Doctorado en Ciencias en Biotecnología
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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Sección de Estudios de Posgrado e Investigación “Obtención y caracterización de material lignocelulósico a partir de residuos de Agave salmiana y su uso en copolímeros de metacrilato” Doctorado en Ciencias en Biotecnología PRESENTA M. en C. Rafael Chávez Romero Directoras de Tesis Dra. Rosalva Mora Escobedo Dra. Areli Flores Morales Ciudad de México, junio 2018
Transcript of Doctorado en Ciencias en Biotecnología
1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Sección de Estudios de Posgrado e Investigación
“Obtención y caracterización de material lignocelulósico a partir de
residuos de Agave salmiana y su uso en copolímeros de metacrilato”
Doctorado en Ciencias en Biotecnología
PRESENTA
M. en C. Rafael Chávez Romero
Directoras de Tesis
Dra. Rosalva Mora Escobedo
Dra. Areli Flores Morales
Ciudad de México, junio 2018
A QUIEN CORRESPONDA: P R E S E N T E.- Quien suscribe el Dr. Manuel Iván Girón Pérez, Editor de la Revista Bio Ciencias
(ISSN: 2007-3380) incorporada a los índices: Web of Science (Thomson Reuters)
DOAJ, IMBIOMED, LATINDEX y Conacyt, hace
CONSTAR
Que el Artículo titulado “DISINTEGRATION TREATMENTS OF AGAVE
SALMIANA WASTE: LIGNOCELLULOSE CHARACTERIZATION BY
PHYSICOCHEMICAL, THERMOGRAVIMETRIC AND SPECTROSCOPIC
STUDIES”, de la autoría de Chávez-Romero Rafael, Flores-Morales Areli, Yee-
Madeira Hernani Tiago, García-Zebadúa Julio Cesar, González-Montoya Marcela,
Mora-Escobedo Rosalva. Actualmente se encuentra en calidad de Artículo Aceptado
en proceso de edición para su publicación en la Revista Bio Ciencias.
Se extiende la presente a petición de los interesados, para los fines Administrativos
que a ellos convengan en la Ciudad de Tepic, Estado de Nayarit México, a los
veintiocho días del mes de junio del año dos mil dieciocho.
ATENTAMENTE
DR. MANUEL IVAN GIRON PEREZ EDITOR DE LA REVISTA BIO CIENCIAS
5
RESUMEN
La generación de residuos ricos en material lignocelulosico, provenientes de la agroindustria, se ha
incrementado e industrias como la alimentaria, de empaque, automotriz y de la construcción están
interesadas en aprovechar, ya que son una fuente económica y abundante para obtener materiales
compuestos reforzados. Por lo tanto, se plantea desintegrar el residuo de agave por tratamientos
fisicoquímicos secuenciales para recuperar materiales de diferentes propiedades para diversas
aplicaciones, además de evaluar la susceptibilidad de los materiales fibrosos a la reacción química
por copolimerización utilizando metilmetacrilato (MMA) como activador para obtener materiales
plásticos. Para eso, se recolectaron hojas de A. salmiana después de la etapa de producción, se
liofilizo y molió a un tamaño de partícula de 180 µm (M0). Se analizó la composición química de
M0, y se aplicaron cuatro tratamientos para extraer o eliminar componentes de manera
secuencial:1). Extracción Soxhlet de M0 con éter de petróleo (M1); 2). Extracción acuosa de M1 a
25°C y extracción acuosa a 80 °C, 2 h (M2); 3). Hidrolisis alcalina de M2 con NaOH al 4%, 80°C,
2 h. (M3); y 4). Oxidación de M3 con NaClO2 al 1.7 %, 80 °C, 4 h., además de oxidación con H2O2
al 2%, 90°C, 2 h. (M4). La reacción de copolimerización se realizó con el material lignocelulosico
M2, M3 y M4 obtenidos por la extracción fraccionada del residuo de agave, en medio acuoso
utilizando nitrato de amonio y cerio IV (CAN) como catalizador y MMA. Los materiales
lignocelulósicos y de copolimerización se analizaron para conocer variación de grupos funcionales
de los componentes, índice de cristalinidad, estabilidad térmica, autofluorescencia de los
componentes, micro y nano estructuras. Además, las imágenes se analizaron por Image J lo que
permitio determinar las características morfométricas y fractales.
La composición química del residuo fue: humedad (86.1 %), cenizas (5.1 %), extracto etéreo (0.7
%), azúcares reductores totales directos (26.5 %), proteínas (5.1 %) y fibras (22.1 %). Los
rendimientos, en base seca, de las muestras fueron: M1 = 99.3 %, M2 = 52.5 %, M3 = 33.4 % y
M4 = 76.4 %. La concentración de la celulosa se enriqueció después aplicar los métodos de
extracción descritos anteriormente, alcanzando 80.7 % de celulosa con el último tratamiento. Los
productos de copolimerización presentaron físicamente consistencia plástica y aunque el
rendimiento es mínimo, hubo señales en el infrarrojo que indican cambios químicos, además la
estabilidad térmica y los índices de cristalinidad son diferentes entre las fibras y sus respectivos
copolímeros. Cambios en la autofluorescencia y en las micro y nanoestructuras, por medio de
análisis de imágenes se observaron cambios morfométricos, pero no de textura. La extracción
6
acuosa genera el mejor rendimiento, seguido del tratamiento alcalino, alcanzando 53 y 76 % de
celulosa, respectivamente. El material copolimerizado con la lignocelulosa obtenida con
tratamiento alcalino fue el más estable térmicamente.
ABSTRACT
The generation of waste rich in lignocellulosic material, coming from the agro-industry, has
increased and industries such as food, packaging, automotive and construction are interested in
taking advantage since they are an economic and abundant source to obtain reinforced composite
materials. Therefore, it is proposed to disintegrate the agave residue by sequential physicochemical
treatments to recover materials of different properties for diverse applications, besides evaluating
the susceptibility of the fibrous materials to the chemical reaction by copolymerization using
methylmethacrylate (MMA) as an activator to obtain materials plastics. For that, leaves of A.
salmiana were collected after the production stage, freeze-dried and ground to a particle size of
180 μm (M0). The chemical composition of M0 was analyzed, and four treatments were applied to
extract or eliminate components sequentially: 1). Soxhlet extraction of M0 with petroleum ether
(M1); 2). Aqueous extraction of M1 at 25 °C and aqueous extraction at 80 °C, 2 h (M2); 3). Alkaline
hydrolysis of M2 with 4% NaOH, 80 ° C, 2 h. (M3); and 4). Oxidation of M3 with 1.7% NaClO2,
80 °C, 4 h., In addition to oxidation with 2% H2O2, 90 °C, 2 h. (M4). The copolymerization reaction
was carried out with the lignocellulosic material M2, M3 and M4 obtained by the fractional
extraction of the agave residue, in an aqueous medium using ammonium nitrate and cerium IV
(CAN) as a catalyst and MMA. The lignocellulosic and copolymerization materials were analyzed
to know variation of functional groups of the components, crystallinity index, thermal stability,
autofluorescence of the components, micro and nanostructures. In addition, the images were
analyzed by Image J to determine the morphometric and fractal characteristics. The chemical
composition of the residue was: humidity (86.1%), ash (5.1%), ether extract (0.7%), total direct
reducing sugars (26.5%), proteins (5.1%) and fibers (22.1%). The yields, on dry basis, of the
samples were: M1 = 99.3%, M2 = 52.5%, M3 = 33.4% and M4 = 76.4%. The concentration of
cellulose was enriched after applying the extraction methods described above, reaching 80.7%
cellulose with the last treatment. The copolymerization products physically presented plastic
consistency and although the yield is minimal, there were signals in the infrared indicating
chemical changes, in addition, the thermal stability and the crystallinity indexes are different
7
between the fibers and their respective copolymers. Changes in autofluorescence and in micro and
nanostructures, by means of image analysis, morphometric changes were observed but not the
texture. The aqueous extraction generates the best yield, followed by the alkaline treatment,
reaching 53 and 76% of cellulose, respectively. The material copolymerized with lignocellulose
obtained with alkaline treatment was the most thermally stable.
8
Índice general
RESUMEN .................................................................................................................................................................... 5
ABSTRACT .............................................................................................................................................................. 6, 7
Índice de figuras ........................................................................................................................................................... 10
Índice de cuadros .......................................................................................................................................................... 12
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................................. 13
1.1 Residuos de agave pulquero y su composición ................................................................................................... 14
1.2 Características y propiedades de las biofibras vegetales ................................................................................... 17
1.2.1 Hemicelulosas ..................................................................................................................................................... 17
1.2.2 Celulosa .............................................................................................................................................................. 18
1.2.3 Lignina ................................................................................................................................................................ 21
1.3.1 Métodos mecánicos (físicos) .............................................................................................................................. 23
1.3.2 Métodos químicos .............................................................................................................................................. 23
1.3.3 Métodos fisicoquímicos ..................................................................................................................................... 24
1.3.4 Métodos biológicos (enzimáticos) ..................................................................................................................... 24
1.4 Métodos de modificación superficial ................................................................................................................... 25
1.4.1 Tratamiento alcalino ......................................................................................................................................... 25
1.4.2 Acetilación, EDTA y silano ............................................................................................................................... 25
1.4.3 Oxidación
clorito y peróxido de hidrógeno ............................................................................................................................ 26
1.5 Propiedades del polimetilmetacrilato ................................................................................................................. 27
2. JUSTIFICACIÓN................................................................................................................................................... 28
3. HIPÓTESIS ............................................................................................................................................................ 30
4. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 31
4.1 Objetivo general.................................................................................................................................................... 31
4.2 Objetivos específicos ............................................................................................................................................. 31
5. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................................................. 32
5.1 Materiales y reactivos ........................................................................................................................................... 32
5.2 Desintegración fisicoquímica de A. salmiana ..................................................................................................... 33
5.3 Análisis proximal de M0 y fibras en lignocelulosas ........................................................................................... 34
5.4 Reacción de copolimerización .............................................................................................................................. 34
5.5 Análisis instrumental de lignocelulosas y copolimeros ...................................................................................... 35
5.5.1. Espectroscopia IR-TF....................................................................................................................................... 35
5.5.2. Difracción de Rayos X (DRX) .......................................................................................................................... 35
5.5.3. Análisis termo gravimétrico (TGA) ................................................................................................................ 36
5.5.4 Colorimetría ....................................................................................................................................................... 36
5.5.5 Microscopia confocal ......................................................................................................................................... 37
5.5.6 Microscopia electrónica de barrido de alta resolución (MEB-AR) ............................................................... 37
5.6 Análisis de imágenes ............................................................................................................................................. 37
5.7 Análisis estadístico ................................................................................................................................................ 38
9
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 39
6.1 Caracterización fisicoquímica de lignocelulosas ................................................................................................ 39
6.2 Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina .................................................................................................... 40
6.3 Caracterización estructural de lignocelulosa ..................................................................................................... 42
6.3.1 Identificando enlaces químicos por IR-TF ...................................................................................................... 42
6.3.2 Difractogramas e índices de cristalinidad ....................................................................................................... 44
6.3.3 Termogramas y estabilidad térmica ................................................................................................................ 47
6.3.4 Parámetros, cambios, índices, intensidad y ángulo de color de las lignocelulosas ....................................... 49
6.4 Caracterización microestructural de las lignocelulosas .................................................................................... 53
6.5 Análisis de imagen de autofluorescencia de los materiales lignocelulosico ..................................................... 57
6.5.1 Área total de fluorescencias .............................................................................................................................. 58
6.5.2 Perímetro de partículas ..................................................................................................................................... 59
6.5.3 Circularidad de partículas ................................................................................................................................ 61
6.5.4 Diámetro de Feret .............................................................................................................................................. 61
6.5.5 Relación de aspecto AR ..................................................................................................................................... 63
6.5.6 Dimensión fractal ............................................................................................................................................... 64
6.5.7 Lagunaridad (área) ........................................................................................................................................... 65
6.5.8 Textura (Dimensión fractal y lagunaridad) ..................................................................................................... 66
6.6 Síntesis y análisis de copolímeros ........................................................................................................................ 66
6.6.1 Porcentaje de injerto ......................................................................................................................................... 66
6.6.2 Termogravimetría ............................................................................................................................................. 67
6.6.3 Microscopia confocal de copolimeros .............................................................................................................. 68
6.6.4 Microscopia MEB-AR ....................................................................................................................................... 70
7. CONCLUSIONES .................................................................................................................................................. 71
Nomenclatura ............................................................................................................................................................... 72
Bibliografía ................................................................................................................................................................... 73
10
Índice de figuras
Pág.
