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Expresión de Lignino peroxidasa en Pichia pastoris X-33 bajo el control del promotor

constitutivo GAP

Erika Juliana Duarte Sabogal

Directora

Claudia Marcela Rivera-Hoyos, Biól., M.Sc. Ph.D.

Asesor

Raúl A. Poutou-Piñales, Bq., M.Sc., Ph.D.

Asesora

Leidy Diana Ardila-Leal, Biól., M.Sc., Ph.D Cand.

Pontificia Universidad Javeriana

Facultad de Ciencias

Trabajo de grado

Bogotá D.C.

Junio de 2020

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Expresión de Lignino peroxidasa en Pichia pastoris X-33 bajo el control del promotor

constitutivo GAP

Erika Juliana Duarte Sabogal

APROBADO

Concepción Puerta Bula, Bact, Ph.D. Marcela Franco Correa, Ph.D. Decana académica Facultad de Ciencias Directora carrera microbiología industrial

Claudia Rivera-Hoyos, Biól., M.Sc. Ph.D. Aura Marina Pedroza, Ph.D.

Directora Evaluadora

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NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se ve en ellas

el anhelo de buscar la verdad y la justicia”

Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1946

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AGRADECIMIENTOS

A Claudia Rivera Hoyos por permitirme ser parte de este proyecto, por su disposición, paciencia y por enseñarme el valor del trabajo en equipo. A Leidy Ardila por su acompañamiento en el laboratorio, por compartirme sus conocimientos y sus críticas constructivas a lo largo de este proceso. A mi familia por el apoyo que recibí de ellos, por su ayuda incondicional y porque han sido el soporte en mi vida. A mis amigos Lorena, Valentina, Karen, Nixon, Paula M y Paula L por acompañarme y ayudarme a culminar este proceso.

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TABLA DE CONTENIDOS

CAPÍTULO 1. DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA TESIS

1.1 Introducción ………………………………………………………………………………. 9

1.2 Descripción del problema de investigación y Justificación ………………………………… 9

1.3 Objetivos ………………………………………………………………………………… 10

1.3.1 Objetivo general .……………………………………………………………………10

1.3.2 Objetivos específicos ………………………………………………………………. 10

1.4 Contexto general de la metodología ……………………………………………………… 11

1.5 Bibliografía .……………………………………………………………………………… 11

CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO

2.1 Contaminación por residuos industriales ………………………………………………… 12

2.2 Estrategias actuales ………………………………………………………………………. 12

2.3 Alternativas biológicas …………………………………………………………………… 13

2.4 Hongos de podredumbre blanca ………………………………………………………… 13

2.4.1 Phanerochaete chrysosporium …………………………………………………………… 14

2.4.2 Enzimas ligninolíticas ……………………………………………………………… 14

2.4.3 Lignino peroxidasa (LiP).....………………………………………………………… 15

2.5 Limitaciones en el uso de hongos ...……………………………………………………… 15

2.6 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) ………………………………………………………… 15

2.6.1 Sistema de expresión en P. pastoris …………………………………………………. 16

2.7 Bibliografía ……………………………………………………………………………… 16

CAPÍTULO 3. DISEÑO DE LA SECUENCIA Y CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR DE

EXPRESIÓN pGAPZαA-LiPH8

3.1 Introducción …………………………………………………………………………… 19

3.2 Metodología ……………………………………………………………………………… 19

3.3 Optimización y diseño de la secuencia sintética de la lignino peroxidasa H8 (LiPH8) de P.

chrysosporium ………………………………………………………………………………… 19

3.4 Microorganismos y vectores ……………………………………………………………. 19

3.5 Construcción del vector de expresión pGAPZαA-LiPH8 ………………………………. 21

3.6 Resultados………………………………………………………………………………. 22

3.6.1 Optimización y diseño de la secuencia sintética de la Lignino peroxidasa H8 (LiPH8) de P.

chrysosporium …………………………………………………………………………………. 22

3.6.2 Transformación de Escherichia coli con el vector pUC57 …………………………… 22

3.6.3 Restricción enzimática y transformación de Escherichia coli con el vector pGAPZαA ..23

3.6.4 Obtención de clones transformantes de Escherichia coli con pGAPZαA y LiPH8……24

3.7 Discusión ……………………………………………………………………………… 25

3.8 Bibliografía ..…………………………………………………………………………… 25

6

CAPÍTULO 4. PRODUCCIÓN DE LiP EN SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGA

(Revisión de literatura)

4.1 Introducción ….………………………………………………………………………… 28

4.2 Ejemplos de expresión de proteínas en Pichia pastoris …………………………………… 29

4.3 Expresión de lignino peroxidasa (LiP) …...……………………………………………… 30

4.4 Expresión de proteínas heterólogas usando un promotor constitutivo ….………………. 31

4.5 Expresión de proteínas heterólogas usando un promotor inducible ...…………………… 31

4.6 Comparación entre un promotor inducible y uno constitutivo ...………………………… 32

4.7 Bibliografía ...……………………………………………………………………………. 34

CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1 Conclusiones …………………………………………………………………………… 37

5.2 Recomendaciones ……………………………………………………………………… 37

7

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla1. Comparación de métodos para el pre-tratamiento de desechos industriales ………………… 8

Tabla 2. Ejemplo de las proteínas heterólogas principales producidas utilizando Pichia pastoris ………16

Tabla 3. Resultados de la transformación de E. coli JM109 ……………………………………… 25

Tabla 4. Promotores de Pichia pastoris …………………………………………………………… 30

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Reacción catalítica de las enzimas ligninolíticas. A. Lacasa, B. Lignino peroxidasa, C. Manganeso

peroxidasa …………………………………………………………………………………… 14

Figura 2. Mapa de restricción del plásmido pUC57 ……………………………………………… 20

Figura 3. Mapa de restricción del plásmido pGAPZαA ………………………………………… 20

Figura 4. Mapa de restricción del plásmido pGAPZαA con el gen LiPH8 ………………………… 21

Figura 5. Sitios de corte de las enzimas EcoRI y NotI en el plásmido pGAPZαA, esta predicción se realizó

utilizando la plataforma NEBcutter V2.0 ……………………………………………………… 21

Figura 6. Mapa de restricción del plásmido pGAPZαA con el gen LiPH8 cortado con la enzima XbaI, esta

predicción se realizó utilizando la plataforma NEBcutter V2.0 …………………………………… 22

Figura 7. Electroforesis de la extracción de DNA plasmídico de tres clones transformantes de E.coli con

pUC57 y LiPH8 ……………………………………………………………………………… 23

Figura 8. Restricción enzimática con el plásmido pUC57 y el gen LiPH8 usando las enzimas EcoR1 y

Not1 ………………………………………………………………………………………… 24

Figura 9. Mapa de restricción del promotor pGAP(A) y pAOX1(B) ……………………………… 33

8

RESUMEN

Las problemáticas actuales relacionadas con el vertimiento de sustancias tóxicas a diferentes cuerpos de

agua generan gran preocupación, ya que representa un riesgo para los ecosistemas y las especies que los

habitan, lo que conlleva a la necesidad de generar alternativas que permitan desarrollar un proceso de

biorremediación sin provocar efectos adversos, como el uso de tratamientos biológicos basados en el uso

de microorganismos productores de enzimas capaces de degradar diferentes compuestos, con lo que sería

posible reducir los niveles de contaminación. Es por esto que, en este estudio se realizó la expresión de

lignino peroxidasa (E.C. 1.11.1.14) recombinante en Pichia pastoris, bajo el control del promotor constitutivo

GAP (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa). Para esto se optimizaron diferentes parámetros gen

codificante determinantes para la expresión de esta enzima, integrándolo inicialmente en E. coli con el vector

de replicación pUC57 con el fin de aumentar la concentración del material genético, para después realizar

un constructo con el plásmido pGAGαA, nuevamente insertándolo en el genoma esta bacteria, una vez que

se obtuviera la mayor cantidad posible de dicho material genético se esperaba realizar una electroporación

con Pichia pastoris, con lo que finalmente se llevaría a cabo una cinética de crecimiento y una evaluación la

actividad enzimática, así como la determinación otros parámetros fundamentales. Adicionalmente, se

realizó una revisión de literatura con respecto a la producción de diferentes proteínas heterólogas en

sistemas inducibles y constitutivos especialmente empleando pAOX1 y pGAP , a partir de lo cual, es posible

concluir que el uso de este último implica mayores beneficios, así como más facilidades en su uso, puesto

que al no necesitar de una sustancia inductora y realizar la trascripción de manera constante, es posible

obtener mejores resultados con respecto a la producción y eficiencia de estas.

Palabras clave: lignino peroxidasa, pGAPZαA, proteínas heterólogas, Pichia pastoris.

