemero lo cual permite una actuacioacuten pronta y eficiente (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) ante infecciones intrace-lulares comparada con las generadas a partir de las ceacutelulas naiumlve activadas Es importante enfatizar que las poblaciones naiumlve y de memoria sufren modificaciones a lo largo de la vida pues la generacioacuten de linfocitos T naiumlve se encuentra reducida al depender del timo un oacutergano que involuciona por lo que disminuye el nuacutemero de linfocitos T naiumlve en periferia531 La pobla-cioacuten de ceacutelulas de memoria sufre modificaciones du-rante los encuentros con diferentes patoacutegenos lo que modifica el repertorio y las subpoblaciones TCM y TEM del mismo compartimento
Es importante establecer un sistema de anaacutelisis que comprenda la eleccioacuten de las moleacuteculas que definiraacuten las poblaciones de intereacutes asiacute como la determinacioacuten
antigeacutenico que induce la activacioacuten de las ceacutelulas T en este caso el VEB
Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observoacute un incremento en aquellas que expresaban CD69 tanto en la poblacioacuten CD45RA+ (Figs 2C y 2G) como en CD45RO+ (Figs 2D y 2H) 21 y 14 veces respectiva-mente El anaacutelisis de la expresioacuten de CRTAM mostroacute un incremento de 56 y 91 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente Es destacable que tampoco se detec-taron ceacutelulas que expresaran ambos marcadores CD69 y CRTAM en esta muestra El anaacutelisis de la expresioacuten de CD69 y CRTAM mostroacute un incremento de 138 y 104 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente
El anaacutelisis de la poblacioacuten de memoria utilizando la expresioacuten de moleacuteculas CD45RO CCR7 y CD62L permitioacute definir las subpoblaciones TCM y TEM para los compartimentos de ceacutelulas CD4+ y CD8+ El anaacute-lisis mostroacute que la poblacioacuten TCM (CD45RO+ CD62L+ CCR7+) y TEM (CD45RO+ CD62Lminus CCR7minus) estaba representada por una mediana de 341 y 296 en la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ (Tabla 3) mientras que para los CD8+ la mediana de las ceacutelulas TCM fue de 4 y para las TEM de 775 (Tabla 5) Los valores de porcentaje de las poblaciones TCM y TEM se ob-tuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RO+
La determinacioacuten y cuantificacioacuten de las ceacutelulas NK (CD16+ CD56+) (Figs 3A y B) mostroacute una media de 2967 con una mediana de 28 (IC 95 22-3726) en los leucocitos de sangre perifeacuterica (Tabla 7) Los valores obtenidos de las ceacutelulas NK son superiores en el valor de la media en comparacioacuten con lo reportado en estudios realizados en Holanda (media de 14 IC 95 4-51)27 y en China (media de 18 IC 95 1012-2834)28-30
Discusioacuten
Caracterizar y cuantificar las diferentes subpoblacio-nes de linfocitos T en sangre perifeacuterica permitioacute conocer la distribucioacuten (nuacutemeros absolutos y porcentaje) en indi-viduos cliacutenicamente sanos Al analizar la poblacioacuten de linfocitos T CD3+ se observoacute que el uso de CD45RA delimita a las ceacutelulas naiumlve bona fide dentro del compar-timento de ceacutelulas CD4+ Sin embargo para los CD8+ es necesario el uso de marcadores adicionales como CD62L y CCR7 si se desea identificar a la poblacioacuten naiumlve de manera precisa Esto es una diferencia impor-tante a considerar cuando el intereacutes de la cuantificacioacuten de las ceacutelulas naiumlve es determinante en el seguimiento
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Figura 2 Fenotipificacioacuten de la poblacioacuten de linfocitos T activados A partir de las poblaciones CD4+ (A y E) y CD8+ (C y G) que expresaban la moleacutecula CD45RA (naiumlve) se analizoacute la expresioacuten de CD69 y CRTAM (marcadores tempranos de activacioacuten) Se realizoacute el mismo anaacutelisis en las poblaciones CD4+ CD45RO+ (B y F) y CD8+ CD45RO+ (D y H) en una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos (fila superior) y un individuo infectado con el virus Epstein Barr (fila inferior)
A
E
B
F
C
G
D
H
CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
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16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
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Introduccioacuten
Los linfocitos T son ceacutelulas del sistema inmune adapta-tivo que maduran en el timo a partir de progenitores linfoi-des comunes provenientes de la meacutedula oacutesea Las sub-poblaciones de linfocitos T CD4 y CD8 egresan del timo y viajan a traveacutes del sistema linfaacutetico para poblar los oacuterganos linfoides secundarios bazo ganglios linfaacuteticos12
Desde hace varias deacutecadas ha incrementado el nuacuteme-ro de moleacuteculas que permiten identificar distintas subpo-blaciones de linfocitos T desde el fenotipo naiumlve hasta los compartimentos de memoria central y efectora incluyen-do el estado de activacioacuten y efector de los linfocitos que son detectables en sangre perifeacuterica3 A continuacioacuten se describen las poblaciones identificadas en la periferia
Linfocitos T naiumlve o viacutergenes
Los linfocitos maduros que egresan del timo se alojan principalmente en los oacuterganos linfoides secundarios La expresioacuten de la isoforma CD45RA (isoforma de mayor peso molecular puesto que conserva la expresioacuten de los 3 exones de CD45) es uno de los principales y maacutes an-tiguos marcadores para su seleccioacuten Ademaacutes la expre-sioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten como CD62L (que se une a E-selectina) y receptores de quimiocinas como CCR7 (se han identificado dos ligandos para este recep-tor CCL19 y CCL12) conforman el fenotipo naiumlve Se localizan en los oacuterganos linfoides secundarios donde las ceacutelulas presentadoras de antiacutegeno (ceacutelulas dendriacuteticas) profesionales presentan a los peacuteptidos en el contexto de moleacuteculas del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) clase I si son antiacutegenos intracelulares principal-mente Activan a los linfocitos T CD8 o CPH clase II (si son antiacutegenos extracelulares generalmente) que a su vez activaraacuten a los linfocitos T CD43-6
Linfocitos T activados
El reconocimiento de los peacuteptidos presentados con-duce a cambios intracelulares como liberacioacuten de las
reservas de calcio translocacioacuten de factores de trans-cripcioacuten al nuacutecleo entre otros ademaacutes de la modifica-cioacuten de la expresioacuten de moleacuteculas en la superficie Este estado llamado activacioacuten se asocia con una disminucioacuten en la expresioacuten de la isoforma CD45RA la aparicioacuten de la moleacutecula CD45RO (isoforma de me-nor peso molecular que se une a CD22 que es una proteiacutena que se encuentra en la membrana de los lin-focitos B) la disminucioacuten de CD62L y la aparicioacuten de la moleacutecula asociada a ceacutelulas T restringida al CPH de clase I conocida como CRTAM (por sus siglas en in-gleacutes class-I MHC-restricted T cell associated molecu-le) y CD69 Estas dos moleacuteculas tienen un patroacuten de expresioacuten similar aproximadamente de 16 a 18 horas postactivacioacuten se alcanza el maacuteximo nivel de expresioacuten y es de caraacutecter transitorio (es decir las ceacutelulas dejan de expresar las moleacuteculas despueacutes de cierto tiempo) por lo que se refieren como marcadores de activacioacuten temprana La expresioacuten de esta moleacutecula en humanos y ratones se presenta exclusivamente en linfocitos T activados7-9 En el caso del receptor de quimiocina CCR7 (asociado con la retencioacuten de los linfocitos T en oacuterganos linfoides) se ha reportado de baja a nula ex-presioacuten en los linfocitos T activados principalmente10 Sin embargo se ha encontrado que los linfocitos T CD8+ despueacutes de una activacioacuten en modelo antiacutegeno especiacutefico (es decir una activacioacuten monoclonal) ex-presaban CCR711 Una de las caracteriacutesticas de la activacioacuten in vivo es que es un evento donde influye tanto el microambiente (las citocinas en el medio ex-tracelular) como la intensidad de activacioacuten recibida (afinidad y avidez) Tal seriacutea el caso de CCR7 ya que se pueden encontrar ceacutelulas antiacutegeno especiacutefico pos-tactivacioacuten que expresan dicha moleacutecula
Los linfocitos activados migran de los oacuterganos linfoi-des secundarios al resto del organismo principalmente al sitio donde se detecte la sentildeal de dantildeo o peligro (generalmente una zona con presencia de inflamacioacuten) ademaacutes de estar presentes en sangre perifeacuterica12 Los linfocitos T activados se pueden encontrar tanto en la
clinically healthy individuals Results Naiumlve (CD3+ CD4+ or CD8+ CD45RA+ CD62L+ CCR7+) activated (CD3+ CD4+ or CD8+ CD45RA+ or CD45RO+ CD69+ andor CRTAM+) effectors (CD3+ CD4+ o CD8+ CD45RA+ CD62Lminus CCR7minus) cen-tral memory (CD3+ CD4+ o CD8+ CD45RO+ CD62L+ CCR7+) memory effectors (CD3+ CD4+ or CD8+ CD62RO+ CD62Lminus CCR7minus) subpopulations were analyzed by flow cytometry Descriptive statistics parameters were calculated (minimum values maximum values mean values median) Conclusions This panel can be very useful for monitoring patients in whom the immunological status from a cellular perspective is needed Particularly it can support the follow-up of patients who require an immunological reconstitution (T-cell component) evaluation
Key words T lymphocyte Lymphocyte subpopulation Flow cytometry
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poblacioacuten CD45RA+ que seriacutean los recientemente ac-tivados como en la poblacioacuten CD45RO+ que seriacutea la de memoria por una reactivacioacuten
Linfocitos T efectores
Posterior a la activacioacuten los linfocitos T adquieren funciones efectoras En el caso de los linfocitos T CD4+ se detecta la produccioacuten de citocinas que pueden pola-rizar el resto de la respuesta inmunoloacutegica Se pueden determinar poblaciones que producen principalmente interferoacuten gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Th1 proinflamatorias) IL-17 (Th17) IL-9 (Th9) e IL-4 e IL-10 (Th2 anti-inflamatorias)
Los linfocitos T CD8+ producen citocinas como TNF-α e IFN-γ y poseen capacidad citotoacutexica que les permite eliminar ceacutelulas infectadas o tumorales a tra-veacutes de moleacuteculas como granzima B y perforina(11) El fenotipo de los linfocitos T efectores es CD45RA+ CD62Lminus CCR7minus La ausencia de expresioacuten de moleacutecu-las asociadas a la retencioacuten de las ceacutelulas en los oacuter-ganos linfoides CCR7 y CD62L favorece que las ceacute-lulas migren al sitio de inflamacioacuten para realizar sus funciones efectoras
Linfocitos T de memoria
Si la activacioacuten de los linfocitos T naiumlve es apropiada entonces se induciraacute la generacioacuten de una poblacioacuten de memoria Estas ceacutelulas se localizan principalmente en los oacuterganos linfoides secundarios y en sangre perifeacuterica
En el humano se utiliza la moleacutecula CD45RO como un marcador para seleccionar la poblacioacuten de ceacutelulas que son progenie de un linfocito T naiumlve activado a traveacutes de su receptor receptor de ceacutelulas T1314
La presencia o ausencia de las moleacuteculas CCR7 y CD62L en la superficie proporcionan en conjunto dos fenotipos1) TCM (del ingleacutes central memory T cells ceacutelulas T de
memoria central) CD45RO+ CD62L+ CCR7+2) TEM (del ingleacutes effector memory T cells ceacutelulas T
de memoria efectora) CD45RO+CD62LminusCCR7minus15
Las TCM son ceacutelulas que se encuentran principal-mente en los oacuterganos linfoides secundarios y son las que mantienen el compartimento de linfocitos T de memoria efectora16 En cambio las TEM son aquellas que ante un encuentro subsecuente con el patoacutegeno responden de manera inmediata con una mayor capacidad efectora (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) en comparacioacuten con
las ceacutelulas efectoras provenientes de la primera dife-renciacioacuten de las ceacutelulas naiumlve activadas Estas ceacutelulas se encuentran principalmente circulando en el organis-mo14-17 debido a la ausencia de las moleacuteculas CCR7 y CD62L
Ceacutelulas natural killer
Las ceacutelulas natural killer (NK) tambieacuten llamadas ase-sinas naturales son linfocitos generados a partir de un precursor linfoide comuacuten cuya funcioacuten efectora estaacute me-diada por la produccioacuten de citocinas especialmente altas cantidades de IFN-γ y actividad citotoacutexica para eliminar ceacutelulas infectadas o tumorales Se localizan en sangre perifeacuterica en los ganglios linfaacuteticos piel intestino hiacutega-do pulmones uacutetero y otros tejidos Morfoloacutegicamente son similares a los linfocitos T pero sus marcadores en superficie son CD16+ CD56+ en ausencia de CD3
Para identificar las diferentes poblaciones y subpo-blaciones de linfocitos se han desarrollado teacutecnicas como la centrifugacioacuten en gradientes18 Sin embargo no es posible diferenciar las ceacutelulas naiumlve o activadas simplemente por su densidad o morfologiacutea por lo que se han utilizado meacutetodos a traveacutes de los cuales se detectan proteiacutenas de membrana que se utilizan como marcadores19
El desarrollo de la tecnologiacutea de hibridomas permitioacute la produccioacuten de anticuerpos monoclonales capaces de reconocer epiacutetopos uacutenicos de las moleacuteculas de su-perficie celular y con ello un gran avance en la iden-tificacioacuten de fenotipos celulares ya sea por teacutecnicas manuales o automatizadas ademaacutes de tinciones muacutel-tiples20 La citometriacutea de flujo tiene gran importancia en los campos de la hematologiacutea e inmunologiacutea para el anaacutelisis completo y la caracterizacioacuten detallada de las ceacutelulas sanguiacuteneas21 Entre las aplicaciones cliacuteni-cas maacutes frecuentes de estos meacutetodos se encuentran la caracterizacioacuten de leucocitos en estados de inmu-nodeficiencia primaria o secundaria como en el caso de infeccioacuten por el virus de inmunodeficiencia adquiri-da2223 y en enfermedades oncohematoloacutegicas24 A esto se debe agregar el desarrollo de un gran nuacuteme-ro de fluorocromos utilizados para unirse covalente-mente a los anticuerpos monoclonales que se emplean en estas teacutecnicas y asiacute marcar muacuteltiples moleacuteculas para su determinacioacuten precisa en una suspensioacuten ce-lular heterogeacutenea2526
Por lo anterior es relevante implementar la determi-nacioacuten y cuantificacioacuten de las diferentes subpoblacio-nes de los linfocitos T asiacute como conocer su asociacioacuten con el estado cliacutenico del paciente De esta forma el
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meacutedico podraacute integrar los resultados signos y siacutento-mas para la toma de decisiones terapeacuteuticas conside-rando la presencia de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T asociados con el padecimiento
En el presente trabajo se estandarizoacute un perfil de moleacuteculas de superficie para la caracterizacioacuten de sub-poblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria central y efectora ademaacutes de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos a traveacutes de citometriacutea de flujo
Meacutetodos
Muestras
Se utilizaron muestras de sangre perifeacuterica recolec-tadas en tubos con anticoagulante aacutecido etilendiami-notetraaceacutetico (EDTA) obtenidas por puncioacuten venosa de 20 individuos cliacutenicamente sanos (ICS) de naciona-lidad mexicana quienes no cursaban con un proceso inflamatorio (por ejemplo infecciones neoplasias o que estuvieran bajo tratamiento farmacoloacutegico) A los participantes se les realizoacute un estudio meacutedico para determinar su estado de salud considerando los valo-res de una citometriacutea hemaacutetica y quiacutemica sanguiacutenea que proporcionan los paraacutemetros baacutesicos para la eva-luacioacuten de la funcioacuten hepaacutetica renal y del metabolismo de los carbohidratos y liacutepidos
Para el fenotipo de activacioacuten se utilizoacute la muestra de una paciente (8 antildeos) con diagnoacutestico de infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr con una carga viral de 26000 copiasml en plasma determinada por reac-cioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real
Se realizoacute el conteo celular mediante una citometriacutea hemaacutetica de cada muestra en el equipo LH 780 Beck-man Coulterreg
Inmunofenotipo
Para la tincioacuten de las muestras se utilizaron tres tubos de ensayo de 12 x 75 mm uno para cada panel Se colocaron 5 microl de cada anticuerpo del panel (los anti-cuerpos provienen de BD Biosciencesreg excepto el an-ticuerpo anti-CRTAM de Biolegendreg) y se adicionoacute sangre perifeacuterica completa Para las muestras con una cuenta de leucocitos totales entre 2000 y 13000 ceacutelmicrol se colocaron 50 microl de sangre perifeacuterica completa con EDTA para obtener una cantidad de ceacutelulas apropiada para el nuacutemero de eventos que seraacuten adquiridos
