Universidad Nacional Auto noma de Me xico Facultad de Estudios Superiores Cuautitla n

Asesoras:

M. en C. Maritere Domnguez Rojas

p.BQD Larisa Andrea Gonzlez Salcedo

Bioinformtica

Grupo: 2001

Flo

res

Rey

es J

osi

ff S

am

uel

20

14

Dis

e

o d

e P

rim

ers

, Mu

ltiP

lex

, O

lig

oa

na

lize

r y

Eje

rcic

ios.

Primer-BLAST

Seleccionando la secuencia de mRNA CDS completo del gen CTLA4 en la especie

H. sapiens.

Homo sapiens CTLA4 (CTLA4) mRNA, complete cds GenBank: AF414120.1

GenBank Graphics

>gi|15778585|gb|AF414120.1| Homo sapiens CTLA4 (CTLA4) mRNA, complete

cds

CTTCTGTGTGTGCACATGTGTAATACATATCTGGGATCAAAGCTATCTATATAAAGTCCTTGATTCTGTG

TGGGTTCAAACACATTTCAAAGCTTCAGGATCCTGAAAGGTTTTGCTCTACTTCCTGAAGACCTGAACAC

CGCTCCCATAAAGCCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGA

CCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGCAATGCACGTGGCCCA

GCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAA

GCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCT

ACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAAGT

GAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTAC

CCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAG

ATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCAGTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCAC

AGCTGTTTCTTTGAGCAAAATGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCTATGTGAAAATGCCC

CCAACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGAGAAACCATTATGA

AGAAGAGAGTCCATATTTCAATTTCCAAGAGCTGAGGCAATTCTAACTTTTTTGCTATCCAGCTATTTTT

ATTTGTTTGTGCATTTGGGGGGAATTCATCTCTCTTTAATATAAAGTTGGATGCGGAACCCAAATTACGT

GTACTACAATTTAAAGCAAAGGAGTAGAAAGACAGAGCTGGGATGTTTCTGTCACATCAGCTCCACTTTC

AGTGAAAGCATCACTTGGGATTAATATGGGGATGCAGCATTATGATGTGGGTCAAGGAATTAAGTTAGGG

AATGGCACAGCCCAAAGAAGGAAAAGGCAGGGAGCGAGGGAGAAGACTATATTGTACACACCTTATATTT

ACGTATGAGACGTTTATAGCCGAAATGATCTTTTCAAGTTAAATTTTATGCCTTTTATTTCTTAAACAAA

TGTATGATTACATCAAGGCTTCAAAAATACTCACATGGCTATGTTTTAGCCAGTGATGCTAAAGGTTGTA

TTGCATATATACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTTAATTTGA

TAGTATTGTGCATAGAGCCACGTATGTTTTTGTGTATTTGTTAATGGTTTGAATATAAACACTATATGGC

AGTGTCTTTCCACCTTGGGTCCCAGGGAAGTTTTGTGGAGGAGCTCAGGACACTAATACACCAGGTAGAA

CACAAGGTCATTTGCTAACTAGCTTGGAAACTGGATGAGGTCATAGCAGTGCTTGATTGCGTGGAATTGT

GCTGAGTTGGTGTTGACATGTGCTTTGGGGCTTTTACACCAGTTCCTTTCAATGGTTTGCAAGGAAGCCA

CAGCTGGTGGTATCTGAGTTGACTTGACAGAACACTGTCTTGAAGACAATGGCTTACTCCAGGAGACCCA

CAGGTATGACCTTCTAGGAAGCTCCAGTTCGATGGGCCCAATTCTTACAAACATGTGGTTAATGCCATGG

ACAGAAGAAGGCAGCAGGTGGCAGAATGGGGTGCATGAAGGTTTCTGAAAATTAACACTGCTTGTGTTTT

TAACTCAATATTTTCCATGAAAATGCAACAACATGTATAATATTTTTAATTAAATAAAAATCTGTGGTGG

TCGTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Se introdujo la secuencia en aparatado de Primer-BLAST donde se mostr

primeramente el rango de la secuencia nucleotdica.

Al dar clic en Search summary se muestran los parmetros con los que se especific

la bsqueda de cada cebador propuesto a continuacin. Como se pareca se

revisaron 310,279 blast para obtener los mejores cebadores de la secuencia.

Formato Graphics de los primeros 5 primers obtenidos, la secuencia en azul es la

regin que se reproducir del gen, al selecciona uno se desliza hacia su informacin

especfica que se mostrara a continuacin.

Primer par de primers propuestos, se aprecia su informacin en una tabla de fcil

lectura, estos datos se deben de analizar para determinar el de mejor eleccin.

Tabla de los 5 primeros Primers que proporciona Primer-BLAST, tambin se

muestran sus respectivas caractersticas, de rojo las secuencias que se deben de

evitar en los primers para evitar estructuras secundarias, y de verde las bases que

se deben de buscar para brindar estabilidad en este extremo.