ABSTRACT

The current problems related to the discard of toxic substances into different water sources are of great

concern, since they represent a risk to the ecosystems and species they inhabit, which leads to the need to

generate alternatives that can develop a bioremediation process without cause adverse effects, such as the

use of biological treatments based in the use of enzyme-producing microorganisms capable of degrading

different compounds, which could reduce contamination levels. That is why, in this study, we sought to

carry out the production of lignin peroxidase recombinantly in the Pichia pastoris expression system, using

the constitutive promoter GAP (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). For this, optimization of the

gene coding for this enzyme was performed, inserted optimally in E. coli with the replication vector pUC57

in order to increase the concentration of the genetic material, to then carry out a construct with the plasmid

PGAGαA, again inserted into this bacteria, once the greatest possible amount of said genetic material is

obtained, it was expected to perform an electroporation with Pichia pastoris, which would finally carry out

growth kinetics and an evaluation of the enzymatic activity, as well as the determination of other parameters

fundamental. In addition, a literature review was carried out regarding the production of different

heterologous proteins in inducible and constitutive systems, especially using pAOXI and pGAP, from which

it is possible to conclude that the use of the latter against the greatest benefits, as well as more ease in its

use, since by not needing an inducing substance and performing the transcription constantly, it is possible

to obtain better results regarding the production and efficiency of these.

Key words: lignin peroxidase, pGAPZαA, heterologous proteins, Pichia pastoris.

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CAPÍTULO 1

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA TESIS

1.1 Introducción

La producción y el consumo de determinados productos como los plásticos, las pinturas y los textiles se ha

incrementado debido a la alta demanda que se genera por el aumento constante de la población a nivel

mundial, los residuos liquidos que generan las diferentes industrias en los procesos de fabricación son

descargados directamente al medio ambiente, en su mayoría a cuerpos de agua como ríos o arroyos que

posteriormente desembocan en mares o en el océano, estos residuos poseen una alta carga de contaminantes

químicos que tienen efectos negativos sobre las especies animales y vegetales que habitan dichos

ecosistemas. Los sistemas acuáticos se ven cada vez más amenazados debido a la acumulación de diferentes

compuestos con altos niveles de toxicidad y a la difícil degradación de estos, afectando así el equilibrio de

las redes tróficas generando un daño casi irreversible sobre el entorno [1].

Se han empleado diferentes estrategias para la degradación de muchos de estos contaminantes, dentro de

las cuales se encuentra el uso de químicos en altas concentraciones, pero estas estrategias no son 100 %

efectivas y además, el consumo de energía que requieren es muy alto, por lo cual los costos se incrementan.

Con la necesidad de detener esta problemática, en los últimos años se han realizado estudios utilizando

modelos biológicos que producen metabolitos capaces de degradar estos contaminantes como es el caso de

las enzimas ligninolíticas, que pueden degradar compuestos con anillos aromáticos como colorantes textiles,

hidrocarburos aromáticos policíclicos, fenoles, pentaclorofenol, entre otros [2].

Existe gran variedad de hongos filamentosos con capacidad de producir dichas enzimas como lo son

Phanerochaete chrysosporium, Bjerkandera adusta, Pleurotus ostreatus, Trametes versicolor, etc., lo cual representa una

posibilidad para el desarrollo de tratamientos biológicos sostenibles. A pesar de esto, la producción a escala

industrial con estos organismos es difícil debido a su crecimiento miceliar y su baja tasa de crecimiento en

comparación con otros microorganismos, como por ejemplo, las levaduras, por lo cual la recuperación del

producto final se dificulta generando pérdidas, por ende, se ha estudiado la expresión de enzimas

recoimbinantes en microorganismos donde se facilite el cultivo, se incremente la producción y se facilite la

obtención del producto final.

Un ejemplo de este tipo de microorganismos son las levaduras como Pichia pastoris o Sacharomyces cerevisiae,

ya que son capaces de realizar modificaciones post-traduccionales, características de los eucariotas

superiores, además, de tener una alta tasa de crecimiento en sustratos relativamente sencillos, lo que

disminuye los costos; aumentando así la productividad del bioproceso [3].

1.2 Descripción del problema de investigación y Justificación

Los compuestos fenólicos se usan ampliamente en la industria para la producción de pinturas, surfactantes,

fertilizantes, explosivos, textiles, gomas, antioxidantes, plásticos entre otros, además de ser utilizados en la

refinación de petróleo, productos petroquímicos y productos farmacéuticos [1] por lo que la generación de

10

aguas residuales aumenta considerablemente debido a la alta demanda de estos productos. La descarga de

efluentes contaminados con estos compuestos y sus derivados a fuentes hídricas constituye un problema

ambiental en cuanto a los ecosistemas acuáticos y de salud tanto para los humanos como para los animales,

ya que, la exposición a corto plazo induce la formación de ampollas cutáneas inmediatas, problemas

respiratorios y quemaduras oculares. La exposición crónica y a largo plazo puede causar fatiga, problemas

pulmonares, debilidad, daño al sistema inmunitario y cáncer [4]. De acuerdo con la Agencia de Protección

Ambiental de EE. UU. (EPA) y el Inventario Nacional de Emisiones de Contaminantes (NPRI), el fenol

es un contaminante prioritario y ocupa el puesto 11 entre 126 químicos no deseados [5].

Actualmente se emplean diferentes tratamientos biológicos, físicos y químicos como la destilación, la

adsorción y la extracción líquido-líquido, entre otras, para el manejo de aguas residuales con estas

características, pero estos no son sostenibles ambientalmente debido a la carga de reactivos químicos que

se emplean, constituyendo una desventaja debido a la toxicidad generada, costos económicos elevados y un

alto consumo energético [1]; generando la necesidad de explorar alternativas no convencionales de

tratamiento como el uso de enzimas recombinantes expresadas en microorganismos fáciles de manipular y

cultivar, obtenidas a partir de organismos con la capacidad de degradar compuestos contaminantes como,

por ejemplo, los de naturaleza fenólica como los colorantes.

Las enzimas producidas por hongos de podredumbre blanca como la Lignino peroxidasa tienen un alto

potencial en cuanto a la descontaminación de efluentes, esto debido a que, por su alto potencial redox y su

baja especificidad tienen la capacidad de actuar sobre compuestos fenólicos y no fenólicos, aromáticos y

halogenados [2], lo que permite que sean utilizadas para el tratamiento de aguas residuales contaminadas.

El tratamiento de aguas residuales contaminadas mediante el uso enzimas permite la eliminación de los

compuestos no deseados sin causar reacciones adversas que puedan afectar negativamente al medio

ambiente y las especies que lo habitan, por lo cual permite una solución sostenible frente a esta

problemática.

La inserción de vectores recombinantes para la expresión de Lignino peroxidasa de Phanerochaete chrysosporium

en el hongo levaduriforme Pichia pastoris regulada bajo el control del promotor constitutivo GAP permitiría

la obtención de esta enzima: facilitando los procesos de producción, al alcanzar concentraciones superiores

a las secretadas normalmente por los hongos filamentosos, evitando los inconvenientes por el crecimiento

hifal [1].

1.3 Objetivos

1.3.1 Objetivo general

- Determinar los avances relacionados con la producción de Lignino peroxidasa (E.C. 1.11.1.14) de

Phanerochaete chrysosporium en sistemas de expresión heteróloga.

1.3.2 Objetivos específicos

- Diseñar una secuencia nucleotídica optimizada a partir de la Lignino peroxidasa H8 de Phanerochaete

chrysosporium que permita la expresión heteróloga de la enzima recombinante en Pichia pastoris bajo

regulación constitutiva.

11

- Esclarecer el estado actual del desarrollo de los sistemas de expresión heteróloga para enzimas

ligninolíticas como la Lignino peroxidasa de Phanerochaete chrysosporium producida bajo regulación

constitutiva e inducible.

1.4 Contexto general de la metodología

Se realizó un análisis bioinformático inicial para optimizar la secuencia del gen LiPH8 con relación al uso

de codones para la expresión constitutiva bajo el promotor pGAP en P. pastoris, contenido de GC (guanina-

citosina), elementos reguladores cis y secuencias repetitivas. El gen sintético optimizado, presente en el

plásmido de replicación pUC57 se replicó en Escherichia coli, a partir del cual se obtuvo el gen de interés y se

insertó en el vector de expresión pGAPZαA, que posteriormente será integrado al genoma de la levadura.

Adicionalmente, se realizó una revisión de literatura para determinar el estado actual del desarrollo de los

sistemas de expresión heteróloga para enzimas ligninoíticas como la Lignino peroxidasa de Phanerochaete

chrysosporium producida bajo regulación constitutiva e inducible.

1.5 Bibliografía

[1] Serrano R, Marrero D, Fando. Pichia pastoris: una plataforma para la producción de proteínas heterólogas.