La mezcla se incuboacute por 15 min a temperatura am-biente en oscuridad Posteriormente se agregaron 2 ml
de solucioacuten FACS Lysing (BD Biosciencesreg) y se incu-boacute por 10 min a temperatura ambiente en oscuridad Al finalizar el tiempo se centrifugaron los tubos 5 min a 1800 rpm se decantaron y se lavoacute dos veces el botoacuten celular con 2 ml de FACS Flow Al finalizar se agrega-ron 350 microl de FACS Flow friacuteo (BD Biosciencesreg) para obtener una suspensioacuten celular homogeacutenea
La lectura de las muestras se realizoacute en el citoacutemetro de flujo BD FACS Canto II siguiendo el procedimiento que marca el manual de usuario y cumpliendo los es-taacutendares de calidad establecidos en el laboratorio cliacuteni-co del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez para los ensayos analiacuteticos con fines de diagnoacutestico Breve-mente previo a la adquisicioacuten de las muestras se cali-broacute el equipo y se compensoacute con tinciones independien-tes con cada uno de los fluocromos para su correcta lectura asiacute como ceacutelulas sin tentildeir para ajustar la auto-fluorescencia Se contabilizaron 50000 eventos para la caracterizacioacuten de las diversas poblaciones celulares
Paneles para la fenotipificacioacuten de los linfocitos T
Se seleccionaron los fluorocromos considerando que no se generara ninguacuten traslape en su lectura aprove-chando los tres rayos laacuteser que posee el equipo De la misma manera se seleccionaron los anticuerpos monoclonales
Para el anticuerpo monoclonal CRTAM se seleccio-noacute el fluorocromo ficoeritrina Al ser una moleacutecula de bajos niveles de expresioacuten se prefirioacute utilizar un fluo-rocromo de mayor intensidad para su deteccioacuten
Se realizaron tres paneles celulares diferentes para determinar linfocitos T naiumlve activados efectores de memoria central y memoria efectora (Tabla 1)
Tabla 1 Panel de anticuerpos utilizados en la caracterizacioacuten de las subpoblaciones de linfocitos T
Fluorocromo Panel 1Linfocitos T naiumlve
y de memoria
Panel 2Linfocitos T activados
Panel 3Linfocitos
NK
FITC CD45RA CD45RA
PE CRTAM CRTAM CD16
Percp- Cy 55 CD45RO CD45RO
APC CD62L CD69 CD56
APC H7 CD4 CD4
V450 CD3 CD3 CD3
PE Cy7 CCR7 CD8
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Anaacutelisis de datos
Los resultados fueron analizados en el programa BD FACsDIVAreg Se realizaron los graacuteficos para la identifi-cacioacuten de cada poblacioacuten y una copia electroacutenica de respaldo asiacute como la plantilla del panel
Se construyoacute una base de datos con la cual median-te conversiones de los porcentajes en relacioacuten con los leucocitos totales y linfocitos obtenidos del valor pro-porcionado por el equipo LH 780 Beckman Coulterreg se calcularon los valores absolutos (ceacutelml)
En el caso de las ceacutelulas NK se obtuvo el porcentaje de ceacutelulas CD3minus CD16+ CD56+ en la poblacioacuten de
leucocitos totales y se calculoacute el nuacutemero absoluto de la misma manera Para el anaacutelisis estadiacutestico de las diferentes poblaciones celulares se utilizoacute el programa GraphPad Prismreg 601 para Mac OS X
Resultados
Se analizaron 20 muestras de sangre perifeacuterica pro-venientes de individuos en un rango de edad de 8 a 18 antildeos (con una media de 10 antildeos y 6 meses y una mediana de 10 antildeos) mestizos mexicanos el 75 (15) de sexo masculino
Figura 1 Fenotipificacioacuten de linfocitos T de sangre perifeacuterica A partir de una aliacutecuota de muestra de sangre perifeacuterica se delimitoacute la poblacioacuten de singletes (A) Se determinaron basaacutendose en su tamantildeo (FSC dispersioacuten frontal por sus siglas en ingleacutes forward scatter) y complejidad (SSC dispersioacuten lateral por sus siglas en ingleacutes side scatter) las distintas poblaciones de sangre perifeacuterica linfocitos monocitos y granulocitos (B) Se determinoacute la poblacioacuten CD3+ (C) A partir de esta poblacioacuten se determinaron los linfocitos T CD4+ y CD8+ (D) Se analizoacute la expresioacuten de las moleacuteculas CD45RA (E) y CD45RO (G) como marcadores de naiumlve y memoria respectivamente en la poblacioacuten de linfocitos CD4+ (F) De la poblacioacuten CD45RA (E) aquellas ceacutelulas que expresaran CD62L y CCR7 fueron identificadas como naiumlve y aquellas CD62L- CCR7- como efectoras (F) Mientras que el anaacutelisis de la expresioacuten de ambas moleacuteculas en las ceacutelulas CD45RO+ (G) permitioacute la identificacioacuten de las ceacutelulas de memoria central (TCM) y memoria efectora (TEM) (H) El mismo anaacutelisis se realizoacute para los linfocitos CD8+ (I-L) Las imaacutegenes mostradas provienen de un individuo y son representativas del resto de participantes incluidos en el estudio
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Tabla 4 Valores (ceacutelulasml) de las subpoblaciones de linfocitos T CD8+ en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutesticofenotipo celular
Linfocitos CD8+ Cel
mL
Linfocitos CD8+ CD45RA+
CelmL
Linfocitos CD8+ naiumlve
CelmL
Linfocitos CD8+ efectores
CelmL
Linfocitos CD8+ CD45RO+
CelmL
Linfocitos CD8+ TCM
CelmL
Linfocitos CD8+ TEM
CelmL
Valor miacutenimo 36186 23232 13219 2741 12738 446 979
Percentil 25 78397 41514 17440 1882 19731 719 11024
Mediana 109396 68644 35240 6974 35035 1931 25275
Percentil 75 196850 154529 63307 11171 53473 4201 38052
Valor maacuteximo 542299 380694 148283 33882 157267 14592 125656
Media 155947 110535 51990 9625 43701 3218 30863
Desviacioacuten estaacutendar 126536 102996 45445 9910 33907 3607 29568
Error estaacutendar 28294 23031 10712 2216 7582 8064 6612
IC 95 valor bajo 96725 62331 29390 4987 27832 1530 17024
IC 95 valor alto 215168 158739 74589 14262 59570 4906 44701
IC intervalo de confianza TCM ceacutelulas T de memoria central TEM ceacutelulas T de memoria efectora
El fenotipo de linfocitos T activados se definioacute como aquellas ceacutelulas que expresaran CD69 un marcador de activacioacuten temprana y CRTAM una moleacutecula reciente-mente descrita y asociada con el estado de activacioacuten La determinacioacuten de este fenotipo se realizoacute tanto en las poblaciones CD45RA+ como CD45RO+ con la fina-lidad de calcular las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) activadas recientemente y las activadasmemoria (CD45RO+) pos-terior a su reactivacioacuten El anaacutelisis de las ceacutelulas con fenotipo de activacioacuten mostroacute que en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ existe una poblacioacuten discreta de ceacutelulas CD45RA+ y CD45RO+ que expresan CD69 y escasas ceacutelulas CRTAM+ (Fig 2) Cabe destacar que no se detectaron ceacutelulas que mostraran coexpresioacuten de CD69 y CRTAM (Fig 2 y Tabla 6)
Considerando que las muestras proveniacutean de indivi-duos cliacutenicamente sanos se analizoacute ademaacutes una muestra de un paciente que cursaba con una infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr (VEB) Se observoacute que en la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ en el com-partimento CD45RA+ existiacutea un aumento de 285 ve-ces de ceacutelulas CD69+ (Figs 2A y 2E) mientras que en la poblacioacuten CD45RO+ este aumento fue de 21 veces (Figs 2B y 2F) comparado con lo observado en los ICS Por otro lado en las ceacutelulas CRTAM+ se observoacute un incremento muy importante de aproximadamente 89 veces en las ceacutelulas CD45RA+ (Figs 2A y 2E) y de 76 veces en la poblacioacuten CD45RO+ (Figs 2B y 2F) con respecto a lo observado en los ICS mostrando una diferencia importante en presencia de un estiacutemulo
A partir de la delimitacioacuten de los eventos sencillos (Fig 1A) se consideraron las caracteriacutesticas de tamantildeo y complejidad para seleccionar las ceacutelulas vivas (Fig 1B) Posteriormente se definioacute la poblacioacuten de linfocitos T basaacutendose en la expresioacuten de la moleacutecula CD3 (Fig 1C) a partir de esta se realizoacute la comparta-mentalizacioacuten de ceacutelulas CD4+ y CD8+ (Fig 1D) La mediana del porcentaje de linfocitos T CD3+ fue del 20 inferior a lo reportado en poblacioacuten pediaacutetrica27 En esta regioacuten las poblaciones CD4+ y CD8+ fueron del 553 y 475 respectivamente y se obtuvo una relacioacuten CD4CD8 de 124 similar a lo reportado anteriormente25
Se analizaron los diferentes perfiles celulares en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ esto es lin-focitos naiumlve efectores memoria central y memoria efectora (Figs 1E-L) Utilizando un perfil de expresioacuten de CD45RA+ CCR7+ CD62L+ se determinoacute la fre-cuencia y el nuacutemero absoluto de linfocitos T naiumlve y los valores de la mediana obtenidos de 9260 y 6780 para los linfocitos T CD4+ y CD8+ respectivamente (Tablas 2 a 5) Los valores de porcentaje de las pobla-ciones naiumlve y efectores se obtuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RA+
Utilizando el mismo panel de tincioacuten es posible de-finir las ceacutelulas efectoras CD45RA+ CCR7minus CD62Lminus en cada una de las subpoblaciones Se calculoacute un por-centaje de 146 y 88 de la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresan CD45RA+ respectiva-mente (Tablas 3 y 5)
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I Parra-Ortega et al Subpoblaciones de linfocitos T
cliacutenico del paciente como puede ser el monitoreo de receptores de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacuteticas
La diferencia en los porcentajes obtenidos en el pre-sente trabajo en comparacioacuten con otros radica princi-palmente en que las subpoblaciones fueron calculadas en la poblacioacuten parental es decir CD45RA+ CD4+ o CD8+ naiumlve activados efectores y CD45RO+ CD4+ o CD8+ TCM y TEM y el valor absoluto calculado ba-saacutendose en los leucocitos totales
La presencia de ceacutelulas activadas es escasa en am-bos compartimentos tanto CD45RA como CD45RO para las poblaciones CD4+ y CD8+ Esto era esperado pues los participantes no presentaban signos ni siacutento-mas asociados a procesos infecciosos agudos Esta observacioacuten es congruente con la presencia discreta de la poblacioacuten de ceacutelulas efectoras La deteccioacuten de estas ceacutelulas en ICS se debe al contacto continuo con microorganismos (aun en ausencia de signos y siacutento-mas cliacutenicos que sugieran un proceso infeccioso agu-do) que induce la respuesta inmunitaria adaptativa y despueacutes de limitar la infeccioacuten a traveacutes de sus funcio-nes efectoras su eliminacioacuten mediante apoptosis Cabe destacar que la frecuencia de ceacutelulas efectoras es ma-yor en la poblacioacuten CD8+ que en las ceacutelulas CD4+
El anaacutelisis de las poblaciones de memoria TCM y TEM en las ceacutelulas CD4+ mostroacute un mayor porcentaje de las primeras Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observa un mayor porcentaje de TEM comparado con las TCM En la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ la presencia de una mayor subpoblacioacuten de TCM permitiriacutea tener una reserva de precursores de TEM que cooperariacutea con los linfocitos B para generacioacuten de anticuerpos y el desempentildeo de su capacidad efectora per se En las ceacutelulas CD8+ la poblacioacuten de ceacutelulas TEM se encuen-tran en mayor nuacutemero lo cual permite una actuacioacuten pronta y eficiente (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) ante infecciones intrace-lulares comparada con las generadas a partir de las ceacutelulas naiumlve activadas Es importante enfatizar que las poblaciones naiumlve y de memoria sufren modificaciones a lo largo de la vida pues la generacioacuten de linfocitos T naiumlve se encuentra reducida al depender del timo un oacutergano que involuciona por lo que disminuye el nuacutemero de linfocitos T naiumlve en periferia531 La pobla-cioacuten de ceacutelulas de memoria sufre modificaciones du-rante los encuentros con diferentes patoacutegenos lo que modifica el repertorio y las subpoblaciones TCM y TEM del mismo compartimento
Es importante establecer un sistema de anaacutelisis que comprenda la eleccioacuten de las moleacuteculas que definiraacuten las poblaciones de intereacutes asiacute como la determinacioacuten
antigeacutenico que induce la activacioacuten de las ceacutelulas T en este caso el VEB
Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observoacute un incremento en aquellas que expresaban CD69 tanto en la poblacioacuten CD45RA+ (Figs 2C y 2G) como en CD45RO+ (Figs 2D y 2H) 21 y 14 veces respectiva-mente El anaacutelisis de la expresioacuten de CRTAM mostroacute un incremento de 56 y 91 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente Es destacable que tampoco se detec-taron ceacutelulas que expresaran ambos marcadores CD69 y CRTAM en esta muestra El anaacutelisis de la expresioacuten de CD69 y CRTAM mostroacute un incremento de 138 y 104 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente
El anaacutelisis de la poblacioacuten de memoria utilizando la expresioacuten de moleacuteculas CD45RO CCR7 y CD62L permitioacute definir las subpoblaciones TCM y TEM para los compartimentos de ceacutelulas CD4+ y CD8+ El anaacute-lisis mostroacute que la poblacioacuten TCM (CD45RO+ CD62L+ CCR7+) y TEM (CD45RO+ CD62Lminus CCR7minus) estaba representada por una mediana de 341 y 296 en la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ (Tabla 3) mientras que para los CD8+ la mediana de las ceacutelulas TCM fue de 4 y para las TEM de 775 (Tabla 5) Los valores de porcentaje de las poblaciones TCM y TEM se ob-tuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RO+
La determinacioacuten y cuantificacioacuten de las ceacutelulas NK (CD16+ CD56+) (Figs 3A y B) mostroacute una media de 2967 con una mediana de 28 (IC 95 22-3726) en los leucocitos de sangre perifeacuterica (Tabla 7) Los valores obtenidos de las ceacutelulas NK son superiores en el valor de la media en comparacioacuten con lo reportado en estudios realizados en Holanda (media de 14 IC 95 4-51)27 y en China (media de 18 IC 95 1012-2834)28-30
Discusioacuten
Caracterizar y cuantificar las diferentes subpoblacio-nes de linfocitos T en sangre perifeacuterica permitioacute conocer la distribucioacuten (nuacutemeros absolutos y porcentaje) en indi-viduos cliacutenicamente sanos Al analizar la poblacioacuten de linfocitos T CD3+ se observoacute que el uso de CD45RA delimita a las ceacutelulas naiumlve bona fide dentro del compar-timento de ceacutelulas CD4+ Sin embargo para los CD8+ es necesario el uso de marcadores adicionales como CD62L y CCR7 si se desea identificar a la poblacioacuten naiumlve de manera precisa Esto es una diferencia impor-tante a considerar cuando el intereacutes de la cuantificacioacuten de las ceacutelulas naiumlve es determinante en el seguimiento
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Figura 2 Fenotipificacioacuten de la poblacioacuten de linfocitos T activados A partir de las poblaciones CD4+ (A y E) y CD8+ (C y G) que expresaban la moleacutecula CD45RA (naiumlve) se analizoacute la expresioacuten de CD69 y CRTAM (marcadores tempranos de activacioacuten) Se realizoacute el mismo anaacutelisis en las poblaciones CD4+ CD45RO+ (B y F) y CD8+ CD45RO+ (D y H) en una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos (fila superior) y un individuo infectado con el virus Epstein Barr (fila inferior)
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CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
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copy
Per
man
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78
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16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
Sin
cont
ar c
on e
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poblacioacuten CD45RA+ que seriacutean los recientemente ac-tivados como en la poblacioacuten CD45RO+ que seriacutea la de memoria por una reactivacioacuten
Linfocitos T efectores
Posterior a la activacioacuten los linfocitos T adquieren funciones efectoras En el caso de los linfocitos T CD4+ se detecta la produccioacuten de citocinas que pueden pola-rizar el resto de la respuesta inmunoloacutegica Se pueden determinar poblaciones que producen principalmente interferoacuten gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Th1 proinflamatorias) IL-17 (Th17) IL-9 (Th9) e IL-4 e IL-10 (Th2 anti-inflamatorias)
Los linfocitos T CD8+ producen citocinas como TNF-α e IFN-γ y poseen capacidad citotoacutexica que les permite eliminar ceacutelulas infectadas o tumorales a tra-veacutes de moleacuteculas como granzima B y perforina(11) El fenotipo de los linfocitos T efectores es CD45RA+ CD62Lminus CCR7minus La ausencia de expresioacuten de moleacutecu-las asociadas a la retencioacuten de las ceacutelulas en los oacuter-ganos linfoides CCR7 y CD62L favorece que las ceacute-lulas migren al sitio de inflamacioacuten para realizar sus funciones efectoras
