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DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA Área de Diagnóstico Fitosanitario Laboratorio de Bacteriología Protocolo de Diagnóstico: Xylella fastidiosa Wells, et al., 1987 (Enfermedad de Pierce) Tecámac, Estado de México, julio 2018.
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DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
Área de Diagnóstico Fitosanitario
Laboratorio de Bacteriología
Protocolo de Diagnóstico:
Xylella fastidiosa Wells, et al., 1987
(Enfermedad de Pierce)
Tecámac, Estado de México, julio 2018.
Aviso
El presente protocolo de diagnóstico fitosanitario fue desarrollado en las instalaciones de la
Dirección del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), de la Dirección General de
Sanidad Vegetal (DGSV) del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad
Agroalimentaria (SENASICA), con el objetivo de diagnosticar específicamente la presencia o
ausencia de Xylella fastidiosa. La metodología descrita, tiene un sustento científico que respalda
los resultados obtenidos al aplicarlo. La incorrecta implementación o variaciones en la
metodología especificada en este documento de referencia pueden derivar en resultados no
esperados, por lo que es responsabilidad del usuario seguir y aplicar el protocolo de forma
correcta.
La presente versión podrá ser mejorada y/o actualizada quedando el registro en el historial de
cambios.
I. ÍNDICE GENERAL
2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................................. 1
2.1. Información sobre la plaga ............................................................................................................................... 1
2.2 Información taxonómica ................................................................................................................................... 3
2.3 Flujo de trabajo ................................................................................................................................................. 4
3. DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN ............................................................................................................... 5
3.1. Aislamiento y purificación ............................................................................................................................... 5
3.2. Técnica de ELISA ............................................................................................................................................ 6
3.2.1. Interpretación de resultados de ELISA .................................................................................................. 7
3.3. Técnicas moleculares ....................................................................................................................................... 7
3.3.1. Extracción de DNA total con el método de CTAB 2%.......................................................................... 7
3.3.2. Extracción de DNA con kit Plant DNAzol® ......................................................................................... 8
3.3.3. Verificación de la calidad del DNA mediante espectrofotometría ......................................................... 8
3.3.4. Verificación de la integridad del DNA por electroforesis en gel de agarosa ......................................... 9
3.3.5. PCR punto final para la detección de Xylella fastidiosa ........................................................................ 9
3.3.6. PCR tiempo real para la detección de Xylella fastidiosa ..................................................................... 12
3.3.7. Controles para las pruebas moleculares ............................................................................................... 13
3.3.8 Interpretación de resultados de PCR punto final ................................................................................... 13
3.3.9 Interpretación de resultados de qPCR ................................................................................................... 15
3.4. Identificación del patógeno ............................................................................................................................ 15
4. REGISTROS ..................................................................................................................................................... 15
5. CONTACTO PARA INFORMACIÓN ADICIONAL .................................................................................. 16
6. RECONOCIMIENTO ..................................................................................................................................... 16
7. REFERENCIAS ............................................................................................................................................... 16
8. ANEXO.............................................................................................................................................................. 18
8.1. Medios de cultivo ........................................................................................................................................... 18
8.2 Soluciones amortiguadoras ............................................................................................................................. 19
II. ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Síntomas de Xylella fastidiosa en vid.. .................................................................................................... 2
Figura 2. Electroforesis de productos de PCR con los primers FXYgyr499 y RXYgyr907.. ............................... 13
Figura 3. Electroforesis de los productos de PCR con los primers RST31 y RST33.. .......................................... 14
Figura 4. Electroforesis de los productos de PCR con los primers HL5/HL6....................................................... 14
Figura 5. Curva de cuantificación para la detección de Xylella fastidiosa en PCR tiempo real. ........................... 15
III. ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Preparación de la mezcla de reacción para la PCR punto final. ........................................................... 10
Cuadro 2. Primers FXYgyr499 y RXYgyr907 propuestos por Rodrigues et al., 2003. ........................................ 10
Cuadro 3. Programa de termociclaje para los primers FXYgyr499 y RXYgyr907............................................... 11
Cuadro 4. Primers RST31 y RST33 propuestos por Minsavage et al., 1994. ...................................................... 11
Cuadro 5. Programa de termociclaje para los primers RST31 y RST33. .............................................................. 11
Cuadro 6. Primers HL5 y HL6 propuestos por Francis, et al. 2006. .................................................................... 11
Cuadro 7. Programa del termociclador para los primers HL5 y HL6. .................................................................. 11
Cuadro 8. Preparación de la mezcla de reacción para la PCR tiempo real............................................................ 12
Cuadro 9. Primers XF-F y XF-R propuestos por Harper et al., 2010. ................................................................... 12
Cuadro 10. Programa del termociclador para los primers XF-F y XF-R. ............................................................. 13
[1]
Versión 1.0
1. OBJETIVO Y ALCANCE DEL PROTOCOLO
Describir la metodología aplicada para la detección de Xylella fastidiosa mediante la técnica de
PCR punto final y PCR tiempo real, que se usa en el Laboratorio de Bacteriología del Centro
Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF).