Fig. 1 Principales entidades federativas productoras de aguamiel en México……… 11
Fig. 2 Ciclo del agave pulquero y generación de residuos………………………….. 12
Fig. 3 Estructura de la biofibra e interacciones entre ellas…………………………… 13
Fig. 4 Estructura química de hemicelulosa tipo xilano y glucomanano…………….. 14
Fig. 5 Jerarquización de la celulosa…………………………………………………. 15
Fig. 6 Polimorfismos de la celulosa………………………………………………… 16
Fig. 7 Estructura básica de la lignina……………………………………………….. 18
Fig. 8 Espectro IRTF de lignocelulosa de A. salmiana, en pastilla de KBr………… 36
Fig. 9 Difractogramas de lignocelulosas de A. salmiana, técnica de polvos……….. 38
Fig. 10 Estabilidad térmica de la lignocelulosa de A. salmiana…………………….. 41
Fig. 11 Micrografía MEB-AR (1000X) que muestra cambios estructurales para
lignocelulosas………………………………………………………………………..
46
Fig. 12 Micrografia confocal (20X) que muestra cambios de autofluorescencia para
lignocelulosas……………………………………………………………………….
47
Fig. 13 Espectros de emisión de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C)……… 49
Fig. 14 Área de partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C)…………. 50
Fig. 15 Perímetro de partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C)…… 52
Fig. 16 Circularidad de las partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C).. 53
Fig. 17 Diámetro de Feret de las partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y
roja (C)…………………………………………………………………………….
54
Fig. 18 Relación de aspecto de las partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y
roja (C)………………………………………………………………………………
55
Fig. 19 Dimensión fractal (DF BCFA) de las partículas de fluorescencia azul (A),
verde (B) y roja (C)………………………………………………………………….
56
Fig. 20 Lagunaridad de área (λBC) de las partículas de fluorescencia azul (A), verde
(B) y roja (C)…………………………………………………………………………
57
Fig. 21 (A) Dimensión fractal de textura (DFSBLA) y (B) lagunaridad de textura
(λSBLA) de las lignocelulosas sin tratamiento (M0) y por la aplicación de diferentes
tratamientos (M1, M2, M3, M4)…………………………………………………….
58
Fig. 22 Estabilidad térmica de los copolímeros usando lignocelulosa proveniente
de A. salmiana……………………………………………………………………….
59
11
Fig. 23 Microscopia confocal (20X) de los materiales lignocelulosicos (M2, M3 y
M4) y material copolimerizado correspondiente (MSA, MCA y MBL)……………
61
Fig. 24. Micrografía MEB-AR del copolímero MCA (usando lignocelulosa M3)…. 62
12
Índice de cuadros
Pág.
Cuadro 1. Composición química de hojas de A. salmiana (M0)…………………………. 34
Cuadro 2. Cambios en el contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina en residuo de A.
salmiana…………………………………………………………………………………..
35
Cuadro 3. Rendimientos de material lignocelulósico con diferentes tratamientos………. 36
Cuadro 4. Índices de cristalinidad estimados con el método de Segal (Kaushik et al.
2010)……………………………………………………………………………………….
40
Cuadro 5. Parámetros de color de acuerdo al modelo cromático CIEL*a*b*de pencas de
A. salmiana tratadas…………………………………………………….............................
44
Cuadro 6. Índices, intensidad, ángulo y cambios de color de pencas de A. salmiana
tratadas…………………………………………………………………………………….
45
Cuadro 7. Porcentaje de injerto en los copolímeros………………………………............. 59
13
1. INTRODUCCIÓN
Los residuos lignocelulósicos han estado tomando importancia toda vez que son fuente de algunos
productos alimenticios, nuevos materiales y químicos que pueden sustituir algunos derivados del
petróleo. Además, la falta de disponibilidad de los recursos fósiles en el futuro, así como la
contaminación del ambiente que ha generado el uso del petróleo y sus derivados han conducido a
investigaciones sobre el aprovechamiento de la biomasa lignocelulósica utilizando procesos de
bajo impacto al ambiente.
Después de producir aguamiel, el agave pulquero genera residuos: pencas y tronco. Los cuales no
se aprovechan por completo; se secan para usarse como material de combustión o como biomasa
para enriquecer la tierra de cultivo, pero podría obtenerse mayor beneficio si se separa y extraen
los diferentes componentes que la constituyen, por ejemplo: los carbohidratos libres, pectinas,
lípidos, proteínas y la celulosa, hemicelulosa y lignina.
La celulosa es de interés prioritario, ya que puede emplearse de diversas maneras: incorporarla en
materiales compuestos para mejorar las propiedades mecánicas (Milsamy 2011), base para
sintetizar copolímeros (Lin Chun-xian, 2009), fuente de bioetanol (Cardona 2010), entre otras.
Este material, también denominado lignocelulosa, es obtenido por procesos de extracción ácida o
alcalina, hasta lograr la mayor purificación con el objetivo de que sea material de reacciones de
esterificación o copolimerización para la obtención de plásticos biodegradables de interés en la
industria de alimentos y otras. La importancia de los procesos de extracción de componentes
lignocelulósicos radica en el impacto que presentan al medio ambiente, el costo del proceso y su
aplicación industrial.
Por lo tanto, en este trabajo se planteó determinar el efecto sobre el residuo de pencas de agave
pulquero, al aplicar una serie de tratamientos simples de extracción con la finalidad de obtener la
mayor proporción de celulosa para hacerla reaccionar con metacrilato de metilo y obtener un
copolímero. Por otra parte, en la literatura se reporta generalmente sobre la caracterización de las
fibras con relación a las propiedades físicas, como es la descripción de color, tamaño, textura,
adsorción o penetración de agua, a través de micrografías, actualmente bajo nuevas tecnologías se
puede profundizar midiendo el color con base en algún modelo cromático que permite evaluar
cambios asociados a los procesos de extracción de componentes lignocelulósicos.
14
1.1 Residuos de agave pulquero y su composición
El género agave tiene 210 especies y México cuenta con 159 de las cuales 119 son endémicas
(Bartra et al. 2012). El A. fourcroydes (henequén) se cultiva en Yucatán para la producción de
diferentes productos domésticos; El A. sisilana (sisal) se cultiva principalmente en Brasil, del cual
provienen materiales fibrosos. El A. tequilana se cultiva en Jalisco principalmente para producir
tequila. El A. angustifolia se produce en Oaxaca para elaborar mezcal.
Como agave pulquero existen diferentes especies, entre ellas están: A. salmiana Otto ex Salm-
Dyck, (maguey de pulque); A. mapisaga; A. atrovirens Karw (maguey manso); A. lehmannii
(maguey corriente); A. cochlearis (maguey chalqueño); A. attisima jacobi (maguey de venado)
(Flores Morales et al. 2009). Algunos autores consideran al A. americana como especie pulquera
(José & García 2000) y hay algunas especies de A. salmiana que se consideran mezcaleros. Aunque
el principal enfoque de cultivar agave pulquero es la recuperación de aguamiel para producir
pulque, esta planta se ha revalorado recientemente, debido a que estudios recientes mencionan que
el aguamiel contiene diferentes fructooligosacáridos de interés alimentario, como la inulina
(Apolinário et al. 2014), lo cual está generando una nueva línea de edulcorantes naturales y ubican
al aguamiel como una fuente de alimento funcional.
Por otro lado, el A. americana se ha estudiado como fuente de fibras textiles (Msahli et al. 2006);
Estudios de A. salmiana y A. americana han reportado el uso de sus fibras como absorbente de
metales catiónicos como Cd (II), Pb (II) y Zn (II) en agua (Velazquez-Jimenez et al. 2013; Hamissa
et al. 2010). Otros estudios reportan que A. tequilana se utiliza en la elaboración de papel artesanal
y biocombustibles (Idarraga et al. 1999; Peng et al. 2012). Amar Singh Singha & Rana 2010,
reportan la modificación química de A. americana para formar materiales compuestos.
La industria del agave pulquero reporta para el año 2008, plantaciones de 195,600 Toneladas de
plantas en el estado de Hidalgo, primer lugar en este ramo. Los estados de Tlaxcala, México y
Puebla son las entidades más importantes en la producción de pulque (Fig. 1) (Bartra et al. 2012;
José & García 2000) (Sagarpa, 2009).
15
_
Fig. 1 Principales entidades federativas productoras de aguamiel en México. SIAP, 2016.
En el 2013, la Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación
presentó el proyecto: Tecnologías de Producción, Transformación y Comercialización de Agave
Pulquero para los estados de Puebla, Hidalgo y Tlaxcala con el cual se pretendía impulsar la
propagación de magueyes y concentración de aguamiel para obtener un jarabe de fructosa de interés
comercial (SAGARPA 2013).
La planta de maguey muere al término de su etapa productiva, generando una gran cantidad de
residuo. Generalmente, éste se seca en el campo, se biodegrada naturalmente y es aprovechado
como abono orgánico, o bien, es utilizado como material de combustión por los habitantes de las
poblaciones aledañas al cultivo de maguey.
Por otra parte, Pinos-Rodríguez et al. (2008), describe La composición de las hojas de A. salmiana
de diferentes edades (12, 14 y 16 años) con un contenido de: 87 – 89.5 % de humedad; y 86.2 –
91.6 % de materia orgánica; 8.4 – 13.8 % de cenizas. De la materia orgánica, 18.9 – 35.8 %
azucares; 3.8 - 4.8 % proteína cruda; y 18.9 - 27 % fue fibra neutra cruda (base seca), con ello
16
muestra que esta composición no cambia con respecto a las diferentes edades de la planta, excepto
para los azúcares que alcanzan su concentración más alta en agaves de 14 años. Por otra parte, se
ha reportado que la fibra neutra cruda de hojas de A. americana está compuesta por 68.4 % de
celulosa; 15.7 % de hemicelulosa y 4.9 % de lignina todo en base seca (Mylsamy & Rajendran
2011). Esta composición es de la fibra macerada en agua por 2 semanas, secadas a temperatura
ambiente y cepilladas para eliminar materia adherida a la fibra. Otras hojas de agaves que se han
estudiado y que son importantes por sus biofibras son: A. cantala; A. fourcroydes; y A. sisilana
(John & Thomas 2008). A la fecha actual no se hay reportes sobre la composición del desecho de
maguey pulquero. La Fig. 2 muestra el ciclo del agave pulquero y como se generan los residuos de
esta planta.
Fig. 2 Ciclo del agave pulquero y generación de residuos.
RESIDUO
HIJUELOS
MADUREZ
MERISTEMO
PRODUCCIÓN
CAPADO EXTRACCIÓN
17
1.2 Características y propiedades de las biofibras vegetales
Entre otros componentes, los vegetales contienen tres biopolímeros que en conjunto se conocen
como fibra neutra cruda o fibra detergente neutra (FDN) y está formada por: celulosa, hemicelulosa
y lignina (John & Thomas 2008). Éstas forman parte de la estructura celular de la biomasa (Fig.
3). La celulosa se encuentra estrechamente asociada a la hemicelulosa y lignina, juntos se conocen
como biomasa lignocelulósica y se considera que es un bionanocomposito natural (Habibi et al.
2010). Esta naturaleza de las biofibras complica la separación de cada una. Por lo que para explotar
al máximo sus propiedades se deben separar. El aislamiento de cada biopolímero de la biomasa se
realiza disolviendo, alterando y/o destruyendo la estructura de los otros dos.
Fig. 3 Estructura de la biofibra e interacciones entre ellas (John & Thomas 2008).
1.2.1 Hemicelulosas
Son un conjunto de polisacáridos heterogéneos y ramificados, compuestos de una combinación de
azúcares de 5 y 6 carbonos: xilosa, arabinosa, glucosa, galactosa, manosa, fucosa, ácido
glucurónico y ácido galacturónico (Fig. 4). Tienen bajo peso molecular y un grado de
polimerización de 80-200 unidades. La heterogeneidad de azúcares, ramificación del polímero y
grado de polimerización son diferencias marcadas entre celulosa y hemicelulosa (John & Thomas
2008; Peng et al. 2012). Además de estar asociados a la celulosa y lignina, también se asocian con
proteínas de la pared celular y otros compuestos fenólicos por enlaces de hidrógeno y covalentes y
por interacciones iónicas e hidrofóbicas (Sun et al. 2000). Por otra parte, los métodos de aislamiento
de la hemicelulosa incluyen: extracción alcalina, extracción con peróxido alcalino, extracción con
agua caliente y explosión con vapor (Peng et al. 2012). La hemicelulosa es hidrofílica, soluble en
álcalis y fácilmente hidrolizada en ácidos (John & Thomas 2008). Los azúcares, producto de su
hidrólisis, se pueden transformar en etanol o en 5-hidroximetilfurural, furfural, ácido levulínico, y
Pared secundaria S3
Pared secundaria S2
Pared secundaria S1
Pared primaria
Angulo espiral
Lumen
Microfibrillas
cristalinas de
celulosa
arregladas
helicoidalmente
Región amorfa
constituida por
lignina y
hemicelulosa
Redes de
microfibrillas de
celulosa cristalina
desordenadas Lignina
Hemicelulosa Microfibrilla Celulosa
Hemicelulosa
Celulosa
Lignina
18
xilitol. También se pueden convertir en biopolímeros por modificación, usándose como
modificadores de viscosidad, aditivos de resistencia a la humedad en papel y aglutinante de
tabletas; posibles usos médicos como protector de úlceras, antitusivo, inmunoestimulante y
antitumoral (Peng et al. 2012).