Linfocitos T de memoria
Si la activacioacuten de los linfocitos T naiumlve es apropiada entonces se induciraacute la generacioacuten de una poblacioacuten de memoria Estas ceacutelulas se localizan principalmente en los oacuterganos linfoides secundarios y en sangre perifeacuterica
En el humano se utiliza la moleacutecula CD45RO como un marcador para seleccionar la poblacioacuten de ceacutelulas que son progenie de un linfocito T naiumlve activado a traveacutes de su receptor receptor de ceacutelulas T1314
La presencia o ausencia de las moleacuteculas CCR7 y CD62L en la superficie proporcionan en conjunto dos fenotipos1) TCM (del ingleacutes central memory T cells ceacutelulas T de
memoria central) CD45RO+ CD62L+ CCR7+2) TEM (del ingleacutes effector memory T cells ceacutelulas T
de memoria efectora) CD45RO+CD62LminusCCR7minus15
Las TCM son ceacutelulas que se encuentran principal-mente en los oacuterganos linfoides secundarios y son las que mantienen el compartimento de linfocitos T de memoria efectora16 En cambio las TEM son aquellas que ante un encuentro subsecuente con el patoacutegeno responden de manera inmediata con una mayor capacidad efectora (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) en comparacioacuten con
las ceacutelulas efectoras provenientes de la primera dife-renciacioacuten de las ceacutelulas naiumlve activadas Estas ceacutelulas se encuentran principalmente circulando en el organis-mo14-17 debido a la ausencia de las moleacuteculas CCR7 y CD62L
Ceacutelulas natural killer
Las ceacutelulas natural killer (NK) tambieacuten llamadas ase-sinas naturales son linfocitos generados a partir de un precursor linfoide comuacuten cuya funcioacuten efectora estaacute me-diada por la produccioacuten de citocinas especialmente altas cantidades de IFN-γ y actividad citotoacutexica para eliminar ceacutelulas infectadas o tumorales Se localizan en sangre perifeacuterica en los ganglios linfaacuteticos piel intestino hiacutega-do pulmones uacutetero y otros tejidos Morfoloacutegicamente son similares a los linfocitos T pero sus marcadores en superficie son CD16+ CD56+ en ausencia de CD3
Para identificar las diferentes poblaciones y subpo-blaciones de linfocitos se han desarrollado teacutecnicas como la centrifugacioacuten en gradientes18 Sin embargo no es posible diferenciar las ceacutelulas naiumlve o activadas simplemente por su densidad o morfologiacutea por lo que se han utilizado meacutetodos a traveacutes de los cuales se detectan proteiacutenas de membrana que se utilizan como marcadores19
El desarrollo de la tecnologiacutea de hibridomas permitioacute la produccioacuten de anticuerpos monoclonales capaces de reconocer epiacutetopos uacutenicos de las moleacuteculas de su-perficie celular y con ello un gran avance en la iden-tificacioacuten de fenotipos celulares ya sea por teacutecnicas manuales o automatizadas ademaacutes de tinciones muacutel-tiples20 La citometriacutea de flujo tiene gran importancia en los campos de la hematologiacutea e inmunologiacutea para el anaacutelisis completo y la caracterizacioacuten detallada de las ceacutelulas sanguiacuteneas21 Entre las aplicaciones cliacuteni-cas maacutes frecuentes de estos meacutetodos se encuentran la caracterizacioacuten de leucocitos en estados de inmu-nodeficiencia primaria o secundaria como en el caso de infeccioacuten por el virus de inmunodeficiencia adquiri-da2223 y en enfermedades oncohematoloacutegicas24 A esto se debe agregar el desarrollo de un gran nuacuteme-ro de fluorocromos utilizados para unirse covalente-mente a los anticuerpos monoclonales que se emplean en estas teacutecnicas y asiacute marcar muacuteltiples moleacuteculas para su determinacioacuten precisa en una suspensioacuten ce-lular heterogeacutenea2526
Por lo anterior es relevante implementar la determi-nacioacuten y cuantificacioacuten de las diferentes subpoblacio-nes de los linfocitos T asiacute como conocer su asociacioacuten con el estado cliacutenico del paciente De esta forma el
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meacutedico podraacute integrar los resultados signos y siacutento-mas para la toma de decisiones terapeacuteuticas conside-rando la presencia de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T asociados con el padecimiento
En el presente trabajo se estandarizoacute un perfil de moleacuteculas de superficie para la caracterizacioacuten de sub-poblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria central y efectora ademaacutes de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos a traveacutes de citometriacutea de flujo
Meacutetodos
Muestras
Se utilizaron muestras de sangre perifeacuterica recolec-tadas en tubos con anticoagulante aacutecido etilendiami-notetraaceacutetico (EDTA) obtenidas por puncioacuten venosa de 20 individuos cliacutenicamente sanos (ICS) de naciona-lidad mexicana quienes no cursaban con un proceso inflamatorio (por ejemplo infecciones neoplasias o que estuvieran bajo tratamiento farmacoloacutegico) A los participantes se les realizoacute un estudio meacutedico para determinar su estado de salud considerando los valo-res de una citometriacutea hemaacutetica y quiacutemica sanguiacutenea que proporcionan los paraacutemetros baacutesicos para la eva-luacioacuten de la funcioacuten hepaacutetica renal y del metabolismo de los carbohidratos y liacutepidos
Para el fenotipo de activacioacuten se utilizoacute la muestra de una paciente (8 antildeos) con diagnoacutestico de infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr con una carga viral de 26000 copiasml en plasma determinada por reac-cioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real
Se realizoacute el conteo celular mediante una citometriacutea hemaacutetica de cada muestra en el equipo LH 780 Beck-man Coulterreg
Inmunofenotipo
Para la tincioacuten de las muestras se utilizaron tres tubos de ensayo de 12 x 75 mm uno para cada panel Se colocaron 5 microl de cada anticuerpo del panel (los anti-cuerpos provienen de BD Biosciencesreg excepto el an-ticuerpo anti-CRTAM de Biolegendreg) y se adicionoacute sangre perifeacuterica completa Para las muestras con una cuenta de leucocitos totales entre 2000 y 13000 ceacutelmicrol se colocaron 50 microl de sangre perifeacuterica completa con EDTA para obtener una cantidad de ceacutelulas apropiada para el nuacutemero de eventos que seraacuten adquiridos
La mezcla se incuboacute por 15 min a temperatura am-biente en oscuridad Posteriormente se agregaron 2 ml
de solucioacuten FACS Lysing (BD Biosciencesreg) y se incu-boacute por 10 min a temperatura ambiente en oscuridad Al finalizar el tiempo se centrifugaron los tubos 5 min a 1800 rpm se decantaron y se lavoacute dos veces el botoacuten celular con 2 ml de FACS Flow Al finalizar se agrega-ron 350 microl de FACS Flow friacuteo (BD Biosciencesreg) para obtener una suspensioacuten celular homogeacutenea
La lectura de las muestras se realizoacute en el citoacutemetro de flujo BD FACS Canto II siguiendo el procedimiento que marca el manual de usuario y cumpliendo los es-taacutendares de calidad establecidos en el laboratorio cliacuteni-co del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez para los ensayos analiacuteticos con fines de diagnoacutestico Breve-mente previo a la adquisicioacuten de las muestras se cali-broacute el equipo y se compensoacute con tinciones independien-tes con cada uno de los fluocromos para su correcta lectura asiacute como ceacutelulas sin tentildeir para ajustar la auto-fluorescencia Se contabilizaron 50000 eventos para la caracterizacioacuten de las diversas poblaciones celulares
Paneles para la fenotipificacioacuten de los linfocitos T
Se seleccionaron los fluorocromos considerando que no se generara ninguacuten traslape en su lectura aprove-chando los tres rayos laacuteser que posee el equipo De la misma manera se seleccionaron los anticuerpos monoclonales
Para el anticuerpo monoclonal CRTAM se seleccio-noacute el fluorocromo ficoeritrina Al ser una moleacutecula de bajos niveles de expresioacuten se prefirioacute utilizar un fluo-rocromo de mayor intensidad para su deteccioacuten
Se realizaron tres paneles celulares diferentes para determinar linfocitos T naiumlve activados efectores de memoria central y memoria efectora (Tabla 1)
Tabla 1 Panel de anticuerpos utilizados en la caracterizacioacuten de las subpoblaciones de linfocitos T
Fluorocromo Panel 1Linfocitos T naiumlve
y de memoria
Panel 2Linfocitos T activados
Panel 3Linfocitos
NK
FITC CD45RA CD45RA
PE CRTAM CRTAM CD16
Percp- Cy 55 CD45RO CD45RO
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APC H7 CD4 CD4
V450 CD3 CD3 CD3
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I Parra-Ortega et al Subpoblaciones de linfocitos T
Anaacutelisis de datos
Los resultados fueron analizados en el programa BD FACsDIVAreg Se realizaron los graacuteficos para la identifi-cacioacuten de cada poblacioacuten y una copia electroacutenica de respaldo asiacute como la plantilla del panel
Se construyoacute una base de datos con la cual median-te conversiones de los porcentajes en relacioacuten con los leucocitos totales y linfocitos obtenidos del valor pro-porcionado por el equipo LH 780 Beckman Coulterreg se calcularon los valores absolutos (ceacutelml)
En el caso de las ceacutelulas NK se obtuvo el porcentaje de ceacutelulas CD3minus CD16+ CD56+ en la poblacioacuten de
leucocitos totales y se calculoacute el nuacutemero absoluto de la misma manera Para el anaacutelisis estadiacutestico de las diferentes poblaciones celulares se utilizoacute el programa GraphPad Prismreg 601 para Mac OS X
Resultados
Se analizaron 20 muestras de sangre perifeacuterica pro-venientes de individuos en un rango de edad de 8 a 18 antildeos (con una media de 10 antildeos y 6 meses y una mediana de 10 antildeos) mestizos mexicanos el 75 (15) de sexo masculino
Figura 1 Fenotipificacioacuten de linfocitos T de sangre perifeacuterica A partir de una aliacutecuota de muestra de sangre perifeacuterica se delimitoacute la poblacioacuten de singletes (A) Se determinaron basaacutendose en su tamantildeo (FSC dispersioacuten frontal por sus siglas en ingleacutes forward scatter) y complejidad (SSC dispersioacuten lateral por sus siglas en ingleacutes side scatter) las distintas poblaciones de sangre perifeacuterica linfocitos monocitos y granulocitos (B) Se determinoacute la poblacioacuten CD3+ (C) A partir de esta poblacioacuten se determinaron los linfocitos T CD4+ y CD8+ (D) Se analizoacute la expresioacuten de las moleacuteculas CD45RA (E) y CD45RO (G) como marcadores de naiumlve y memoria respectivamente en la poblacioacuten de linfocitos CD4+ (F) De la poblacioacuten CD45RA (E) aquellas ceacutelulas que expresaran CD62L y CCR7 fueron identificadas como naiumlve y aquellas CD62L- CCR7- como efectoras (F) Mientras que el anaacutelisis de la expresioacuten de ambas moleacuteculas en las ceacutelulas CD45RO+ (G) permitioacute la identificacioacuten de las ceacutelulas de memoria central (TCM) y memoria efectora (TEM) (H) El mismo anaacutelisis se realizoacute para los linfocitos CD8+ (I-L) Las imaacutegenes mostradas provienen de un individuo y son representativas del resto de participantes incluidos en el estudio
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Tabla 4 Valores (ceacutelulasml) de las subpoblaciones de linfocitos T CD8+ en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutesticofenotipo celular
Linfocitos CD8+ Cel
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Linfocitos CD8+ CD45RA+
CelmL
Linfocitos CD8+ naiumlve
CelmL
Linfocitos CD8+ efectores
CelmL
Linfocitos CD8+ CD45RO+
CelmL
Linfocitos CD8+ TCM
CelmL
Linfocitos CD8+ TEM
CelmL
Valor miacutenimo 36186 23232 13219 2741 12738 446 979
Percentil 25 78397 41514 17440 1882 19731 719 11024
Mediana 109396 68644 35240 6974 35035 1931 25275
Percentil 75 196850 154529 63307 11171 53473 4201 38052
Valor maacuteximo 542299 380694 148283 33882 157267 14592 125656
Media 155947 110535 51990 9625 43701 3218 30863
Desviacioacuten estaacutendar 126536 102996 45445 9910 33907 3607 29568
Error estaacutendar 28294 23031 10712 2216 7582 8064 6612
IC 95 valor bajo 96725 62331 29390 4987 27832 1530 17024
IC 95 valor alto 215168 158739 74589 14262 59570 4906 44701
IC intervalo de confianza TCM ceacutelulas T de memoria central TEM ceacutelulas T de memoria efectora
El fenotipo de linfocitos T activados se definioacute como aquellas ceacutelulas que expresaran CD69 un marcador de activacioacuten temprana y CRTAM una moleacutecula reciente-mente descrita y asociada con el estado de activacioacuten La determinacioacuten de este fenotipo se realizoacute tanto en las poblaciones CD45RA+ como CD45RO+ con la fina-lidad de calcular las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) activadas recientemente y las activadasmemoria (CD45RO+) pos-terior a su reactivacioacuten El anaacutelisis de las ceacutelulas con fenotipo de activacioacuten mostroacute que en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ existe una poblacioacuten discreta de ceacutelulas CD45RA+ y CD45RO+ que expresan CD69 y escasas ceacutelulas CRTAM+ (Fig 2) Cabe destacar que no se detectaron ceacutelulas que mostraran coexpresioacuten de CD69 y CRTAM (Fig 2 y Tabla 6)
Considerando que las muestras proveniacutean de indivi-duos cliacutenicamente sanos se analizoacute ademaacutes una muestra de un paciente que cursaba con una infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr (VEB) Se observoacute que en la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ en el com-partimento CD45RA+ existiacutea un aumento de 285 ve-ces de ceacutelulas CD69+ (Figs 2A y 2E) mientras que en la poblacioacuten CD45RO+ este aumento fue de 21 veces (Figs 2B y 2F) comparado con lo observado en los ICS Por otro lado en las ceacutelulas CRTAM+ se observoacute un incremento muy importante de aproximadamente 89 veces en las ceacutelulas CD45RA+ (Figs 2A y 2E) y de 76 veces en la poblacioacuten CD45RO+ (Figs 2B y 2F) con respecto a lo observado en los ICS mostrando una diferencia importante en presencia de un estiacutemulo
A partir de la delimitacioacuten de los eventos sencillos (Fig 1A) se consideraron las caracteriacutesticas de tamantildeo y complejidad para seleccionar las ceacutelulas vivas (Fig 1B) Posteriormente se definioacute la poblacioacuten de linfocitos T basaacutendose en la expresioacuten de la moleacutecula CD3 (Fig 1C) a partir de esta se realizoacute la comparta-mentalizacioacuten de ceacutelulas CD4+ y CD8+ (Fig 1D) La mediana del porcentaje de linfocitos T CD3+ fue del 20 inferior a lo reportado en poblacioacuten pediaacutetrica27 En esta regioacuten las poblaciones CD4+ y CD8+ fueron del 553 y 475 respectivamente y se obtuvo una relacioacuten CD4CD8 de 124 similar a lo reportado anteriormente25
Se analizaron los diferentes perfiles celulares en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ esto es lin-focitos naiumlve efectores memoria central y memoria efectora (Figs 1E-L) Utilizando un perfil de expresioacuten de CD45RA+ CCR7+ CD62L+ se determinoacute la fre-cuencia y el nuacutemero absoluto de linfocitos T naiumlve y los valores de la mediana obtenidos de 9260 y 6780 para los linfocitos T CD4+ y CD8+ respectivamente (Tablas 2 a 5) Los valores de porcentaje de las pobla-ciones naiumlve y efectores se obtuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RA+
Utilizando el mismo panel de tincioacuten es posible de-finir las ceacutelulas efectoras CD45RA+ CCR7minus CD62Lminus en cada una de las subpoblaciones Se calculoacute un por-centaje de 146 y 88 de la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresan CD45RA+ respectiva-mente (Tablas 3 y 5)
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cliacutenico del paciente como puede ser el monitoreo de receptores de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacuteticas
La diferencia en los porcentajes obtenidos en el pre-sente trabajo en comparacioacuten con otros radica princi-palmente en que las subpoblaciones fueron calculadas en la poblacioacuten parental es decir CD45RA+ CD4+ o CD8+ naiumlve activados efectores y CD45RO+ CD4+ o CD8+ TCM y TEM y el valor absoluto calculado ba-saacutendose en los leucocitos totales
La presencia de ceacutelulas activadas es escasa en am-bos compartimentos tanto CD45RA como CD45RO para las poblaciones CD4+ y CD8+ Esto era esperado pues los participantes no presentaban signos ni siacutento-mas asociados a procesos infecciosos agudos Esta observacioacuten es congruente con la presencia discreta de la poblacioacuten de ceacutelulas efectoras La deteccioacuten de estas ceacutelulas en ICS se debe al contacto continuo con microorganismos (aun en ausencia de signos y siacutento-mas cliacutenicos que sugieran un proceso infeccioso agu-do) que induce la respuesta inmunitaria adaptativa y despueacutes de limitar la infeccioacuten a traveacutes de sus funcio-nes efectoras su eliminacioacuten mediante apoptosis Cabe destacar que la frecuencia de ceacutelulas efectoras es ma-yor en la poblacioacuten CD8+ que en las ceacutelulas CD4+