2. INTRODUCCIÓN
2.1. Información sobre la plaga
Un gran porcentaje de las enfermedades que generan pérdidas importantes en los cultivos son
ocasionadas por bacterias (Varani, 2013).
Los síntomas de Xylella fastidiosa se observaron por primera vez en 1892 en cultivos de vid
ubicados al Sur de California en Estados Unidos de Norte América, y años más tarde, el
síndrome fue nombrado “Enfermedad de Pierce”. Actualmente esta bacteria está ampliamente
distribuida en el continente Americano y en la región mediterránea (Italia, Francia y España).
Xylella fastidiosa es una bacteria Gram negativa, aerobia, tiene forma de bastón, generalmente
mide de 0.1 – 0.5 µm por 1 - 5 µm, sin flagelos y no forma esporas. Se reproduce asexualmente
por fisión binaria, su crecimiento es muy lento en diferentes medios de cultivo artificiales, en
los cuales se desarrolla de 15 a 28 días a 28 °C con un pH óptimo de 6.5 a 6.9 (CABI, 2018).
Esta bacteria fitopatógena es un habitante exclusivo del xilema de las plantas y su colonización
ocasiona el taponamiento de los haces vasculares. Los síntomas más característicos en las
plantas es el secado marginal de las hojas (escaldadura o quemazón de la hoja) y su
desprendimiento quedando adheridos a la rama los peciolos (síntoma denominado como cerillo),
en las ramas, se observan decoloraciones, zonas verdes seguidas de zonas cafés “islas” (Figura
1a), y existe maduración irregular de los frutos por falta de nutrimentos (Figura 1b).
La bacteria se dispersa principalmente por material propagativo infectado a otras regiones y
países, y por insectos vectores de las familias Cercopidae y Cicadellidae que se alimentan
principalmente de los fluidos del xilema. Los insectos adquieren la bacteria al alimentarse de
plantas infectadas, la bacteria se aloja en el cibario del insecto y al alimentarse de plantas sanas
ocurre la transmisión e infección (Lee et al., 1991; He et al., 2000).
[2]
Versión 1.0
Figura 1. Síntomas de Xylella fastidiosa en vid. a) Secado de hojas, desprendimiento de hoja y maduración irregular
de las ramas. b) Secado prematuro de frutos. (Créditos Laboratorio de Bacteriología-CNRF).
Xylella fastidiosa está presente en muchas plantas cultivadas en América, tales como aguacate,
alfalfa, almendro, arándano, café, cítricos, ciruelo, maple, melocotón, mora, nogal pecanero, olivo,
olmo, roble y vid (Harris, 2015). Se estima que existen más de 359 especies de plantas hospedantes
(EFSA, 2016).
Esta bacteria presenta amplia diversidad genómica, lo cual le confiere especificidad en el rango de
hospedantes (Nunney, 2014).
La descripción de la bacteria fue realizada en 1987 por Wells y colaboradores, y los diferentes
estudios que se han realizado desde entonces, han propuesto seis subespecies: X. fastidiosa subsp.
fastidiosa (Schaad, 2004), X. fastidiosa subsp. multiplex (Schaad, 2004), X. fastidiosa subsp. pauca
(Schaad, 2004), X. fastidiosa subsp. sandyi (Schuenzel, 2005), X. fastidiosa subsp. tashke (Randall,
2009) y X. fastidiosa subsp. morus (Nunney, 2014).
[3]
Versión 1.0
2.2 Información taxonómica
Nombre: Xylella fastidiosa Wells, et al., 1987
Sinonimia: Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa Schaad et al. 2004 (Bull et al., 2012)
Nombre Común: Enfermedad de Pierce
Dominio: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Xanthomonadales
Familia: Xanthomonadaceae
Género: Xylella
Especie: fastidiosa
(CABI, 2018).
[4]
Versión 1.0
2.3 Flujo de trabajo
Recepción de la muestra
Detección por:
-ELISA
-PCR tiempo real
-PCR punto final
NO
Resultado
negativo
Registro de
resultados
SI
Aislamiento en medios de cultivo selectivos.
Colonias con
morfología
típica
NO SI
Secuenciación del
fragmento de DNA
amplificado y análisis de
la secuencia.
Envío de resultado
Resultado Positivo a
Xylella fastidiosa
Al menos dos técnicas /
pruebas positivas.
PCR tiempo real
PCR punto final
Revisión y
selección
[5]
Versión 1.0
3. DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN
La detección de la bacteria puede realizarse a partir de plantas y barbados infectados
sintomáticos o bien asintomáticos, así como en insectos posibles vectores. Debido a la
importancia del patógeno, el análisis debe realizarse utilizando por lo menos dos técnicas
alternas. Mediante la técnica serológica de ELISA, PCR punto final con 3 juegos de primers y
PCR tiempo real.