Fig. 4 Estructura química de hemicelulosa tipo xilano y glucomanano
1.2.2 Celulosa
Es un homopolisacárido lineal cuya unidad básica es β-D-Glucopiranosa unida por enlaces β-1-4,
la unidad que se repite es un dímero de la glucosa (celobiosa). Cada monómero contiene tres grupos
hidroxilos, susceptibles de formar puentes de hidrógeno y que influyen en el empacamiento
cristalino y propiedades físicas de la celulosa. En la madera su grado de polimerización es de
alrededor de 10,000 ((Habibi et al. 2010; John & Thomas 2008). Su jerarquía morfológica (Fig. 5),
de menor a mayor tamaño, consiste en:
1. Molécula de celulosa
Enlace glicosídico β-1,3
(a) Xilano
(b) Glucomanano Enlace glicosídico β-1,4
R = CH3CO o H
19
2. Protofibrilla (Fibrilla elemental, 5 nm). Una protofibrilla se forma por 36 moléculas de
celulosa.
3. Microfibrilla (CMF y/o CNC, 20 – 50 nm).
4. Grupo de microfibrillas.
Fig. 5. Jerarquización de la celulosa (Lavoine et al. 2012)
De acuerdo al nivel de arreglo de las microfibrillas hay regiones cristalinas (altamente ordenadas,
celulosa nanocristalina, CNC) o amorfa (desordenadas) (Lavoine et al. 2012; Habibi et al. 2010).
En la región cristalina, las interacciones inter e intramoleculares pueden generar polimorfos de
celulosa. Se han identificado seis polimorfos intercambiables llamados I, II, IIII, IIIII, IVI y IVII.
La celulosa I, nativa en muchas fuentes, agrupa sus cadenas paralelamente; existe en dos sub-
alomorfos: Celulosa Iα (con celda unitaria triclínica) prevalece en algas y bacterias; mientras que
celulosa Iβ (con celda unitaria monoclínica) se encuentra en plantas superiores. La celulosa II
agrupa sus cadenas de forma antiparalela y tiene una fase monoclínica. Ésta se obtiene por
regeneración, que consiste en disolver la celulosa I con soluciones complejas de grupo amino y un
metal pesado, y luego precipitando la celulosa con agua. También por mercerizado se obtiene
Pared celular
Imagen MEB
Celulosa microfibrilada
Fibrilla elemental (Microfibrilla)
Fibra de celulosa Regiones cristalinas
Regiones amorfas
Estructura química de la cadena de celulosa
Fibra de celulosa
Fuentes de celulosa
20
celulosa II, el procedimiento radica en remojar con solución de hidróxido de sodio (> 17 %) o ácido
nítrico (65 %) celulosa I y posteriormente eliminar esta solución.
Si la celulosa I o II se ponen en contacto con amoniaco o aminas, se forma la celulosa III que puede
ser IIII o IIIII dependiendo del tipo de celulosa expuesta. Ambas tienen casi la misma estructura
monoclínica. Por otro lado, el polimorfo IVI y IVII se prepara calentando a 260 °C en glicerol la
celulosa IIII o IIIII, no se tiene claro el tipo de estructura cristalina que tienen (Habibi et al. 2010).
La Fig. 6 muestra las condiciones para obtener los diferentes polimorfos de la celulosa y la relación
entre ellos.
Fig. 6 Polimorfismos de la celulosa.
La celulosa es altamente resistente a álcali fuerte y moderadamente a agentes oxidantes, pero es
fácilmente hidrolizable por ácidos a azúcares solubles en agua (John & Thomas 2008).
La celulosa es considerada como la biofibra de mayor interés para la formación de materiales
compuestos. Las pulpas blanqueadas Kraft y al sulfito obtenidas de la madera son los materiales
más comunes para la fabricación de celulosa microfibrilada (CMF). La CMF se extrae por medios
físicos manejando un homogenizador de Gaulin, un microfluidizador o un molino, todos ellos
conllevan un alto consumo de energía. Además, debido a que la celulosa en la madera se encuentra
en una pared secundaria de la planta, obtener CMF demanda mayor consumo de energía. Por otro
lado, la CMF a partir de los residuos de las cosechas agrícolas y sus subproductos se obtiene desde
una pared primaria: se consume menos energía y hay beneficios ambientales, y es una fuente
fácilmente renovable (Lavoine et al. 2012).
Celulosa II Celulosa I
Celulosa IIII Celulosa IVI Celulosa IIIII Celulosa IIIII
Amonio Amonio
Glicerol Glicerol
-80°C -80°C
Cadenas paralelas Cadenas antiparalelas
Regeneración NaOH
21
Las microfibrillas, largas y flexibles, tiene alrededor de 20 nm de ancho, y de 10 – 50 µm en
longitud, consisten de dominios amorfos y cristalinos alternados (Brinchi et al. 2013), como se
aprecia en la Fig. 5. La CMF se puede convertir en películas, recubrir otros materiales o mezclarse
con una matriz polimérica (Lavoine et al. 2012). Al combinarse con otros biopolímeros como el
almidón o con polímeros sintéticos como el polietileno, se obtiene materiales con propiedades
mecánicas, ópticas y/o térmicas mejoradas.
La celulosa nanocristalina (CNC) se obtiene de CMF por medio de una hidrólisis con un ácido
fuerte al 60 %. Este tipo de celulosa está formada por partículas en forma de varilla rígida de 5 –
70 nm de ancho y 100 nm a varias micras de largo. Las partículas son 100 % de celulosa y altamente
cristalina entre 54 y 88 % (Moon et al. 2011). Las dimensiones, morfología y grado de cristalinidad
varían dependiendo de la fuente de material celulósico y de las condiciones de preparación (Habibi
et al. 2010). La obtención de celulosa por medios químicos, hidrólisis acidas o alcalinas, generan
bajos rendimientos de recuperación (Khalil et al. 2012).
1.2.3 Lignina
La Fig. 7 muestra la estructura básica de la lignina, la cual es un polímero hidrocarbonado
complejo, con constituyentes alifáticos y aromáticos, que proporciona rigidez a las plantas y ofrece
protección contra patógenos y herbívoros. Es totalmente amorfa y de naturaleza hidrofóbica, se
considera que es un polímero termoplástico (Stephens & Halpin 2007).
Es totalmente insoluble en la mayoría de los disolventes y no se puede dividir en unidades
monoméricas. Sus unidades estructurales derivan del 4-hidroxi-3-metoxifenilpropano. Contiene 5
hidroxilos y 5 metóxidos por unidad de construcción. Se considera que la lignina es el componente
químico más difícil de retirar de la biomasa lignocelulósica (Brinchi et al. 2013). No se hidroliza
con ácidos, pero es soluble en álcali caliente, fácilmente oxidado y condensable con fenol. No se
ha establecido ningún método que sea capaz de aislar la lignina en su estado natural.
Sin embargo, la extracción de lignina altamente pura es fácil de realizar por hidrólisis ácida y el
principal uso que se ha encontrado es para la elaboración de fibra de carbono (Luo et al. 2011). Es
importante evaluar el contenido de lignina para optimizar los parámetros de los pre-tratamientos
mecánicos y químicos necesarios para producir pulpa de celulosa pura (Brinchi et al. 2013).
22
Fig. 7 Estructura básica de la lignina
1.3 Obtención de lignocelulosas
La lignocelulosa está compuesta principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina, junto con
pequeñas cantidades de proteínas, aceites y cenizas. Su aprovechamiento podría derivar en la
obtención de más de 200 compuestos de valor agregado al aplicar diversos métodos de tratamiento.
Además, podría ser la base para sustituir al petróleo como fuente de productos químicos para la
obtención de productos muy diversos como son biocombustibles, biomateriales y biomoléculas
(Isikgor y Becer 2015).
La composición y conformación de la lignocelulosa la hace resistente a la degradación química y
enzimática. Por ello, es necesario aplicar un pretratamiento, o una combinación de ellos, para
modificar sus propiedades físicas y químicas a través de fraccionar, solubilizar, hidrolizar y separar
sus componentes. La finalidad común que tienen es reducir el tamaño de la biomasa y abrir su
estructura física (Isikgor y Becer 2015). Estos pretratamientos se han clasificado en: mecánicos
(físicos), químicos, fisicoquímicos y biológicos (enzimáticos).
Alcohol p-cumarílico
Alcohol coniferílico
Alcohol sinapílico
23
1.3.1 Métodos mecánicos (físicos)
La molienda y ultrasonido son comunes para reducir el tamaño de las partículas e incrementar la
relación superficie/volumen para mejorar el contacto entre la biomasa y los reactivos de
tratamientos posteriores. La molienda consiste en desgarrar a la biomasa con una superficie rugosa.
La pulpa refinada se obtiene alimentando la biomasa al centro rotatorio del disco en presencia de
un aspersor de agua. Se utilizan aparatos mecánicos como el homogenizador de Gaulin,
microfluidizador de pulpa, molino de piedra, licuadora o triturador para someter la suspensión o
pulpa de la fibra a esfuerzos mecánicos extremos y ocasionar la liberación de las microfibrillas
rompiendo la pared celular (Lavoine et al. 2012; Uetani & Yano 2011; Bhatnagar & Sain 2005).
Con este tratamiento se obtiene CMF. Los molinos de bolas ejercen una fuerza grande sobre la
fibra de tal manera que se convierte la celulosa cristalina en celulosa amorfa.
1.3.2 Métodos químicos
Se aplican reactivos que rompen los enlaces de los componentes para lograr su separación. La
principal estrategia que se sigue para aislar las fibras por medios químicos es separando la lignina
de la matriz. En la madera se usan principalmente dos procesos para obtener: Proceso de sulfato
(Kraft) y proceso de sulfito. Sin embargo, como no hay un reactivo que sea selectivo para la lignina,
existe perdida de carbohidratos (celulosa y hemicelulosa) en el proceso. Además, se contamina el
agua con especies azufradas.
Para materiales provenientes de plantas, se utilizan normalmente el remojo con agua destilada para
retirar los azúcares solubles (Praznik et al., 2013; Mylsamy et al., 2011). También es frecuente
realizar una extracción soxhlet con acetona para eliminar grasas y lignina (Amar Singh Singha &
Rana 2010). También se incluyen comúnmente procesos de hidrolisis: la alcalina es común aplicar
tratamientos con NaOH en concentraciones alrededor de 4 a 5 % para eliminar hemicelulosa,
lignina y azúcares. También se han utilizado Ca(OH)2,
La hidrolisis ácida se produce con H2SO4, H3PO4 y HCl diluido o concentrado para recuperar
lignina.
La extracción con disolventes orgánicos como etanol, acetona, etc., disuelve por calentamiento
diferentes componentes. Eso permite la eliminación de componentes de la biomasa de tal manera
24
que se pueden recuperar con ligeras alteraciones comparados a tratamientos con ácidos o álcalis
fuertes. Es un método que se aplica en un sentido ecológico porque evita descargas al agua.
La oxidación TEMPO (2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil) incorpora grupos carboxilato y genera
fuerzas de repulsión entre moléculas de celulosa produciendo fibras menos rígidas y cohesivas.
Existen otros métodos de extracción de material lignocelulósico como son la hidrólisis ácida y la
ultrasonificación de alta intensidad.
1.3.3 Métodos fisicoquímicos
La termo hidrolisis o fraccionamiento acuoso utiliza agua a alta temperatura y presión
La auto hidrólisis o explosión con vapor consiste en someter biomasa con vapor en alta presión de
vapor por periodos cortos de tiempo seguido por una descompresión repentina (explosión) para
lograr la fibrilación o “mulching” por acción química y mecánica. Se introdujo inicialmente para
desfibrilar madera. Los efectos de este proceso en la biomasa según (Singh et al. 2015; Kaushik et
al. 2010) son:
Rompimiento de los enlaces glicosídicos.
Rompimiento de los enlaces β-éter de la lignina.
Rompimiento de los enlaces complejos lignina-carbohidrato.
Modificación química menor de la lignina y carbohidratos
1.3.4 Métodos biológicos (enzimáticos)
Aplicar tratamiento enzimático como la pectinasa (aspergilius aculleatus) para retirar la pectina en
A. americana (Bessadok et al. 2008). Para obtener fibras que sean menos rígidas y cohesivas, se
consigue con enzimas como la endogluconasa tipo C.