Primers Secuencia 3-5 Cadena molde

Longitud

Start Stop

Tm CG%

Autocomplemntaridad Homodimeros

Autocomplemntaridad Heterodimeros

Longiotud del producto

Forward Reverse

TGAAGACCTGAACACCGCTC CGCACAGACTTCAGTCACCT

Plus Minus

20 20

126 413

145 394

59.97 59.97

55 55

2 6

1 1

228

Forward Reverse

AGGTGACTGAAGTCTGTGCG

GGCTGTGCCATTCCCTAACT Plus Minus

20 20

394 1132

413 1113

59.97 60.03

55 55

6 3

2 1

739

Forward Reverse

CTGAAGACCTGAACACCGCT ATCATGTAGGTTGCCGCACA

Plus Minus

20 20

125 427

144 408

59.97 60.04

55 50

2 5

2 3

303

Forward Reverse

AGTTAGGGAATGGCACAGCC

CTGCTGCCTTCTTCTGTCCA Plus Minus

20 20

1113 1837

1132 1818

60.03 59.96

55 55

3 3

3 2

725

Forward Reverse

TGTGCGGCAACCTACATGAT CATGAGCTCCACCTTGCAGA

Plus Minus

20 20

408 557

427 538

60.04 60.04

50 55

5 6

3 2

150

Para seleccionar el mejor Primer se deben de considerar aquel par que cumpla la

mayora o las mejores condiciones, los parmetros Start y Stop nos indican la

localizacin de los primers forward y reverse y es importante ver si entre estos se

encuentra la regin especifica del gen a amplificar; la direccin de la cadena molde

cuando es positiva nos indica que la secuencia va de 3 a 5 y negativo es de 5 a

3. Asi como la estabilidad de las cadenas en el extremo 5 y no en 3, recordando

que la estabilidad esta conferida por la cantidad de C y G debido a que requieren

una mayor energa para su separamiento. Este anlisis es sencillo a comparacin

del posterior con Oligo analyzer. Otros aspectos a considerar se resumen en la

siguiente tabla.

Longitud ideal de 20 a 25 nucletidos

Cualquiera de los primers mostrados en la tabla cumple con las condiciones de longitud.

Porcentaje de G/C entre 40% y 60%.

Todos entran dentro del rango oscilando en un contenido del 50%

La diferencia entre la temperatura a la que se abren las cadenas de DNA (55Tm75), de los primers forward y reverse no debe de ser mayor a 5C.

Todos presentan Tm muy similares donde su diferencia es de dcimas.

No se deben formar regiones 2 internas (Mientras menor sea la autocomplementaridad mayor probabilidad de formar estructuras secundarias) mientras que a mayor complementariedad en 3 indica la probabilidad del emparejamiento de los primers.

Las energas libres de Gibbs de Autocomplementaridad son mayores a 2 por lo que no se llevan a cabo reacciones espontaneas para la formacin de estructuras secundarias, al igual que la complementariedad en 3 son mayores que 1, y nos indica que no reaccionan los primers entre s.

Regin 5ms estable Todas presentan guanina y citosinas en el extremo 5, confirindole estabilidad, sin embargo los ms estables son los pares 1 y 4.

Evitar ms de 3 bases C o G seguidas en extremo 3

En los primeres 1 y 2 se presentan 3 bases seguidas de GC lo que no es conveniente, al igual que en el 5 que no estn l extremo pero es un tetrmero de Gy C.

Considerando el anterior anlisis podemos determinar que el mejor par de primers

es el par 4. El resumen de sus caractersticas se presenta en la tabla.

Ahora esta secuencia se analizara con oligo analyzer para poder determinar de

forma ms especifica la posible formacin de estructuras secundarias as como la

interaccin entre los primers.

Oligoanalizer nos muestra informacin

similar a Primer-BLAST indicndonos la

secuencia del primer a analizar, su

complementaria, la longitud de 20pb as

como el porcentaje de GC, peso molecular

y temperatura de fusin las cuales son

similares a lo reportado anteriormente, el

coeficiente de extincin molar es una

constante fsica derivada de la ley de

Lambert- Beer relacionada con la lectura

espectrofotomtrica de la secuencia a

260nm. Los datos de concentraciones

sirven como referencia de estndar donde

4.95nmoles de oligonucletido al

disolverse en 1ml de volumen resulta una

absorbancia de 260nm, sirvindonos como

referencia de pureza del oligonucletido, al

igual que los 30.65 los cuales fueron

derivados del coeficiente de extincin

molar.

Debajo encontramos una seccin sobre anotaciones sobre la temperatura de fusin

para que sea preciso como:

Se deben de usar oligos de 8 a 60 pb de longitud

Solucin buffer neutra (7Ph8)

Concentracin de Sodio (1.5mMNa+1.2M)

Concentracin de Magnesio (0.01mMMg++600mM)

Concentracin de Trifosfatos (dNTPs120% de la concentracin de catin divalente)

Al analizar la secuencia con la opcin Hairpin (Horquilla) nos muestra las posibles

estructuras de horquilla que se pueden formar del primer forward. Indicndonos que

son 3 diferentes a temperaturas de 45-61C.