Se deben tomar y enviar hojas (20 hojas) y tallos (1 a 2 tallos de 20 cm de longitud) con síntomas
de la enfermedad, colocarlos cuidadosamente en toallas de papel secante e introducirlos en
bolsas de plástico con cierre hermético. Identificar correctamente las muestras y enviarlas en
hielera con geles refrigerantes a fin de evitar la oxidación de las mismas. El envío debe realizarse
el mismo día de la colecta, de no ser posible, las muestras deben resguardarse a 4°C y enviarse
al día siguiente.
El material vegetal recibido en el laboratorio debe ser inspeccionado para admitir o no su
recepción y comenzar con el proceso de diagnóstico. El tejido debe estar en buen estado, es
decir, fresco y sin presencia de fenolización u oxidación excesiva, tampoco debe tener la
presencia de organismos saprofitos.
Se observa si el material vegetal presenta síntomas característicos, el tejido vegetal óptimo para
realizar la detección son las zonas en donde se confina y se concentra la bacteria, las cuales
comprenden los tejidos del xilema, por lo que según sea el tipo de muestra, ésta debe incluir:
hojas con síntomas o asintomáticas, pecíolos, brotes, ramas y sarmientos o barbados en caso de
ser material propagativo.
3.1. Aislamiento y purificación
Debido a que Xylella fastidiosa presenta un crecimiento lento (de 15 a 30 días), el aislamiento
de ésta es con fines de investigación y no se considera una técnica de diagnóstico.
Un factor importante en el éxito del aislamiento, es la selección del tejido a partir del cual se
pretende extraer la bacteria. Éste debe contener una alta población bacteriana ya que tienden a
acumularse en partes específicas de la planta como los tejidos vasculares y pecíolos de las hojas,
por lo que éstas se consideran muestras muy aptas para realizar los aislamientos.
El siguiente método fue proporcionado por el Doctor D. Wenbin Li (USDA, APHIS, PPQ,
CPHST, Laboratorio Nacional de germoplasma y Cuarentena de Plantas Bldg 580, BARC- East,
Beltsville, MD 20705) y adecuado/estandarizado por el Laboratorio de Bacteriología del CNRF:
1) Cortar el tejido con tijeras o bisturí esterilizados y colocarlo en un vaso de precipitado
estéril y etiquetado.
2) Agregar alcohol (etanol) al 70% y dejar el material vegetal por 2 minutos.
[6]
Versión 1.0
3) Transferir el material a otro vaso de precipitado y agregar hipoclorito de sodio al 2% por 2
minutos.
4) Enjuagar el tejido con agua destilada estéril tres veces y reposar tres minutos cada enjuague.
5) Decantar el último enjuague y cortar el tejido en trozos más pequeños sobre una caja petri
esterilizada.
6) Colocar el tejido en medio de cultivo líquido PW, PD2 o CS20 (20 ml) (Anexo 8.1) y dejar
reposar por 3 a 4 horas. Agitar suavemente periódicamente.
7) Tomar 1 ml del medio PW, PD2 o CS20 inoculado y colocarlo en 10 mL de medio líquido
PW, PD2 o CS20 nuevo.
8) Sembrar 50 μL de este último medio PW, PD2 o CS20 inoculado, sobre medio PW, PD2 o
CS20 sólido.
El crecimiento de la bacteria en los diferentes medios de cultivo es lento. Tardan en crecer,
aproximadamente, entre 12 y 15 días, a 28ºC, en un ambiente aerobio. También se presentan
diferencias en el tiempo de crecimiento y el tamaño de las colonias.
Los aislamientos de vid presentan dos tipos de colonias blancas: unas convexas, pulvinadas,
opacas, lisas y con bordes enteros; y otras también convexas, pulvinadas, opacas rugosas y con
bordes ondulados. La superficie de la porción convexa de las colonias es lisa mientras que las
porciones menos elevadas son rugosas. Ambos tipos miden 0.6 mm de diámetro después de 10
días de incubación, a 27ºC y más de 1.5 mm de diámetro después de 30 días (Figuras 6 y 7).
Los análisis bioquímicos y fisiológicos revelan que son bacterias Gram negativas, oxidasa
negativa, catalasa positiva, estrictamente aerobias, no fermentativas, no halófilas, no
pigmentadas y no móviles (carecen de flagelos). La temperatura óptima de crecimiento oscila
entre 26-28º C y su pH óptimo entre 6.5-6.9 (Wells et al. 1987).
Los cultivos puros de las bacterias se pueden preservar mediante liofilización o almacenamiento
a -70ºC con glicerol al 30% o dimetilsulfóxido.