25
1.4 Métodos de modificación superficial
Las fibras naturales tienen carácter hidrofílico y muchas matrices poliméricas tienen carácter
hidrofóbico, para que haya buena adhesión se debe modificar la fibra por reacciones de los
hidroxilos de la celulosa con reactivos como: silanos, halogenuros de acilo, isocianatos, ácidos
carboxílicos o anhídridos (John & Thomas 2008). Estas modificaciones reducen el envejecimiento
prematuro por degradación y pérdida de fuerza (Bessadok et al. 2008). La modificación química
se puede hacer por tres formas (Xie et al. 2010):
1. Injertando polímeros en la fibra. Monómeros vinílicos.
2. Reticulación de las paredes celulares de la fibra, toluen diisocianato para reticular celulosa
3. Usando agentes acoplantes. Anhídrido maleíco para polipropileno y polietileno; Isocianatos
para uretanos.
Sin embargo, este tratamiento no es necesario cuando la matriz es polar como un poliéster
insaturado o una resina epóxica.
1.4.1 Tratamiento alcalino
Es un tratamiento que inicialmente se hizo para mejorar la reactividad de colorantes con las fibras.
Varios estudios han aplicado este tratamiento a fibras de agave (A. fourcroydes, A. sisilana y A.
americana) encontrando que se degradan significativamente los componentes de la pared interna
dejando intacta la pared celular; incrementa la separación fibrilar y la pérdida de celulosa amorfa
(Schalek et al. 2005). Separa impurezas, expone a la lignina hidrofóbica e incrementa el área
superficial (Thamae & Baillie 2007). Se incrementa el módulo de Young y reduce tanto el
contenido de hemicelulosa como de lignina (Kim & Netravali 2010). Al hidrolizar con hidróxido
de sodio al 5 % hojas de A. americana por 30 min, se modifica la superficie de la fibra y se mejoran
los enlaces químicos para resistir altas cargas de tensión en los compositos epóxico/fibra (Mylsamy
& Rajendran 2011).
1.4.2 Acetilación, EDTA y silano
La acetilación es otro tratamiento económico de las fibras que genera hidrofobicidad para mejorar
la adhesión a matrices de materiales compuestos. (Khalil et al. 2001), realizaron la acetilación de
26
fibras de coco con anhídrido acético y notaron que se incrementó la resistencia a la cizalladura
interfacial, además de que cambia la morfología superficial de la fibra que llegó a ser mucho más
suave. La mejor adhesión y propiedades mecánicas fueron mostradas con poliestireno.
El EDTA es usado para debilitar la estructura de gel formado por pectina y iones calcio y para
separar la pectina (pectina altamente metilesterificada). Le Troedec et al. (2008), usaron este
tratamiento, solo y posterior al tratamiento con álcali, como un agente quelante para evitar la
fijación de iones calcio en la superficie de la fibra de cáñamo. Se mejoró el grado de cristalinidad,
pero no tanto como el tratamiento con álcali y la fuerza de adhesión fue menor que en la fibra sin
ningún tratamiento, posiblemente al menor contacto entre los coloides y las fibras y a la
heterogeneidad de la superficie.
(Thamae & Baillie 2007), sometieron A. americana a un tratamiento con una solución al 0.05 %
(p/p) de trietoxivinilsilano con agitación por 5 min posterior a un mercerado pero no se apreció
ninguna mejora de propiedades mecánicas ni de enlace interfacial de la fibra con polietileno de alta
densidad (HDPE) usado.
1.4.3 Oxidación: clorito y peróxido de hidrógeno
Aunque existen métodos ecológicos como el peróxido de hidrógeno, ozono, entre otros para el
blanqueamiento de pulpa. Sigue siendo utilizado el cloro por su efectividad en el blanqueo y precio
económico, genera un impacto negativo ecológicamente.
Oxidación con clorito, peróxido de hidrogeno
27
1.5 Propiedades del polimetilmetacrilato.
El metil metacrilato es un líquido incoloro, con olor parecido al azufre, dulce, penetrante, tono
hedónico: desagradable. Ligeramente soluble en agua, soluble en tetrahidrofurano, esteres e
hidrocarburos clorados y aromáticos. Se polimeriza por medio de radicales libres en masa o en
suspensión, como se muestra en la reacción de la Fig. 8. Los objetos se moldean por inyección o
soplado, extrusión, termoformado y vaciado. Este monómero por si solo produce el
polimetilmetacrilato, el cual tiene alta resistencia mecánica, excelentes propiedades ópticas y
térmicas:
Fig. 8 Reacción de copolimerización del metilmetacrilato por medio de radicales libres.
El polimetilmetacrilato es un polímero sintético termoplástico lineal que tiene una alta claridad
óptica (80-93 % de la luz visible). Tiene aplicaciones médicas, farmacéuticas (empacado “no
ingerible” de capsulas, tabletas, píldoras, supositorios), ingeniería eléctrica, vehículos, equipo de
oficina, juguetes y en la construcción (REF). Sin embargo, sus propiedades mecánicas limitan sus
usos en muchas áreas (Maiti 2013). Este polímero no se afecta por soluciones acuosas de
detergentes, limpiadores, ácidos y álcalis diluidos e hidrocarburos alifáticos. Es atacado por
hidrocarburos aromáticos y clorados, esteres y cetonas. Se disuelve completamente en cloroformo,
di y tri cloroetano.
Metilmetacrilato
Radical libre
Iniciador Polimetilmetcrilato
28
2. JUSTIFICACIÓN
En México se producen 28 millones de toneladas anuales de residuos sólidos provenientes de la
industria del azúcar (70 %), de aceites comestibles (12 %), cervecera (9%), trigo (5%), café (2%),
conservas (1%), y el resto de las industrias pesquera, aves y ganado, agave, maíz y manzana (Mario
Molina, 2016). Aunque el residuo de agave es relativamente poco, implica alrededor de 200,000
toneladas anuales de plantas en el estado de Hidalgo (SIAP, 2006). Es un residuo que tiene
componentes valiosos para diferentes industrias: la alimentaria, farmacológica, empaques,
automotriz, construcción, bioenergía, entre otras. Actualmente los métodos de separación y
purificación son importantes ya que se tiene la perspectiva de que la biomasa lignocelulósica puede
ser la que sustituya al petróleo como fuente de diferentes productos químicos. Sin embargo, algunos
de estos métodos tienen desventajas: son inespecíficos, costosos y algunos dañan al ambiente.
Por otro lado, la industria de los empaques recae sobre materiales plásticos derivados del petróleo,
lo cual llega a ser un problema de interés económico y ambiental. En Europa existe la tendencia a
consumir materiales reciclables, materiales reusables, materiales más ligeros y polímeros
bioderivados (Johansson et al. 2012). Las fibras naturales pueden formar compositos con polímeros
sintéticos, reforzando y mejorando las propiedades de resistencia de esos materiales.
La literatura reporta que se han elaborado compositos con fibras de algunas especies de agave como
A. sisilana y A. fourcroydes, tomando como polímero de interés la celulosa presente, la cual es
sometida a reacciones de copolimerización, esterificación o Kraff, utilizando monómeros
hidrofóbicos como etileno y propileno, o usando monómeros hidrofílicos como epóxido y
metilmetacrilato. En los copolímeros productos de reacción se han evaluado las propiedades
mecánicas, térmicas y de biodegradabilidad principalmente. Por lo tanto, el aprovechamiento de la
celulosa proveniente de plantas de agaves puede ser utilizada para elaborar empaques
biodegradables, lo cual cobra importancia, porque sería una forma de empezar a sustituir empaques
derivados del petróleo lo que conlleva a reducir el impacto ambiental, además de aprovechar este
residuo renovable y biodegradable.
Por lo tanto, en este trabajo se planteó aplicar tratamientos físicos y fisicoquímicos básicos a un
residuo de Agave salmiana, en una secuencia tal que permita la recuperación de algunos
componentes en cada etapa, hasta llegar a un material lignocelulosico con la mayor cantidad de
29
celulosa amorfa. Para sintetizar posteriormente un copolímero entre celulosa y metilmetacrilato,
por medio de una reacción de radicales libres. Evaluar finalmente los cambios en la microestructura
y composición química de los residuos de agave, pencas de A. salmiana.
30
3. HIPÓTESIS
La aplicación de diferentes tratamientos de desintegración física y química (extracción etérea y
acuosa, así como hidrolisis alcalina y oxidación con agentes blanqueadores) sobre hojas residuales
de Agave salmiana generarán un material lignocelulosico con propiedades físicas, químicas y
microestructurales idóneas que favorecerán su copolimerización con metacrilato de metilo por el
método de injerto y mejorarán las propiedades térmicas, ópticas y de cristalinidad del material
sintetizado que podrá ser utilizado como material de embalaje.
31
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Obtener materiales compatibles para la copolimerización mediante tratamientos fisicoquímicos
de residuos agroindustriales.
4.2 Objetivos específicos
1. Obtener lignocelulosas a partir de residuos A. salmiana por medio de extracción etérea y
acuosa, hidrolisis alcalina y oxidación por blanqueamiento.
2. Determinar la composición química del material nativo y contenido de fibras
lignocelulósicas.
3. Caracterizar los efectos que causa cada tratamiento de extracción sobre las fibras
determinando color, grupos funcionales predominantes, estabilidad térmica y cristalinidad.
4. Evaluar cambios morfométricos de los materiales lignocelulósicos y copolímeros por
medio de microscopia óptica y análisis de imágenes.
5. Determinar las propiedades de textura por microscopia electrónica de barrido.
6. Correlacionar el análisis de imágenes con análisis termogravimétrico.
7. Copolimerizar la fibra lignocelulósica con metacrilato de metilo.
8. Evaluar los copolímeros mediante con IR-TF, DRX, Análisis Termogravimétrico y
Microscopía.
32
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Fig. 9 Diagrama de flujo con la secuencia seguida para obtener lignocelulosas M0, M1, M2,
M3 y M4, los copolímeros MSA, MCA y MBL y determinaciones realizadas.
5.1 Materiales y reactivos
Como materia prima se utilizó pencas de A. salmiana de 10 años. Estas se obtuvieron de la
agroindustria del pulque y se recolectaron en Nanacamilpa, Tlaxcala (México). Fueron residuos de
maguey, ya que la planta había dejado de producir aguamiel un mes atrás aproximadamente. Las
1.Recolectar
Agave
Residuo
2.Trocear
hasta 1 cm3
3.Liofilizar y
almacenar
4.Moler
hasta 180
micras
M0
5.Extracción
soxhlet (éter)
(3 g)
M1
6.Extracción acuosa a 24-28°C
(3 g)
7.Extracción
acuosa a
80°C
M2
9.Oxidación
clorito,
1.7 % (3 g)
8.Hidrolisis
alcalina
NaOH (4%)
(3 g)
M4
10.Oxidación
peróxido,
H202 2%
M3
Análisis
Químico
Proximal
Determinación
de humedad
Determinación de: Celulosa; Hemicelulosa; y Lignina
Grupos funcionales; Estabilidad térmica;
Cristalinidad Autofluorescencia y
microestructura
MSA MCA MBL
Determinación de: Grupos funcionales; Estabilidad térmica;
Cristalinidad Autofluorescencia y
Microestructura
Extracto I
(Concentrar) Extracto II
(Liofilizar)
Extracto III
(Neutralizar)
Extracto IV
(Desechar)
COPOLIMERIZACIÓN
33
pencas se lavaron con agua para retirar polvo y se secaron con aire; se cortaron en piezas de 1 cm3,
se homogenizó y se determinó humedad. La muestra restante se liofilizó y se almacenó en frascos
herméticos a 4 °C. Como se esquematizan en la figura 9, etapas 1-3.
Los reactivos químicos usados en el tratamiento fisicoquímico fueron éter de petróleo (C6H14,
marca Fermont), agua destilada (H2O), hidróxido de sodio (NaOH, marca Meyer), clorito de sodio
(NaClO2 marca Reasol), peróxido de hidrógeno (H2O2, marca Reasol), etilendiaminotetracetato de
sodio (EDTA-Na2, marca Sigma) y sulfato de magnesio (MgSO4, marca Reasol).
5.2 Tratamientos fisicoquímicos de A. salmiana
La materia liofilizada se molió en un molino Knifetec 1095 hasta obtener un tamaño de partícula
menor a 180 µm con un tamiz del número 80. A esta muestra liofilizada y molida se nombró M0 y
se determinó su composición, etapa 4, de la figura 9. Por otro lado, a la muestra pulverizada (3g)
se le eliminaron diversos componentes a través de una serie de tratamientos:
(i) Extracción continua con éter de petróleo por 6 h, el extracto I de la muestra se evaporó a
temperatura ambiente (24-28°C) durante toda la noche. El peso final del sólido extraído se
registró y esta lignocelulosa se nombró M1.