Revista CENIC. Ciencias Biológicas, 2016; 67:77-72

[2] Villegas L, Mashhadi N, Chen M, Mukherjee D, Taylor K, Biswas N. A Short review of techniques for

phenol removal from wastewater. Current Pollution Reports. 2016; 2(3):157-167.

[3] Kirk T, Schultz E, Connors W, Lorenz L, Zeikus J. Influence of culture parameters on lignin metabolism

by Phanerochaete chrysosporium. Archives of Microbiology. 1978; 117(3):277-285.

[4] Shaheen R, Asgher M, Hussain F, Bhatti H. Immobilized lignin peroxidase from Ganoderma lucidum IBL-

05 with improved dye decolorization and cytotoxicity reduction properties. International Journal of

Biological Macromolecules. 2017; 103:57-64.

[5] National Pollutant Release Inventory (NPRI) Substance List. Available from: https://ec.gc.ca/inrp-

npri/default.asp?lang=En&n= E2BFC2DB-1.

12

CAPÍTULO 2

MARCO TEÓRICO

2.1 Contaminación por residuos industriales

Actualmente muchos procesos industriales son responsables directamente de la contaminación ambiental,

ya que al generar residuos líquidos de producción que son descargados con aguas residuales en fuentes de

agua provocan un aumento en la toxicidad de la misma y por ende influyen negativamente tanto en los

ecosistemas acuáticos como terrestres; estas industrias representan una gran amenaza al desarrollo de los

procesos naturales de estos ecosistemas, debido a que, como por ejemplo, en el caso de los colorantes

textiles ya sean orgánicos o inorgánicos impiden la penetración normal de la luz al agua [1]. Además,

representan un problema de salud por el consumo de estas aguas, ya que dentro de los contaminantes que

se pueden encontrar están los tintes azoicos que están relacionados con cáncer de vejiga, hepatocarcinomas

entre muchas otras patologías [2], por lo cual, estos requieren un control mediante procesos alternativos

como el uso del potencial enzimático de diferentes microorganismos.

Debido a la importancia del fenol como contaminante, las entidades reguladoras a nivel internacional

estipulan límites rigurosos en cuanto a la descarga de fenoles en el medio ambiente [3], uno de ellos es la

Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. (EPA) la cual fijó un estándar de pureza de agua de menos

de 1 ppb para este compuesto en agua superficial [4], por otro lado en la resolución 0631 del 2015 establecen

que para compuestos fenólicos el valor máximo permisible para el vertimiento de aguas residuales es de

0,20 mg/L [5], la importancia de establecer estos límites radica en que el nivel de toxicidad de encuentra en

un rango de 9 a 25 mg/L tanto para humanos como para animales acuáticos [4], si se exceden esos límites

se pueden desencadenar consecuencias que constituyen un problema de salud pública, dentro de estos

efectos se encuentra la anorexia, pérdida de peso, vértigo, diarrea, incluso paro respiratorio si la dosis llega

a ser letal, mientras que en los animales provoca reducción del peso corporal, retraso en el crecimiento y

desarrollo anormal en la descendencia [6,7].

2.2 Estrategias actuales

En la actualidad se emplean diferentes métodos para el tratamiento o pretratamiento de efluentes

industriales, dentro de los cuales se encuentran los procesos físicos asociados a tratamientos terciarios como

los sistemas de filtración y ultra filtración entre otros, que buscan separar las partículas del agua, pero estos

no permiten obtener agua libre de componentes tóxicos como los alquifenoles, colorantes azoicos, ftalato,

etc. por otro lado, se encuentran las estrategias químicas, para las cuales se emplean altas temperaturas para

descomponer diferentes compuestos pero el alto uso de la electricidad incrementa significativamente los

costos, además, de esto ninguno de los procesos son sostenibles con el ambiente. Para el tratamiento de

biomasa lignocelulósica en la cual estas enzimas tienen gran importancia se ha reportado que el uso de estas

tiene un mejor impacto a nivel medioambiental como se muestra en la Tabla 1, lo que evidencia que, aunque

no se esté hablando del mismo proceso, el uso de estas moléculas ofrece una alternativa eficiente.

13

Tabla1. Comparación de métodos para el pre-tratamiento de desechos industriales [8]

Proceso de pretratamiento

Delignificación de biomasa

Duración del proceso

Costos Impacto medio ambiental

Físico Alta - Alto Negativo

Químico Alta - Alto Negativo

Hongos Alta 6 a 45 días Bajo Positivo

Enzimático Alta 2 a 48 horas Alto Positivo

Como se observa en la Tabla 1, tanto los tratamientos químico como físicos tiene un alto costo y un

impacto negativo para el medio ambiente a pesar de tener un alto nivel cuando se habla delignificación, por

otro lado el uso de hongos tiene un tiempo de duración demasiado alto, lo que no permite un proceso

eficiente, y por ultimo está el tratamiento enzimático, el cual a pesar de tener un alto costo, tiene un impacto

positivo ya que no altera el entorno y el proceso podría darse en un máximo de dos días.

2.3 Alternativas biológicas

Debido a los inconvenientes expuestos en el punto anterior se ha estudiado la actividad biológica que tienen

ciertas enzimas para degradar los compuestos tóxicos como los fenoles, que se encuentran en los efluentes,

los microorganismos, en especial los hongos poseen la habilidad de expresar dichas enzimas, se encuentran

tres grupos capaces de sintetizar estas enzimas los hongos de podredumbre blanca los cuales poseen todo

el complejo enzimático, los hongos de podredumbre marrón o café y azul [9].

2.4 Hongos de podredumbre blanca

Los Basidiomicetes son un grupo diverso en hongos dentro del cual se encuentran los hongos de pudrición

de blanca, los principales géneros son Bjerkandera, Dichomitus, Phanerochaete, Pleurotus y Trametes. Estos hongos

son capaces de degradar la lignina y también una amplia gama de contaminantes orgánicos complejos y

tóxicos como dioxinas, hidrocarburos de petróleo, trinitrotolueno, efluentes industriales de tintes, bifenilos

policlorados, herbicidas y pesticidas [10]; debido a que los hongos de podredumbre blanca producen una

amplia variedad de enzimas extracelulares, entre las que se encuentran principalmente la lacasa (Lac) (EC

1.10.3.2), lignino peroxidasa (LiP) (EC 1.11.1.7) y manganeso peroxidasa (MnP) (EC 1.11.1.7).

Este complejo enzimático producido por los microorganismos anteriormente mencionados realiza

diferentes acciones, como la ruptura de la molécula de lignina, degradación de una gran variedad de

xenobióticos y biorremediación de desechos industriales tóxicos. Por otro lado, una vez realizados los

procesos de purificación, caracterización e inmovilización también pueden aplicarse en la industria papelera,

llevando a cabo procesos de bio-pulpeo y bio-blanqueamiento, evitando así la generación de contaminantes

y sustituyendo productos químicos que se emplean para dichos procesos [11].

14

2.4.1 Phanerochaete chrysosporium

Phanerochaete chrysosporium es un hongo filamentoso Basidiomycota, perteneciente a la familia Corticiaceae, con

una temperatura óptima de crecimiento de 39 ºC, termotolerante, (12 a 50 ºC), clasificado dentro del grupo

de hongos de podredumbre blanca debido a su facultad de producir enzimas ligninolíticas como la

manganeso peroxidasa y lignino peroxidasa, ha sido estudiado ampliamente en aplicaciones para procesos

biotecnológicos, por su capacidad de degradar contaminantes orgánicos persistentes, que son moléculas

sintetizadas químicamente como herbicidas, pesticidas, insecticidas y organoclorados [12], además, también

actúa sobre la lignina, siendo uno de los microorganismos con mayores porcentajes de degradación de este

polímero; donde incluso se han reportado porcentajes de degradación del 90 % en un período de 2 a 3

meses de tratamiento con este hongo [13]. Por otro lado, la lignino peroxidasa fue descrita en por primera

vez en 1982 al obtenerla a partir este hongo a manera de metabolito secundario, y se ha reportado que los

niveles de producción son mayores comparados con otros microorganismos como Pleurotus ostreatus [14].

2.4.2 Enzimas Ligninolíticas

Dentro de las enzimas ligninolíticas se encuentran las lacasas (polifenoloxidasa), lignino peroxidasas,

manganeso peroxidasas y veratril peroxidasas las cuales son capaces de atacar diferentes tipos de

compuestos ya que no actúan sobre un sustrato específico (Figura 1).

A. B. C.

Figura 1. Reacción catalítica de las enzimas ligninolíticas. A. Lacasa, B. Lignono peroxidasa, C. Mangameso

peroxidasa [15]

Las lacasas poseen como centro activo el cobre y como aceptor final de electrones está el oxígeno, mientras

que la familia de las peroxidasas tiene hierro y el peróxido de hidrogeno como aceptor final, a pesar de estas

diferencias todas pueden ser utilizadas para el tratamiento de contaminantes, ya que como se mencionó

anteriormente actúan de manera no específica.