3.2. Técnica de ELISA
Para la detección de Xylella fastidiosa se utiliza la técnica serológica ELISA (Enzime linked
imunosorbent assay) que está basada en la relación inmunológica, entre anticuerpos que
reconocen y se unen a un antígeno específico. Es una técnica confiable y rápida para la
detección de bacterias fitopatógenas.
[7]
Versión 1.0
Se han desarrollado algunas variantes, el método directo de DAS-ELISA (Double Antibody
Sándwich) es el que se encuentra estandarizado por las compañías comerciales. Consiste en la
adsorción de anticuerpos específicos a una placa de poliestireno, en la que, posteriormente se
añade el antígeno que reacciona con los anticuerpos adheridos a la placa, se complementa con
la adición de un conjugado enzimático (segundo anticuerpo) para formar el complejo:
anticuerpo-antígeno-anticuerpo.
Los protocolos que se emplean son: el desarrollado por la Compañía Agdia® DAS ELISA
conjugado con peroxidasa (AGDIA® / SRP 34501/01000), y también se puede emplear el juego
de antisueros de la compañía europea LOEWE ® 071195/500, cuyos resultados son confiables.
Para la prueba de ELISA se deben seguir las instrucciones descritas en el protocolo del
fabricante.
3.2.1. Interpretación de resultados de ELISA
Las lecturas se realizan cada 15 minutos después de adicionar el sustrato y los resultados se
interpretan de acuerdo a los siguientes criterios:
La reacción se considera positiva (presencia de la fitobacteria), si la lectura de la densidad óptica
es mayor o igual a 3 veces el valor de la media del testigo negativo (muestra sana o solución
amortiguadora). Si el testigo negativo presenta en promedio valores de densidad óptica menores
de 0.03, solo se consideran positivas aquellas muestras con densidades ópticas mayores a 0.100.
Cuando solo uno de los pozos de las muestras es positivo y/o si la diferencia con su repetición
es mayor o igual al 50% de su valor, la muestra debe procesarse nuevamente para determinar la
presencia de la bacteria.
3.3. Técnicas moleculares
3.3.1. Extracción de DNA total con el método de CTAB 2%
1) Revisar la muestra y seleccionar los tejidos de la nervadura central o porción basal de las
hojas, del peciolo o del punto de unión del peciolo con la rama, homogenizar el tejido y
pesar de 300 a 500 mg de tejido en una balanza analítica. Si no se observa la zona de avance;
tomar los tejidos que pudieran contener una infección latente. En caso de insectos tomar la
cabeza (en el cibario se concentra la bacteria) y remover los ojos para evitar inhibición en
la reacción de PCR.
2) Colocar el tejido en un mortero estéril y macerar con nitrógeno líquido hasta obtener una
consistencia de polvo. En caso de no contar con nitrógeno, la muestra puede ser congelada
a ultrabaja temperatura (-80 °C) y posteriormente macerarse.
[8]
Versión 1.0
3) Depositar el polvo en un tubo estéril de 2 mL y agregar 1.5 mL de buffer CTAB 2% (Anexo
8.1) previamente calentado a 80°C.
4) Incubar los tubos con las muestras a 80°C durante 15 minutos en baño María.
5) Transcurrido el tiempo dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente por 3 minutos y
agregar 100 µL de SDS (Sodio Duodecil Sulfato) 10%, homogenizar las muestras e incubar
nuevamente en baño María a 80 °C por 15 minutos.
6) Dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente de 3 a 5 minutos y centrifugar 15 minutos a
13 000 g. Transferir el sobrenadante a otro tubo estéril de 2 mL y agregar 500 µL de fenol:
cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), mezclar por inversión para homogenizar la
muestra (este paso puede realizarse dos veces).
7) Centrifugar a 13 000 g durante 15 minutos y transferir de 500 a 700 µL del sobrenadante a
un tubo estéril de 1.5 mL.
8) Agregar ½ volumen de etanol: metanol: ácido acético glacial (9:3:1), mezclar por inversión
(es posible dejar toda la noche a 4°C o bien 60 min a -20 °C) y centrifugar a 13 000 g por
10 minutos.
9) Decantar el sobrenadante, procurando no tirar la pastilla y lavarla con 500 μL de etanol:
agua: metanol: acetato de sodio 3M (30:9:5:1) (Anexo 8.2). Centrifugar a 13 000 g por 5
minutos.
10) Decantar el sobrenadante, sin perder la pastilla y lavarla con 500 μL de etanol al 70 %.
Centrifugar a 13 000 g por 5 minutos.
11) Dejar secar la pastilla y resuspender en 50-100 µL de agua libre de nucleasas.
3.3.2. Extracción de DNA con kit Plant DNAzol®
La extracción de DNA también puede realizarse con el kit comercial PlantDNAzol™ Reagent
(Invitrogen®, catalogo 10978021) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Nota: se puede emplear algún otro protocolo de extracción de DNA, siempre y cuando
el DNA extraído cumpla con los parámetros de calidad e integridad.