(ii) Extracción de materia soluble en agua en dos etapas, la muestra desengrasada (M1, 3 g) se
suspendió en agua destilada en una relación fibra/solución (1:10) a temperatura ambiente (24-
28°C) por 2 h con agitación magnética constante. La mezcla fue centrifugada (10,304 g) a 4°C
por 10 min, y re-suspendida en agua destilada en una relación fibra/solución (1:10) a 80°C por
30 min en agitación magnética constante (Santos et al. 2013). La mezcla fue centrifugada y
lavada usando agua destilada a temperatura ambiente. El extracto II (acuoso) fue recuperado
totalmente, una alícuota fue separada para determinar azucares reductores y el resto se liofilizó
y pesó. El sólido extraído fue secado en estufa a 100°C por 4 h; se registró el peso y esta
lignocelulosa se etiquetó como M2.
(iii) Hidrolisis alcalina de la materia (M2, 3g) dos veces con una solución de NaOH al 4% m/v en
una relación fibra solución de 1:25 a 70-80°C por 2 h. La mezcla fue centrifugada a 927 g y
10°C por 20 min. El extracto III fue neutralizado para precipitar algunos componentes y
descargar al desagüe sin contaminar. El sólido extraído fue lavado tres veces con agua
destilada y secado en estufa a 100°C por 4 h (Rosli et al. 2013; Johar et al. 2012). El peso de
la materia fue registrado y esta lignocelulosa se denominó M3. Finalmente,
34
(iv) Oxidación en dos etapas; la muestra hidrolizada (M3, 3g) fue blanqueada con una solución de
NaClO2 al 1.7% p/v en una relación fibra/solución 1:25 a 70-90°C por 4 h. La mezcla fue
centrifugada a 10,304 g y el sólido fue lavada tres veces con agua destilada. Luego, la pulpa
fue depositada en un tubo de centrifuga y se agregó H2O2 al 2%. La mezcla se calentó entre
70-90°C en baño maría por 20 min, y se agregaron las soluciones de EDTA sal disódica
dihidratada al 1%, MgSO4 al 2% y NaOH al 0.6% de acuerdo al método descrito (Rosli et al.
2013; Johar et al. 2012; Loureiro et al. 2011). La mezcla fue centrifugada (10,304 g, 10 min)
lavada tres veces con agua destilada y secada a 100°C por 4 h. El extracto IV se desechó al
desagüe. El sólido blanqueado se pesó y rotuló como M4. Todos los tratamientos fueron
realizados por triplicado.
5.3 Análisis proximal de M0 y fibras en lignocelulosas
Para conocer la composición inicial del residuo, se aplicaron métodos AOAC 1995 (Association
of Official Analytical Chemists) para humedad 934.01 32, cenizas 923.03 y extracto etéreo 920.39.
La proteína total se determinó por el método Kjeldahl-Gunning-Arnold modificado, usando 6.25
como factor de conversión nitrógeno-proteína. Los azúcares reductores libres del extracto II
(acuoso), fue cuantificado por espectrofotometría (Ting 1956).
Además, la variación del contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina en cada tipo de
lignocelulosa obtenida se evalúo por técnicas FOSS FibertecTM para fibra detergente neutra con
base a la materia orgánica y α-amilasa (αNDFom) con base a los métodos AOAC
2002:04/ISO16472:2005, para la fibra detergente ácida (ADF) y lignina detergente ácida (ADL)
por el método EN ISO 13906:2008. Todas las muestras fueron realizadas por triplicado.
5.4 Reacción de copolimerización
Se realizó en medio heterogéneo según el método y condiciones óptimas que propusieron (Singha
& Rana 2010). Se utilizó 0.5 g del material lignocelulósico obtenido por los tratamientos de
extracción acuosa (M2), hidrolisis alcalina (M3) y oxidación (M4). Cada material se suspendió en
100 mL de agua destilada a 45 °C por 24 h. Se pesó 360 mg de CAN (Nitrato de cerio (IV) y
amonio) y se disolvieron en aproximadamente 2 mL de HNO3 concentrado, se agregó a la
suspensión y se mantuvo en agitación por 1 h. La suspensión se filtró en papel filtro y embudo
Buchner. Se re-suspendió el material lignocelulósico que reaccionó con el catalizador, se agregó
35
1.9 mL de metilmetacrilato muy lentamente y se mantuvo en reacción por 2 h. El producto de la
reacción se centrifugó a 10,000 rpm a 10°C por 10 min. El producto derivado del M2 se llamó
MSA; el proveniente de M3 se nombró MCA; y el obtenido con M4 se registró como MBL. El
material centrifugado se vertió en cajas Petri de plástico, se homogenizó la superficie y se secó en
la estufa a 60°C por 6 h.
5.5 Análisis instrumental de lignocelulosas y copolímeros
A los materiales lignocelulósicos se les realizaron diferentes análisis instrumentales para identificar
cambios en la estructura y composición, de acuerdo con los diferentes tratamientos del agave.
Además de los materiales obtenidos por la reacción de copolimerización para demostrar la
formación de nuevos enlaces.
5.5.1 Espectroscopia IR-TF
Las muestras de las fibras sin tratamiento (M0) y con tratamiento (M1, M2, M3, M4), además de
los productos de la reacción (MSA, MCA y MBL) se analizaron por IR-TF en un espectrofotómetro
Bruker Tensor 27. Las muestras se molieron, homogeneizaron y se comprimieron con bromuro de
potasio para formar una pastilla. El análisis espectral se realizó entre 500 a 4000 cm-1 de número
de onda.
5.5.2 Difracción de Rayos X (DRX)
Se empleó un difractómetro de Rayos X Bruker D8 advance Vantec, Alemania, usando una
radiación Cu Kα (λ = 1.5418 Å), un filtro de Ni y un contador de centelleo como detector a 40 KV
y 40 mA, con una rotación de 10 a 40 ° en la escala 2 θ según la técnica descrita por (Singha &
Rana 2010). Se empleó la técnica de polvos para analizar las muestras de material lignocelulósico
y para el material copolimerizado.
El índice de cristalinidad (I.C.) se determinó utilizando los conteos de difracción a un ángulo 2 θ
entre 18 – 19° (intensidad mínima) y entre 22 – 23 ° (Intensidad máxima), usando la ecuación 1:
36
𝐼. 𝐶. =𝐼𝑐 − 𝐼𝑎
𝐼𝑐 ecuación 1
Donde 𝐼𝑐 es la intensidad de la fracción cristalina (22 – 23 °) y la 𝐼𝑎 es la intensidad de la fracción
amorfa (18 – 19 °).
5.5.3 Análisis termo gravimétrico (TGA)
Se empleó un equipo de Termogravimetría (Equinox, Brukker, Finlandia) con un analizador
térmico simultáneo (STA 409 PC Luxx, Netzsch, Alemania), para analizar la estabilidad térmica
de las fibras de agave (M0, M1, M2, M3 y M4) y productos MSA, MCA y MBL. Se usaron
aproximadamente 11 mg de cada muestra. Se utilizó un crisol DTA/TG de aluminio. Las
condiciones generales fueron: flujo de Argón de 20 y 60 mL min-1; calentamiento desde
temperatura ambiente a 900 °C a una velocidad de flujo de 10 °C min-1.
5.5.4 Colorimetría
Cada muestra (M0-M4) se depositó en una bolsa transparente de polipropileno y se colocó sobre
el plano lector de colorímetro (CR-10, Konica Minolta, Japón) que utiliza un iluminante D65 y un
ángulo de observador de 10°. Se determinaron los parámetros de color L*, a* y b*. Éstos fueron
medidos 10 veces en cada muestra. La diferencia de color (ΔE*) entre tratamientos se determinó
usando la ecuación 2 (Rodrigo et al. 2007; Marszałek et al. 2015) y el índice de color (CI) se estimó
por la ecuación 3 (Vignoni et al. 2006). Además, la intensidad de color (C*) con la ecuación 4 y
el ángulo de color (H*) por la ecuación 5 (Acosta-Montoya et al. 2010; Cesa et al. 2017).
∆𝐸 = (∆𝐿∗2 + ∆𝑎∗2 + ∆𝑏∗2)1
2 ecuación 2
𝐶𝐼 =𝑎∗∗1000
𝐿∗∗𝑏∗ ecuación 3
𝐶∗ = (𝑎∗2 + 𝑏∗2)1
2 ecuación 4
𝐻∗ = tan−1 𝑏∗
𝑎∗ ecuación 5
37
5.5.5 Microscopia confocal
Se utilizó un microscopio confocal Carl Zeiss modelo LSM 710 NLO con un fotomultiplicador
GaAsP NDD como detector. Se utilizaron diferentes láseres de excitación 405 nm, 561 nm, 488
nm y 633 nm en un rango del 2 al 4 %, para determinar la autofluorescencia.
5.5.6 Microscopia electrónica de barrido de alta resolución (MEB-AR)
La microestructura de las muestras tratadas (M0-M4) se observó mediante un MEB-AR (Jeol
modelo JSM-7800F, USA) operado a 5 kV y usando un detector LED. Cada muestra de cubrió
con una capa de oro por 40 s previo al análisis.
5.6 Análisis de imágenes
Cinco micrografías con focales de 512x453 pixeles, RGB-JPG fueron tomadas para cada muestra
(M0-M4), todas a la magnificación de 20X. Se empleó Image J versión 1.51a. Para el análisis de
las imágenes se eliminó el margen de la imagen y se calibró la escala; se ajustó el umbral del color
(rojo, verde o azul) para fragmentar la emisión de autofluorescencia en cada micrografía; Se
transformó la imagen a blanco y negro para después convertirla a formato binario; finalmente, se
analizaron las partículas para determinar sus parámetros morfométricos (área total, perímetro,
circularidad, diámetro de feret y relación de aspecto). Con la misma imagen en formato binario se
hizo el análisis fractal de área (dimensión fractal, DFBC, y lagunaridad, λLA) usando el complemento
FracLac que aplica el método Box Counting Fractal and Lacunarity Analysis. Por otro lado, de dos
micrografías MEB-AR de 1280x1024 pixeles obtenidas a 10,000X para cada muestra (M0-M4),
RGB-TIF, se obtuvieron 5 imágenes de 50x50 pixeles, 8 bits-JPG. Los parámetros fractales de
textura (dimensión fractal, DFSB, y lagunaridad, λSB) se determinaron aplicando el complemento
FracLac que emplea el método Sliding Box Lacunarity Analysis y la variación diferencial del
volumen (Gray 2: Grayscale).
Área.
Es el área de la selección en pixeles cuadrados o en unidades cuadradas calibradas (por ejemplo,
mm2, μm2, etc).
38
Perímetro.
La longitud de la frontera externa de la selección. Con versiones IJ 1.44f y posteriores, el perímetro
de una selección compuesta se calcula descomponiendo en selecciones individuales. Hay que notar
que el perímetro compuesto y la suma de los perímetros individuales puede ser diferente debido al
uso de diferentes métodos de cálculo.
Circularidad.
Calculado con la formula 4𝜋 ×[𝐴𝑟𝑒𝑎]
[𝑃𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜]2 con un valor de 1.0 se indica un círculo perfecto.
Conforme el valor se acerque a 0.0, se indica un incremento de la forma alargada. Los valores
pueden no ser válidos para partículas pequeñas.
Diámetro de Feret.
La distancia más larga entre dos puntos a través de la frontera seleccionada.
Relación de aspecto.
Relación entre el eje mayor y menor de la elipse ajustada a la partícula. Es decir, 𝐸𝑗𝑒 𝑀𝑎𝑦𝑜𝑟
𝐸𝑗𝑒 𝑀𝑒𝑛𝑜𝑟 .
Dimensión fractal de área y lagunaridad.
Dimensión fractal de textura.
5.7 Análisis estadístico
Los datos de imagen fueron sometidos a análisis de varianza (ANOVA-una vía-medidas repetidas)
y contraste de medias (Prueba de Tukey). El programa OriginPro 8 fue empleado para estimar las
diferencias estadísticas (p < 0.05) entre las medias. Se determinó la correlación de Pearson usando
xlstat entre las proporciones de fibra, los parámetros de color y los parámetros morfométricos y
fractales derivados del análisis de imágenes.
39
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Caracterización fisicoquímica de lignocelulosas
Las hojas de agave colectadas tenían un color verde–amarillo en su epidermis y blanca en la pulpa.
Presentó una humedad del 86.08% ±0.15. Este valor fue cercano al reportado para agave maduro
(89.5%) sin la extracción de aguamiel (Pinos-Rodríguez et al. 2008). La baja perdida de humedad
se explica por la habilidad inherente de la planta para retener agua (Linton & Nobel 2001). Esta es
una característica relevante ya que permite la recuperación de componentes soluble (azúcares libres
y otros) en el medio acuoso. Por otro lado, la biofibra liofilizada pierde 4.3%± 0.3 de su peso
después de calentarse (100°C, 4h). Esta pérdida representa la fracción correspondiente a los
componentes volátiles y/o agua intermolecular como se comprobó posteriormente por análisis
termogravimétricos y análisis de infrarrojo. Este valor se usó para los cálculos en base seca.
Después de liofilizada y pulverizada, la muestra presentó un olor herbáceo y un color amarillo.