El pretratamiento de la biomasa lignocelulósica con las enzimas ligninolíticas es un enfoque novedoso,

respetuoso con el medio ambiente y más viable que la conversión química debido a los rendimientos más

altos, la generación insignificante de subproductos, las necesidades mínimas de energía y las condiciones de

procesamiento moderadas. El proceso de pretratamiento para la despolimerización de la lignocelulosa en la

práctica industrial actual es muy discutido y, en la actualidad, todavía no hay disponible en el mercado una

estrategia de pretratamiento adecuada y rentable [16].

15

2.4.3 Lignina peroxidasa (LiP)

La enzima lignino peroxidasa es una glucoproteína de bajo peso molecular, esta enzima escinde

oxidativamente compuestos de lignina fenólicos y no fenólicos utilizando peróxido de hidrógeno como

aceptor de electrones, esta enzima es eficaz en la degradación de contaminantes con alto contenido no

específico y además, cuenta con un potencial de oxidación-reducción elevado; potencialmente puede oxidar

xenobióticos, que generalmente son difíciles de degradar usando otras peroxidasas, la lignina peroxidasa

también degrada la lignina de manera similar a la lacasa [1,17].

También es conocida como diaril propano oxigenasa, la cual actúa como un biocatalizador, posee una

proteína hemo con la cual cataliza la deconstrucción oxidativa de la lignina o compuestos aromáticos

recalcitrantes, mediada por peróxido de hidrogeno (H2O2) [2], Farell et al., (1987) describieron los diferentes

tipos de isoenzimas de LiP clasificándolos como H1, H2, H6, H7, H8 y H10, obtenidas a partir de un

cultivo de P. chrysosporium BKM-F-1767, además, se reportó que la enzima con mayor producción fue el tipo

H8, el peso molecular de estas se encuentra en el rango de 38 a 43 kDa, mientras que el punto isoeléctrico

oscila desde 3.3 a 4.6, por otro lado se encontró que actúa de manera óptima cuando se encuentra a pH

ácido especialmente a 3.0. Además, de degradar compuestos fenólicos, es capaz de actuar sobre arilglicerol-

aril éteres, los cuales constituyen gran parte de la lignina, al realizar procesos de oxidación de electrones se

forma un catión radical, que provoca la adición intramolecular, desmetilación, reordenamientos y escisión

de la cadena lateral [3].

El ciclo catalítico de la lignino peroxidasa consiste en 3 fases, en primer lugar ocurre la reacción de oxidación

de la enzima en su centro catalítico (Hierro) con peróxido de hidrógeno el cual actúa como aceptor de

electrones formando así el compuesto I, este compuesto actúa como generador de radicales libres de hierro,

y se reduce en presencia de una molécula de sustrato cuando está dona un electrón formando el compuesto

II, por último, el sustrato reducido dona nuevamente un electrón al compuesto II lo que induce la

regeneración de la enzima nativa. Si hay exceso de peróxido de hidrógeno en el medio, la enzima se inactiva

debido a un proceso de transformación de su centro catalítico. Los usos industriales de esta enzima incluyen:

desintoxicación de suelos, biopulping, desarrollo de biosensores para la detección de peróxido de hidrógeno

y compuestos relacionados, industria del papel, productos dermatológicos y el tratamiento de aguas

residuales contaminadas con fenoles y clorofenoles [18]. Para el desarrollo este último, se han realizado

varios estudios empleando un complejo enzimático con lacasas, manganeso peroxidasas y lignino

peroxidasa, con lo cual se ha podido confirmar el poder oxidativo y la capacidad de degradación de estas

moléculas.

2.5 Limitaciones del uso de hongos

La producción de enzimas ligninoliticas por parte de los Basidiomycetes a pesar de ser una solución sostenible

con el medio ambiente, no permite una producción tan sencilla debido a su morfología, ya que al ser

microorganismos filamentosos no es posible producirlos a escala industrial en bioreactores con turbinas

como es lo común, además, de este el tiempo de crecimiento es más largo por lo cual el proceso se hace

más largo incrementando de esta manera los costos, y se necesitan tener ciertas enzimas como las

endoglucanasas para romper la pared y de esta manera obtener el producto de interés [19].

2.6 Pichia pastoris (Komagataella phaffii)

La especie Komagataella phaffii, o comúnmente denominada Pichia pastoris es un hongo levaduriforme,

utilizado ampliamente en la industria principalmente por sus altos niveles de crecimiento en medios no

16

complejos, facilidad de recombinación genética y las modificaciones post-traduccionales de proteínas

recombinantes, además, este microorganismo secreta una baja cantidad de proteínas endógenas, por lo cual

la extracción y recuperación de proteínas recombinantes es más sencilla y no se necesitan procesos de

purificación rigurosos [20]. Otras de las ventajas del uso del microorganismo incluyen la presencia de

promotores estrictamente regulados y eficientes y una fuerte tendencia al crecimiento respiratorio en

oposición al crecimiento fermentativo [21].

2.6.1 Sistema de expresión en P. pastoris

Actualmente P. pastoris es uno de los microorganismos más empleados en la producción de proteínas

heterólogas (Tabla 2), esto se debe principalmente a los promotores que posee, en primer lugar se

encuentra el promotor pAOX1 el cual codifica para el gen de la Alcohol oxidasa 1, el cual le permite a la

célula crecer libremente en medios con alto contenido de metanol, y a su vez se encuentra el promotor

constitutivo pGAP, el cual codifica para la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, una enzima involucrada

en los procesos de glucólisis.

Tabla 2. Ejemplo de las algunas proteínas heterólogas producidas utilizando Pichia pastoris [22].

Proteína heteróloga g/L

Fragmento C de la toxina tetánica 12,0

Factor de necrosis tumoral 8,0

Interleucina humana 2 4,0

Albúmina sérica humana 4,0

Invertasa 2,5

Inhibidor de proteasa Kunitz 1,0

Análogo de la apoproteína 0,8

Lisozima humana 0,7

Factor de crecimiento epidérmico murino 0,45

Antígeno de superficie del virus de hepatitis B 0,3

Además, de realizar modificaciones post-traduccionales, como glicosilaciones, este microorganismo es

capaz de secretar al medio pequeñas cantidades de proteínas endógenas, lo que facilita los procesos de

purificación de proteínas heterólogas, por otro lado, sintetiza cadenas de oligosacáridos con menor grado

de ramificación [23].

2.7 Bibliografía

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19

CAPÍTULO 3

DISEÑO DE LA SECUENCIA Y CONSTRUCCIÓN

DEL VECTOR DE EXPRESIÓN pGAPZαA-LiPH8

3.1 Introducción

Se realizó la construcción de un vector de expresión constitutivo junto con la secuencia codificante de la

enzima lignino peroxidasa (LiPH8), que en primer lugar se encontraba en el vector de replicación pUC57

con el cual se transformó Escherichia coli con el fin de aumentar la cantidad del material genético

recombinante, y así usarlo para construir el vector recombinante de expresión pGAPZαA-LiP. Con el que

posteriormente se realizaría una electroporación en Pichia pastoris integrando la construcción al genoma de

la levadura, con el objetivo de generar la expresión de la proteína heteróloga. A futuro, se espera escalar a

un cultivo de 200 mL para finalmente evaluar la actividad enzimática, así como otros factores determinantes

como la productividad, el rendimiento y el tiempo de crecimiento con el objetivo de determinar el clon con

la eficiencia de producción y el nivel enzimático más alto y continuar el proceso de producción a nivel

industrial realizando las aplicaciones ambientales correspondientes en estudios posteriores.

3.2 Metodología

Este Trabajo de Grado hace parte del proyecto de investigación “Optimización, clonación y expresión de los genes

codificantes para Manganeso peroxidasa y Lignino peroxidasa de Phanerochaete chrysosporium, bajo el control del promotor

GAP en Pichia pastoris”, propuesta ID: 00008282, proyecto ID: 00008564, financiado por la Vicerrectoría de

Investigaciones de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá D.C.

3.3 Optimización y diseño de la secuencia sintética de la Lignino peroxidasa H8 (LiPH8) de

P. chrysosporium

El gen que codifica para la Lignino peroxidasa H8 de P. chrysosporium se diseñó a partir de una secuencia que

se encuentra en el Joint Genome Institute – USA [https://genome.jgi.doe.gov/cgi-

bin/dispGeneModel?db=Phchr2&id=2989894]. La secuencia fue optimizada a través del algoritmo

OptimumGeneTM de GenScript (USA Inc. 860 Centennial Ave. Piscataway, NJ 08854) y el gen optimizado

se denominó LiPH8. Dicha optimización se realizó con el objetivo de ajustar el uso de codones para la

expresión en P. pastoris, el contenido de GC, la presencia de elementos reguladores Cis y las secuencias

repetitivas. Adicionalmente, se eliminó la región correspondiente al péptido señal nativo y se añadieron

sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción EcoRI y NotI en los extremos 5´y

3´respectivamente, con el fin de facilitar la construcción del vector de expresión. La secuencia optimizada

fue sintetizada por la compañía GenScript (USA Inc. 860 Centennial Ave. Piscataway, NJ 08854).