3.3.3. Verificación de la calidad del DNA mediante espectrofotometría
El DNA tiene una absorbancia máxima de 260 nm, mientras que las proteínas, las cuales son las
impurezas más comunes en el DNA, tienen una absorbancia máxima de 280 nm. Es por ello que
esas dos longitudes de onda son utilizadas para verificar la pureza del DNA.
[9]
Versión 1.0
Si la relación 260/280 está entre 1.7 y 2.0, la muestra de DNA se considera pura. Una relación
menor indica impurezas proteicas o fenólicas.
1) Analizar la calidad y cantidad de DNA extraído en el espectrofotómetro.
2) Realizar las diluciones correspondientes llevando la concentración del DNA de 20-30
ng/mL y verificar que la calidad se encuentre entre 1.7 y 2.0 de absorbancia.
1) En caso de que la muestra no se encuentre en el rango óptimo de pureza, se recomienda
realizar una nueva extracción de DNA o comprobar mediante amplificación del gen
endógeno que el DNA es amplificable.
3.3.4. Verificación de la integridad del DNA por electroforesis en gel de agarosa
1) Preparar un gel de agarosa al 1.5% y cargar en cada uno de los pozos, 5µL de DNA mezclado
con 3µL de buffer de corrida (naranja G 6X) (Anexo 8.2) previamente teñido con el colorante
GelRedTM.
2) Si no se cuenta con GelRedTM, el gel debe ser teñido con bromuro de etidio, añadiendo 0.5µL
por cada 100 mL de buffer TAE 1X. El manejo de este reactivo debe ser muy cuidadoso, se
debe destinar un área del laboratorio específica y así evitar contaminaciones con este
reactivo.
3) Correr la electroforesis a 95 volts durante 30 minutos.
4) Finalmente observar el gel bajo luz UV.
5) Si se observan bandas bien definidas, sin impurezas y sin degradación puede procederse a
realizar la reacción de la PCR, de lo contrario se recomienda realizar una nueva extracción
de DNA o comprobar mediante amplificación del gen endógeno que el DNA es amplificable.
3.3.5. PCR punto final para la detección de Xylella fastidiosa
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es un método de detección altamente sensible
y específico, por lo que se han desarrollado primers universales que amplifican DNA (Ácido
Desoxirribonucleico) de todas las variantes de X. fastidiosa como RST31 y RST33 (Minsavage
et al., 1994); sin embargo, al presentarse inconsistencias, ha sido necesario el diseño de varios
juegos de primers para detectar otras variantes de la bacteria y poder diferenciar las subespecies
en algunos casos (EFSA, 2016).
[10]
Versión 1.0
Los diferentes juegos de primers fueron diseñados por grupos de investigadores (Minsavage et
al., 1994, Rodrigues et al., 2003 y Francis et al., 2006) a partir de las secuencias de DNA del
genoma de la bacteria procedente de 4 aislamientos (Temecula, Dixon, Ann and CVC). En este
protocolo se describen las condiciones de tres juegos de primers: FXYgyr499 y RXYgyr907;
RST31 y RST33; HL5 y HL6.
Debido a la variabilidad genética de la bacteria se recomienda realizar la PCR convencional con
los primers FXYgyr499 y RXYgyr907, los cuales se diseñaron para detectar el gen de la gyrasa
B, éste es necesario para la duplicación de la bacteria y cualquier aislamiento de Xylella lo usa
para su reproducción (comunicación personal Dr. Jorge L. Mazza Rodrigues, University of
California – Davis).
1) Descongelar los reactivos que se enlistan a continuación y preparar la mezcla de reacción
con las cantidades indicadas en el Cuadro 1 (emplear los primers correspondientes, Cuadros
2, 4 y 6).
2) Programar el termociclador de acuerdo a las condiciones establecidas para cada juego de
primers empleados (Cuadros 3, 5 y 7).
Nota: se utiliza la misma cantidad de reactivos para los tres juegos de primers.
Cuadro 1. Preparación de la mezcla de reacción para la PCR punto final.
Reactivos Concentración
inicial
Concentración
final
Volumen
(µL)
Buffer de PCR 10X 1X 2.5
MgCl2 50 mM 1.5 mM 0.75
Mezcla de dNTP´s 10 mM 200 µM 0.5
Primer F 10 pmol/ µL 0.4 µM 1
Primer R 10 pmol/ µL 0.4 µM 1
Taq DNA polimerasa 5 U/µL 0.06 U/µL 0.3
DNA 20 ng/µL 100 ng 5
Agua grado PCR ------------- ---------------- 13.95
Volumen final 25
Cuadro 2. Primers FXYgyr499 y RXYgyr907 propuestos por Rodrigues et al., 2003.