Al analizarlo con self-dimer y Hetero-dimer podemos obtener informacin sobre

predicciones en la formacin de estructuras secundarias posibles u oligonucletidos

hibridados que pueden suceder a una temperatura determinada. Es importante

examinar que no se formen estructuras secundarias porque podran causar

problemas en experimentos de hibridacin como son la PCR produciendo errores

significativos. La estructura con menor energa libre es la que ms predomina en

solucin debido a que reacciona de manera ms espontanea.

El delta G se calcula tomando en cuenta la seccin de la secuencia con mayor

nmero de bases complementarias, representndose con una lnea que las une.

El valor que corresponde a la secuencia analizada presenta un delta G, pequeo

indicndonos la posibilidad de formar estructuras homodimericas, como lo muestra

a continuacin.

Sin embargo ninguna presenta estructuras

dimericas complejas, donde a lo mucho se

ven involucradas 3 bases, y no representan

mucho espontaneidad, debido a la energa

libre de Gibs tan baja.

A diferencia con Hetero-dimer se analiza la secuencia pero en comparacin con otra

secuencia de primer, eligiendo preferencialmente al reverse, para evaluar la

formacin de estructuras heterodimericas.

Pero este anlisis tambin se puede realizar entre otras secuencias de primers

ajenas al par, como en el diseo de una PCR multiplex y analizar la interaccin entre

cada cebado, aunque existen otras herramientas que proporcionan esta informacin

ms sencilla para mltiples cebadores.

Debajo nos muestra cada una de las interacciones entre los primers que pueden

suceder y el Delta G correspondiente as como el nmero de pares de bases

involucradas.

En el apartado Mismatch podemos alterar las bases de la secuencia del

oligonucletido y predecir la termodinmica de las molculas de DNA que contiene

el cambio comprado con el original para estimar la discriminacin y falta de

coincidencia en el diseo de sondas para detectar SNPs.

Primer Forward

Primer Reverse

Primer3

Para el anlisis de esta herramienta, emplearemos otro tipo de secuencia debido a

que sobre esta se tienen registrados los Polimorfismo de un solo nucletido SNPs.

Aportando la ventaja de seleccionar de forma ms rpida el cambio (regin roja).