El anaacutelisis de las poblaciones de memoria TCM y TEM en las ceacutelulas CD4+ mostroacute un mayor porcentaje de las primeras Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observa un mayor porcentaje de TEM comparado con las TCM En la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ la presencia de una mayor subpoblacioacuten de TCM permitiriacutea tener una reserva de precursores de TEM que cooperariacutea con los linfocitos B para generacioacuten de anticuerpos y el desempentildeo de su capacidad efectora per se En las ceacutelulas CD8+ la poblacioacuten de ceacutelulas TEM se encuen-tran en mayor nuacutemero lo cual permite una actuacioacuten pronta y eficiente (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) ante infecciones intrace-lulares comparada con las generadas a partir de las ceacutelulas naiumlve activadas Es importante enfatizar que las poblaciones naiumlve y de memoria sufren modificaciones a lo largo de la vida pues la generacioacuten de linfocitos T naiumlve se encuentra reducida al depender del timo un oacutergano que involuciona por lo que disminuye el nuacutemero de linfocitos T naiumlve en periferia531 La pobla-cioacuten de ceacutelulas de memoria sufre modificaciones du-rante los encuentros con diferentes patoacutegenos lo que modifica el repertorio y las subpoblaciones TCM y TEM del mismo compartimento
Es importante establecer un sistema de anaacutelisis que comprenda la eleccioacuten de las moleacuteculas que definiraacuten las poblaciones de intereacutes asiacute como la determinacioacuten
antigeacutenico que induce la activacioacuten de las ceacutelulas T en este caso el VEB
Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observoacute un incremento en aquellas que expresaban CD69 tanto en la poblacioacuten CD45RA+ (Figs 2C y 2G) como en CD45RO+ (Figs 2D y 2H) 21 y 14 veces respectiva-mente El anaacutelisis de la expresioacuten de CRTAM mostroacute un incremento de 56 y 91 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente Es destacable que tampoco se detec-taron ceacutelulas que expresaran ambos marcadores CD69 y CRTAM en esta muestra El anaacutelisis de la expresioacuten de CD69 y CRTAM mostroacute un incremento de 138 y 104 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente
El anaacutelisis de la poblacioacuten de memoria utilizando la expresioacuten de moleacuteculas CD45RO CCR7 y CD62L permitioacute definir las subpoblaciones TCM y TEM para los compartimentos de ceacutelulas CD4+ y CD8+ El anaacute-lisis mostroacute que la poblacioacuten TCM (CD45RO+ CD62L+ CCR7+) y TEM (CD45RO+ CD62Lminus CCR7minus) estaba representada por una mediana de 341 y 296 en la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ (Tabla 3) mientras que para los CD8+ la mediana de las ceacutelulas TCM fue de 4 y para las TEM de 775 (Tabla 5) Los valores de porcentaje de las poblaciones TCM y TEM se ob-tuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RO+
La determinacioacuten y cuantificacioacuten de las ceacutelulas NK (CD16+ CD56+) (Figs 3A y B) mostroacute una media de 2967 con una mediana de 28 (IC 95 22-3726) en los leucocitos de sangre perifeacuterica (Tabla 7) Los valores obtenidos de las ceacutelulas NK son superiores en el valor de la media en comparacioacuten con lo reportado en estudios realizados en Holanda (media de 14 IC 95 4-51)27 y en China (media de 18 IC 95 1012-2834)28-30
Discusioacuten
Caracterizar y cuantificar las diferentes subpoblacio-nes de linfocitos T en sangre perifeacuterica permitioacute conocer la distribucioacuten (nuacutemeros absolutos y porcentaje) en indi-viduos cliacutenicamente sanos Al analizar la poblacioacuten de linfocitos T CD3+ se observoacute que el uso de CD45RA delimita a las ceacutelulas naiumlve bona fide dentro del compar-timento de ceacutelulas CD4+ Sin embargo para los CD8+ es necesario el uso de marcadores adicionales como CD62L y CCR7 si se desea identificar a la poblacioacuten naiumlve de manera precisa Esto es una diferencia impor-tante a considerar cuando el intereacutes de la cuantificacioacuten de las ceacutelulas naiumlve es determinante en el seguimiento
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Figura 2 Fenotipificacioacuten de la poblacioacuten de linfocitos T activados A partir de las poblaciones CD4+ (A y E) y CD8+ (C y G) que expresaban la moleacutecula CD45RA (naiumlve) se analizoacute la expresioacuten de CD69 y CRTAM (marcadores tempranos de activacioacuten) Se realizoacute el mismo anaacutelisis en las poblaciones CD4+ CD45RO+ (B y F) y CD8+ CD45RO+ (D y H) en una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos (fila superior) y un individuo infectado con el virus Epstein Barr (fila inferior)
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CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
Sin
cont
ar c
on e
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imie
nto
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78
Bol Med Hosp Infant Mex 201976
16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
Sin
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meacutedico podraacute integrar los resultados signos y siacutento-mas para la toma de decisiones terapeacuteuticas conside-rando la presencia de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T asociados con el padecimiento
En el presente trabajo se estandarizoacute un perfil de moleacuteculas de superficie para la caracterizacioacuten de sub-poblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria central y efectora ademaacutes de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos a traveacutes de citometriacutea de flujo
Meacutetodos
Muestras
Se utilizaron muestras de sangre perifeacuterica recolec-tadas en tubos con anticoagulante aacutecido etilendiami-notetraaceacutetico (EDTA) obtenidas por puncioacuten venosa de 20 individuos cliacutenicamente sanos (ICS) de naciona-lidad mexicana quienes no cursaban con un proceso inflamatorio (por ejemplo infecciones neoplasias o que estuvieran bajo tratamiento farmacoloacutegico) A los participantes se les realizoacute un estudio meacutedico para determinar su estado de salud considerando los valo-res de una citometriacutea hemaacutetica y quiacutemica sanguiacutenea que proporcionan los paraacutemetros baacutesicos para la eva-luacioacuten de la funcioacuten hepaacutetica renal y del metabolismo de los carbohidratos y liacutepidos
Para el fenotipo de activacioacuten se utilizoacute la muestra de una paciente (8 antildeos) con diagnoacutestico de infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr con una carga viral de 26000 copiasml en plasma determinada por reac-cioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real
Se realizoacute el conteo celular mediante una citometriacutea hemaacutetica de cada muestra en el equipo LH 780 Beck-man Coulterreg
Inmunofenotipo
Para la tincioacuten de las muestras se utilizaron tres tubos de ensayo de 12 x 75 mm uno para cada panel Se colocaron 5 microl de cada anticuerpo del panel (los anti-cuerpos provienen de BD Biosciencesreg excepto el an-ticuerpo anti-CRTAM de Biolegendreg) y se adicionoacute sangre perifeacuterica completa Para las muestras con una cuenta de leucocitos totales entre 2000 y 13000 ceacutelmicrol se colocaron 50 microl de sangre perifeacuterica completa con EDTA para obtener una cantidad de ceacutelulas apropiada para el nuacutemero de eventos que seraacuten adquiridos
La mezcla se incuboacute por 15 min a temperatura am-biente en oscuridad Posteriormente se agregaron 2 ml
de solucioacuten FACS Lysing (BD Biosciencesreg) y se incu-boacute por 10 min a temperatura ambiente en oscuridad Al finalizar el tiempo se centrifugaron los tubos 5 min a 1800 rpm se decantaron y se lavoacute dos veces el botoacuten celular con 2 ml de FACS Flow Al finalizar se agrega-ron 350 microl de FACS Flow friacuteo (BD Biosciencesreg) para obtener una suspensioacuten celular homogeacutenea
La lectura de las muestras se realizoacute en el citoacutemetro de flujo BD FACS Canto II siguiendo el procedimiento que marca el manual de usuario y cumpliendo los es-taacutendares de calidad establecidos en el laboratorio cliacuteni-co del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez para los ensayos analiacuteticos con fines de diagnoacutestico Breve-mente previo a la adquisicioacuten de las muestras se cali-broacute el equipo y se compensoacute con tinciones independien-tes con cada uno de los fluocromos para su correcta lectura asiacute como ceacutelulas sin tentildeir para ajustar la auto-fluorescencia Se contabilizaron 50000 eventos para la caracterizacioacuten de las diversas poblaciones celulares
Paneles para la fenotipificacioacuten de los linfocitos T
Se seleccionaron los fluorocromos considerando que no se generara ninguacuten traslape en su lectura aprove-chando los tres rayos laacuteser que posee el equipo De la misma manera se seleccionaron los anticuerpos monoclonales
Para el anticuerpo monoclonal CRTAM se seleccio-noacute el fluorocromo ficoeritrina Al ser una moleacutecula de bajos niveles de expresioacuten se prefirioacute utilizar un fluo-rocromo de mayor intensidad para su deteccioacuten
Se realizaron tres paneles celulares diferentes para determinar linfocitos T naiumlve activados efectores de memoria central y memoria efectora (Tabla 1)
Tabla 1 Panel de anticuerpos utilizados en la caracterizacioacuten de las subpoblaciones de linfocitos T
Fluorocromo Panel 1Linfocitos T naiumlve
y de memoria
Panel 2Linfocitos T activados
Panel 3Linfocitos
NK
FITC CD45RA CD45RA
PE CRTAM CRTAM CD16
Percp- Cy 55 CD45RO CD45RO
APC CD62L CD69 CD56
APC H7 CD4 CD4
V450 CD3 CD3 CD3
PE Cy7 CCR7 CD8
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Anaacutelisis de datos
Los resultados fueron analizados en el programa BD FACsDIVAreg Se realizaron los graacuteficos para la identifi-cacioacuten de cada poblacioacuten y una copia electroacutenica de respaldo asiacute como la plantilla del panel
Se construyoacute una base de datos con la cual median-te conversiones de los porcentajes en relacioacuten con los leucocitos totales y linfocitos obtenidos del valor pro-porcionado por el equipo LH 780 Beckman Coulterreg se calcularon los valores absolutos (ceacutelml)
En el caso de las ceacutelulas NK se obtuvo el porcentaje de ceacutelulas CD3minus CD16+ CD56+ en la poblacioacuten de
leucocitos totales y se calculoacute el nuacutemero absoluto de la misma manera Para el anaacutelisis estadiacutestico de las diferentes poblaciones celulares se utilizoacute el programa GraphPad Prismreg 601 para Mac OS X
Resultados
Se analizaron 20 muestras de sangre perifeacuterica pro-venientes de individuos en un rango de edad de 8 a 18 antildeos (con una media de 10 antildeos y 6 meses y una mediana de 10 antildeos) mestizos mexicanos el 75 (15) de sexo masculino
Figura 1 Fenotipificacioacuten de linfocitos T de sangre perifeacuterica A partir de una aliacutecuota de muestra de sangre perifeacuterica se delimitoacute la poblacioacuten de singletes (A) Se determinaron basaacutendose en su tamantildeo (FSC dispersioacuten frontal por sus siglas en ingleacutes forward scatter) y complejidad (SSC dispersioacuten lateral por sus siglas en ingleacutes side scatter) las distintas poblaciones de sangre perifeacuterica linfocitos monocitos y granulocitos (B) Se determinoacute la poblacioacuten CD3+ (C) A partir de esta poblacioacuten se determinaron los linfocitos T CD4+ y CD8+ (D) Se analizoacute la expresioacuten de las moleacuteculas CD45RA (E) y CD45RO (G) como marcadores de naiumlve y memoria respectivamente en la poblacioacuten de linfocitos CD4+ (F) De la poblacioacuten CD45RA (E) aquellas ceacutelulas que expresaran CD62L y CCR7 fueron identificadas como naiumlve y aquellas CD62L- CCR7- como efectoras (F) Mientras que el anaacutelisis de la expresioacuten de ambas moleacuteculas en las ceacutelulas CD45RO+ (G) permitioacute la identificacioacuten de las ceacutelulas de memoria central (TCM) y memoria efectora (TEM) (H) El mismo anaacutelisis se realizoacute para los linfocitos CD8+ (I-L) Las imaacutegenes mostradas provienen de un individuo y son representativas del resto de participantes incluidos en el estudio
A
E
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Tabla 4 Valores (ceacutelulasml) de las subpoblaciones de linfocitos T CD8+ en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutesticofenotipo celular
Linfocitos CD8+ Cel
mL
Linfocitos CD8+ CD45RA+
CelmL
Linfocitos CD8+ naiumlve
CelmL
Linfocitos CD8+ efectores
CelmL
Linfocitos CD8+ CD45RO+
CelmL
Linfocitos CD8+ TCM
CelmL
Linfocitos CD8+ TEM
CelmL
Valor miacutenimo 36186 23232 13219 2741 12738 446 979
Percentil 25 78397 41514 17440 1882 19731 719 11024
Mediana 109396 68644 35240 6974 35035 1931 25275
Percentil 75 196850 154529 63307 11171 53473 4201 38052
Valor maacuteximo 542299 380694 148283 33882 157267 14592 125656
Media 155947 110535 51990 9625 43701 3218 30863
Desviacioacuten estaacutendar 126536 102996 45445 9910 33907 3607 29568
Error estaacutendar 28294 23031 10712 2216 7582 8064 6612
IC 95 valor bajo 96725 62331 29390 4987 27832 1530 17024
IC 95 valor alto 215168 158739 74589 14262 59570 4906 44701
IC intervalo de confianza TCM ceacutelulas T de memoria central TEM ceacutelulas T de memoria efectora
El fenotipo de linfocitos T activados se definioacute como aquellas ceacutelulas que expresaran CD69 un marcador de activacioacuten temprana y CRTAM una moleacutecula reciente-mente descrita y asociada con el estado de activacioacuten La determinacioacuten de este fenotipo se realizoacute tanto en las poblaciones CD45RA+ como CD45RO+ con la fina-lidad de calcular las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) activadas recientemente y las activadasmemoria (CD45RO+) pos-terior a su reactivacioacuten El anaacutelisis de las ceacutelulas con fenotipo de activacioacuten mostroacute que en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ existe una poblacioacuten discreta de ceacutelulas CD45RA+ y CD45RO+ que expresan CD69 y escasas ceacutelulas CRTAM+ (Fig 2) Cabe destacar que no se detectaron ceacutelulas que mostraran coexpresioacuten de CD69 y CRTAM (Fig 2 y Tabla 6)
Considerando que las muestras proveniacutean de indivi-duos cliacutenicamente sanos se analizoacute ademaacutes una muestra de un paciente que cursaba con una infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr (VEB) Se observoacute que en la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ en el com-partimento CD45RA+ existiacutea un aumento de 285 ve-ces de ceacutelulas CD69+ (Figs 2A y 2E) mientras que en la poblacioacuten CD45RO+ este aumento fue de 21 veces (Figs 2B y 2F) comparado con lo observado en los ICS Por otro lado en las ceacutelulas CRTAM+ se observoacute un incremento muy importante de aproximadamente 89 veces en las ceacutelulas CD45RA+ (Figs 2A y 2E) y de 76 veces en la poblacioacuten CD45RO+ (Figs 2B y 2F) con respecto a lo observado en los ICS mostrando una diferencia importante en presencia de un estiacutemulo
A partir de la delimitacioacuten de los eventos sencillos (Fig 1A) se consideraron las caracteriacutesticas de tamantildeo y complejidad para seleccionar las ceacutelulas vivas (Fig 1B) Posteriormente se definioacute la poblacioacuten de linfocitos T basaacutendose en la expresioacuten de la moleacutecula CD3 (Fig 1C) a partir de esta se realizoacute la comparta-mentalizacioacuten de ceacutelulas CD4+ y CD8+ (Fig 1D) La mediana del porcentaje de linfocitos T CD3+ fue del 20 inferior a lo reportado en poblacioacuten pediaacutetrica27 En esta regioacuten las poblaciones CD4+ y CD8+ fueron del 553 y 475 respectivamente y se obtuvo una relacioacuten CD4CD8 de 124 similar a lo reportado anteriormente25
Se analizaron los diferentes perfiles celulares en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ esto es lin-focitos naiumlve efectores memoria central y memoria efectora (Figs 1E-L) Utilizando un perfil de expresioacuten de CD45RA+ CCR7+ CD62L+ se determinoacute la fre-cuencia y el nuacutemero absoluto de linfocitos T naiumlve y los valores de la mediana obtenidos de 9260 y 6780 para los linfocitos T CD4+ y CD8+ respectivamente (Tablas 2 a 5) Los valores de porcentaje de las pobla-ciones naiumlve y efectores se obtuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RA+
Utilizando el mismo panel de tincioacuten es posible de-finir las ceacutelulas efectoras CD45RA+ CCR7minus CD62Lminus en cada una de las subpoblaciones Se calculoacute un por-centaje de 146 y 88 de la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresan CD45RA+ respectiva-mente (Tablas 3 y 5)
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I Parra-Ortega et al Subpoblaciones de linfocitos T
cliacutenico del paciente como puede ser el monitoreo de receptores de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacuteticas
La diferencia en los porcentajes obtenidos en el pre-sente trabajo en comparacioacuten con otros radica princi-palmente en que las subpoblaciones fueron calculadas en la poblacioacuten parental es decir CD45RA+ CD4+ o CD8+ naiumlve activados efectores y CD45RO+ CD4+ o CD8+ TCM y TEM y el valor absoluto calculado ba-saacutendose en los leucocitos totales
La presencia de ceacutelulas activadas es escasa en am-bos compartimentos tanto CD45RA como CD45RO para las poblaciones CD4+ y CD8+ Esto era esperado pues los participantes no presentaban signos ni siacutento-mas asociados a procesos infecciosos agudos Esta observacioacuten es congruente con la presencia discreta de la poblacioacuten de ceacutelulas efectoras La deteccioacuten de estas ceacutelulas en ICS se debe al contacto continuo con microorganismos (aun en ausencia de signos y siacutento-mas cliacutenicos que sugieran un proceso infeccioso agu-do) que induce la respuesta inmunitaria adaptativa y despueacutes de limitar la infeccioacuten a traveacutes de sus funcio-nes efectoras su eliminacioacuten mediante apoptosis Cabe destacar que la frecuencia de ceacutelulas efectoras es ma-yor en la poblacioacuten CD8+ que en las ceacutelulas CD4+
El anaacutelisis de las poblaciones de memoria TCM y TEM en las ceacutelulas CD4+ mostroacute un mayor porcentaje de las primeras Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observa un mayor porcentaje de TEM comparado con las TCM En la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ la presencia de una mayor subpoblacioacuten de TCM permitiriacutea tener una reserva de precursores de TEM que cooperariacutea con los linfocitos B para generacioacuten de anticuerpos y el desempentildeo de su capacidad efectora per se En las ceacutelulas CD8+ la poblacioacuten de ceacutelulas TEM se encuen-tran en mayor nuacutemero lo cual permite una actuacioacuten pronta y eficiente (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) ante infecciones intrace-lulares comparada con las generadas a partir de las ceacutelulas naiumlve activadas Es importante enfatizar que las poblaciones naiumlve y de memoria sufren modificaciones a lo largo de la vida pues la generacioacuten de linfocitos T naiumlve se encuentra reducida al depender del timo un oacutergano que involuciona por lo que disminuye el nuacutemero de linfocitos T naiumlve en periferia531 La pobla-cioacuten de ceacutelulas de memoria sufre modificaciones du-rante los encuentros con diferentes patoacutegenos lo que modifica el repertorio y las subpoblaciones TCM y TEM del mismo compartimento
Es importante establecer un sistema de anaacutelisis que comprenda la eleccioacuten de las moleacuteculas que definiraacuten las poblaciones de intereacutes asiacute como la determinacioacuten
antigeacutenico que induce la activacioacuten de las ceacutelulas T en este caso el VEB
Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observoacute un incremento en aquellas que expresaban CD69 tanto en la poblacioacuten CD45RA+ (Figs 2C y 2G) como en CD45RO+ (Figs 2D y 2H) 21 y 14 veces respectiva-mente El anaacutelisis de la expresioacuten de CRTAM mostroacute un incremento de 56 y 91 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente Es destacable que tampoco se detec-taron ceacutelulas que expresaran ambos marcadores CD69 y CRTAM en esta muestra El anaacutelisis de la expresioacuten de CD69 y CRTAM mostroacute un incremento de 138 y 104 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente
El anaacutelisis de la poblacioacuten de memoria utilizando la expresioacuten de moleacuteculas CD45RO CCR7 y CD62L permitioacute definir las subpoblaciones TCM y TEM para los compartimentos de ceacutelulas CD4+ y CD8+ El anaacute-lisis mostroacute que la poblacioacuten TCM (CD45RO+ CD62L+ CCR7+) y TEM (CD45RO+ CD62Lminus CCR7minus) estaba representada por una mediana de 341 y 296 en la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ (Tabla 3) mientras que para los CD8+ la mediana de las ceacutelulas TCM fue de 4 y para las TEM de 775 (Tabla 5) Los valores de porcentaje de las poblaciones TCM y TEM se ob-tuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RO+
La determinacioacuten y cuantificacioacuten de las ceacutelulas NK (CD16+ CD56+) (Figs 3A y B) mostroacute una media de 2967 con una mediana de 28 (IC 95 22-3726) en los leucocitos de sangre perifeacuterica (Tabla 7) Los valores obtenidos de las ceacutelulas NK son superiores en el valor de la media en comparacioacuten con lo reportado en estudios realizados en Holanda (media de 14 IC 95 4-51)27 y en China (media de 18 IC 95 1012-2834)28-30
Discusioacuten
Caracterizar y cuantificar las diferentes subpoblacio-nes de linfocitos T en sangre perifeacuterica permitioacute conocer la distribucioacuten (nuacutemeros absolutos y porcentaje) en indi-viduos cliacutenicamente sanos Al analizar la poblacioacuten de linfocitos T CD3+ se observoacute que el uso de CD45RA delimita a las ceacutelulas naiumlve bona fide dentro del compar-timento de ceacutelulas CD4+ Sin embargo para los CD8+ es necesario el uso de marcadores adicionales como CD62L y CCR7 si se desea identificar a la poblacioacuten naiumlve de manera precisa Esto es una diferencia impor-tante a considerar cuando el intereacutes de la cuantificacioacuten de las ceacutelulas naiumlve es determinante en el seguimiento
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Figura 2 Fenotipificacioacuten de la poblacioacuten de linfocitos T activados A partir de las poblaciones CD4+ (A y E) y CD8+ (C y G) que expresaban la moleacutecula CD45RA (naiumlve) se analizoacute la expresioacuten de CD69 y CRTAM (marcadores tempranos de activacioacuten) Se realizoacute el mismo anaacutelisis en las poblaciones CD4+ CD45RO+ (B y F) y CD8+ CD45RO+ (D y H) en una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos (fila superior) y un individuo infectado con el virus Epstein Barr (fila inferior)
A
E
B
F
C
G
D
H
CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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I Parra-Ortega et al Subpoblaciones de linfocitos T
edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
Sin
cont
ar c
on e
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sent
imie
nto
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2019
78
Bol Med Hosp Infant Mex 201976
16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
Sin
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ar c
on e
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Anaacutelisis de datos
Los resultados fueron analizados en el programa BD FACsDIVAreg Se realizaron los graacuteficos para la identifi-cacioacuten de cada poblacioacuten y una copia electroacutenica de respaldo asiacute como la plantilla del panel
Se construyoacute una base de datos con la cual median-te conversiones de los porcentajes en relacioacuten con los leucocitos totales y linfocitos obtenidos del valor pro-porcionado por el equipo LH 780 Beckman Coulterreg se calcularon los valores absolutos (ceacutelml)
En el caso de las ceacutelulas NK se obtuvo el porcentaje de ceacutelulas CD3minus CD16+ CD56+ en la poblacioacuten de
leucocitos totales y se calculoacute el nuacutemero absoluto de la misma manera Para el anaacutelisis estadiacutestico de las diferentes poblaciones celulares se utilizoacute el programa GraphPad Prismreg 601 para Mac OS X
Resultados
Se analizaron 20 muestras de sangre perifeacuterica pro-venientes de individuos en un rango de edad de 8 a 18 antildeos (con una media de 10 antildeos y 6 meses y una mediana de 10 antildeos) mestizos mexicanos el 75 (15) de sexo masculino
Figura 1 Fenotipificacioacuten de linfocitos T de sangre perifeacuterica A partir de una aliacutecuota de muestra de sangre perifeacuterica se delimitoacute la poblacioacuten de singletes (A) Se determinaron basaacutendose en su tamantildeo (FSC dispersioacuten frontal por sus siglas en ingleacutes forward scatter) y complejidad (SSC dispersioacuten lateral por sus siglas en ingleacutes side scatter) las distintas poblaciones de sangre perifeacuterica linfocitos monocitos y granulocitos (B) Se determinoacute la poblacioacuten CD3+ (C) A partir de esta poblacioacuten se determinaron los linfocitos T CD4+ y CD8+ (D) Se analizoacute la expresioacuten de las moleacuteculas CD45RA (E) y CD45RO (G) como marcadores de naiumlve y memoria respectivamente en la poblacioacuten de linfocitos CD4+ (F) De la poblacioacuten CD45RA (E) aquellas ceacutelulas que expresaran CD62L y CCR7 fueron identificadas como naiumlve y aquellas CD62L- CCR7- como efectoras (F) Mientras que el anaacutelisis de la expresioacuten de ambas moleacuteculas en las ceacutelulas CD45RO+ (G) permitioacute la identificacioacuten de las ceacutelulas de memoria central (TCM) y memoria efectora (TEM) (H) El mismo anaacutelisis se realizoacute para los linfocitos CD8+ (I-L) Las imaacutegenes mostradas provienen de un individuo y son representativas del resto de participantes incluidos en el estudio
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Tabla 4 Valores (ceacutelulasml) de las subpoblaciones de linfocitos T CD8+ en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutesticofenotipo celular
Linfocitos CD8+ Cel
mL
Linfocitos CD8+ CD45RA+
CelmL
Linfocitos CD8+ naiumlve
CelmL
Linfocitos CD8+ efectores
CelmL
Linfocitos CD8+ CD45RO+
CelmL
Linfocitos CD8+ TCM
CelmL
Linfocitos CD8+ TEM
CelmL
Valor miacutenimo 36186 23232 13219 2741 12738 446 979
Percentil 25 78397 41514 17440 1882 19731 719 11024
Mediana 109396 68644 35240 6974 35035 1931 25275
Percentil 75 196850 154529 63307 11171 53473 4201 38052
Valor maacuteximo 542299 380694 148283 33882 157267 14592 125656
Media 155947 110535 51990 9625 43701 3218 30863
Desviacioacuten estaacutendar 126536 102996 45445 9910 33907 3607 29568
Error estaacutendar 28294 23031 10712 2216 7582 8064 6612
IC 95 valor bajo 96725 62331 29390 4987 27832 1530 17024
IC 95 valor alto 215168 158739 74589 14262 59570 4906 44701
IC intervalo de confianza TCM ceacutelulas T de memoria central TEM ceacutelulas T de memoria efectora
El fenotipo de linfocitos T activados se definioacute como aquellas ceacutelulas que expresaran CD69 un marcador de activacioacuten temprana y CRTAM una moleacutecula reciente-mente descrita y asociada con el estado de activacioacuten La determinacioacuten de este fenotipo se realizoacute tanto en las poblaciones CD45RA+ como CD45RO+ con la fina-lidad de calcular las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) activadas recientemente y las activadasmemoria (CD45RO+) pos-terior a su reactivacioacuten El anaacutelisis de las ceacutelulas con fenotipo de activacioacuten mostroacute que en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ existe una poblacioacuten discreta de ceacutelulas CD45RA+ y CD45RO+ que expresan CD69 y escasas ceacutelulas CRTAM+ (Fig 2) Cabe destacar que no se detectaron ceacutelulas que mostraran coexpresioacuten de CD69 y CRTAM (Fig 2 y Tabla 6)
Considerando que las muestras proveniacutean de indivi-duos cliacutenicamente sanos se analizoacute ademaacutes una muestra de un paciente que cursaba con una infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr (VEB) Se observoacute que en la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ en el com-partimento CD45RA+ existiacutea un aumento de 285 ve-ces de ceacutelulas CD69+ (Figs 2A y 2E) mientras que en la poblacioacuten CD45RO+ este aumento fue de 21 veces (Figs 2B y 2F) comparado con lo observado en los ICS Por otro lado en las ceacutelulas CRTAM+ se observoacute un incremento muy importante de aproximadamente 89 veces en las ceacutelulas CD45RA+ (Figs 2A y 2E) y de 76 veces en la poblacioacuten CD45RO+ (Figs 2B y 2F) con respecto a lo observado en los ICS mostrando una diferencia importante en presencia de un estiacutemulo
A partir de la delimitacioacuten de los eventos sencillos (Fig 1A) se consideraron las caracteriacutesticas de tamantildeo y complejidad para seleccionar las ceacutelulas vivas (Fig 1B) Posteriormente se definioacute la poblacioacuten de linfocitos T basaacutendose en la expresioacuten de la moleacutecula CD3 (Fig 1C) a partir de esta se realizoacute la comparta-mentalizacioacuten de ceacutelulas CD4+ y CD8+ (Fig 1D) La mediana del porcentaje de linfocitos T CD3+ fue del 20 inferior a lo reportado en poblacioacuten pediaacutetrica27 En esta regioacuten las poblaciones CD4+ y CD8+ fueron del 553 y 475 respectivamente y se obtuvo una relacioacuten CD4CD8 de 124 similar a lo reportado anteriormente25
Se analizaron los diferentes perfiles celulares en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ esto es lin-focitos naiumlve efectores memoria central y memoria efectora (Figs 1E-L) Utilizando un perfil de expresioacuten de CD45RA+ CCR7+ CD62L+ se determinoacute la fre-cuencia y el nuacutemero absoluto de linfocitos T naiumlve y los valores de la mediana obtenidos de 9260 y 6780 para los linfocitos T CD4+ y CD8+ respectivamente (Tablas 2 a 5) Los valores de porcentaje de las pobla-ciones naiumlve y efectores se obtuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RA+
Utilizando el mismo panel de tincioacuten es posible de-finir las ceacutelulas efectoras CD45RA+ CCR7minus CD62Lminus en cada una de las subpoblaciones Se calculoacute un por-centaje de 146 y 88 de la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresan CD45RA+ respectiva-mente (Tablas 3 y 5)
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cliacutenico del paciente como puede ser el monitoreo de receptores de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacuteticas
La diferencia en los porcentajes obtenidos en el pre-sente trabajo en comparacioacuten con otros radica princi-palmente en que las subpoblaciones fueron calculadas en la poblacioacuten parental es decir CD45RA+ CD4+ o CD8+ naiumlve activados efectores y CD45RO+ CD4+ o CD8+ TCM y TEM y el valor absoluto calculado ba-saacutendose en los leucocitos totales
La presencia de ceacutelulas activadas es escasa en am-bos compartimentos tanto CD45RA como CD45RO para las poblaciones CD4+ y CD8+ Esto era esperado pues los participantes no presentaban signos ni siacutento-mas asociados a procesos infecciosos agudos Esta observacioacuten es congruente con la presencia discreta de la poblacioacuten de ceacutelulas efectoras La deteccioacuten de estas ceacutelulas en ICS se debe al contacto continuo con microorganismos (aun en ausencia de signos y siacutento-mas cliacutenicos que sugieran un proceso infeccioso agu-do) que induce la respuesta inmunitaria adaptativa y despueacutes de limitar la infeccioacuten a traveacutes de sus funcio-nes efectoras su eliminacioacuten mediante apoptosis Cabe destacar que la frecuencia de ceacutelulas efectoras es ma-yor en la poblacioacuten CD8+ que en las ceacutelulas CD4+
El anaacutelisis de las poblaciones de memoria TCM y TEM en las ceacutelulas CD4+ mostroacute un mayor porcentaje de las primeras Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observa un mayor porcentaje de TEM comparado con las TCM En la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ la presencia de una mayor subpoblacioacuten de TCM permitiriacutea tener una reserva de precursores de TEM que cooperariacutea con los linfocitos B para generacioacuten de anticuerpos y el desempentildeo de su capacidad efectora per se En las ceacutelulas CD8+ la poblacioacuten de ceacutelulas TEM se encuen-tran en mayor nuacutemero lo cual permite una actuacioacuten pronta y eficiente (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) ante infecciones intrace-lulares comparada con las generadas a partir de las ceacutelulas naiumlve activadas Es importante enfatizar que las poblaciones naiumlve y de memoria sufren modificaciones a lo largo de la vida pues la generacioacuten de linfocitos T naiumlve se encuentra reducida al depender del timo un oacutergano que involuciona por lo que disminuye el nuacutemero de linfocitos T naiumlve en periferia531 La pobla-cioacuten de ceacutelulas de memoria sufre modificaciones du-rante los encuentros con diferentes patoacutegenos lo que modifica el repertorio y las subpoblaciones TCM y TEM del mismo compartimento
Es importante establecer un sistema de anaacutelisis que comprenda la eleccioacuten de las moleacuteculas que definiraacuten las poblaciones de intereacutes asiacute como la determinacioacuten
antigeacutenico que induce la activacioacuten de las ceacutelulas T en este caso el VEB
Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observoacute un incremento en aquellas que expresaban CD69 tanto en la poblacioacuten CD45RA+ (Figs 2C y 2G) como en CD45RO+ (Figs 2D y 2H) 21 y 14 veces respectiva-mente El anaacutelisis de la expresioacuten de CRTAM mostroacute un incremento de 56 y 91 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente Es destacable que tampoco se detec-taron ceacutelulas que expresaran ambos marcadores CD69 y CRTAM en esta muestra El anaacutelisis de la expresioacuten de CD69 y CRTAM mostroacute un incremento de 138 y 104 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente
El anaacutelisis de la poblacioacuten de memoria utilizando la expresioacuten de moleacuteculas CD45RO CCR7 y CD62L permitioacute definir las subpoblaciones TCM y TEM para los compartimentos de ceacutelulas CD4+ y CD8+ El anaacute-lisis mostroacute que la poblacioacuten TCM (CD45RO+ CD62L+ CCR7+) y TEM (CD45RO+ CD62Lminus CCR7minus) estaba representada por una mediana de 341 y 296 en la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ (Tabla 3) mientras que para los CD8+ la mediana de las ceacutelulas TCM fue de 4 y para las TEM de 775 (Tabla 5) Los valores de porcentaje de las poblaciones TCM y TEM se ob-tuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RO+
La determinacioacuten y cuantificacioacuten de las ceacutelulas NK (CD16+ CD56+) (Figs 3A y B) mostroacute una media de 2967 con una mediana de 28 (IC 95 22-3726) en los leucocitos de sangre perifeacuterica (Tabla 7) Los valores obtenidos de las ceacutelulas NK son superiores en el valor de la media en comparacioacuten con lo reportado en estudios realizados en Holanda (media de 14 IC 95 4-51)27 y en China (media de 18 IC 95 1012-2834)28-30
Discusioacuten
Caracterizar y cuantificar las diferentes subpoblacio-nes de linfocitos T en sangre perifeacuterica permitioacute conocer la distribucioacuten (nuacutemeros absolutos y porcentaje) en indi-viduos cliacutenicamente sanos Al analizar la poblacioacuten de linfocitos T CD3+ se observoacute que el uso de CD45RA delimita a las ceacutelulas naiumlve bona fide dentro del compar-timento de ceacutelulas CD4+ Sin embargo para los CD8+ es necesario el uso de marcadores adicionales como CD62L y CCR7 si se desea identificar a la poblacioacuten naiumlve de manera precisa Esto es una diferencia impor-tante a considerar cuando el intereacutes de la cuantificacioacuten de las ceacutelulas naiumlve es determinante en el seguimiento
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Figura 2 Fenotipificacioacuten de la poblacioacuten de linfocitos T activados A partir de las poblaciones CD4+ (A y E) y CD8+ (C y G) que expresaban la moleacutecula CD45RA (naiumlve) se analizoacute la expresioacuten de CD69 y CRTAM (marcadores tempranos de activacioacuten) Se realizoacute el mismo anaacutelisis en las poblaciones CD4+ CD45RO+ (B y F) y CD8+ CD45RO+ (D y H) en una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos (fila superior) y un individuo infectado con el virus Epstein Barr (fila inferior)
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CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
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16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
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Anaacutelisis de datos
Los resultados fueron analizados en el programa BD FACsDIVAreg Se realizaron los graacuteficos para la identifi-cacioacuten de cada poblacioacuten y una copia electroacutenica de respaldo asiacute como la plantilla del panel
Se construyoacute una base de datos con la cual median-te conversiones de los porcentajes en relacioacuten con los leucocitos totales y linfocitos obtenidos del valor pro-porcionado por el equipo LH 780 Beckman Coulterreg se calcularon los valores absolutos (ceacutelml)
En el caso de las ceacutelulas NK se obtuvo el porcentaje de ceacutelulas CD3minus CD16+ CD56+ en la poblacioacuten de
leucocitos totales y se calculoacute el nuacutemero absoluto de la misma manera Para el anaacutelisis estadiacutestico de las diferentes poblaciones celulares se utilizoacute el programa GraphPad Prismreg 601 para Mac OS X
Resultados
Se analizaron 20 muestras de sangre perifeacuterica pro-venientes de individuos en un rango de edad de 8 a 18 antildeos (con una media de 10 antildeos y 6 meses y una mediana de 10 antildeos) mestizos mexicanos el 75 (15) de sexo masculino
Figura 1 Fenotipificacioacuten de linfocitos T de sangre perifeacuterica A partir de una aliacutecuota de muestra de sangre perifeacuterica se delimitoacute la poblacioacuten de singletes (A) Se determinaron basaacutendose en su tamantildeo (FSC dispersioacuten frontal por sus siglas en ingleacutes forward scatter) y complejidad (SSC dispersioacuten lateral por sus siglas en ingleacutes side scatter) las distintas poblaciones de sangre perifeacuterica linfocitos monocitos y granulocitos (B) Se determinoacute la poblacioacuten CD3+ (C) A partir de esta poblacioacuten se determinaron los linfocitos T CD4+ y CD8+ (D) Se analizoacute la expresioacuten de las moleacuteculas CD45RA (E) y CD45RO (G) como marcadores de naiumlve y memoria respectivamente en la poblacioacuten de linfocitos CD4+ (F) De la poblacioacuten CD45RA (E) aquellas ceacutelulas que expresaran CD62L y CCR7 fueron identificadas como naiumlve y aquellas CD62L- CCR7- como efectoras (F) Mientras que el anaacutelisis de la expresioacuten de ambas moleacuteculas en las ceacutelulas CD45RO+ (G) permitioacute la identificacioacuten de las ceacutelulas de memoria central (TCM) y memoria efectora (TEM) (H) El mismo anaacutelisis se realizoacute para los linfocitos CD8+ (I-L) Las imaacutegenes mostradas provienen de un individuo y son representativas del resto de participantes incluidos en el estudio
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Tabla 4 Valores (ceacutelulasml) de las subpoblaciones de linfocitos T CD8+ en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutesticofenotipo celular
Linfocitos CD8+ Cel
mL
Linfocitos CD8+ CD45RA+
CelmL
Linfocitos CD8+ naiumlve
CelmL
Linfocitos CD8+ efectores
CelmL
Linfocitos CD8+ CD45RO+
CelmL
Linfocitos CD8+ TCM
CelmL
Linfocitos CD8+ TEM
CelmL
Valor miacutenimo 36186 23232 13219 2741 12738 446 979
Percentil 25 78397 41514 17440 1882 19731 719 11024
Mediana 109396 68644 35240 6974 35035 1931 25275
Percentil 75 196850 154529 63307 11171 53473 4201 38052
Valor maacuteximo 542299 380694 148283 33882 157267 14592 125656
Media 155947 110535 51990 9625 43701 3218 30863
Desviacioacuten estaacutendar 126536 102996 45445 9910 33907 3607 29568
Error estaacutendar 28294 23031 10712 2216 7582 8064 6612
IC 95 valor bajo 96725 62331 29390 4987 27832 1530 17024
IC 95 valor alto 215168 158739 74589 14262 59570 4906 44701
IC intervalo de confianza TCM ceacutelulas T de memoria central TEM ceacutelulas T de memoria efectora
El fenotipo de linfocitos T activados se definioacute como aquellas ceacutelulas que expresaran CD69 un marcador de activacioacuten temprana y CRTAM una moleacutecula reciente-mente descrita y asociada con el estado de activacioacuten La determinacioacuten de este fenotipo se realizoacute tanto en las poblaciones CD45RA+ como CD45RO+ con la fina-lidad de calcular las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) activadas recientemente y las activadasmemoria (CD45RO+) pos-terior a su reactivacioacuten El anaacutelisis de las ceacutelulas con fenotipo de activacioacuten mostroacute que en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ existe una poblacioacuten discreta de ceacutelulas CD45RA+ y CD45RO+ que expresan CD69 y escasas ceacutelulas CRTAM+ (Fig 2) Cabe destacar que no se detectaron ceacutelulas que mostraran coexpresioacuten de CD69 y CRTAM (Fig 2 y Tabla 6)
Considerando que las muestras proveniacutean de indivi-duos cliacutenicamente sanos se analizoacute ademaacutes una muestra de un paciente que cursaba con una infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr (VEB) Se observoacute que en la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ en el com-partimento CD45RA+ existiacutea un aumento de 285 ve-ces de ceacutelulas CD69+ (Figs 2A y 2E) mientras que en la poblacioacuten CD45RO+ este aumento fue de 21 veces (Figs 2B y 2F) comparado con lo observado en los ICS Por otro lado en las ceacutelulas CRTAM+ se observoacute un incremento muy importante de aproximadamente 89 veces en las ceacutelulas CD45RA+ (Figs 2A y 2E) y de 76 veces en la poblacioacuten CD45RO+ (Figs 2B y 2F) con respecto a lo observado en los ICS mostrando una diferencia importante en presencia de un estiacutemulo
A partir de la delimitacioacuten de los eventos sencillos (Fig 1A) se consideraron las caracteriacutesticas de tamantildeo y complejidad para seleccionar las ceacutelulas vivas (Fig 1B) Posteriormente se definioacute la poblacioacuten de linfocitos T basaacutendose en la expresioacuten de la moleacutecula CD3 (Fig 1C) a partir de esta se realizoacute la comparta-mentalizacioacuten de ceacutelulas CD4+ y CD8+ (Fig 1D) La mediana del porcentaje de linfocitos T CD3+ fue del 20 inferior a lo reportado en poblacioacuten pediaacutetrica27 En esta regioacuten las poblaciones CD4+ y CD8+ fueron del 553 y 475 respectivamente y se obtuvo una relacioacuten CD4CD8 de 124 similar a lo reportado anteriormente25
Se analizaron los diferentes perfiles celulares en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ esto es lin-focitos naiumlve efectores memoria central y memoria efectora (Figs 1E-L) Utilizando un perfil de expresioacuten de CD45RA+ CCR7+ CD62L+ se determinoacute la fre-cuencia y el nuacutemero absoluto de linfocitos T naiumlve y los valores de la mediana obtenidos de 9260 y 6780 para los linfocitos T CD4+ y CD8+ respectivamente (Tablas 2 a 5) Los valores de porcentaje de las pobla-ciones naiumlve y efectores se obtuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RA+
Utilizando el mismo panel de tincioacuten es posible de-finir las ceacutelulas efectoras CD45RA+ CCR7minus CD62Lminus en cada una de las subpoblaciones Se calculoacute un por-centaje de 146 y 88 de la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresan CD45RA+ respectiva-mente (Tablas 3 y 5)
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cliacutenico del paciente como puede ser el monitoreo de receptores de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacuteticas
La diferencia en los porcentajes obtenidos en el pre-sente trabajo en comparacioacuten con otros radica princi-palmente en que las subpoblaciones fueron calculadas en la poblacioacuten parental es decir CD45RA+ CD4+ o CD8+ naiumlve activados efectores y CD45RO+ CD4+ o CD8+ TCM y TEM y el valor absoluto calculado ba-saacutendose en los leucocitos totales
La presencia de ceacutelulas activadas es escasa en am-bos compartimentos tanto CD45RA como CD45RO para las poblaciones CD4+ y CD8+ Esto era esperado pues los participantes no presentaban signos ni siacutento-mas asociados a procesos infecciosos agudos Esta observacioacuten es congruente con la presencia discreta de la poblacioacuten de ceacutelulas efectoras La deteccioacuten de estas ceacutelulas en ICS se debe al contacto continuo con microorganismos (aun en ausencia de signos y siacutento-mas cliacutenicos que sugieran un proceso infeccioso agu-do) que induce la respuesta inmunitaria adaptativa y despueacutes de limitar la infeccioacuten a traveacutes de sus funcio-nes efectoras su eliminacioacuten mediante apoptosis Cabe destacar que la frecuencia de ceacutelulas efectoras es ma-yor en la poblacioacuten CD8+ que en las ceacutelulas CD4+
El anaacutelisis de las poblaciones de memoria TCM y TEM en las ceacutelulas CD4+ mostroacute un mayor porcentaje de las primeras Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observa un mayor porcentaje de TEM comparado con las TCM En la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ la presencia de una mayor subpoblacioacuten de TCM permitiriacutea tener una reserva de precursores de TEM que cooperariacutea con los linfocitos B para generacioacuten de anticuerpos y el desempentildeo de su capacidad efectora per se En las ceacutelulas CD8+ la poblacioacuten de ceacutelulas TEM se encuen-tran en mayor nuacutemero lo cual permite una actuacioacuten pronta y eficiente (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) ante infecciones intrace-lulares comparada con las generadas a partir de las ceacutelulas naiumlve activadas Es importante enfatizar que las poblaciones naiumlve y de memoria sufren modificaciones a lo largo de la vida pues la generacioacuten de linfocitos T naiumlve se encuentra reducida al depender del timo un oacutergano que involuciona por lo que disminuye el nuacutemero de linfocitos T naiumlve en periferia531 La pobla-cioacuten de ceacutelulas de memoria sufre modificaciones du-rante los encuentros con diferentes patoacutegenos lo que modifica el repertorio y las subpoblaciones TCM y TEM del mismo compartimento
Es importante establecer un sistema de anaacutelisis que comprenda la eleccioacuten de las moleacuteculas que definiraacuten las poblaciones de intereacutes asiacute como la determinacioacuten
antigeacutenico que induce la activacioacuten de las ceacutelulas T en este caso el VEB
Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observoacute un incremento en aquellas que expresaban CD69 tanto en la poblacioacuten CD45RA+ (Figs 2C y 2G) como en CD45RO+ (Figs 2D y 2H) 21 y 14 veces respectiva-mente El anaacutelisis de la expresioacuten de CRTAM mostroacute un incremento de 56 y 91 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente Es destacable que tampoco se detec-taron ceacutelulas que expresaran ambos marcadores CD69 y CRTAM en esta muestra El anaacutelisis de la expresioacuten de CD69 y CRTAM mostroacute un incremento de 138 y 104 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente
El anaacutelisis de la poblacioacuten de memoria utilizando la expresioacuten de moleacuteculas CD45RO CCR7 y CD62L permitioacute definir las subpoblaciones TCM y TEM para los compartimentos de ceacutelulas CD4+ y CD8+ El anaacute-lisis mostroacute que la poblacioacuten TCM (CD45RO+ CD62L+ CCR7+) y TEM (CD45RO+ CD62Lminus CCR7minus) estaba representada por una mediana de 341 y 296 en la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ (Tabla 3) mientras que para los CD8+ la mediana de las ceacutelulas TCM fue de 4 y para las TEM de 775 (Tabla 5) Los valores de porcentaje de las poblaciones TCM y TEM se ob-tuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RO+
La determinacioacuten y cuantificacioacuten de las ceacutelulas NK (CD16+ CD56+) (Figs 3A y B) mostroacute una media de 2967 con una mediana de 28 (IC 95 22-3726) en los leucocitos de sangre perifeacuterica (Tabla 7) Los valores obtenidos de las ceacutelulas NK son superiores en el valor de la media en comparacioacuten con lo reportado en estudios realizados en Holanda (media de 14 IC 95 4-51)27 y en China (media de 18 IC 95 1012-2834)28-30
Discusioacuten
Caracterizar y cuantificar las diferentes subpoblacio-nes de linfocitos T en sangre perifeacuterica permitioacute conocer la distribucioacuten (nuacutemeros absolutos y porcentaje) en indi-viduos cliacutenicamente sanos Al analizar la poblacioacuten de linfocitos T CD3+ se observoacute que el uso de CD45RA delimita a las ceacutelulas naiumlve bona fide dentro del compar-timento de ceacutelulas CD4+ Sin embargo para los CD8+ es necesario el uso de marcadores adicionales como CD62L y CCR7 si se desea identificar a la poblacioacuten naiumlve de manera precisa Esto es una diferencia impor-tante a considerar cuando el intereacutes de la cuantificacioacuten de las ceacutelulas naiumlve es determinante en el seguimiento
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Figura 2 Fenotipificacioacuten de la poblacioacuten de linfocitos T activados A partir de las poblaciones CD4+ (A y E) y CD8+ (C y G) que expresaban la moleacutecula CD45RA (naiumlve) se analizoacute la expresioacuten de CD69 y CRTAM (marcadores tempranos de activacioacuten) Se realizoacute el mismo anaacutelisis en las poblaciones CD4+ CD45RO+ (B y F) y CD8+ CD45RO+ (D y H) en una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos (fila superior) y un individuo infectado con el virus Epstein Barr (fila inferior)
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CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
Sin
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Per
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2019
78
Bol Med Hosp Infant Mex 201976
16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
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Tabla 4 Valores (ceacutelulasml) de las subpoblaciones de linfocitos T CD8+ en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutesticofenotipo celular
Linfocitos CD8+ Cel
mL
Linfocitos CD8+ CD45RA+
CelmL
Linfocitos CD8+ naiumlve
CelmL
Linfocitos CD8+ efectores
CelmL
Linfocitos CD8+ CD45RO+
CelmL
Linfocitos CD8+ TCM
CelmL
Linfocitos CD8+ TEM
CelmL
Valor miacutenimo 36186 23232 13219 2741 12738 446 979
Percentil 25 78397 41514 17440 1882 19731 719 11024
Mediana 109396 68644 35240 6974 35035 1931 25275
Percentil 75 196850 154529 63307 11171 53473 4201 38052
Valor maacuteximo 542299 380694 148283 33882 157267 14592 125656
Media 155947 110535 51990 9625 43701 3218 30863
Desviacioacuten estaacutendar 126536 102996 45445 9910 33907 3607 29568
Error estaacutendar 28294 23031 10712 2216 7582 8064 6612