Tipo Nombre del
primer
Secuencia (5´3´) Tamaño
(pb)
Sentido FXYgyr499 5´-CAG TTA GGG GTG TCA GCG-3´ 429 pb
Antisentido RXYgyr907 5´-CTC AAT GTA ATT ACC CAA GGT-3´
[11]
Versión 1.0
Cuadro 3. Programa de termociclaje para los primers FXYgyr499 y RXYgyr907.
Temperatura (°C) Tiempo Ciclos
95 5:00 1
95 0:30
35 60 0:30
72 0:45
72 7:00 1
Cuadro 4. Primers RST31 y RST33 propuestos por Minsavage et al., 1994.
Tipo Nombre
del primer
Secuencia (5´3´) Tamaño
(pb)
Sentido RST31 5´ GCGTTAATTTTCGAAGTGATTCGATTGC 3´ 733 pb
Antisentido RST33 5´ CACCATTCGTATCCCGGTG3´
Cuadro 5. Programa de termociclaje para los primers RST31 y RST33.
Temperatura (°C) Tiempo Ciclos
95 1:00 1
95 0:30
40 55 0:30
72 0:45
72 7:00 1
Cuadro 6. Primers HL5 y HL6 propuestos por Francis, et al. 2006.
Tipo Nombre del
primer
Secuencia (5´3´) Tamaño
(pb)
Sentido HL5 5´ AAGGCAATAAACGCGCACTA3´ 221 pb
Antisentido HL6 5´ GGTTTTGCTGACTGGCAACA3´
Cuadro 7. Primers del termociclador para los primers HL5 y HL6.
Temperatura (°C) Tiempo Ciclos
95 3:00 1
95 0:30
35 60 0:30
72 0:45
72 5:00 1
[12]
Versión 1.0
3.3.6. PCR tiempo real para la detección de Xylella fastidiosa
La qPCR (quantitative polymerase chain reaction) es una variante de la PCR empleada para
amplificar y cuantificar simultáneamente de forma absoluta el producto de la amplificación del
DNA, cuantifica la fluorescencia de una molécula reportera (sonda), la cual es medida a lo largo
del termociclaje.
1) Descongelar los reactivos que se enlistan a continuación y preparar la mezcla de reacción
con las cantidades indicadas en el Cuadro 8, empleando los primers y sonda
correspondientes (Cuadro 9).
2) Programar el termociclador de acuerdo con las indicaciones del Cuadro 10.
Nota: usar tubos o placas ópticas para qPCR de acuerdo al tipo/marca de termociclador
utilizado. Las condiciones de este ensayo se estandarizaron en el termociclador marca
Bio-Rad CFX-96 real-time thermocycler (Bio-rad Laboratories1).
Cuadro 8. Preparación de la mezcla de reacción para la PCR tiempo real.
Reactivos Concentración
inicial
Concentración
final
Volumen
(µL)
Buffer de PCR 10X 1X 2.2
MgCl2 50 mM 4 mM 1.76
Mezcla de dNTP´s 10 mM 0.30 µM 0.6
Primer F 10 pmol/ µL 0.30 µM 0.6
Primer R 10 pmol/ µL 0.30 µM 0.6
Taq DNA
polimerasa
5 U/µL 0.09 U/µL 0.4
Sonda 10 pmol/ µL 0.04 µM 0.1
DNA 20 ng/µL 80 ng 4
Agua grado PCR 11.64
Volumen final 22
Cuadro 9. Primers XF-F y XF-R propuestos por Harper et al., 2010.
Tipo Nombre
del primer
Secuencia (5´3´)
Sentido XF-F 5´ -CACGGCTGGTAACGGAAGA-3´
Antisentido XF-R 5´- GGGTTGCGTGGTGAAATCAAG-3´
XF-P
(sonda) 5´ 6FAM- TCGCATCCCGTGGCTCAGTCC-BHQ-1-3´
sonda
Taqman
[13]
Versión 1.0
3.3.7. Controles para las pruebas moleculares
Se deben incluir controles que permitan disminuir la incertidumbre de los resultados. Los
controles corresponden a:
Control positivo: asegura la funcionalidad de los reactivos de PCR. Contiene DNA o clona de
la plaga de interés y debe estar confirmado mediante secuenciación.
Control negativo de matriz: este control corresponde a un extracto de vid sin la plaga. Asegura
que no exista reacción cruzada con la matriz o contaminación durante la extracción.
Control negativo de reactivos: es la mezcla de reacción sin DNA molde o clona. Descarta
falsos positivos.
3.3.8 Interpretación de resultados de PCR punto final
Primers FXYgyr499 y RXYgyr907 propuestos por Rodrigues et al., 2003. Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% en TAE (Tris-acetate-EDTA) 1x, a 100 Volts por 60
minutos.
Figura 2. Electroforesis de los productos de PCR con los primers FXYgyr499 y RXYgyr907. MM: Marcador
Molecular 1Kb (Invitrogen), 1: control positivo, 2-11, muestras vegetales, 12 control negativo.