La composición química de las hojas de agave se muestra en el Cuadro 1. Los principales
componentes son αNDFom (22.15% de celulosa, hemicelulosa y lignina) y azúcares reductores
(26.47%) siendo la fructosa la fracción más grande. Pinos-Rodríguez et al. (2008) han reportado
previamente 27.2% de NDF y 24.7% de azúcares reductores libres en hojas de A. salmiana madura.
Esta diferencia se puede relacionar al uso de α-amilasa en este trabajo para hidrolizar y eliminar el
almidón de la muestra M0, mientras que Pinos-Rodríguez et al. (2008) no empleó esta enzima.
Por lo tanto, hubo una alta concentración de azúcares, considerando que es una biomasa residual y
que, por ejemplo, la cantidad de azúcares reductores en bagazo de A. tequilana fue más bajo
(12.68%) (Arrizon et al. 2010). El extracto acuoso contenía 52.45% ±0.91 de sólidos. Este valor es
más alto que el reportado para el aguamiel de A. mapisaga (11.5% materia seca) (Basurto-Ortíz et
al. 2008).
40
Cuadro 1. Composición química de hojas de A. salmiana (M0)
Componentes
individuales % peso seco Fracciones % peso seco
αNDFom 22.1 ±0.1
Celulosa
Hemicelulosa
Lignina
18.7 ±0.4
1.2 ±0.1
2.3 ±0.1
Azúcares reductores libres 26.5 ±0.9 Glucosa
Fructosa
7.7 ±1.4
18.8 ±0.7
Proteína 5.1 ±0.3
Ceniza 5.1 ±0.1
Extracto etéreo 0.7 ±0.1
Valores promedio ± desviación estándar; n = 3; αNDFom, Fibra detergente neutra, base a materia orgánica,
usando α-amilasa;
Además, algunos autores indican que el extracto acuoso está compuesto de fructooligosacáridos
(FOS) (Apolinário et al. 2014), pectinas (Santos et al. 2013) y minerales (Basurto-Ortíz et al. 2008)
entre otros. Esto podría ser usado para recuperar azúcares con agua caliente como pretratamiento
y convertirlos en bioetanol a través de fermentación (FitzPatrick et al. 2010). Además, el
rendimiento de biofibras se podría mejorar mientras que el consumo de químicos en tratamientos
posteriores se puede reducir. Sin embargo, el contenido de proteínas y ceniza fue baja (5%), dado
que los minerales (Fe, Ca, K), proteínas, y aminoácidos (Santos-Zea et al. 2012) son obtenidos
también durante el proceso de extracción de aguamiel de agave.
6.2 Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina
Es importante considerar que hay un incremento en la proporción de celulosa de 18.67% (M0) a
75.40% (M3) como se muestra en el Cuadro 2. Esto es debido a la extracción de ácidos y alcoholes
grasos, esteroles libres y alcanos con éter (Gutiérrez et al. 2008) así como azúcares libres, FOS
(Praznik et al. 2013), y parte de la hemicelulosa (Peng et al. 2012) por métodos acuosos en frio y
caliente. Por su parte, la hidrolisis alcalina disuelve la materia amorfa compuesta por celulosa,
hemicelulosa, lignina, y pectina (Le Troedec et al. 2008). Entonces, esta secuencia de tratamientos
limpió, extendió y blanqueo la superficie de la biofibra dejando disponible la materia
41
lignocelulosica (Zhang et al. 2005). Rosli et al. (2013) ha reportado un incremento en la α-celulosa
de A. angustifolia de 67% a 87% por hidrólisis alcalina y de 97% por blanqueo. Deepa et al. (2015)
recuperó 38.8% de nanocelulosas de A. sisilana combinando el tratamiento alcalino, blanqueo e
hidrólisis ácida. El alto rendimiento de celulosa (M3 y M4) es útil para recuperar materiales
lignocelulosicos para definir la relación costo-beneficio cuando se aplica a biomateriales (Singh et
al. 2015). Además, recuperando altos niveles de carbohidratos solubles (glucosa, fructosa, y FOS)
podrían incrementar los beneficios.
Cuadro 2. Cambios en el contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina en residuo de A. salmiana.
(% Materia orgánica en base seca)
Muestra Celulosa Hemicelulosa Lignina
M0 18.67 ± 0.39 a 1.17 ± 0.09 a 2.30 ± 0.07 a
M1 18.18 ± 0.59 a 1.51 ± 0.22 a 2.28 ± 0.03 a
M2 52.90 ±0.69 b 5.75 ± 0.76 b 7.53 ± 0.03 c
M3 75.40 ±0.85 c 8.90 ± 1.20 c 4.20 ± 0.18 b
M4 78.88 ± 0.65 d 6.53 ± 0.13 b 5.16 ± 1.03 b
Valores promedio ± desviación estándar, n = 3, letras diferentes en la columna muestra diferencia estadística
significativa (p<0.05), de acuerdo con la prueba de Tukey. Tratamientos consecutivos: M0 (sin tratamiento),
M1 (extracción con éter de petróleo), M2 (extracciones acuosas at 25 y 80ºC), M3 (hidrólisis alcalina con
NaOH 4%), y M4 (blanqueamiento con 1.7% NaClO2 y 2% H2O2).
El objetivo fue obtener un material lignocelulósico rico en celulosa ya que obtener celulosa
nanocristalina (CNC) o celulosa micrifibrilada (CMF) demanda mayores costos por el uso de
reactivos para romper los enlaces del biocomposito natural. A través de estos tratamientos se reduce
la masa debido a la pérdida de diferentes componentes, enriqueciendo la celulosa (78.88%). Por lo
tanto, al incrementarse el número de los grupos hidroxilos se piensa que el material tratado puede
utilizarse para obtener copolímeros entre este material lignocelulósico y metacrilato de metilo.
El cuadro 3, muestra que el rendimiento total del material lignocelulosico recuperado es bajo. Por
lo que, con la intención de obtener el mayor aprovechamiento del residuo, se plantea la
recuperación de algunos de ellos.
42
Cuadro 3. Rendimientos de material lignocelulósico con diferentes tratamientos.
Tratamientos
Éter petróleo M1
Acuoso M2
Alcalino M3
Blanqueo M4
TOTAL M0-M4
Rendimiento, (% base seca)
99.27 ± 0.17 52.45 ± 0.91 33.44 ± 3.08 76.40 ± 4.06 12.89 ± 1.20
Valores promedio ± desviación estándar, n = 3. Tratamientos consecutivos: M0 (sin tratamiento), M1
(extracción con éter de petróleo), M2 (extracciones acuosas a 25 y 80ºC), M3 (hidrólisis alcalina con NaOH
4%), y M4 (blanqueamiento con 1.7% NaClO2 y 2% H2O2).
No se encontró reporte alguno sobre el rendimiento de estos tratamientos por lo que no se puedan
comparar. Es importante conocer los rendimientos de recuperación de las fibras para estimar la
viabilidad del proyecto a gran escala. Se propone recuperar tanto los azúcares como las
hemicelulosas.
6.3 Caracterización estructural de lignocelulosa
6.3.1 Identificando enlaces químicos por IR-TF
La Figura 1, muestra el espectro infrarrojo de la materia lignocelulósica (M0-M4). Una banda de
absorción típica (3280 cm-1) entre 3250-3500 cm-1 de la flexión de enlaces intermoleculares C-H y
O-H que corresponden a grupos funcionales proveniente de ácidos y alcoholes grasos así como
carbohidratos (Toledano-Thompson et al. 2005; Sain & Panthapulakkal 2006), observándose en
todas las muestras. Sin embargo, la intensidad de la señal (% transmitancia) disminuye de M0
(0.17) a M4 (0.03) debido a los pretratamientos de extracción acuosa (carbohidratos solubles) y
éter (ácidos y alcoholes grasos), así como también, hidrólisis alcalina y blanqueamiento de la
biofibra. En consecuencia, el conglomerado de la lignocelulosa se debilita y hay un incremento de
celulosa expuesta (Abraham et al. 2011). Mientras tanto, las bandas de absorción entre 2750 y 3000
cm-1 debida a vibraciones típicas de estiramiento del enlace C-H y que corresponden a los anillos
aromáticos y alcanos (Khalil et al. 2001) también muestran cambios en la intensidad debido a los
tratamientos (Fig. 8).
43
Fig. 8 Espectro IRTF de lignocelulosa de A. salmiana, en pastilla de KBr. Tratamientos consecutivos: M0
(sin tratamiento), M1 (extracción con éter de petróleo), M2 (extracciones acuosas a 25 y 80ºC), M3
(hidrólisis alcalina con NaOH 4%), y M4 (blanqueamiento con 1.7% NaClO2 y 2% H2O2).
Se debe observar que la banda de absorción entre 1500 y 1750 cm-1, corresponde a la vibración de
estiramiento del enlace C=O, disminuyó su intensidad (M0-M3) hasta casi desaparecer (M4). Este
comportamiento es una consecuencia de la extracción de ácidos y alcoholes grasos usando éter de
petróleo y agua, así como hidrólisis de pectina, hemicelulosa y lignina (Sain & Panthapulakkal
2006; Alemdar & Sain 2008; Sun et al. 2005). Esta señal es imperceptible después del tratamiento
alcalino (M3) y blanqueo (M4) debido a la oxidación del enlace carbonilo provocado por clorito y
peróxido (Elanthikkal et al. 2010). La banda de absorción (1516 cm-1) que corresponde a la
vibración C=C del anillo aromático de la lignina se encontró en mismo rango (Elanthikkal et al.
2010). Además, en el rango 1000-1250 cm-1, hay una señal (1242 cm-1) que coincide con el
estiramiento fuera del plano del enlace C-O del arilo de lignina (Le Troedec et al. 2008) que reduce
la intensidad de M0 (0.19) con el pretratamiento M1 (0.16) y M2 (0.12), pero principalmente con
la hidrólisis alcalina M3 (0.09) y blanqueo (0.05) debido a la reducción de hemicelulosa y lignina.
Algunos estudios reportan que el agua adsorbida por las fibras presenta señales en infrarrojo entre
44
1630 y 1650 cm-1 (Johar et al. 2012; Le Troedec et al. 2008). Sin embargo, en este estudio no se
pudo determinar el estiramiento del enlace O-H (agua absorbida) en las muestras estudiadas debido
a una señal de absorción amplia (1525-1700 cm-1) con intensidad variable no permitió la
observación de esta señal.
Todas las muestras exponen señales que son típicas de la celulosa en la región de huella dactilar
(1500-500 cm-1). En esta región, las bandas de absorción entre 1417 y 1426 cm-1 corresponde a
la deformación asimétrica del enlace C-H (Elanthikkal et al. 2010). Esta señal se desplaza a
números de onda más grandes debido al tratamiento alcalino (M3) y blanqueamiento (M4). En
1368 cm-1 observamos la flexión de los enlaces C-H y O-H de la celulosa (Marques et al. 2010);
aunque también se han reportado en 1380 cm-1 (Alemdar & Sain 2008; Sun et al. 2005). La banda
de absorción en 1315 cm-1 observado en M2, M3 y M4 es una consecuencia de las vibraciones de
los enlaces C-C y C-O de la estructura anular de la celulosa. Sun et al. (2005) reporto esta señal en
1327 cm-1 para materia lignocelulosica en cáscara de trigo. La señal con la transmitancia más baja
se observó entre 1021 y 1029 cm-1 para todas las muestras. La cual fue causada por la vibración en
los enlaces C-O-C del anillo de piranosa (Elanthikkal et al. 2010). Mientras tanto, el cambio en
896 cm-1 observado en M2, M3 y M4 está relacionado a la vibración de los enlaces C-H y C-O
causado por la deformación del enlace β-glicosídico-C-H, ayudado por la vibración anular y flexión
de -O-H (Alemdar & Sain 2008; Nacos et al. 2006). Las bandas de absorción observados en 1052,
1104, y 1159 son resueltos después de la hidrólisis alcalina y el blanqueamiento. Elanthikkal et al.
(2010) considera que entre más alta sea la resolución mayor es la cristalinidad de la celulosa.
6.3.2 Difractogramas e índices de cristalinidad
Los difractogramas M0 y M1 (Fig. 9) muestran un pico central entre 21.5° y 22.55° pero no son
picos intensos, dado que la celulosa se encuentra en una baja proporción en relación con la materia
amorfa (lignina, hemicelulosa y otros componentes). Los difractogramas M3 y M4 mostraron
señales a 14.95°, 22.55°, 24.40°, y 34.90°. Además, se sabe que la celulosa tipo I muestra
difracciones aproximadamente a 14°, 16°, 23°, y 35° (Ouajai & Shanks 2005); mientras que la
celulosa tipo II muestra señales a 11, 20, 22 y 37° en la escala 2θ (Qin et al. 2008). Los ángulos
de difracción de M3 y M4 indica que la fracción cristalina de la celulosa es del tipo I, lo cual
concuerda con lo reportado por Oudiani et al. (2011) reportada para la biofibra de A. americana.