Homo sapiens cytotoxic T-lymphocyte-associated protein

4 (CTLA4), RefSeqGene on chromosome 2

NCBI Reference Sequence: NG_011502.1

GenBank Graphics

>gi|224809308:5003-11175 Homo sapiens cytotoxic T-lymphocyte-associated

protein 4 (CTLA4), RefSeqGene on chromosome 2

CTTCTGTGTGTGCACATGTGTAATACATATCTGGGATCAAAGCTATCTATATAAAGTCCTTGATTCTGTG

TGGGTTCAAACACATTTCAAAGCTTCAGGATCCTGAAAGGTTTTGCTCTACTTCCTGAAGACCTGAACAC

CGCTCCCATAAAGCCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGA

CCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGGTGAGTGAGACTTTTG

GAGCATGAAGATGGAGGAGGTGTTTCTCCTACCTGGGTTTCATTTGTTTCAGCAGTCAAAGGCAGTGATT

TATAGCAAAGCCAGAAGTTAAAGGTAAAACTCCAATCTGGCTTGGCTGGCTCTGTATTCCAGGGCCAGCA

GGGAGCAGTTGGGCGGCAGCAAATAAGGCAAAGAGATAGCTCAGAACAGAGCGCCAGGTATTTAGTAGGG

GCTTCATGAATGCATGTGAGTTGGTTTAGTAGAGAGACACAGGCAATTTCAGACCCTTCTATGAGACTGG

AAGTGATTTAAGAGGGAAAGGATAGCCATAGTCCTGAATACATTTGAGCTGGGTTTCAGGATGAGCTCAC

AAGTTCCTTTAAAAAAAATTGACTTAAGCAAATCCTGGGAAGAGTTTTTTTGCTATACAATTCAAGGTTT

TAAGGTCCTCGGATTCATATACTTTATAAATGAATTAGCCAGCTTGTTTAAAATGTAGGGAAATTGTGGG

AAGAATGCCTTCTTTACTTAATTCAAGGTTTTAAGGTTCTCTTAATCAATTCTACTAGCTAATTAGCCAA

TTATTTAAAAATAAAAGTTTGAAATTGCCAAAAAAAAAAGACAAGGAAAAGGAAAGAAAGAAAGCCACCA

GTCTGTTTGGCATACAATACTTAATTGTTGCCTGACCTACGTGTGGGTTTCAGATGCAGATCCTCAGTTT

TCAGCTCTTCAGAGACTGACACCAGGTTTGTTACACGGCTTAAAATGATGAGTATATCCATTGAATCTCA

ACCTTATCTCTCTCTAGACCTTCTTGGTTAAGAAACCATGTAGTTTGTATGAAGTAGGTACTCAAAAGAT

ATTTGATGATTTAATTTTTACTGGAGAAGAAATATTCATATATGTTTTCTTATTTTTACATGTTTTAAAT

ATGTAAAGATTAAATAAACACTCTTAGAAGTATTTAAATTTCCTAAAGTAAATTTATCTCAACCAGTAAC

AGGACCCTCCCAATACTGGAAAGTTGAGTGTGACCGCATTTAGTGGTGATGAGTGTGAGCTTGCTTGGGG

AGAGGGCAGGACATTTAGGATTTCTTAAGCTTAGAGTCAATACAATAAAGATTATTGAGTGCTCACTTGG

GTGGGCTATAATCACTGCTCACAGGAGTTCATGAACCACAAGTAAAAGAGTGAGGAGATATGATTAGCTC

ACAAATAACTTTAATACAGAGCAGAAAGTAATGAACTACTGCAATGGAGTTATCACAGTGCTAAGGATGC

TCAGAGGGCATCTCTGATAGGCAGAGGTGAGGGTTAGGGAAGGAAGCTGTAGTCTAGCTAGCTAGAGCTG

CTGGAATAGACATGACAATGGCTGCTGCCAAACTGTTTTCTCTTCTGAGGACAGATGTCCCGTGCAAGTG

GCTTGGTGGAAGGGACTAGTGTCTCTAATATAGGGTGATTTATAAGCAGGAAAGTGTGTCCTAGAAATTC

AGACCAGAGTGATAGATTGGAATTGGATCATGGGGGACTCATTGAATGTTATTTATTGTATTTGTTTTTG

CGATCAGTGTTAGTAAAGTGTCAAAGGGATTGAGCAGATGAGTGACATCATGCAACACAAGTTTTGAGTT

TCACTTGTCAGACTGACTGGAGAGGGGCCTGGTTAGTTACAGGAAGGTAATTTGGCATGCAGCCACTATT

TTTGAGTTGATGCAAGCCTCTCTGTATGGAGAGCTGGTCTCCTTTATCCTGTGGGAAAAGAGAACAAAGG

AGCATGGGAGTGTTCAAGGGAAGGAGAAATAAAGGGCAGAGAGGCAGCGGTGGTGTCAGGGGAAGCCCAC

AGGAGTTAACAGCAGGGTTGCCTCAACCTAGAGAGGAAGCGACCTGGTGCCCTCGGCTCTGTGGCTTCCT

TCATCTAACAACATCTTCCACTCTACAACAATGCCAGGGAAGGCGGAGGCTGGTACAGTGCATCAAGACA

CAGCTACTCCTGGGTGACAGAGGTTCAGGGCCAGCTCACTAAGTAGGCAGAAGTTTTTGACATATACTTT

GAGAGATAAAGCAAGATTCTGTACCTCAACCTTCAGAATTTCCCCTACCACTCATTATAGTTCCGGAGCT

ATATAGCTCCTATCATTCTATCATAACCTTAGAATACCAGAGAACATATCATCTCATCTAATTATCTCTT

ACTATATGTGAAAAAAATGAAGGACATGGGGGAAGTGTGACTTGCCCCAAATCACATATTTCATGGTAGA

GCCAGGTCTTCTGTTTGTCATATCAGTGTTCTTCCTGCCACAACCATCTTGAAGAATCTATTTCTCAGTA

AGAAAATATCTTTATGGAGAGTAGCTGGAAAACAGTTGAGAGATGGAGGGGAGGCTGGGGGTGTGGAGAG

GGGAAGGGGTAAGTGATAGATTCGTTGAAGGGGGGAGAAAAGGCCGTGGGGATGAAGCTAGAAGGCAGAA

GGGCTTGCCTGGGCTTGGCCATGAAGGAGCATGAGTTCACTGAGTTCCCTTTGGCTTTTCCATGCTAGCA

ATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATG

CATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGT

CTGTGCGGCAACCTACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCC

AGTGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGG

TGGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGGTGA

GCAAAGCCATTTCACTGAGTTGACACCTGTTGCATTGCAGTCTTCTATGCACAAAAACAGTTTTGTTCCT

TAATTTCAGGAGGTTTACTTTTAGGACTGTGGACATTCTCTTTAAGAGTTCTGTACCACATGGTAGCCTT