Cuadro 10. Programa del termociclador para los primers XF-F y XF-R.
Temperatura °C Tiempo Ciclos
50 2:00 1
95 10:00 1
94 0:10 39
62 0:40
MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
429 pb
pbpb
[14]
Versión 1.0
Primers RST31 y RST33 propuestos por Minsavage et al., 1994.
Electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % en TAE (Tris-acetate-EDTA) 1x, a 100 Volts por 60
minutos.
Figura 3. Electroforesis de los productos de PCR con los primers RST31 y RST33. MM: Marcador Molecular
100pb (Invitrogen), 1 y 2 controles positivos, 4: control negativo, 5-7: muestras vegetales.
Primers HL5 y HL6 propuestos por Francis, et al. 2006.
Electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % en TAE (Tris-acetate-EDTA) 1x, a 100 Volts por 60
minutos.
Figura 4. Electroforesis de los productos de PCR con los primers HL5/HL6. MM: Marcador Molecular 1Kb
(Invitrogen), 1: control positivo, 2-8: muestras vegetales, 9 y 10: control negativo.
Los resultados son válidos solamente bajo los siguientes criterios:
El control positivo genera una banda de 429 pb, 733 pb y 221 pb con los primers
FXYgyr499/RXYgyr907, RST31/RST33 y HL5/HL6 respectivamente.
El control negativo de matriz y el control negativo de reactivos no deben de generar bandas.
MM 1 2 3 4 5 6 7
MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
221 pb
733 pb
[15]
Versión 1.0
3.3.9 Interpretación de resultados de qPCR
El análisis y cuantificación de los datos se realiza en la Fase Exponencial de la reacción
Resultado negativo: muestras con valores de FAM Cq=0.00 o ˃35.00
Resultado positivo: muestras con valores de FAM Cq ˂35.00
Muestras con valores de FAM Cq en el rango de 32.01 a 34.99 necesitan confirmación, mediante
una segunda corrida.
Los resultados son válidos solamente bajo los siguientes criterios:
El control positivo y las muestras positivas generan una curva de amplificación con los primers
XF-F/ XF-R específicos a Xylella fastidiosa, así como se presenta en la Figura 5.
El control negativo de matriz y el control negativo de reactivos no deben de generar una curva
de amplificación con los primers XF-F/ XF-R.
3.4. Identificación del patógeno
El requisito mínimo de identificación de Xylella fastidiosa, es que al menos dos pruebas deben
ser positivas con sus controles correspondientes. Esto debido a que Xylella fastidiosa muestra
una alta variabilidad genética.
4. REGISTROS
Tener registros y evidencias de todo el proceso que implique el diagnóstico de la plaga conforme
al manual del sistema de gestión de calidad.
Ciclos (Cq) entre 15 y
35 indican resultados
positivos
Ciclos (Cq) 0, N/A y
mayores a 35 indican
resultados negativos
Figura 5. Curva de cuantificación para la detección de Xylella fastidiosa en PCR tiempo real.
[16]
Versión 1.0
1) La muestra original debe ser resguardada a 4°C hasta que el proceso de diagnóstico finalice.
2) El DNA obtenido de material vegetal y cepas bacterianas deben ser almacenados a -20°C o
bien a -80°C, debidamente identificado.
3) Cuando aplique las cepas bacterianas deben ser conservadas en una mezcla de caldo nutritivo
con glicerol (1 parte de caldo nutritivo por 2 partes de glicerol) a -80°C.
Una vez finalizado el diagnóstico, el tejido vegetal junto con las cepas bacterianas que no se
utilizaron, deben ser inactivados en autoclave a 121°C y 15lb durante 40 minutos.
5. CONTACTO PARA INFORMACIÓN ADICIONAL
Correo: [email protected],
Teléfono: 01 (55) 59 05 1000 Ext. 51314 y 51333.
6. RECONOCIMIENTO
Este protocolo fue elaborado por el Laboratorio de Bacteriología (Andrés Aguilar Granados,
Bárbara Hernández Macías, Lidia Guadarrama Valencia y Sandra Lourdes Moya Hernández),
revisado por el Departamento de Fitopatología (María del Rocío Hernández Hernández) y
editado por el Grupo DiaFi (Andrés Aguilar Granados y Ariana Guadalupe Robles Zárate).
7. REFERENCIAS
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based PCR primers for specific and sensitive detection and quantification of Xylella
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[17]
Versión 1.0
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Minsavage, G. V., Thompson, C. M., Hopkins, D. L., Leite, R. M. V. B. C. y Stall R. E. (1994).
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in plant tissue. Phytopathology 84, 446-461.