45
Fig. 9 Difractogramas de lignocelulosas de A. salmiana, técnica de polvos. Tratamientos consecutivos: M0
(sin tratamiento), M1 (extracción con éter de petróleo), M2 (extracciones acuosas a 25 y 80ºC), M3
(hidrólisis alcalina con NaOH 4%), y M4 (blanqueamiento con 1.7% NaClO2 y 2% H2O2).
Por otro lado, el pico estrecho de 24.40° en M3 y M4 se debe a impurezas, considerando que se
han reportado impurezas inorgánicas de SiO2 y CaCO3 a 14.5° y 25.5° para lignina residual oxidada
con clorito de sodio en el plano (1 0 1); aunque esto no se ha reportado en tratamientos con NaOH
entre 2-20% (Ben Sghaier et al. 2012).
46
Cuadro 4. Índices de cristalinidad estimados con el método de Segal (Kaushik et al. 2010)
2θ (am) (°) Iam (Conteo) 2θ (002) (°) I002 (Conteo) Índices de cristalinidad, %
M0 18.05 197 22.30 279 29.39
M1 18.10 224 22.25 326 31.29
M2 18.00 154 22.55 321 52.02
M3 18.75 182 22.50 565 67.79
M4 18.35 121 22.80 236 48.73
am, fase amorfa de la celulosa; 002, fase cristalina de la celulosa. Tratamientos consecutivos: M0 (sin
tratamiento), M1 (extracción con éter de petróleo), M2 (extracciones acuosas at 25 y 80ºC), M3 (hidrólisis
alcalina con NaOH 4%), y M4 (blanqueamiento con 1.7% NaClO2 y 2% H2O2).
Hay un incremento en el porcentaje del índice de cristalinidad, el mayor fue para M3 (hidrólisis
alcalina). Este incremento en cristalinidad se atribuye a dos efectos: a) eliminación progresiva de
algunos constituyentes amorfos como azúcares libres, hemicelulosa y lignina fácilmente
hidrolizable; y b) el rearreglo de la región cristalina a una de naturaleza más cristalina (Ben Sghaier
et al. 2012; Johar et al. 2012; Rosli et al. 2013). Sin embargo, el blanqueo tiene un efecto contrario,
ya que el índice de cristalinidad disminuye de 67 a 48% para M4. Este resultado es opuesto a lo
reportado por otros autores que estudiaron cascarilla de arroz (Johar et al. 2012) y fibra de agave
(Rosli et al. 2013) usando hidróxido de sodio (4%) como primer etapa y clorito de sodio (1.7%)
como blanqueamiento. Sus resultados mostraron un incremento (50.2-56.5 y 69-74%) del
porcentaje del índice de cristalinidad. Sin embargo, aquí usamos una combinación de métodos de
blanqueo, el primero con clorito de sodio y el segundo con peróxido de hidrógeno. En esta
tecnología verde el anión perhidroxilo (HOO-) elimina grupos carbonilos conjugados de la lignina
y los radicales hidroxilos (HO·) y peroxilos (·O2) producen una descomposición oxidativa de los
anillos aromáticos de la lignina.
La reactividad de los radicales en la lignina es ligeramente más alta que en la celulosa. Además, si
el peróxido de hidrógeno se descompone demasiado rápido, la concentración de radicales llega a
ser alta y se produce la degradación de la celulosa y lignina (Bajpai 2012). Algunos metales de
transición catalizan estas descomposiciones por lo que algunos autores han propuesto proteger la
47
celulosa agregando quelante como el EDTA y sales de magnesio (Loureiro et al. 2011) durante el
blanqueo con peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, incrementando la celulosa amorfa y/o evitando
su degradación resultará en una diminución del índice de cristalinidad.
6.3.3 Termogramas y estabilidad térmica
La estabilidad térmica de lignocelulosa de A. salmiana fue monitoreada por curvas
termogravimétricas (Fig. 10a). De las mediciones, se crearon los espectros termogravimétricos
diferenciales (Fig. 10b). Los termogramas de M0 y M1 son similares entre sí, pero diferentes de
M2-M4 (Fig. 10c). Se observa un pico en M0 y M1 a una temperatura de 208°C, los cuales
desaparecen en los espectros M2-M4. Esto se debe a la pérdida de componentes grasos (extracción
con éter de petróleo) e hidrosolubles (extracción acuosa). También en M2-M4, observamos un pico
ancho (210-380°C) relacionado a la pirolisis de hemicelulosa y celulosa (Carrier et al. 2011), el
cual fue más intenso para M3 a 340°C lo que significa que esta muestra es térmicamente más
estable. Este comportamiento es causado principalmente por un alto contenido de celulosa y la
cristalinidad más alta ocasionada por el tratamiento alcalino. Además, el pico más alto para M4 fue
a 320 °C, 20°C por debajo de lo reportado para M3, atribuible al hecho de que los cambios en la
celulosa cristalina ocurridos durante la degradación de lignina por el blanqueo. La muestra M4
también mostró picos entre 400 y 600 °C debido a las fracciones de lignina formadas por su
oxidación.
48
_
Fig. 10 Estabilidad térmica de la lignocelulosa de A. salmiana. (a) Curvas termogravimétricas y (b) espectro
termogravimétrico diferencial. Tratamientos consecutivos: M0 (sin tratamiento), M1 (extracción con éter
de petróleo), M2 (extracciones acuosas at 25 y 80ºC), M3 (hidrólisis alcalina con NaOH 4%), y M4
(blanqueamiento con 1.7% NaClO2 y 2% H2O2).
49
Las curvas termogravimétricas confirman el comportamiento pirolítico (Fig. 10a). A temperaturas
<100°C, observamos perdidas de masa de 2-10% (M0-M4), la muestra M4 sufrió la pérdida más
grande (10%). Estas pérdidas podrían explicarse por la evaporación de agua y la presencia de
sustancias volátiles. En temperaturas entre 170 y 380°C, tuvo lugar una pérdida de masa más rápida
(45-65%), siendo M0 la muestra que mostró la estabilidad térmica más baja al compararse con M3,
la cual registró la estabilidad más alta. La degradación en M0 fue causada por un mayor número
de componentes termosensibles (lípidos y azúcares libres) todavía presentes en la biofibra. En
temperaturas inferiores a 380°C los carbonos de la lignina son oxidados (Amar Singh Singha &
Rana 2010; Tronc et al. 2007), mostrando una reducción lenta y gradual en la pérdida de masa.
Finalmente, a 700°C entre el 80 y 90 % de la lignocelulosa es volatilizada. Este comportamiento
pirolítico de las biofibras de A. salmiana es como el reportado por Carrier et al. (2011) quien
observó que la pérdida de masa más grande en madera álamo y helecho es producida entre 300-
350°C, donde la hemicelulosa es degradada a 200-300°C, α-celulosa en 250-350°C y lignina en
200-500°C. Similarmente, Tronc et al. (2007) sostuvo que Agave tequilana Weber azul es
degradada alrededor de 350°C mientras que lo mismo ocurre para la lignina en temperaturas por
arriba de 450°C. Después de estos análisis, se determinó que la hidrólisis alcalina provee más
estabilidad térmica a la materia lignocelulósica, que la lignocelulosa blanqueada pierde resistencia
térmica y reduce el índice de cristalinidad, aun cuando se mejora considerablemente la blancura.
El último proceso se podría omitir si se desea un índice de cristalinidad alto para usarse en
materiales como refuerzo. Por otro lado, la materia blanqueada podría utilizarse para producir
biocombustibles o copolímeros por engrapado donde se prefiere la celulosa amorfa porque se
facilita la reacción enzimática o el engrapado se incrementa.
6.3.4 Parámetros, cambios, índices, intensidad y ángulo de color de las lignocelulosas
En el cuadro 5, se presentan los valores de los parámetros de color (L, a, b) de acuerdo con el
modelo cromático CIELab. Se observa reducción significativa en la luminosidad (L*) después de
la extracción con éter de petróleo (M1, 73) y agua (M2, 65), ocasionada por la eliminación de
ácidos grasos y carbohidratos solubles, y como consecuencia la lignina que cubre a las fibras de la
celulosa (Mwaikambo & Ansell 2002) es expuesta, ocasionando oscurecimiento del material
lignocelulosico.
50
Por el contrario, un incremento estadísticamente significativo en la luminosidad de M3 (66) a M4
(86) se produce por eliminación de lignina con el proceso de blanqueamiento (Elanthikkal et al.
2010). Por otro lado, el componente cromático (a*) en la escala del rojo de la biofibra (M0, +1.2)
aumento después de extracción con éter de petróleo (M1, +3.6) y agua (M2, +4.28), pero se redujo
después de la hidrólisis alcalina (M3, +2.0), incluso con tendencia al verde después del proceso del
blanqueado (M4, -1.15). Mientras que el componente cromático (b*) en la escala del amarillo de
la biofibra (M0, +20) disminuyó ligeramente después de los tratamientos consecutivos (M4, +15).
A nuestro saber, esta es la primera vez que se reportan los parámetros y coeficientes de color de la
biofibra de A. salmiana hidrolizada y con blanqueamiento, ya que anteriormente solo se reportó el
efecto del blanqueado por simple percepción visual (Tovar-Carrillo et al. 2014; Rosli et al. 2013;
Johar et al. 2012) y no usando un sistema cromático como CIELab o RGB.
51
Cuadro 5. Parámetros de color de acuerdo al modelo cromático CIEL*a*b*de muestras en polvo
pencas de A. salmiana tratadas.
Sample Color Parameters, CIEL*a*b*
L* a* b*
M0 75.70 ± 0.91 b 1.20 ± 0.12 a 19.45 ± 0.17 b
M1 73.16 ± 0.39 c 3.59 ± 0.22 b 21.53 ± 0.83 c
M2 65.48 ± 0.28 a 4.28 ± 0.11 c 16.34 ± 0.12 a
M3 66.90 ± 2.55 a 2.02 ± 0.34 d 16.50 ± 1.25 a
M4 86.02 ± 0.51 d -1.15 ± 0.15 e 15.06 ± 0.71 d
Valores promedio ± desviación estándar, n = 10, diferentes letras en la misma columna muestran diferencia
estadística significativa (p <0.05), de acuerdo con la prueba de Tukey. Luminosidad (L *); (a y B*);
Tratamientos consecutivos: M0 (sin tratamiento), M1 (extracción con éter de petróleo), M2 (extracción
acuosa a 25 y 80 ºC), M3 (hidrólisis alcalina con NaOH al 4%) y M4 (blanqueamiento con NaClO2 al 1,7%
y H2O2 al 2%).
Con las ecuaciones 1-4, se determinaron: (i) diferencias de color respecto al tratamiento, (ii) índice
de color, y para el modelo CIELCh: (iii) Intensidad de color (C) y (iv) apariencia de color (ángulo
h). Las diferencias de coloración (ΔE) de las biofibras respecto a la fibra inicial, son mayores con
la extracción acuosa (11.13) y blanqueamiento (11.47). Aunque el cambio de color con el
tratamiento alcalino (M3, 9,67) es alto, no es estadísticamente significativo, para p<0.05, con la
muestra de extracción acuosa (M2), pero sí lo es con la muestra del blanqueamiento (M4). De igual
manera, M2, M3 y M4 son estadísticamente significativos con respecto a M1. Esto significa que
los compuestos que son eliminados o que forman la nueva superficie de la fibra tratada influyen en
los parámetros de color, tanto en la luminosidad (L*) y los componentes cromáticos entre verde-
rojo (a*) y entre azul-amarillo (b*) no muestra diferencia estadística entre tratamientos.
De acuerdo con los índices de color (IC), el color se incrementó desde M0 (0.81) hasta M2 (4.00),
cambia en M3 (1.82) y M4 (-0.89), todas las muestras son estadísticamente diferentes para p<0.05
de acuerdo con la prueba de Tukey. Esto implica que las muestras M0, M3 y M4 son amarillo-
verdosas (IC -2 a +2) y las muestras M1 y M2 van de amarillo-pálido a naranja-intenso (IC +2 a
52
+20) Vignoni et al. (2006). Las extracciones acuosas y con éter dejaron en la superficie compuestos
con grupos aromáticos como la lignina, que favorecieron valores altos de los componentes
cromáticos y bajos valores de luminosidad. Por otro lado, con la hidrólisis y blanqueamiento se
oxidan y fragmentan estas estructuras, dejando la celulosa con menos sustancias en la superficie
reduciendo así los valores cromáticos y aumentando la luminosidad.
La intensidad de color (C*) aumenta ligeramente con la extracción con éter (M0, 18.48; M1, 21.83)
y reduce con los tratamientos posteriores, aunque entre M2 y M3 no hay una diferencia
significativa. Esto es consecuencia de la eliminación consecutiva de los componentes, que a su vez
ocasiona menor saturación de color en las muestras. Se percibe información diferente si se analizan
los componentes cromáticos por separado, pero al determinar la intensidad de color se evalúa el
cambio conjunto de éstos que es más cercano a lo percibido por el ojo humano.