3.4 Microorganismos y vectores

Para los protocolos de subclocación, se usó Escherichia coli JM109 (endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk–,

mk+), relA1, supE44, Δ( lac-proAB), [F´ traD36, proAB, laqIqZΔM15]). Para la expresión de la enzima

20

recombinante se empleará a futuro la levadura P. pastoris X-33 cepa silvestre. Como vector de transporte y

replicación del gen se usó pUC57 (Figura 2) y como vector de expresión constitutiva pGAPZαA (Figura

3). Como marcadores de selección, se usó ampicilina a 100 µg mL-1 (cuando se usó el vector pUC57) o

ZeocinaTM a 25 µg mL-1 (cuando se usó el vector pGAPZαA).

Figura 2. Mapa general del plásmido pUC57 [1].

El plásmido PUC57 se utilizó sólo para la replicación, para la obtención del plásmido de expresión de la

enzima LiP se seleccionó el vector pGAPZαA, que posee un factor α, el cual actúa como señal de secreción,

lo que permite una recuperación más sencilla del producto deseado.

Figura 3. Mapa general del plásmido pGAPZαA [3].

21

3.5 Construcción del vector de expresión pGAPZαA-LiPH8

Las manipulaciones del DNA y las clonaciones se llevaron a cabo usando procedimientos estandarizados y

reportados previamente [2]. Luego de ser replicados, los vectores de transporte que llevan el gen sintético

fueron digeridos con las enzimas de restricción respectivas, y los productos de la digestión se purificaron

usando el kit commercial Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Los fragmentos purificados

se ligaron al vector de expresión constitutiva (Figura 4); con los productos de ligación, se transformaron

células de E. coli JM109. Los clones positivos fueron seleccionados en función de la capacidad de crecer en

medio LB suplementado con Zeocina a 25 µg mL-1. La extracción de DNA plasmídico se llevó a cabo

usando el sistema de purificación Wizard® Plus SV Miniprep Purification System (Promega).

Figura 4. Mapa de restricción del plásmido pGAPZαA con el gen LiPH8 [4].

Tomado en cuenta el mapa de restricción de la Figura 4, se seleccionaron las enzimas EcoRI y NotI para la

digestión enzimática obteniendo los cortes que se muestran en la Figura 5, donde el fragmento de 1042 pb

corresponde al gen LiPH8.

Figura 5. Sitios de corte de las enzimas EcoRI y NotI en el plásmido pGAPZαA, esta predicción se

realizó utilizando la plataforma NEBcutter V2.0 [4].

22

Finalmente, se realizó un análisis de restricción usando la enzima de restricción XbaI para demostrar la

presencia del gen de interés y su correcta inserción (Figura 6).

Figura 6. Mapa de restricción del plásmido pGAPZαA con el gen LiPH8 cortado con la enzima Xba1,

esta predicción se realizó utilizando la plataforma NEBcutter V2.0 [4].

3.6 Resultados

3.6.1 Optimización y diseño de la secuencia sintética de la Lignino peroxidasa H8

(LiPH8) de P. chrysosporium

P. chrysosporium presenta diferencias importantes en cuanto al uso de codones al compararlo con P. pastoris.

La secuencia de DNA de gen LiPH8 incluía algunos codones que en P. pastoris son utilizados con baja

frecuencia, con valores iniciales de CAI (Codon Adaptation Index) de 0.59, valor que luego de la

optimización se incrementó a 0.96. De igual forma, se optimizó el contenido de GC, donde en la secuencia

final obtenida se redujo de 61,67 % a 40,60 %, porcentaje de GC cercano al rango de 30-70 %, y que

corresponde a los valores que normalmente se encuentran en P. pastoris. Adicionalmente, se optimizaron

también las secuencias involucradas en la formación de estructuras secundarias e inestables del mRNA, y

se modificó el codón de parada original de TGA a TAA. También, se añadieron los sitios de reconocimiento

para las enzimas de restricción EcoRI y NotI en los extremos 5´ y 3´ respectivamente.

3.6.2 Transformación de Escherichia coli con el vector pUC57

Se realizó la transformación en células de E. coli con el fin de obtener una mayor concentración de DNA

plasmídico recombinante con el gen LiPH8 empleando el vector pUC57 para la replicación, en medio LB

suplementado con 100 µg mL-1 de ampicilina como marcador de selección, se encontraron colonias color

beige, puntiformes características de E. coli DH5α, a partir de esto se sembró en 2 mL del mismo medio

usando la misma concentración de antibiótico y con aquellos que presentaron crecimiento se realizó una

extracción de DNA plasmídico, y una electroforesis para confirmar la presencia del plásmido junto con el

gen de interés (LiPH8), (Figura 7).

23

Figura 7. Electroforesis de la extracción de DNA plasmídico de tres clones transformantes de E.coli con

pUC57 y LiPH8

Las condiciones a las cuales se llevó a cabo la electroforesis fueron: gel de agarosa al 1%, 80V y 60 minutos

de corrido, el primer carril (M) corresponde al marcador de talla molecular 1kpb DNA ladder, mientras que

los siguientes tres carriles numerados corresponden a la extracción de DNA plasmídico empleando el kit

Wizard® Plus SV Miniprep Purification System (Promega)

Como se evidencia en la Figura 7, se encontró una banda de aproximadamente 3,5 Kb la cual corresponde

al vector de replicación (pUC57) el cual tiene un peso aproximado de 2,7 Kb, y al gen de la Lignino

peroxidasa (1042 pb).

3.6.3 Restricción enzimática y transformación de Escherichia coli con el vector

pGAPZαA

Se emplearon las enzimas de restricción EcoRI y NotI para cortar en plásmido pUC57 y de esta manera

obtener el gen LiPH8 (Figura 8), con el cual se realizó una ligación usando el vector pGAPZαA

nuevamente en E. coli con el fin de aumentar la cantidad de DNA para posteriormente realizar la

transformación final en Pichia pastoris; para esto se produjeron células competentes y junto con el producto

de la ligación (plásmido y gen) se realizó un choque térmico a 42°C durante 2 minutos para ingresar el DNA

a la célula. Seguido de esto, se sembró en cajas con agar LB suplementado con 25 µg mL-1 de Zeocina, como

marcador de selección del nuevo plásmido, a partir de las colonias obtenidas se hizo una extracción de

DNA plasmídico.

24

Figura 8. Restricción enzimática con el plásmido pUC57 y el gen LiPH8 usando las enzimas

EcoR1 y Not1

Las condiciones a las cuales se llevó a cabo la electroforesis fueron: gel de agarosa al 1%, 80V y 60 minutos de corrido, los primeros tres carriles numerados corresponden a 3 muestras de la digestión enzimática realizada con las enzimas de restricción NotI y EcoRI, en siguiente carril (M) corresponde al marcador de talla molecular 1kpb DNA ladder

Las bandas que se encuentran en subrayadas tienen un peso entre 2.5Kb y 3Kb lo que corresponde con el peso del plásmido pUC57 (2,7Kb), mientras que las bandas que se encuentran en la parte inferior corresponden aproximadamente a la banda de 1Kb que es similar al peso del gen LiPH8, por lo cual es posible afirmar que la digestión enzimática se realizo correctamente.

3.6.4 Obtención de clones transformantes de E. coli con pGAPZαA y LiPH8

A partir de los diferentes ensayos de transformación usando CaCl2 para desestabilizar la membrana y

posteriormente choque térmico para permitir la entrada del DNA exógeno, se obtuvieron los resultados

que se muestran en la Tabla 3.

25

Tabla 3. Resultados de la transformación de E. coli JM109

Medio de cultivo Muestra Resultados

Control + LB + Zeocina Células transformantes+

pGAPZαA

Se observó crecimiento masivo en la caja de Petri

Control - Medio LB Células transformantes+ H2O

No se obtuvieron colonias

Células transformantes LB + Zeocina Células transformantes+

pGAPZαA-LiPH8

A las 20 horas de crecimiento, se encontraron colonias beige de mediano tamaño

Se tomaron las colonias que tuvieran mayor tamaño y se sembraron en erlenmeyers de 25 mL, con 2 mL,

de medio LB suplementado con 25 µg mL-1 de Zeocina, se incubó durante 20 horas y a partir de los frascos

en donde se observara turbidez se realizó la extracción de DNA plasmídico utilizando el kit Wizard® Plus

SV Miniprep Purification System (Promega). Con las extracciones obtenidas se realizará una electroforesis para

comprobar la presencia del plásmido junto con el gen de interés.