GCTTATTGTGGGTGGCAACCTTAATAGCATTCTGACTGTAAAATAAAATGATTTGGGGAAGTTGGGGCTC

TCGCTCTGGAGTGCTAACCATCATGACGTTTGATCTGTACTTTTGATATGATATGATGCTCCTGGGGAAG

TAGTCCCAAATAGCCAAACCTATTGGTGGGCTACCCATGCAATTTAGGGGTGGACCTCAAGGCCTGGAAG

CTCTAATGTCCTTTTTTCACCAATGTTGGGGAGTAGAGCCCTAGAGTTTAAAACTGTCTCAGGGAGGCTC

TGCTTTGTTTTCTGTTGCAGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCA

GTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCACAGCTGTTTCTTTGAGCAAAATGGTGAGTGTGG

TGCTGATGGTGCACCATGTCTGATGGGGATACCTTTAGTGGTATCAACTGGCCAAAAGATGATGTTGAGT

TTAGTGTTCTTGAGATGAGATGAGGCAATAAATGAAGAGGAAGGACAGTGGTAAAGAACGCACTAGAACC

GTAGGCATTGGCATTTGAGGTTTCAGAATGACTAATATTTTAGATGAATTTGTTTGACATTGAATGTTCA

TGTGCTTCTGAGCAGGGTTTCAATTTGAGTAACCGTTGCAATAACATGGGGCAGCTGTTTTGCTCTTTGT

CTTCATGACAACTGTACTTAAGCTAACAGCCCTGAAACATGAGATTAGGCTGGGCAGAATGCTGCTAGAG

AGGACCACTTGGATGGTCTTTATTCTCCTTCTCCATGTCCCTCTCCATCACCTGGAAGTCACCTCTGGGT

GCCACTCTGGTGCCTTCCTTGTCGAAGCTGTAGCTGCTCACATGACACCTATCCCTGTTATCCAGTTTGC

TTGACTGGGACGTTTTGCCTTCCCCTTCAGCCAGGAAGTGAAAGTCCCAGTTTTTATTTATCACAGGTGT

TGGTATTGGTGGTAGAAGAGGTAGAATTATGGAATCAGGCCTCCTGTCAGGATTTCTTTTTGACAGTCCC

TCTCAGACACCTCTGCCTAAGGCCAGCTTTGCCATTACAAACTCTCCCTTCTCCCTCTCTCCCTTCTTCT

CTTCCTCTTCCTTCTTCTCGCTCTTTCTCTCTCTCTCTTTCTCCCTCTCTGTCTCTTATACACATACACA

AAGATATACTCTATTCCAACATCCTCTACCCAACCTGACAGAGATGTCCTTTGCTGTAGGTTCAGCAGTG

GGGATGAGAAATACAGCTCTCAAACAGGATAACTAAAGCTTATTATCTTATCAAGCTTGTTCCCTTGCAG

ACAAGATTGATCAATTATCATAGGCTTTCTGGGTGTTCTTTCTGAAGCTTTCTCAAAGTCTCTTTCTCCT

ATCTTCCATTCAAGGCAAATGATTGCCATTTAACATCAAAATCACAGTTATTTATCTAAAATAAATTTTA

ATAGCTGAATCAAGAAAATCTCCTGAGGTTTATAATTCTGTATGCTGTGAACATTCATTTTTAACCAGCT

AGGGACCCAATATGTGTTGAGTTCTATTATGGTTAGAAGTGGCTTCCGTATTCCTCAGTAGTAATTACTG

TTTCTTTTTGTGTTTGACAGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCTATGTGAAAATGCCCCC

AACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGAGAAACCATTATGAAG

AAGAGAGTCCATATTTCAATTTCCAAGAGCTGAGGCAATTCTAACTTTTTTGCTATCCAGCTATTTTTAT

TTGTTTGTGCATTTGGGGGGAATTCATCTCTCTTTAATATAAAGTTGGATGCGGAACCCAAATTACGTGT

ACTACAATTTAAAGCAAAGGAGTAGAAAGACAGAGCTGGGATGTTTCTGTCACATCAGCTCCACTTTCAG

TGAAAGCATCACTTGGGATTAATATGGGGATGCAGCATTATGATGTGGGTCAAGGAATTAAGTTAGGGAA

TGGCACAGCCCAAAGAAGGAAAAGGCAGGGAGCGAGGGAGAAGACTATATTGTACACACCTTATATTTAC

GTATGAGACGTTTATAGCCGAAATGATCTTTTCAAGTTAAATTTTATGCCTTTTATTTCTTAAACAAATG

TATGATTACATCAAGGCTTCAAAAATACTCACATGGCTATGTTTTAGCCAGTGATGCTAAAGGTTGTATT

GCATATATACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTTA

ATTTGATAGTATTGTGCATAGAGCCACGTATGTTTTTGTGTATTTGTTAATGGTTTGAATATAAACACTA

TATGGCAGTGTCTTTCCACCTTGGGTCCCAGGGAAGTTTTGTGGAGGAGCTCAGGACACTAATACACCAG

GTAGAACACAAGGTCATTTGCTAACTAGCTTGGAAACTGGATGAGGTCATAGCAGTGCTTGATTGCGTGG

AATTGTGCTGAGTTGGTGTTGACATGTGCTTTGGGGCTTTTACACCAGTTCCTTTCAATGGTTTGCAAGG

AAGCCACAGCTGGTGGTATCTGAGTTGACTTGACAGAACACTGTCTTGAAGACAATGGCTTACTCCAGGA

GACCCACAGGTATGACCTTCTAGGAAGCTCCAGTTCGATGGGCCCAATTCTTACAAACATGTGGTTAATG

CCATGGACAGAAGAAGGCAGCAGGTGGCAGAATGGGGTGCATGAAGGTTTCTGAAAATTAACACTGCTTG

TGTTTTTAACTCAATATTTTCCATGAAAATGCAACAACATGTATAATATTTTTAATTAAATAAAAATCTG

TGGTGGTCGTTTT

Para ejemplificar el uso de Primer 3, se emple la RefSeq del cromosoma 2, debido

a que bajo esta secuencia se encuentran reportadas los SNP de inters, aunque

bien se podra analizar en el CDS del mRNA del gen CTLA4, solo que se debera

de considerar la posicin, el SNP se encuentra en la posicin 204, y es una cambio

de una Adenina por una Guanina, el cual est asociado al padecimiento de diabetes

tipo1 (OMIM, 2013)

Una ventaja que presenta esta herramienta a diferencia de otras es que permite

usar smbolos dentro de la secuencia para seleccionar reas de inters, regiones

de exclusin, inicio obligado del cebador as como final.