IC 95 valor bajo 96725 62331 29390 4987 27832 1530 17024
IC 95 valor alto 215168 158739 74589 14262 59570 4906 44701
IC intervalo de confianza TCM ceacutelulas T de memoria central TEM ceacutelulas T de memoria efectora
El fenotipo de linfocitos T activados se definioacute como aquellas ceacutelulas que expresaran CD69 un marcador de activacioacuten temprana y CRTAM una moleacutecula reciente-mente descrita y asociada con el estado de activacioacuten La determinacioacuten de este fenotipo se realizoacute tanto en las poblaciones CD45RA+ como CD45RO+ con la fina-lidad de calcular las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) activadas recientemente y las activadasmemoria (CD45RO+) pos-terior a su reactivacioacuten El anaacutelisis de las ceacutelulas con fenotipo de activacioacuten mostroacute que en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ existe una poblacioacuten discreta de ceacutelulas CD45RA+ y CD45RO+ que expresan CD69 y escasas ceacutelulas CRTAM+ (Fig 2) Cabe destacar que no se detectaron ceacutelulas que mostraran coexpresioacuten de CD69 y CRTAM (Fig 2 y Tabla 6)
Considerando que las muestras proveniacutean de indivi-duos cliacutenicamente sanos se analizoacute ademaacutes una muestra de un paciente que cursaba con una infeccioacuten aguda por el virus de Epstein-Barr (VEB) Se observoacute que en la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ en el com-partimento CD45RA+ existiacutea un aumento de 285 ve-ces de ceacutelulas CD69+ (Figs 2A y 2E) mientras que en la poblacioacuten CD45RO+ este aumento fue de 21 veces (Figs 2B y 2F) comparado con lo observado en los ICS Por otro lado en las ceacutelulas CRTAM+ se observoacute un incremento muy importante de aproximadamente 89 veces en las ceacutelulas CD45RA+ (Figs 2A y 2E) y de 76 veces en la poblacioacuten CD45RO+ (Figs 2B y 2F) con respecto a lo observado en los ICS mostrando una diferencia importante en presencia de un estiacutemulo
A partir de la delimitacioacuten de los eventos sencillos (Fig 1A) se consideraron las caracteriacutesticas de tamantildeo y complejidad para seleccionar las ceacutelulas vivas (Fig 1B) Posteriormente se definioacute la poblacioacuten de linfocitos T basaacutendose en la expresioacuten de la moleacutecula CD3 (Fig 1C) a partir de esta se realizoacute la comparta-mentalizacioacuten de ceacutelulas CD4+ y CD8+ (Fig 1D) La mediana del porcentaje de linfocitos T CD3+ fue del 20 inferior a lo reportado en poblacioacuten pediaacutetrica27 En esta regioacuten las poblaciones CD4+ y CD8+ fueron del 553 y 475 respectivamente y se obtuvo una relacioacuten CD4CD8 de 124 similar a lo reportado anteriormente25
Se analizaron los diferentes perfiles celulares en las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ esto es lin-focitos naiumlve efectores memoria central y memoria efectora (Figs 1E-L) Utilizando un perfil de expresioacuten de CD45RA+ CCR7+ CD62L+ se determinoacute la fre-cuencia y el nuacutemero absoluto de linfocitos T naiumlve y los valores de la mediana obtenidos de 9260 y 6780 para los linfocitos T CD4+ y CD8+ respectivamente (Tablas 2 a 5) Los valores de porcentaje de las pobla-ciones naiumlve y efectores se obtuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RA+
Utilizando el mismo panel de tincioacuten es posible de-finir las ceacutelulas efectoras CD45RA+ CCR7minus CD62Lminus en cada una de las subpoblaciones Se calculoacute un por-centaje de 146 y 88 de la poblacioacuten de linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresan CD45RA+ respectiva-mente (Tablas 3 y 5)
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I Parra-Ortega et al Subpoblaciones de linfocitos T
cliacutenico del paciente como puede ser el monitoreo de receptores de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacuteticas
La diferencia en los porcentajes obtenidos en el pre-sente trabajo en comparacioacuten con otros radica princi-palmente en que las subpoblaciones fueron calculadas en la poblacioacuten parental es decir CD45RA+ CD4+ o CD8+ naiumlve activados efectores y CD45RO+ CD4+ o CD8+ TCM y TEM y el valor absoluto calculado ba-saacutendose en los leucocitos totales
La presencia de ceacutelulas activadas es escasa en am-bos compartimentos tanto CD45RA como CD45RO para las poblaciones CD4+ y CD8+ Esto era esperado pues los participantes no presentaban signos ni siacutento-mas asociados a procesos infecciosos agudos Esta observacioacuten es congruente con la presencia discreta de la poblacioacuten de ceacutelulas efectoras La deteccioacuten de estas ceacutelulas en ICS se debe al contacto continuo con microorganismos (aun en ausencia de signos y siacutento-mas cliacutenicos que sugieran un proceso infeccioso agu-do) que induce la respuesta inmunitaria adaptativa y despueacutes de limitar la infeccioacuten a traveacutes de sus funcio-nes efectoras su eliminacioacuten mediante apoptosis Cabe destacar que la frecuencia de ceacutelulas efectoras es ma-yor en la poblacioacuten CD8+ que en las ceacutelulas CD4+
El anaacutelisis de las poblaciones de memoria TCM y TEM en las ceacutelulas CD4+ mostroacute un mayor porcentaje de las primeras Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observa un mayor porcentaje de TEM comparado con las TCM En la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ la presencia de una mayor subpoblacioacuten de TCM permitiriacutea tener una reserva de precursores de TEM que cooperariacutea con los linfocitos B para generacioacuten de anticuerpos y el desempentildeo de su capacidad efectora per se En las ceacutelulas CD8+ la poblacioacuten de ceacutelulas TEM se encuen-tran en mayor nuacutemero lo cual permite una actuacioacuten pronta y eficiente (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) ante infecciones intrace-lulares comparada con las generadas a partir de las ceacutelulas naiumlve activadas Es importante enfatizar que las poblaciones naiumlve y de memoria sufren modificaciones a lo largo de la vida pues la generacioacuten de linfocitos T naiumlve se encuentra reducida al depender del timo un oacutergano que involuciona por lo que disminuye el nuacutemero de linfocitos T naiumlve en periferia531 La pobla-cioacuten de ceacutelulas de memoria sufre modificaciones du-rante los encuentros con diferentes patoacutegenos lo que modifica el repertorio y las subpoblaciones TCM y TEM del mismo compartimento
Es importante establecer un sistema de anaacutelisis que comprenda la eleccioacuten de las moleacuteculas que definiraacuten las poblaciones de intereacutes asiacute como la determinacioacuten
antigeacutenico que induce la activacioacuten de las ceacutelulas T en este caso el VEB
Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observoacute un incremento en aquellas que expresaban CD69 tanto en la poblacioacuten CD45RA+ (Figs 2C y 2G) como en CD45RO+ (Figs 2D y 2H) 21 y 14 veces respectiva-mente El anaacutelisis de la expresioacuten de CRTAM mostroacute un incremento de 56 y 91 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente Es destacable que tampoco se detec-taron ceacutelulas que expresaran ambos marcadores CD69 y CRTAM en esta muestra El anaacutelisis de la expresioacuten de CD69 y CRTAM mostroacute un incremento de 138 y 104 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente
El anaacutelisis de la poblacioacuten de memoria utilizando la expresioacuten de moleacuteculas CD45RO CCR7 y CD62L permitioacute definir las subpoblaciones TCM y TEM para los compartimentos de ceacutelulas CD4+ y CD8+ El anaacute-lisis mostroacute que la poblacioacuten TCM (CD45RO+ CD62L+ CCR7+) y TEM (CD45RO+ CD62Lminus CCR7minus) estaba representada por una mediana de 341 y 296 en la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ (Tabla 3) mientras que para los CD8+ la mediana de las ceacutelulas TCM fue de 4 y para las TEM de 775 (Tabla 5) Los valores de porcentaje de las poblaciones TCM y TEM se ob-tuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RO+
La determinacioacuten y cuantificacioacuten de las ceacutelulas NK (CD16+ CD56+) (Figs 3A y B) mostroacute una media de 2967 con una mediana de 28 (IC 95 22-3726) en los leucocitos de sangre perifeacuterica (Tabla 7) Los valores obtenidos de las ceacutelulas NK son superiores en el valor de la media en comparacioacuten con lo reportado en estudios realizados en Holanda (media de 14 IC 95 4-51)27 y en China (media de 18 IC 95 1012-2834)28-30
Discusioacuten
Caracterizar y cuantificar las diferentes subpoblacio-nes de linfocitos T en sangre perifeacuterica permitioacute conocer la distribucioacuten (nuacutemeros absolutos y porcentaje) en indi-viduos cliacutenicamente sanos Al analizar la poblacioacuten de linfocitos T CD3+ se observoacute que el uso de CD45RA delimita a las ceacutelulas naiumlve bona fide dentro del compar-timento de ceacutelulas CD4+ Sin embargo para los CD8+ es necesario el uso de marcadores adicionales como CD62L y CCR7 si se desea identificar a la poblacioacuten naiumlve de manera precisa Esto es una diferencia impor-tante a considerar cuando el intereacutes de la cuantificacioacuten de las ceacutelulas naiumlve es determinante en el seguimiento
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Figura 2 Fenotipificacioacuten de la poblacioacuten de linfocitos T activados A partir de las poblaciones CD4+ (A y E) y CD8+ (C y G) que expresaban la moleacutecula CD45RA (naiumlve) se analizoacute la expresioacuten de CD69 y CRTAM (marcadores tempranos de activacioacuten) Se realizoacute el mismo anaacutelisis en las poblaciones CD4+ CD45RO+ (B y F) y CD8+ CD45RO+ (D y H) en una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos (fila superior) y un individuo infectado con el virus Epstein Barr (fila inferior)
A
E
B
F
C
G
D
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CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
Sin
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Bol Med Hosp Infant Mex 201976
16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
Sin
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cliacutenico del paciente como puede ser el monitoreo de receptores de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacuteticas
La diferencia en los porcentajes obtenidos en el pre-sente trabajo en comparacioacuten con otros radica princi-palmente en que las subpoblaciones fueron calculadas en la poblacioacuten parental es decir CD45RA+ CD4+ o CD8+ naiumlve activados efectores y CD45RO+ CD4+ o CD8+ TCM y TEM y el valor absoluto calculado ba-saacutendose en los leucocitos totales
La presencia de ceacutelulas activadas es escasa en am-bos compartimentos tanto CD45RA como CD45RO para las poblaciones CD4+ y CD8+ Esto era esperado pues los participantes no presentaban signos ni siacutento-mas asociados a procesos infecciosos agudos Esta observacioacuten es congruente con la presencia discreta de la poblacioacuten de ceacutelulas efectoras La deteccioacuten de estas ceacutelulas en ICS se debe al contacto continuo con microorganismos (aun en ausencia de signos y siacutento-mas cliacutenicos que sugieran un proceso infeccioso agu-do) que induce la respuesta inmunitaria adaptativa y despueacutes de limitar la infeccioacuten a traveacutes de sus funcio-nes efectoras su eliminacioacuten mediante apoptosis Cabe destacar que la frecuencia de ceacutelulas efectoras es ma-yor en la poblacioacuten CD8+ que en las ceacutelulas CD4+
El anaacutelisis de las poblaciones de memoria TCM y TEM en las ceacutelulas CD4+ mostroacute un mayor porcentaje de las primeras Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observa un mayor porcentaje de TEM comparado con las TCM En la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ la presencia de una mayor subpoblacioacuten de TCM permitiriacutea tener una reserva de precursores de TEM que cooperariacutea con los linfocitos B para generacioacuten de anticuerpos y el desempentildeo de su capacidad efectora per se En las ceacutelulas CD8+ la poblacioacuten de ceacutelulas TEM se encuen-tran en mayor nuacutemero lo cual permite una actuacioacuten pronta y eficiente (grandes cantidades de citocinas y producidas en menor tiempo) ante infecciones intrace-lulares comparada con las generadas a partir de las ceacutelulas naiumlve activadas Es importante enfatizar que las poblaciones naiumlve y de memoria sufren modificaciones a lo largo de la vida pues la generacioacuten de linfocitos T naiumlve se encuentra reducida al depender del timo un oacutergano que involuciona por lo que disminuye el nuacutemero de linfocitos T naiumlve en periferia531 La pobla-cioacuten de ceacutelulas de memoria sufre modificaciones du-rante los encuentros con diferentes patoacutegenos lo que modifica el repertorio y las subpoblaciones TCM y TEM del mismo compartimento
Es importante establecer un sistema de anaacutelisis que comprenda la eleccioacuten de las moleacuteculas que definiraacuten las poblaciones de intereacutes asiacute como la determinacioacuten
antigeacutenico que induce la activacioacuten de las ceacutelulas T en este caso el VEB
Para el caso de las ceacutelulas CD8+ se observoacute un incremento en aquellas que expresaban CD69 tanto en la poblacioacuten CD45RA+ (Figs 2C y 2G) como en CD45RO+ (Figs 2D y 2H) 21 y 14 veces respectiva-mente El anaacutelisis de la expresioacuten de CRTAM mostroacute un incremento de 56 y 91 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente Es destacable que tampoco se detec-taron ceacutelulas que expresaran ambos marcadores CD69 y CRTAM en esta muestra El anaacutelisis de la expresioacuten de CD69 y CRTAM mostroacute un incremento de 138 y 104 veces en las poblaciones CD45RA+ (Figs 2C y 2G) y CD45RO+ (Figs 2D y 2H) respectivamente
El anaacutelisis de la poblacioacuten de memoria utilizando la expresioacuten de moleacuteculas CD45RO CCR7 y CD62L permitioacute definir las subpoblaciones TCM y TEM para los compartimentos de ceacutelulas CD4+ y CD8+ El anaacute-lisis mostroacute que la poblacioacuten TCM (CD45RO+ CD62L+ CCR7+) y TEM (CD45RO+ CD62Lminus CCR7minus) estaba representada por una mediana de 341 y 296 en la poblacioacuten de ceacutelulas CD4+ (Tabla 3) mientras que para los CD8+ la mediana de las ceacutelulas TCM fue de 4 y para las TEM de 775 (Tabla 5) Los valores de porcentaje de las poblaciones TCM y TEM se ob-tuvieron a partir de la poblacioacuten CD45RO+
La determinacioacuten y cuantificacioacuten de las ceacutelulas NK (CD16+ CD56+) (Figs 3A y B) mostroacute una media de 2967 con una mediana de 28 (IC 95 22-3726) en los leucocitos de sangre perifeacuterica (Tabla 7) Los valores obtenidos de las ceacutelulas NK son superiores en el valor de la media en comparacioacuten con lo reportado en estudios realizados en Holanda (media de 14 IC 95 4-51)27 y en China (media de 18 IC 95 1012-2834)28-30
Discusioacuten
Caracterizar y cuantificar las diferentes subpoblacio-nes de linfocitos T en sangre perifeacuterica permitioacute conocer la distribucioacuten (nuacutemeros absolutos y porcentaje) en indi-viduos cliacutenicamente sanos Al analizar la poblacioacuten de linfocitos T CD3+ se observoacute que el uso de CD45RA delimita a las ceacutelulas naiumlve bona fide dentro del compar-timento de ceacutelulas CD4+ Sin embargo para los CD8+ es necesario el uso de marcadores adicionales como CD62L y CCR7 si se desea identificar a la poblacioacuten naiumlve de manera precisa Esto es una diferencia impor-tante a considerar cuando el intereacutes de la cuantificacioacuten de las ceacutelulas naiumlve es determinante en el seguimiento
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Figura 2 Fenotipificacioacuten de la poblacioacuten de linfocitos T activados A partir de las poblaciones CD4+ (A y E) y CD8+ (C y G) que expresaban la moleacutecula CD45RA (naiumlve) se analizoacute la expresioacuten de CD69 y CRTAM (marcadores tempranos de activacioacuten) Se realizoacute el mismo anaacutelisis en las poblaciones CD4+ CD45RO+ (B y F) y CD8+ CD45RO+ (D y H) en una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos (fila superior) y un individuo infectado con el virus Epstein Barr (fila inferior)
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CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
Sin
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ar c
on e
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78
Bol Med Hosp Infant Mex 201976
16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
Sin
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ar c
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Figura 2 Fenotipificacioacuten de la poblacioacuten de linfocitos T activados A partir de las poblaciones CD4+ (A y E) y CD8+ (C y G) que expresaban la moleacutecula CD45RA (naiumlve) se analizoacute la expresioacuten de CD69 y CRTAM (marcadores tempranos de activacioacuten) Se realizoacute el mismo anaacutelisis en las poblaciones CD4+ CD45RO+ (B y F) y CD8+ CD45RO+ (D y H) en una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos (fila superior) y un individuo infectado con el virus Epstein Barr (fila inferior)