3.7 Discusión

En la mayoría de las investigaciones en que se expresan proteínas recombinantes en P. pastoris predomina

el uso del promotor inducible pAOX1. Sin embargo, en el presente trabajo de empleó el pGAP de P. pastoris

de forma tal que la expresión del gen se pudiera llevar a cabo de forma constitutiva. Esta estrategia se

encuentra encaminada a las aplicaciones de tipo ambiental que se pretenden a largo plazo, donde muy

seguramente se podría pensar en el uso de reactores con células inmovilizadas de P. pastoris recombinante

para el tratamiento de efluentes de distinta naturaleza. En este sentido, usando un promotor constitutivo se

evita la adición de metanol como agente inductor del promotor AOX1. [5]

Por otro lado, para facilitar la secreción de la proteína al medio de cultivo se seleccionó la secuencia del α-

Factor para P. pastoris proveniente de Saccharomyces cerivisiae; eliminando la secuencia nucleotídica

correspondiente al péptido señal nativo (residuos 1-60). Adicionalmente, aunque P. pastoris es un hospedero

eficiente para la producción de proteínas recombinantes, el uso de codones sinónimos puede variar debido

a la preferencia por algunos codones [6], siendo otro aspecto importante en el proceso de optimización de

genes. La presencia de codones raros en los genes expresados de manera heteróloga en P. pastoris, podría

limitar al hospedero debido al agotamiento de los ARNt raros; hecho que puede llevar a pausas del ribosoma

en el proceso de traducción y por tanto a la disminución en los niveles de expresión de la proteína de interés

[7]. Los valores CAI cuantifican el grado en que la tendencia en el uso de codones de un gen se asemeja a

la de los genes altamente expresados en el microorganismo hospedero, considerando que en la medida que

los valores se acercan a 1 son perfectos para el organismo hospedero [8]. Por otra parte, el codón de parada

también se cambió para garantizar que la traducción terminara al final del gen y que no se tradujeran los

sitios correspondientes al epítope myc y la cola de 6 Histidinas presente corriente abajo del multicloning site en

el vector de expresión pGAPZαA.

26

Así, el uso de genes sintéticos para Lignino peroxidasa H8, optimizados para el uso de codones en P. pastoris,

contenido de G-C, elementos reguladores Cis, secuencias repetitivas y el péptido señal, podrían incrementar

la producción de proteínas heterólogas secretadas al medio de cultivo. Se ha dicho que esta optimización

podría resultar en un incremento de 10 a 50 veces en la producción de la proteína de interés [9, 10].

Adicionalmente en la optimización y sin afectar el marco de lectura, se añadieron los sitios de cortes para

las enzimas EcoRI y NotI respectivamente en los flancos 5´ y 3´ del gen, con el objetivo de facilitar la ligación

direccional del fragmento en el vector de expresión.

El análisis por restricción mostró que el constructo obtenido contenía la secuencia de interés in frame con

la dirección de la transcripción y corriente abajo del péptido señal, debido a la inserción correcta usando los

sitios de restricción EcoRI y NotI en las regiones 5´ y 3´ incluidos respectivamente en los flancos del gen

(Figura 8).

3.8 Bibliografía

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28

CAPÍTULO 4

PRODUCCIÓN DE LiP EN SISTEMAS

DE EXPRESIÓN HETERÓLOGA

(Revisión de literatura)

4.1 Introducción

Pichia pastoris es un microorganismo que ha adquirido gran importancia en el área de producción de proteínas

recombinantes, ya sea en la industria farmacéutica como de uso industrial, al ser un organismo eucariota

posee ciertas características a diferencia de las bacterias, ya que posee una amplia gama de herramientas de

modificación genética que las cuales incluyen kits para la edición de genomas como el sistema CRISPR /

Cas9, su capacidad de crecimiento en altas concentraciones celulares en medios relativamente sencillos, la

capacidad de realizar modificaciones post-traduccionales y la liberación de proteínas al medio extracelular,

lo que convierte a P. pastoris en un sistema de expresión de alta importancia para la producción de proteínas,

y sumado a la creciente demanda de las mismas, ha provocado que se estudien procesos dirigidos a aumentar

la eficiencia y la rentabilidad del bioproceso [1].

El sistema de expresión de esta levadura cuenta con diferentes promotores, entre los que se destacan debido

a su eficiencia en la expresión y producción de proteínas heterólogas, el promotor de alcohol oxidasa

inducible por metanol (pAOX1), este promotor facilita una regulación precisa y rigurosa, pero esto a su

vez también implica un problema, puesto que al requerir obligatoriamente esta sustancia para activar el

sistema es necesario adoptar medidas de seguridad que aumentan los costos de producción y que a su vez

generan dificultades operativas como la alta producción de calor, alta demanda de oxígeno, cargas

metabólicas celulares y cultivo de lisis celular. Es por esto que recientemente se ha estado estudiando la

posibilidad de usar promotores alternativos que eviten el uso de este compuesto como el pGAP [2].

El promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, conocido también como pGAP, participa en el

paso de griceraldehido-3-fosfato a 1,3 bifosfoglicerato en la vía Embden Meyerhof o glucólisis, al ser un

promotor constitutivo, no necesita de otro compuesto para activarse, por lo tanto, fue uno de los primeros

en ser estudiado con respecto a la eficiencia en la producción de diferentes proteínas, y debido a su potencial

para la producción a gran escala, además, de poseer el factor α, que actúa como señal de secreción, que

permite la obtención de la proteína sin necesidad de realizar un proceso adicional de lisis celular para la

recuperación de la misma [2].

Por otro lado, algunos autores han encontrado una relación entre el número de copias del casete de

expresión del genoma con la productividad específica de la proteína, se conocía previamente que en la

medida que incrementa el número de copias de genes se obtiene como resultado mayores porcentajes de

productividad, pero esto a su vez puede generar efectos adversos [3,4,5].

29

En estudios realizados por Nieto et al., (2019), se buscaba producir de manera recombinante la enzima

Candida rugosa lipasa (CrL1), debido a la dificultad en la recuperación de la proteína cuando esta es obtenida

del microorganismo que la expresa naturalmente (Candida rugosa), para este fin se propuso producirla en un

microorganismo que contara con un sistema de expresión permitiendo asi la síntesis, el plegamiento y la

secreción de esta, como el de P. pastoris. Para esto, se insertaron los fragmentos codificantes del gen en el

plásmido pGAPZαA y se insertaron al genoma de la célula (cepa X-33) por medio de un proceso de

electroporación, por medio de una PCR se seleccionaron los clones recombinantes y estos se incubaron en

biorreactores, para después evaluar la producción de biomasa, el consumo de la fuente de carbono y la

producción de proteína, así como su actividad enzimática. Como resultado se obtuvieron niveles de

rendimiento y productividad más elevados con respecto a la producción desde el huésped original [1].

4.2 Ejemplos de expresión de proteínas en Pichia pastoris

En la investigación realizada por Kalinina et al., (2019), se tuvo como objetivo estudiar y comparar las

propiedades de las xilanasas, que son enzimas que catalizan reacciones de hidrolisis, generando la ruptura

del xilano, obteniendo como subproductos residuos de xilosa, estas moléculas tienen utilidad en la industria

panadera, textil, de papel y pulpa, así como también se emplean ampliamente en las prácticas mejoramiento

de las propiedades de alimentación animal; se buscaba obtenerlas en el sistema de expresión de Pichia pastoris,

para posteriormente seleccionar aquella que tuviera las características óptimas para la producción; al igual

que las peroxidasas, estas enzimas son producidas en hongos filamentosos como Trichoderma, Aspergillus y

Penicillum, lo que dificulta su obtención a escala industrial, y en bacterias como Bacillus y Paenibacillus, que al

ser organismos procariotas no tienen la capacidad de realizar modificaciones post-traduccionales [6].

Para esto se recuperaron los genes que codifican la enzima a partir de Bacillus pumilus, Paenibacillus polymyxa,

Thermomyces lanuginosus y Schizophyllum commune, se empleó la técnica de PCR, para amplificar los genes y el

producto se insertó en el plásmido pAOX2-GAP, empleando la enzima de restricción BglII se linealizó el

plásmido y se introdujo a células transformadas de P. pastoris mediante electroporación; estos transformantes

se cultivaron en medio YPD (Dextrosa, extracto de levadura y peptona) y se evaluó la actividad enzimática

mediante una reacción que contenía extracto crudo del cultivo y xilano de abedul como sustrato, los

azucares residuales fueron cuantificados mediante la técnica de DNS [7], también se evaluó la estabilidad

térmica, el rango de pH y el pH óptimo para cada proteína recombinante.