Nunney, L., Schuenzel E. L., Scally, M., Bromley, R. E. y Stouthamer, R. (2014). Large-scale
intersubspecific recombination in the plant-pathogenic bacterium Xylella fastidiosa is
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Rodrigues, J. L. M., Silva-Stenico, M. E., Gomes, J. E., Lopes, J. R. S.y Tsai, S. M. (2003).
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Insect Samples by Using 16S rRNA and gyrB Sequences. Appl Environ Microbiol.
69(7), 4249–4255. doi:10.1128/AEM.69.7.4249-4255.2003.
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subspecies: X. fastidiosa subsp. pierce, subsp. nov., X. fastidiosa subsp. multiplex subsp.
nov., and X. fastidiosa subsp. pauca subsp. nov. Syst Appl Microbiol. 27, 290–300.
Schuenzel, E. L., Scally, M., Stouthamer, R. y Nunney, L. (2005). A multigene phylogenetic
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Xylella fastidiosa. Appl Environ Microbiol; 71, 3832–3839.
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Wells, J. M., Raju, B.C., Hung, H. Y., Weisburg, W. G., Mandelco-Paul, L., and Brenner, D. J.
1987. Xylella fastidiosa gen. Nov., sp. nov: Gram negative, xylem limited, fastidious
plant bacteria related to Xanthomonas spp. Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 136-143.
Forma recomendada de citar:
SENASICA. Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. (2018).
Protocolo de Diagnóstico: Xylella fastidiosa Wells, et al., 1987 (Enfermedad de Pierce)
[Versión 1.0]. Tecámac, México: Autor.
[18]
Versión 1.0
8. ANEXO
8.1. Medios de cultivo
Medio PW
Reactivo Cantidad
Peptona 4.0 g
Triptona (Peptona de Caseína) 1.0 g
Cloruro de Hemina (Hemin chloride) 0.010 g
Sulfato de Magnesio pentahidratado 0.4 g
Fosfato de Potasio 1.2 g
Fosfato de Potasio monobásico 1.0 g
Rojo de fenol 0.020 g
L-glutamina 4.0 g
Albumina de suero de bovino fracción V (BSA) 6.0 g
Agar 15.0 g
pH 6.8
Esterilizar durante 20 minutos a 115 lb de presión.
Medio PD2
Reactivo Cantidad
Peptona 4.0 g
Triptona (Peptona de Caseína) 1.0 g
Citrato trisodico 1.0 g
Sucsanato de Sodio 1.0 g
Cloruro de Hemina (Hemin chloride) 0.010 g
Almidón de papa soluble 2.0 g
Sulfato de Magnesio pentahidratado 0.4 g
Fosfato de Potasio 1.5 g
Fosfato de Potasio monobásico 1.0 g
Agar 12.0 g
pH 6.8
Esterilizar durante 20 minutos a 115 lb de presión, cuando el medio alcance una temperatura
aproximada de 50 °C agregar por filtración Millipore el Cloruro de Hemina previamente diluido
en 5mL de agua.
Medio CS 20
Reactivo Cantidad
Peptona de soya 2.0 g
Triptona (Peptona de Caseína) 1.0 g
[19]
Versión 1.0
Cloruro de Hemina (Hemin chloride)
0.010 g
Sulfato de Magnesio pentahidratado 0.4 g
Fosfato de Amonio dibásico 0.85 g
Fosfato de Potasio dibásico 1.0 g
Dextrosa 1.0 g
Almidón de papa soluble 2.0 g
L- Histidina 1.0 g
Albumina de suero de bovino fracción V (BSA) 2.0 g
Rojo de fenol 0.010 g
Agar 15.0 g
pH 6.8
Esterilizar durante 20 minutos a 115 lb de presión. Los aminoácidos (Glutamina e Histidina) se
preparan por separado, así como el BSA, agregar por filtración Millipore.
Nota: en todos los medios la cantidad de los reactivos está calculada para 1L.
8.2 Soluciones amortiguadoras
Buffer CTAB 2%
Reactivo Cantidad CTAB 20.0 g
NaCl 82.0 g
Tris base 2.42 g
EDTA 1.46 g
Agua destilada 1000 mL
Mezclar bien los reactivos y agregar lentamente 750 mL de agua. Si permanecen grumos,
calentar en microondas o en parrilla, hasta ebullición y seguir agitando. Aforar a un litro y
esterilizar en autoclave durante 20 minutos a 115 lb de presión.
Acetato de sodio 3M
Reactivo Cantidad Acetato de sodio 180.55 g
Ácido acético glacial 45.7 mL
Agua destilada 1000 mL
Disolver el acetato de sodio en 500 mL de agua y posteriormente agregar lentamente el ácido
acético glacial. Ajustar el pH a 5.2 y aforar a 1L.
[20]
Versión 1.0
Buffer de corrida naranja G 6X
Reactivo Cantidad Naranja G 60 mg
Glicerol 18 mL
Agua 40 mL
Aforar la mezcla a 50 mL y almacenar a 4 °C.