Lo cual en opinin propia es ms fcil de colocar, distinguir e interpretar, es

importante remarcar que primer 3 y primer plus son muy parecidos en cuanto a su

interfaz.

Como podemos observar las condiciones que deben de cumplir los oligonucleotidos

son corretas ya que su longitud es de ambos de 20pb, asi como las temperaturas

de fusin son muy cercanas en ambos, el porcentaje de GC es adecuado, tampoco

hibrida consigo mismo ni con el otro primer as como tampoco forma estrcturas

secundarias segn el analisis proprocionado por Primer 3, el producto es de 246pb

donde se encuentra la region de interes que es la Adenina en la posicion 204.

Regin de inters

left primer >

right primer <

Posteriormente nos porporcionanan mas opciones de oligonucleotidos, para poder

elegir el mejor.

Analizaremos el primer par de oligonucleotidos para anaizarlos con Oligo analyzer

y asi determinar si nos se forman estrcuturas secundarias.

Left primer Rigth primer TTGGATTTCAGCGGCACAAG TGGAATACAGAGCCAGCCAA

Debido a la energia libre de Gibs reportada para cada estructura podemos decir que

no se forman estrcturas homodimericas ni heterodimericas.

Primer3Plus

Para ejemplificar su uso se trabaja con la misma secuecnia que la anterior (Refseq

CTLA4).

Donde se selecciona la misma secuecnia donde se encuentra el Polimorfismo de

un solo nucleotido que esta relacionado con la Diabetes Mellitus tipo1, siendo la

sustitucin de una Adenina por una Timina. Los cebadores propuestos por Primer

3Plus son los siguientes:

Longitud ideal de 20 a 25 nucletidos

Ambos miden 20 pares de bases.

Porcentaje de G/C entre 40% y 60%.

Ambos entran dentro del rango siendo de 50%

La diferencia entre la temperatura a la que se abren las cadenas de DNA (55Tm75), de los primers forward y reverse no debe de ser mayor a 5C.

Sus temperaturas se encuentran dentro del rango y su diferencia es de 0.8 grados Celsius.

No se deben formar regiones 2 internas (Mientras menor sea la autocomplemtaridad mayor probabilidad de formar estructuras secundarias) mientras que a mayor complementariedad en 3 indica la probabilidad del emparejamiento de los primers.

No se forman estructuras secundarias homodimericas de ninguno de los primers, tampoco interaccionan los cebadores entre s.

Debajo se observa dentro de la secuencia nucleotdica de azul el forward primer o

primer izquierdo y de verde el reverse primer o primer derecho, de verde se subraya

la secuencia de inters dentro de la cual se contiene la Adenina en la posicin 204.

Posteriormente tabein muestra mas opciones de pares de primers para seleccionar

el mejor, este analisis con Oligo analyzer ya no se hara puesto que es lo mismo que

con Primer-BLAST y Primer3.

Oligo Analyzer

La base de datos de IDT, permite aparte de hacer el uso de la herramienta de Oligo

analyzer asi como de sus otras calculadoras muy utiles en el labor tcnico de la

gentica, tambin permite proponer oligoncleotidos a partir de la secuencia

analizada, seleccionando PCR 2 primers.

Como resultados primero nos muestra de forma grafica las secciones de los primers

para observar las regiones que se reproduciran.

Debajo se muestran los conjuntos de primers que propone oligo analyzer, donde

apreciamos que ocilan entre los 20 pares de bases, siendo la Tm de todos de 62,

y el porcentaje de GC es en todos menor a 50, por lo que de primera instancia todos

son buenos candidatos, la diferencia aqu radica en la seccin del gen a reproducir,

ya que de forma similar a Primer-BLAST, nos porporciona regiones aletorias de

amplificacin.

Los conjuntos de primers se muestran sin la apreciacion de la secuencia de

oligonucleotido, pero si proporciona la longitud del producto a replicar.

Cambiando la seleccin de la secuecnia a replicar, se coloc que se desea que

entre la region del SNP relacionado con Diabetes mellitus (nucleotido en la posicin

204), por lo que las regiones en verde indican las secciones a reproducir.

Posterioremnete el analisis de cada uno de estos indica nuevamente que cualquiera

se puede elegir, ya que la Tm es adecuada, la longitud y el porcentaje de GC igual,

por lo que solo resta hacer el analisis con Oligo analyzer.

Tomando el conjunto de primers que presentan el producto de mayor tamao es

decir el conjunto 3, se analiza dando click en ver detalles de ensayo, donde se abre

una ventana que muestra las secuencias del primer sentido y del antisentido, asi

como sus caracteristicas que son buenas para ser primers.

Primer Forward

El primer forward si presenta reacciones de autocomplemnetaridad, a tempraturas

de fusion intermedias, sin embargo estas no son muy estables y no causan mayor

problema.

Primer Reverse

Presenta 4 posibles estrcturas pero que no se alcansan a formar debido a que no

se presentan espontaneamente.