Los resultados de la producción de xilanasas con P. pastoris, demostraron la eficacia de esta levadura en la

síntesis de proteínas heterólogas cuando estas provienen de bacterias, ya que se reportó una baja

productividad en las enzimas cuando el gen proviene de hongos, esto se puede deber a que en estos

microorganismos hay presencia de sitios de n-glicosilaciones en secuencias de aminoácidos lo que puede

disminuir la eficiencia en la secreción, a pesar de esto se obtuvo en cuanto a la actividad enzimática un rango

de 746 UE/mg a 1201 UE/mg; siendo la enzima proveniente de Schizophyllum commune el de mayor actividad,

lo que indicó que a pesar de que la secreción no fue tan efectiva, la molécula fue funcionalmente estable y

puede ser utilizada en procesos industriales [6].

Además, del promotor empleado en el estudio anterior, el sistema de Pichia pastoris cuenta con una gran

variedad de vectores tanto constitutivos como inducibles los cuales poseen diferentes características, como

los niveles de expresión y las sustancias que activan los procesos de transcripción, los promotores de mayor

importancia se describen en la Tabla 4.

30

Tabla 4. Promotores de Pichia pastoris [8]

Promotores Inducibles

Nombre Producto Inductor Nivel de expresión

AOX1 Alcohol oxidasa 1 Metanol Alto

ADH3 Alcohol deshidrogenasa Etanol Alto

DAS Dihidroxiacetona fosfato Metanol Alto

FLDI Formaldehido deshidrogenasa Metilamina Alto

LRA3 L-ramnosa deshidratasa Ramnosa Bajo

ICLI Isocitrato liasa Etanol Alto

PPLCC1 Lacasa Cobre -

Promotores Constitutivos

Nombre Producto Nivel de expresión

GAP Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa Alto

YPTI GTPasa Bajo

TEFI Factor 1-alfa Alto

GCW14 Glicosilfosfatidilinositol Alto

PGK1 Fosfoglicerato quinasa Bajo

4.3 Expresión de lignino peroxidasa (LiP)

La lignino peroxidasa es una hemoproteína producida por hongos basidiomicetos de podredumbre blanca,

la cual actúa como degradador de la lignina en una reacción oxidativa, para la cual necesita la presencia de

peróxido de hidrogeno, dentro de los inhibidores de la actividad enzimática de LiP se encuentran el cianuro,

el EDTA, el manganeso, el bromuro de cetiltrimetilamonio, el SDS, el perborato de sodio y la

tetrametiletilendiamina entre otros. Como compuestos activadores están el peróxido de hidrogeno, el

carbonato de sodio, la teraacetiletilendiamina y el alcohol veratrilico [9]. En varios estudios se ha realizado

la expresión de la lignino peroxidasa, tanto en Phanerochaete chrysosporium como productor original, y en otros

organismos a manera de proteína heteróloga, de esta molécula se han descrito 6 isoenzimas (HI, H2, H6,

H7, H8 y H10), pero dentro de este grupo la LiPH8 ha sido la más empleada en procesos de delignificación

por su alto impacto y efectividad [10].

Como afirmaron Pham et al., (2018), la isoenzima de lignino peroxidasa H8 demuestra un alto potencial de

oxido reducción, lo que le permite realizar eficientemente reacciones de catálisis en la oxidación del alcohol

veratrilico, así como la degradación de la lignina recalcitrante, sin embrago, se conoce que esta enzima

producida desde el hongo de podredumbre blanca es inestable a pH ácido, lo que representa un problema

puesto que, la repolimerización de compuestos fenólicos se inhibe a estos valores de pH [11].

31

Debido a lo anteriormente expuesto, los autores diseñaron una lignino peroxidasa “in silico” clonando el

fragmento de la secuencia codificante de esta enzima con sus variaciones, las cuales consisten en la inserción

de puentes de sal iónica en el vector de expresión de E. coli pET21, después se realizó una PCR y

posteriormente se recuperó nuevamente la enzima recombinante. Los resultados mostraron que con esta

variante LiPH8 posee mayor estabilidad, así como mayores niveles de actividad cuando los niveles de pH

son bajos, lo que permite que sea utilizado en procesos de despolimerización selectiva de la lignina [11].

4.4 Expresión de proteínas heterólogas usando un promotor constitutivo

Los promotores constitutivos son aquellos que expresan de manera continua un gen asociado sin la

necesidad de un agente que active la transcripción, dentro del sistema de expresión de P. pastoris se encuentra

el promotor pGAP que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAP), una enzima que

participa en el proceso de glucólisis, se ha reportado que con este vector las células se desarrollan

correctamente en medios suplementados con glucosa, glicerol y metanol, además, se conoce que cuando la

producción de proteínas recombinantes se realiza bajo el control de pGAP, la biomasa aumenta, mientras

que la proteína se sintetiza al mismo tiempo. Por otro lado, también se sabe que el nivel de actividad del

promotor es de dos tercios en medio de glicerol y un tercio en medio de metanol en comparación con el

medio de glucosa [12].

Huang et al., (2016) estudiaron la expresión de lacasas en P. pastoris empleando como vector de expresión

pGAPZαA bajo la regulación del promotor constitutivo pGAP, al igual que la lignino peroxidasa, la lacasa

es una enzima producida por hongos de podredumbre blanca implicada en diferentes procesos

biotecnológicos y ambientales, para esto se tomó la secuencia del gen Lcc1 y se tetiró el fragmento 5´que

corresponde a la región N-terminal y se adicionaron los sitos de corte para las enzimas XhoI y NotI, se ralizó

una PCR y el producto de esta se insertó en el plásmido, lo que se confirmó mediante electroforesis en gel

de agarosa, después de esto se linealizó el plásmido empleando la enzima BspHI y se insertó en células

competentes de P. pastoris por electroporación, los clones positivos se seleccionaron llevando a cabo una

prueba en medio YPD suplementado con ABTS por la presencia de halos verdes alrededor de la colonia

[13]

Una vez confirmada la actividad lacasa, se llevó a un cultivo discontinuo en un fermentador de 5 L por 60

horas en un medio salino básico, se recogieron 5 mL, de los cuales se extrajo el sobrenadante y se purificaron

las enzimas utilizando cromatografía de afinidad y posteriormente se realizaron los ensayos de actividad

enzimática usando ABTS como sustrato. Los resultados mostraron que las proteínas recombinantes se

expresaron y secretaron correctamente, la mayor actividad lacasa se registró a las 54 horas de crecimiento

con 194.06 UE/L [13].

Al expresar la enzima Lcc1 de manera constitutiva en P. pastoris la actividad enzimática aumentó conforme

lo hacía el crecimiento celular en un periodo relativamente corto después del inicio del cultivo discontinuo,

a pesar de esto no se logró alcanzar la misma productividad en el sistema constitutivo de esta levadura que

cuando se expresa en un sistema inducible; aun así la facilidad en el proceso de fermentación y la eficiencia

de producción fue superior a la alcanzada en el microorganismo que la produce originalmente [13,14].

4.5 Expresión de proteínas heterólogas usando un promotor inducible

Los promotores inducibles son aquellos que se activan bajo condiciones específicas, y que pueden ser

regulados mediante control positivo y negativo, estos se clasifican según el tipo de molécula que acciona su

32

actividad, los más comunes son aquellos que se encuentran regulados químicamente, que activan la

transcripción cuando una sustancia química específica para cada uno de ellos se encuentra en el medio, uno

de los ejemplos más conocidos es el Tet-ON que corresponde a un promotor que se encuentra inactivo

cuando no haya presencia de tetraciclina o sus derivados, otro el ejemplo es el promotor pLac el cual requiere

la eliminación del represor lac para que se del proceso, esto ocurre cuando en presencia de lactosa el represor

sufre un cambio conformacional que hace que se libere y cese la represión del gen; por otro lado, se

encuentran los promotores inducibles por temperatura, que son sistemas de expresión sensibles a este

factor, por lo que pueden ser activados por exposición al calor o al frio según sea el caso, un ejemplo de

estos son los promotores derivados de Hsp70 los cuales comienzan su actividad si sufren un choque

térmico, y por último, los promotores inducibles por luz, una variable que puede activar la expresión génica,

como es el caso del promotor pDawn que sólo es funcionalmente activo cuando hay luz presente, por lo

cual en condiciones de oscuridad no se generan los procesos de transcripción [15].