A
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C
G
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CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
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16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
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CD45RA+ como en CD45RO+ considerando que las moleacuteculas de superficie CD69 y CRTAM son marcado-res tempranos que pudieran expresarse tanto en las ceacutelulas activadas por primera vez es decir las ceacutelulas naiumlve (CD45RA+) y aquellas de memoria (CD45RO+) generadas a partir de la activacioacuten de linfocitos T naiumlve que respondieron a alguacuten estiacutemulo como podriacutea ser el caso de infecciones virales35 o bacterianas o bien por el reconocimiento de un aloantiacutegeno36 Se observoacute que la presencia de ceacutelulas con dichas caracteriacutesticas (CD69+CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+) es casi nula en individuos cliacutenicamente sanos tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como CD8+ en tanto que se encontraron enriquecidas en un individuo que cursaba con una infeccioacuten viral aguda La expre-sioacuten transitoria de CD69 es un marcador claacutesico de activacioacuten temprana y aunque CRTAM comparte di-chas caracteriacutesticas se desconociacutea la expresioacuten en condiciones de infeccioacuten in vivo La relevancia de incluir un segundo marcador de activacioacuten ademaacutes de CD69 permite tener un caacutelculo preciso de la poblacioacuten de linfocitos T activados debido a que la expresioacuten
de porcentajes (relativa a la poblacioacuten de linfocitos o leucocitos totales) en cada laboratorio donde se utili-zaraacuten como paraacutemetros para el monitoreo o determi-nacioacuten uacutenica en muestras de sangre perifeacuterica Esto debido a que los diferentes protocolos utilizados para la caracterizacioacuten de poblaciones celulares deben des-cribirse de tal manera que puedan ser reproducidos y no sobre-estimados como el uso uacutenico de CD45RA para definir la poblacioacuten naiumlve En este aspecto se han descrito variaciones significativas entre usuarios equi-pos y meacutetodos de tincioacuten y caacutelculo de porcentajes y nuacutemeros absolutos lo cual debe ser un punto crucial cuando se presenta informacioacuten de nuacutemero y frecuen-cia en los diversos grupos celulares3233
Dado que esta relacioacuten se ve disminuida debido al aumento de la cantidad de linfocitos T CD8+ que ac-tuacutean como ceacutelulas efectoras del sistema inmunoloacutegico al eliminar ceacutelulas tumorales o potencialmente infecta-das por virus bacterias o protozoarios34 es congruente con el estado de los participantes (ICS)
Asimismo se determinoacute la presencia de ceacutelulas con un fenotipo de activacioacuten tanto en la subpoblacioacuten
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
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16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
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heterogeacutenea de ambas moleacuteculas permite distinguir tres fenotipos de activacioacuten CD69+ CRTAMminus CD69+ CRTAM+ y CD69-CRTAM+ Se desconoce si pertene-cen a subpoblaciones independientes generadas du-rante la activacioacuten o bien siguen una liacutenea de diferen-ciacioacuten Seriacutea importante conocer el impacto de cada una en la respuesta efectora (produccioacuten de citocinas y capacidad citotoacutexica) ante una infeccioacuten viral por ejemplo de cada subpoblacioacuten identificada
El uso de un panel de anticuerpos que permitan dis-tinguir esta poblacioacuten es de utilidad especiacuteficamente
en aquellos casos en los cuales una expansioacuten clonal asociada con un estado de infeccioacuten o de rechazo de trasplante (soacutelido o de ceacutelulas progenitoras hematopo-yeacuteticas) pudiera confundirse con una reconstitucioacuten del compartimento de ceacutelulas T
La obtencioacuten de informacioacuten a partir de la fenotipifi-cacioacuten de los linfocitos T debe considerarse como un dato adicional provisto por el laboratorio cliacutenico que debe ser integrado a las caracteriacutesticas cliacutenicas del paciente tratamiento deteccioacuten de infecciones virales o bacterianas entre otros Su demanda debe ser valo-rada en aquellas situaciones en las que se requiere conocer el perfil (fenotipo y nuacutemero absoluto) de las subpoblaciones naiumlve activado efector o de memoria en los compartimentos de linfocitos T CD4+ o CD8+ Esto resulta muy uacutetil por ejemplo en individuos some-tidos a trasplante de ceacutelulas progenitoras hematopoyeacute-ticas que requieren ser monitoreados para establecer el eacutexito del tratamiento asiacute como en individuos en los que la identificacioacuten de ciertas subpoblaciones podriacutea apoyar en la identificacioacuten de deficiencias en las sub-poblaciones de linfocitos T asociados con la presencia de infecciones recurrentes o baja respuesta inmunitaria protectora despueacutes de una vacunacioacuten
Se debe considerar que las poblaciones y subpobla-ciones celulares en el compartimento de linfocitos T se encuentran en homeostasis dinaacutemica dependiendo del nuacutemero de eventos antigeacutenicos al que haya sido expuesto el individuo de manera conocida vacuna-cioacuten contagio de infecciones conocidas o determina-das o de agentes desconocidos por los que se haya generado una respuesta inmunoloacutegica ademaacutes de la
Tabla 7 Valores de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica de individuos cliacutenicamente sanos
Valor estadiacutestico Ceacutelulas NK (ceacutelml) Ceacutelulas NK ()
Valor miacutenimo 18284 105
Percentil 25 28313 188
Mediana 58177 28
Percentil 75 87420 408
Valor maacuteximo 130597 511
Media 60530 2967
Desviacioacuten estaacutendar 33430 1255
Error estaacutendar 9272 3482
IC 95 valor bajo 40328 2208
IC 95 valor alto 80732 3726
IC intervalo de confianza NK ceacutelulas asesinas naturales (natural killer)
Figura 3 Identificacioacuten de las ceacutelulas natural killer en sangre perifeacuterica A partir de la regioacuten de ceacutelulas vivas y morfologiacutea de linfocitos (tamantildeo pequentildeo y poco granular) se realizoacute la identificacioacuten de la poblacioacuten CD3minus (A) De esta poblacioacuten se analizoacute la expresioacuten en la superficie de las moleacuteculas CD16 y CD56 para la identificacioacuten de las ceacutelulas NK CD16+ CD56+ (B) Esta es una muestra representativa del grupo de individuos cliacutenicamente sanos
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
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16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
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edad37 por lo que los datos de las subpoblaciones de linfocitos T deben interpretarse de manera individual y considerar que la referencia para las subpoblaciones de linfocitos T debe ser el mismo individuo antes o despueacutes de una intervencioacuten cliacutenica o terapeacuteutica De esta manera se podriacutea contrarrestar la heterogeneidad observada en las subpoblaciones entre individuos
En el caso de las ceacutelulas NK se observaron valores similares a los reportados38 y la definicioacuten de la pobla-cioacuten CD3minus CD16+ CD56+ fue claramente delimitada por lo que tambieacuten podriacutea ser utilizada como un dato adicional en la caracterizacioacuten del perfil de ceacutelulas con capacidad citotoacutexica
Con la estandarizacioacuten de un panel para la carac-terizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria en sangre perifeacuteri-ca y el conocimiento de la distribucioacuten de este grupo de ceacutelulas en ICS se demostroacute que esta herramienta es uacutetil y capaz de marcar diferencias en una subpo-blacioacuten de ceacutelulas activadas y efectoras en presencia y ausencia de un estiacutemulo antigeacutenico (en este caso una infeccioacuten viral) Es necesario continuar con la in-clusioacuten de una muestra mayor y homogeacutenea para conocer los valores de cada una de las subpoblacio-nes y detectar alguna alteracioacuten que merezca un anaacute-lisis detallado o bien darles seguimiento a los indivi-duos en los que el uso de este panel puede detectar variaciones que sirvan de herramienta para que el equipo cliacutenico tome decisiones terapeacuteuticas e incluso sirvan de monitoreo de su avance y eficacia del tratamiento
Como conclusiones se logroacute estandarizar un panel para la caracterizacioacuten de subpoblaciones de linfocitos T naiumlve activados efectores y de memoria asiacute como de las ceacutelulas NK en sangre perifeacuterica utilizando cito-metriacutea de flujo (citoacutemetro BD FACS CANTO IIreg de ocho colores) Este panel seraacute de gran utilidad para dar se-guimiento a pacientes que requieran de valoraciones frecuentes de su estado inmunoloacutegico desde el punto de vista celular y a los pacientes de los cuales se re-quiera evaluar la reconstitucioacuten inmunoloacutegica particu-larmente el linaje T
Responsabilidades eacuteticas
Proteccioacuten de personas y animales Los autores declaran que para esta investigacioacuten no se han realiza-do experimentos en seres humanos ni en animales
Confidencialidad de los datos Los autores decla-ran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacioacuten de datos de pacientes
Derecho a la privacidad y consentimiento infor-mado Los autores declaran que en este artiacuteculo no aparecen datos personales de pacientes Los partici-pantes fueron informados de las caracteriacutesticas del pro-tocolo asiacute como el riesgo miacutenimo al que seriacutean some-tidos para la obtencioacuten de la muestra Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes o sujetos referidos en el artiacuteculo Este documento obra en poder del autor de correspondencia
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ninguacuten conflicto de intereacutes
Financiamiento
El presente estudio fue aprobado por el Comiteacute de Eacutetica e Investigacioacuten del Hospital Infantil de Meacutexico Federico Goacutemez considerando los documentos inter-nacionales como la Declaracioacuten de Helsinki e Informe Belmont y nacionales como la Ley General de Salud y la NOM-012-SSA3-2012 Este protocolo forma parte del proyecto HIM2017038
Bibliografiacutea 1 Goldsby K Inmunologiacutea Meacutexico McGraw Hill 2004 2 Abbas AK Lichman AH PS Immunologiacutea celular y molecular Barcelona
Elsevier Saunders 2015 3 Appay V Sauce D Naive T cells the crux of cellular immune aging Exp
Gerontol 20145490-3 4 Taub DD Longo DL Insights into thymic aging and regeneration Immu-
nol Rev 200520572-93 5 Linton PJ Dorshkind K Age-related changes in lymphocyte development
and function Nat Immunol 20045133-9 6 Qi Q Zhang DW Weyand CM Goronzy JJ Mechanisms shaping the
naiumlve T cell repertoire in the elderlymdashthymic involution or peripheral homeostatic proliferation Exp Gerontol 20145471-4
7 Medina-Contreras O Soldevila G Patintildeo-Lopez G Canche-Pool E Va-lle-Rios R Ortiz-Navarrete V Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development Dev Comp Immunol 201034196-202
8 Wong SH Vannberg FO Spencer AJ van der Weyden L Hill AVS Wyllie DH CRTAM confers late-stage activation of CD8+ T cells to re-gulate retention within lymph node J Immunol 20101844052-3
9 Beristain-Covarrubias N Canche-Pool EB Ramirez-Velazquez C Barra-gan-Galvez JC Gomez-Diaz RA Ortiz-Navarrete V Class I-restricted T cell-associated molecule is a marker for IFN-γ-producing iNKT cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes J Interferon Cytokine Res 20173739-49
10 Calabresi PA Allie R Mullen KM Yun SH Georgantas RW Whar-tenby KA Kinetics of CCR7 expression differ between primary activation and effector memory states of T(H)1 and T(H)2 cells J Neuroimmunol 200313958-65
11 van Leeuwen EMM van Buul JD Remmerswaal EBM Hordijk PL ten Berge IJM van Lier RAW Functional re-expression of CCR7 on CMV-spe-cific CD8+ T cells upon antigenic stimulation Int Immunol 200517713-9
12 Krammer PH Arnold R Lavrik IN Life and death in peripheral T cells Nat Rev Immunol 20077532-42
13 Mahnke YD Brodie TM Sallusto F Roederer M Lugli E The whorsquos who of T-cell differentiation Human memory T-cell subsets Eur J Immunol 2013432797-809
14 Weninger W Manjunath N von Andrian UH Migration and differentiation of CD8+ T cells Immunol Rev 2002186221-33
15 Lanzavecchia A Sallusto F Understanding the generation and function of memory T cell subsets Curr Opin Immunol 200517326-32
Sin
cont
ar c
on e
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sent
imie
nto
prev
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acioacute
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copy
Per
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2019
78
Bol Med Hosp Infant Mex 201976
16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
Sin
cont
ar c
on e
l con
sent
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78
Bol Med Hosp Infant Mex 201976
16 Zanetti M Franchini G T cell memory and protective immunity by vac-cination is more better Trends Immunol 200627511-7
17 Sallusto F Lenig D Foumlrster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector func-tions Nature 1999401708-12
18 Boslashyum A Isolation of lymphocytes granulocytes and macrophages Scand J Immunol 1976Suppl 59-15
19 Brain P Gordon J Willetts WA Rosette formation by peripheral lympho-cytes Clin Exp Immunol 19706681-8
20 Bonner WA Hulett HR Sweet RG Herzenberg LA Fluorescence acti-vated cell sorting Rev Sci Instrum 197243404-9
21 Appay V van Lier RAW Sallusto F Roederer M Phenotype and function of human T lymphocyte subsets consensus and issues Cytometry A 200873975-83
22 Corneau A Cosma A Even S Katlama C Le Grand R Frachet V et al Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle activation and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-in-fected individuals Cytom Part B Clin Cytom 20179221-32
23 Siegel RL Fox RW A longitudinal study of a patient with acquired im-munodeficiency syndrome using T cell subset analysis Adv Exp Med Biol 1983166295-303
24 Toubert A Clave E Talvensaari K Douay C Charron D New tools in assessing immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplan-tation Vox Sang 20007829-31
25 Santagostino A Garbaccio G Pistorio A Bolis V Camisasca G Pagliaro P et al An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults Haematologica 199984499-504
26 Flores MGP Vaacutezquez MIC Camantildeo MEV Bayardo RLG Contreras FO Galicia Tapia J et al Determinacioacuten de concentraciones de subpoblaciones de linfocitos en donadores adultos sanos del CMN 20 de Noviembre ISSSTE Rev Espec Meacutedico-Quiruacutergicas 2013 18228-34
27 Schatorjeacute EJH Gemen EFA Driessen GJA Leuvenink J van Hout RWNM de Vries E Paediatric reference values for the peripheral T cell compartment Scand J Immunol 201275436-44
28 Jiang Y Zhang L Wen D Ding Y Role of physical and chemical inte-ractions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E coli Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016691361-6
29 Lin C Shao B Zhou Y Niu X Lin Y Maternal high-fat diet influences stroke outcome in adult rat offspring J Mol Endocrinol 201656101-12
30 Ding Y Zhou L Xia Y Wang W Wang Y Li L et al Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China J Allergy Clin Immunol 2018142970-3
31 Jiao Y Qiu Z Xie J Li D Li T Reference ranges and age-related chan-ges of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults Sci China Ser C Life Sci 200952643-50
32 Rivadeneyra-Espiacutenoza L Peacuterez-Romano B Gonzaacutelez-Flores A Guz-maacuten-Garciacutea MO Carvajal-Armora F Ruiz-Arguumlelles A Instrument- and protocol-dependent variation in the enumeration of CD34+ cells by flow cytometry Transfusion 200646530-6
33 Ruiz-Arguumlelles A Peacuterez-Romano B Immunophenotypic analysis of peri-pheral blood lymphocytes Curr Protoc Cytom 200011651-14
34 Ahmed R Gray D Immunological memory and protective immunity understanding their relation Science 199627254-60
35 Griffiths SJ Riddell NE Masters J Libri V Henson SM Wertheimer A et al Age-associated increase of low-avidity cytomegalovirus-specific CD8+ T cells that re-express CD45RA J Immunol 20131905363-72
36 Akbar AN Salmon M Ivory K Taki S Pilling D Janossy G Human CD4+CD45R0+ and CD4+CD45RA+ T cells synergize in response to alloantigens Eur J Immunol 1991212517-22
37 Clement LT Isoforms of the CD45 common leukocyte antigen family markers for human T-cell differentiation J Clin Immunol 1992121-10
38 Bisset LR Lung TL Kaelin M Ludwig E Dubs RW Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland Eur J Haematol 200472203-12
Sin
cont
ar c
on e
l con
sent
imie
nto
prev
io p
or e
scri
to d
el e
dito
r no
pod
raacute r
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opia
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