En el analisis de Hetero dimeros mostr que no reaccionana los cebadores enttre si

no forman estrcturas secundarias.

MP primer

Se trato de disear una PCR multiplex para las variantes del gen CTLA4 que son 2,

sin embargo al introducir las secuencias a MPprimer, marcaba error. Se decidio

trabjar una PCR con distintos genes que predisponen la enfermedad celiaca, tema

con el cual se incio la investigacin del gen CTLA4.

Segn la base OMIM estos son los genes que predisponene la enfermedad Celiaca,

donde se trabajaron solamente con aquello que a nivel clnico se han vinculado con

la enfermedad y no solo in silico.

En esta imagen se muestran los numeros de identificacion de las secuecnias

empleadas, se introdujeron las secuecnias asi como algunas caracteristicas de

MPprimer.

A continuacion se muestra el resumen de los resultadosde los conjutnos de

cebadores propuestos por MPprimer, delante se aprecia un avlor de penalizacion el

cual es similar a un error producido por trabajar con estos primers, en la sigueinte

columna se aprecian la longitud de cada producto de amplificacin donde en general

oscilan entre los 397, 759, 482 y 581 pares de bases. El ltimo apartado son las

tempraturas de fusin de cada par de cebadores, es imporatante revisar que sean

similares entre todos y que encuentren dentro del rango optimo de Tm. Todos

cumplen con las caracteristicas sealadas.

Ahora seleccionando el primer conjunto de cebadores, ya que presenta la menor

penalizacin y las temperaturas de fusion son muy similares entre cada par de

primers con una desviacin estandar de 1.3C.

Se pueden descragar en 2 tipos de formatos el conjunto de primers pudiendo ser en formato

FASTA o en vista de Excel

>gi|52426772|ref|NM_002122.3|_0_397_fp

TGCTTCCAGACACCAAGGGCCA

>gi|52426772|ref|NM_002122.3|_0_397_rp

AGTCAGCCCTGGATGAAAGATGGA

>gi|15778585|gb|AF414120.1|_0_759_fp

TGAAGACCTGAACACCGCTCCCA

>gi|15778585|gb|AF414120.1|_0_759_rp

AGAATTGCCTCAGCTCTTGGAAATTGA

>gi|166788571|dbj|AB290184.1|_0_482_fp

TGGGAGGCATGCTGAAGCCA

>gi|166788571|dbj|AB290184.1|_0_482_rp

TCATCAAAGTCCGCCTGCTGCC

>gi|188194|gb|M32577.1|HUMMHDQBH_1_581_fp

TGCTACTTCACCAACGGGACGGA

>gi|188194|gb|M32577.1|HUMMHDQBH_1_581_rp

AGCACGAAGCCTCCAATGCCAC

Debajo de cada conjunto de primers esta la opcin de determinar el contenido de

GC y numero de sitios de union entre todos los cebadores, asi como su longitud,

con la herramienta submit to MFEprimer, donde tambien podemos cambiar las

condiciones termodinamicas y observar su comportamiento.

Tambien nos permite ver las reacciones entre los cebadores y las secuencias,

colocando en una tabla a cada cebador e indicando las interacciones.

Otro dato importante es que detecta 5 productos de replicacin, pero como uno se

repite, podemos asegurar que cada uno pertence a la expresion del gen de estudio.

A continuacin se presentan los sitios de union de cada primer a la secuencia

correspondiente.

La opcin Submit to PriDimerCheck perimte la evaluacion entre de los

heterodimeros con los diferetes cebadores.

Estas son todas las relaciones que se pueden producir entre los cebadores, la

mayoria no intervienen tantos enlaces, y s se llegan a formar debido a las energias

libres de Gibs indican que reaccin espontaneamente.

Por ltimo encontramos la opcin de submit to virtual electrophoresis que permite

seleccionar los pares de primers a evalar y observar un diagrma indicatio de lo que

sucederia si se correira la electroforesis, se puede modificar la concentracin del

gel de agarosa 0.5 a 2%

La imagen del electrofotograma es de mucha utilidad ya que nos permite observar

si se van a diferenciar los productos de la amplificacin asi como nos ayuda a

detemrinar el marcador de peso molclar adecuado, en este caso ese paramero no

se controla debido a que el programa lo asigna.

De acuerdo a los pesos de los replicados, podemos determinar que seria mejor un

marcador de peso molecular que valla de 100 en 100 debido a la carcania en el

peso.

Electroforesis virtual de 4 genes que predisponen a la enfermedad celiaca, en la

evaluacion de personas que presenten dicha enfermedad se tiene que presentar

teoricamnete la evidencia de las 4 bandas.

Peso molecular

Gen expresado

759 pb Homo sapiens CTLA4 (CTLA4) mRNA, complete cds

582 pb Human MHC HLA-DQ beta mRNA, complete cds

482 pb Homo sapiens mRNA for MYO9B variant protein, complete cds

397 pb Homo sapiens major histocompatibility complex, class II, DQ alpha 1 (HLA-DQA1), mRNA

Ejercicio de repaso

Los genes housekeeping empleados como estandares internos que eleg son: a la

albumina y la cycplophilin debido a que ambos se encuentran en la espcie H.

sapiens y se presentan secuecniados en forma de mRNA ambos.