Hablando específicamente de Pichia pastoris, el promotor inducible de mayor importancia por su extenso

uso en la producción de proteínas heterólogas es el promotor del gen de la alcohol oxidasa I o pAOX1, el

cual codifica para la enzima alcohol oxidasa, una enzima implicada en reacciones de conversión de metanol

a formaldehido, este microorganismo hace uso de esta enzima cuando su crecimiento se da en medio que

contiene metanol, siendo esta sustancia el agente inducible de su actividad. Se conoce que P. patoris dentro

de su genoma cuenta con los genes AOX1 y AOX2, este primero es el causante del 85 % de la actividad

enzimática de la alcohol oxidasa [16], siendo regulada su expresión por mecanismos de represión e

inducción con respecto al desarrollo de la célula en medios con diferentes fuentes de carbono, este

microorganismo tiene la capacidad de crecer en presencia de glucosa, glicerol, etanol, acetato, manitol,

sorbitol, trehalosa, alanina y metanol entre otros, siendo estos los más destacados, pero los primeros cuatro

sustratos reprimen el uso del metanol, lo que genera una supresión en los procesos de transcripción del

promotor, Inan y Meagher [17] reportaron que este efecto represor esta mediado por dos diferentes

mecanismos de regulación: la represión del catabolito y la inactivación de catabolito [18].

Para la expresión de proteínas con el promotor AOXI es necesario llevar a cabo el proceso en diferentes

fases, las cuales consisten en la fase de alimentación con glicerol, esto con el fin de aumentar la densidad

celular y llegar a fase exponencial, empleando este sustrato como fuente de carbono, una vez hayan

disminuidos los niveles de concentración de este, se introduce al cultivo discontinuo el metanol, de manera

que, cuando se acabe en su totalidad el sustrato inicial, la célula empleará el agente inductor que por ende

activará los procesos de trascripción y producción [19].

4.6 Comparación entre un promotor inducible y uno constitutivo

El uso de promotores constitutivos para la producción de enzimas recombinantes facilita el manejo del

cultivo, ya que no es necesario emplear un agente inductor para la expresión de la proteína, además de que

estimula la transcripción constante del gen de interés; en cambio si se emplea un promotor inducible se

debe usar únicamente como fuente de carbono el compuesto activador, ya que si se usan fuentes menos

complejas de asimilar como la glucosa el microorganismo utilizará este para su crecimiento y no se generará

la expresión de genes provocando una represión en la codificación de los mismos. Para el caso de la

producción de proteínas heterólogas con pAOX1 se tendrían que monitorear continuamente los niveles de

metanol en el medio para garantizar la síntesis, además esta sustancia química es toxica e inflamable, por lo

que su uso debe realizarse bajo supervisión constante y no se podría almacenar en altas concentraciones. A

pesar de estas desventajas, se conoce que este es un promotor fuerte y requiere bajas condiciones del agente

inductor, y la transcripción se realiza bajo un proceso altamente regulado [20]. Sin embargo, trabajar a gran

escala con el uso de metanol podría resultar en un manejo peligroso de este compuesto.

33

Además, de esto, el metanol es un producto petroquímico lo que implica limitaciones ya que cuando se

busca la producción de aditivos en la industria alimentaria, su uso como fuente de carbono puede no ser la

más segura. Por otro lado, el manejo de grandes cantidades de metanol para aplicaciones industriales

requiere precauciones de seguridad adicionales debido a la inflamabilidad y al riesgo de mezclas explosivas

cuando hay contacto con el aire. Por esta razón, el promotor GAP es una alternativa eficiente para la

producción de proteínas recombinantes en P. pastoris. Las ventajas de este promotor radican en que no hay

necesidad de usar metanol para la inducción, así como tampoco es necesario cambiar la fuente de carbono

durante el crecimiento, pero, como desventaja se encuentra que este promotor no es útil para la producción

de una proteína que es tóxica para las células de la levadura [18].

Como se observa en la Figura 9, las conformaciones estructurales entre los dos plásmidos no varían en

gran medida, entre las diferencias más notables se encuentran el peso molecular, siendo mayor para el vector

inducible por aproximadamente 400 pb cuando no está la secuencia de secreción α-factor, y las enzimas

que presentan sitios de corte en cada secuencia, pero estas variables no representan un factor determinante

para la eficacia en el comportamiento de cada uno de estos. En un estudio realizado por Carreras-Villaseñor

et al., (2020), en donde se buscaba expresar la enzima Fosfanato deshidrogenasa de Trichoderma atroviride en

un sistema constitutivo, afirman que este tipo de promotores favorecen la expresión constitutiva de genes,

además de permitir la producción de interés empleando medios de cultivo simples y sin la necesidad de

introducir un compuesto o señal inductora de la actividad como ya se ha mencionado anteriormente [21].

A. B.

Figura 9. Mapa de restricción del promotor pGAP(A) y pAOX1(B) [22]

Para la comparación entre estos dos promotores es necesario evaluar la eficacia en la producción de una

misma enzima en las mismas condiciones empleando los dos sistemas, es por esto que Boer et al., (2000)

realizaron un estudio en el cual buscaban producir celobiohidrolasa Cel7A de Trichoderma reesei en Pichia

pastoris en el promotor de la alcohol oxidasa pAOX1 y el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato-

deshidrogenasa pGAP, para esto se clonó el fragmento de la secuencia codificante de la enzima en los

vectores de expresión empleando las enzimas de restricción EcoRI y PmlI para el promotor inducible y

constitutivo respectivamente, esto se confirmó mediante una secuenciación del DNA. Para la

transformación se empleó la técnica de electroporación con células transformantes de la levadura y se

34

linealizó con las enzimas con NotI y AvrII correspondientemente, se seleccionaron los mejores clones en

cada experimento y se escaló a un cultivo discontinuo en donde el glicerol se usó como fuente de carbono

y se adicionó metanol para los clones obtenidos en pAOX1 [23].

Después de esto, se llevó a cabo una extracción y purificación de proteínas, para realizar posteriormente

ensayos de actividad enzimática. Una vez obtenidos los resultados se pudo concluir que: el plásmido

recombinante se insertó y se expresó correctamente en ambos sistemas (inducible y constitutivo) lo que se

comprobó mediante los niveles de secreción de la enzima al medio extracelular, a pesar de esto se encontró

un mayor nivel de expresión y rendimiento enzimático en AOX1, pero los cultivos con este mismo vector

indicaron que es necesario realizar la fermentación en condiciones controladas debido a la necesidad en el

uso de metanol para la obtener una producción eficiente, problemas que no se presentaron con el promotor

constitutivo, pues su crecimiento no presentó inconvenientes en un medio relativamente sencillo, para el

cual no se debe implementar o vigilar los niveles de metanol pues esta sustancia no es esencial para su

desarrollo o la expresión de proteínas recombinantes [23].

Finalmente, toda esta información reunida, puede considerarse como hallazgos importantes a la luz de la

expresión de enzimas recombinantes para su uso en sistemas ambientalmente amigables y, particularmente,

con respecto a la las Lignino peroxidasas debido al amplio rango de sustratos que pueden ser transformados

por éstas. Contribuyendo a una gran gama de productos en diversos entornos: la industria, el uso clínico y

química y aplicaciones ambientales.

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37

CAPÍTULO 5

CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

5.1 Conclusiones

Actualmente el uso de promotores inducibles para la expresión de proteínas heterólogas es el sistema de

mayor importancia, puesto que se han reportado en diversos artículos la efectividad de estos vectores en la

síntesis y producción de estas, a pesar de dichas ventajas, la necesidad de usar una sustancia inductora de la

actividad trae consigo varios inconvenientes, tales como la producción del cultivo en diferentes etapas con

el fin de obtener células en fase exponencial para iniciar con la producción de la enzima recombinante, uso

de diferentes sustratos como glicerol y metanol, monitoreo del glicerol residual para evitar la represión de

la transcripción, uso medido del metanol debido a su naturaleza tóxica, además, de la imposibilidad de usar

este mecanismo cuando se desea obtener proteínas para la industria de alimentos. Por otro lado, se

encuentran los promotores constitutivos, los cuales se expresan de manera constante, por lo tanto, es

posible producir la enzima en medios relativamente sencillos y como se mencionó anteriormente, varios

autores demostraron que la actividad enzimática, así como la productividad satisfacen las necesidades

requeridas para ser implementados en procesos industriales. Es por esto que el uso del promotor pGAP

para la expresión de lignino peroxidasa H8 proporciona mayores utilidades y beneficios que si se emplea el

promotor inducible pAOXI para dicho proceso.

Se diseñó una secuencia nucleotídica optimizada para el gen de la Lignino peroxidasa H8 de Phanerochaete

chrysosporium y se insertó en un vector de expresión regulado de forma constitutiva. Adicionalmente, la

información obtenida en este trabajo es de gran utilidad para avanzar en los procesos de producción a

mayor escala de las Lignino peroxidasas recombinantes, utilizando el sistema de expresión P. pastoris. Estos

resultados son importantes a la luz de la utilidad de los sistemas de expresión de enzimas recombinantes en

las nuevas tecnologías amigables con el ambiente.

5.2 Recomendaciones

Se recomienda continuar con la transformación de Pichia pastoris con el constructo de expresión constitutiva

que contiene el gen que codifica para la Lignino peroxidasa H8 y evaluar la expresión de la enzima a escala

de 100 mL, con el fin de poder estudiar distintas variables y finalmente mejorar su expresión.