Homo sapiens albumin (ALB), mRNA NCBI Reference Sequence: NM_000477.5

GenBank Graphics

>gi|215982788|ref|NM_000477.5| Homo sapiens albumin (ALB), mRNA

AGTATATTAGTGCTAATTTCCCTCCGTTTGTCCTAGCTTTTCTCTTCTGTCAACCCCACACGCCTTTGGC

ACAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTC

GTCGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT

GGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAA

GTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCC

TTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGC

AAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTG

GTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACT

TATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAA

AGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTT

CGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAA

GAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTC

CAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGAT

GACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCT

GTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTT

GCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTC

TTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGAC

TTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAA

AGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTT

GAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGT

CAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGA

AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAG

AAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTT

CAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA

TATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACAC

AAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCT

GCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGC

CTTAGGCTTATAACATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGAT

CAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATT

TCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGT

ACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTG

TTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACT

CTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Para ambos se analizaron en Primer3Plus ya que se aprecio mayor claridad de lo

que se mostraba,

Se colocaron corchetes dentro de la secuecnia para la secuencia replicada fuera la

que pertence al CDS del gen, los cebadores se posicionaron adecuadamente.

El forward primer tiene un longitud adecuada de 19 pb, y su porcentaje de C y G es

un poco elevado pero entra dentro del rango, sin embrago se aprecia mayor

estabilidad en el extremo 3 que en el 5 sucediendo lo mismo con el reverse primer,

segn la fuente no presenta reaccion autocomplemetaria. El reverse primer

presenta una adecuada longitud de pares de bases y porcentaje de GC, la

temperatura de ambos esta dentro del rango y estan diferenciadas por 3 decimas

permitiendo que los dos se cebadores se unan al mismo tiempo al alcanzar la

temperatura de fusion optima.

EL primer forward puede presentar un acoplaminto de orquilla efecto de la

complemnetaridad de sus bases, esto es un proceso espontaneo y se produciria a

61.1C.

Tambien se pueden presentar reaccion de homodimerizacion de forma espontanea,

con enlaces fuertes en promedio 2 pares de bases.

En cuanto a la formacin de heterodimeros, hay dos que presentan un valor de delta

G muy bajo indicandonos que la reaccin es muy espontanea y que seguramente

se produciran estas estrcuturas secundarias que interfiran en el proceso, sin

embargo a comparacion de otras dos opciones mostradas por Primer3plus

presentan menor cantidad de estructuras secuendarias.

Para la realizacion del los primers para Cyclpphilin emple Primer3Plus, no

selecione ningun area en particular y me selecciono el mejor par de cebadores.

Homo sapiens cyclophilin mRNA, complete cds

GenBank: AF022115.1

GenBank Graphics

>gi|29028315|gb|AF022115.1| Homo sapiens cyclophilin mRNA, complete cds

CCACTGTCGCTTTTCGCCGCTTGCTGCAGCCATGGTCAACCCCACCGTGTTCTTCGACATCACGGCCGAT

GACGAGCCCTTGGGCCGCGTCTCCTTCGAGCTGTTTGCAGACAAAGTTCCAAAGACAGCAGAAAACTTTC

GAGCTCTGAGCACTGGAGAGAAAGGATTTGGCTATAAGGGTTCCTCCTTTCACAGAATTATTCCAGGATT

CATGTGCCAGGGTGGTGACTTTACACGCCATAATGGCACTGGCGGCAGGTCCATCTACGGAGAGAAATTT

GAGGATGAGAACTTCATCCTAAAGCATACAGGTCCTGGCATCTTGTCCATGGCAAATGCTGGACCAAACA

CAAACGGTTCCCAGTTTTTTATCTGCACTGCCAAGACTGAATGGCTGGATGGCAAGCATGTGGTCTTTGG

GAAGGTGAAAGAAGGCATGAACATTGTGGAAGCCATGGAGCGTTTTGGGTCCAGGAATGGCAAGACCAGC

AAGAAGATCACCATTTCCGACTGTGGACAGCTCTAATTTCTTTTGACTTGCGGGCATTTTACCCATCAAA

CCATTCCTTCTGTAGCTCAGGAGAGCGTCCCTACCCCATCCTGCTCGCAATGTCCTGTAATCTCTGCTCT

CACTGAAGTCTTTGGGTTCCATATTTTCCTCATTCCCCTTCAAGTCTAGCTGGATTGCAAAGTTAAGTTT

Homodimeros Heterodimeros

ATGATTATGAATA

Donde la longitud de los primers son ideales, la temperatuura de fusion entra en el

rango, y su diferecnia es minima, el porcentaje de G y C es bueno, aunque indican

reaccion de autocomplementaridad. En el analisis con Oligo analyzer se

encontraron 4 posibles estrcturas que se producen espontaneamente pero no son

tan significativas.

Tambein inidca la formacion de homodimeros y heterodimeros, pero su delta G

indica que no son tan importantes, podiendo ser cebadores del gen.

Homodimeros

Heterodimeros