Cuadro 6. Índices, intensidad, ángulo y cambios de color de pencas de A. salmiana tratadas
Sample
CIEL*C*h*
ΔE CI C* h*
M0 --- 0.81 ± 0.08 a 19.48 ± 0.18 b 1.51 ± 0.006 a
M1 4.22 ± 0.72 c 2.28 ± 0.20 b 21.83 ± 0.80 c 1.40 ± 0.014 b
M2 11.13 ± 0.92 a, b 4.00 ± 0.12 c 16.89 ± 0.11 a 1.31 ± 0.007 c
M3 9.67 ± 2.18 a 1.82 ± 0.25 d 16.63 ± 1.28 a 1.44 ± 0.013 d
M4 11.47 ± 1.36 b -0.89 ± 0.13 e 15.10 ± 0.70 d -1.49 ± 0.012 e
Valores promedio ± desviación estándar, n = 10, diferentes letras en la columna muestran una diferencia
estadística significativa (p <0.05), de acuerdo con la prueba de Tukey. Cambio de color (ΔE) relacionado
con M0; Índice de color (CI); Croma (intensidad del color, C); y Hue (ángulo de color, h). Tratamientos
consecutivos: M0 (sin tratamiento), M1 (extracción con éter de petróleo), M2 (extracción acuosa a 25 y 80
ºC), M3 (hidrólisis alcalina con NaOH al 4%) y M4 (blanqueamiento con NaClO2 al 1,7% y H2O2 al 2%)
53
En cuanto al ángulo de color (h*) las muestras M0-M3 presentaron valores alrededor de 1.4° lo
que significa que dentro del modelo cromático CIELCh se ubican en el cuadrante rojo-amarillo,
éste cambia drásticamente con el blanqueamiento a -1.5° lo que implica un cambio en la tonalidad
hacia el cuadrante verde-amarillo.
6.4 Caracterización microestructural de las lignocelulosas
Con la microscopia electrónica de barrido de alta resolución (MEB-AR) se obtuvieron los
diferentes grados de desintegración de las muestras lignocelulósicas de A. salmiana (M0-M4) con
respecto a los tratamientos. Las muestras M0 y M1 son estructuralmente similares, se presentan
como aglomerados gruesos de fibras cementadas por otros componentes. Esto podría ser porque la
extracción con éter solo elimina algunos componentes no polares en un bajo porcentaje (0.8 %).
En las muestras M2 se comienza a ver una desintegración del material, con las microfibrillas
separadas y en forma de espiral, ya que los componentes polares hidrosolubles como carbohidratos
(42 %) son eliminados. Para la muestra M3, donde la celulosa se incrementó (75%), se observa una
nueva aglomeración y un recubrimiento fino del material esto fue ocasionado porque el tratamiento
alcalino eliminó hemicelulosas y parte de ligninas para facilitar aglomeración de celulosa.
Finalmente, aunque en M4 se siguen apreciando láminas aglomeradas son más finas que las
correspondientes en M3 pero además se percibió una expansión, que se relaciona con una
disminución en la cristalinidad.
54
Fig. 11 Micrografía MEB-AR (1000X) que muestra cambios estructurales para lignocelulosas. Tratamientos
consecutivos: M0 (sin tratamiento), M1 (extracción con éter de petróleo), M2 (extracciones acuosas at 25 y
80ºC), M3 (hidrólisis alcalina con NaOH 4%), y M4 (blanqueamiento con 1.7% NaClO2 y 2% H2O2).
M0 M1
M2 M3
M4
55
Fig. 12 Micrografia con focal (20X) que muestra cambios de autofluorescencia para lignocelulosas. Tratamientos consecutivos: M0 (sin tratamiento), M1 (extracción con éter de petróleo), M2
(extracciones acuosas at 25 y 80ºC), M3 (hidrólisis alcalina con NaOH 4%), y M4 (blanqueamiento con
1.7% NaClO2 y 2% H2O2).
M0 M1
M2 M3
M4
56
Las micrografías confocal (Fig. 12) y los espectros de emisión de autofluorescencia de 420-720
nm (Fig. 13) de las lignocelulosas de A. salmiana, presentaron cambios con respecto a los
tratamientos aplicados. En la muestra M0 se aprecian tres tipos de emisiones de autofluorescencia:
azul (420-490nm), verde (490-560nm) y roja (625-720). A simple vista, en M0 predominan
autofluorescencias azul y verde; para M1 prevalece la autofluorescencia azul; en M2 se incrementa
notablemente la emisión roja. En la muestra M3 domina la emisión azul sobre la verde y en M4 es
principalmente emisión azul.
Aunque la autofluorescencia en biomasa se debe a la presencia de diferentes componentes como
son: nucleótidos, flavonoides, antocianinas, clorofila, algunas proteínas, celulosa y lignina se ha
utilizado poco para conocer la distribución de estos componentes después de los tratamientos de la
biomasa no maderable.
Se ha reportado que para muestras vegetales la emisión de autofluorescencia azul se debe
principalmente a la presencia de celulosa (420-430nm) (Roshchina 2012) y lignina (455nm)
(Donaldson 2013). Por su parte, la autofluorescencia verde se presenta por terpenos, alcaloides y
flavonoides (470-525nm) y flavinas (520nm) (Roshchina 2012) y lignina (530-545nm) (Donaldson
2013). La autofluorescencia roja se debe a clorofilas (675-680nm) (Roshchina 2012) lignina
(580nm) (Donaldson 2013) y poliacetilenos, isoquinolinas, alcaloides acridoneos (570-655nm)
(Roshchina 2012).
57
Fig. 13 Espectros de emisión de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C). Tratamientos consecutivos:
M0 (sin tratamiento), M1 (extracción con éter de petróleo), M2 (extracción acuosa a 25 y 80 ºC), M3
(hidrólisis alcalina con 4 % NaOH), y M4 (blanqueo con 1.7 % NaClO2 and 2 % H2O2). Los espectros M4
verde y M3 y M4 rojo no se obtuvieron porque no se detectó a simple vista emisión de este tipo en estas
muestras.
6.5 Análisis de imagen de autofluorescencia de los materiales lignocelulosico
Las imágenes de autofluorescencia se analizaron para determinar la influencia de cada tratamiento
sobre los componentes y su distribución. Aunque una misma fluorescencia puede deberse a dos o
más compuestos diferentes puede detectarse influencias importantes y que pueden explicar ciertos
resultados que han sido solo analizados directamente.
58
6.5.1 Área total de fluorescencias
Fig. 14 Área de partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C), de residuo de agave sin tratamiento
(M0) y lignocelulosas después de diferentes tratamientos (M1, M2, M3, M4).
El área total representa de forma indirecta la cantidad de los componentes que fluorecen en azul,
verde o rojo, en este estudio. De acuerdo con las medias, la fluorescencia azul tiene alrededor de
30,000 μm2 la cual corresponde a la muestra M1. En los tratamientos posteriores ocasionan una
reducción en la cantidad de esta sustancia. Como la fluorescencia azul puede deberse
principalmente a celulosa o lignina (Roshchina 2012; Donaldson 2013) y debido a la reducción que
se tienen en el área de este tipo de fluorescencia de M1-M4, entonces debe corresponder a lignina
ya que por análisis fisicoquímicos se determinó, que la celulosa se incrementa con estos
tratamientos. La muestra con blanqueamiento (M4) tiene diferencia estadística con M1 y M3,
alcanzando M4 un área por debajo de 100 μm2.
59
La fluorescencia verde representada por terpenos, alcaloides, flavonoides, flavinas y lignina
(Roshchina 2012; Donaldson 2013), disminuye con los diferentes tratamientos. Estos componentes
y las clorofilas se reducen gradualmente por los tratamientos M1 (extracción no polar) y M2
(extracción acuosa). Sin embargo, debido a que la lignina no se solubiliza en estos dos tratamientos,
ésta se concentra en la muestra M2. La cual es abatida con el tratamiento alcalino y blanqueamiento
ya que la lignina es soluble en álcali caliente y oxidada con peróxido de hidrógeno.
La fluorescencia roja en plantas se presenta principalmente por la presencia de clorofila y lignina
(Roshchina 2012; Donaldson 2013). El área de la fluorescencia roja es estadísticamente mayor para
la lignocelulosa de la muestra M2, aunque no hay presencia de clorofila porque se han eliminado
con la extracción no polar y acuosa. Este resultado muestra que la lignina queda en la superficie de
la fibra, además que el tratamiento alcalino es efectivo en la remoción o fragmentación de esta
macromolécula.
6.5.2 Perímetro de partículas
Este parámetro representa el perímetro promedio de las partículas, es decir, puede interpretarse
como el tamaño promedio o grado de fragmentación o distribución de los componentes que
representan cierta fluorescencia. La fluorescencia azul que se ha asignado aquí corresponde a
lignina, el perímetro en M4 es menor a 10 micras y diferente estadísticamente a M0, M1, M2 y M3
con un perímetro entre 30 y 40 micras esto puede indicar una reducción del tamaño macromolecular
de la lignina ocasionada por los tratamientos M2 y M3. Para la fluorescencia verde que también se
ha asignado para la lignina se tiene que el perímetro para M4 se incrementó a 50 micras marcando
una diferencia significativa con las muestras de M0-M3 que tuvieron un perímetro de alrededor de
15 a 25 micras. Al relacionar este perímetro grande con el área pequeña de la M4 del espectro
verde, se puede decir que la lignina fluorescente verde se recondensa después del fraccionamiento
cubriendo la superficie de la celulosa, por ser la fibra más abundante en M4, generando perímetros
grandes, aunque el área sea pequeña. Por su parte, el perímetro de la fluorescencia verde tiene una
media de 35 micras y es diferente a los tratamientos M0, M1, M3 y M4 con perímetro entre 8-15
micras. Al observar estas diferencias en el comportamiento de la lignina en diferentes longitudes
de onda, se puede decir que se trata de diferente conformación o fragmentos de la lignina ya que
es un polímero amorfo y de composición variada.
60
Fig. 15 Perímetro de partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C), de residuo de agave sin
tratamiento (M0) y lignocelulosas después de diferentes tratamientos (M1, M2, M3, M4).
61
6.5.3 Circularidad de partículas
Fig. 16 Circularidad de las partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C), de residuo de agave
sin tratamiento (M0) y lignocelulosas después de diferentes tratamientos (M1, M2, M3, M4).
Para la fluorescencia roja en la muestra M2, se presentó una circularidad baja (0.80) y diferente
con los otros tratamientos M0, M1, M3 y M4 (0.90-0.93), al considerar para la misma muestra alta
área, alto perímetro y baja circularidad se deduce que la lignina se concentra en M2, y que se
desintegra por los tratamientos alcalino y blanqueamiento.
6.5.4 Diámetro de Feret
La circularidad indica que tanta similitud existe a una circunferencia, se representa en un valor de
0-1, siendo 1 una circunferencia perfecta. La fluorescencia azul, correspondiente a lignina, para
M4 ha presentado baja área y bajo perímetro esto indica que son partículas pequeñas y ahora con
alta circularidad para M4, confirma que se ha desintegrado a través de los tratamientos de tal
62
manera que forma partículas con una circularidad de 0.91. En cambio, las muestras M0-M3 tienen
una circularidad entre 0.79-0.82. En la fluorescencia verde, solo hay diferencia significativa entre
las medias de los tratamientos M2 y M4. Baja área y alto perímetro puede indicar que se trata de
contornos de partículas grandes y aunado con la baja circularidad (0.77) se puede decir que son de
forma irregular.
Fig. 17 Diámetro de Feret de las partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C), de residuo de
agave sin tratamiento (M0) y lignocelulosas después de diferentes tratamientos (M1, M2, M3, M4).
El diámetro de Feret representa la distancia más grande entre dos puntos de la frontera
seleccionada. Si esta frontera es formada por las partículas producidas por los tratamientos, se
aprecia que la M4 tiene dos comportamientos, ambos con diferencia significativa entre M0-M3,
bajo diámetro de Feret (< 5) para aquellas que producen autofluorescencia azul, y alto diámetro de
63
Feret para las que producen fluorescencia verde (>18). Este parámetro se correlaciona directamente
con el perímetro de las partículas de fluorescencia azul y verde, aparentemente la fluorescencia
azul son partículas pequeñas de alta circularidad y, por el contrario, la fluorescencia verde
corresponde a partículas grandes y alargadas. La fluorescencia roja de la lignocelulosa M2 tiene
diámetro de Feret estadísticamente diferente con M3 y M4. En ella se tienen partículas grandes de
baja circularidad y se aprecia como los tratamientos alcalinos y blanqueamiento disgregan esas
sustancias en componentes más pequeños.
6.5.5 Relación de aspecto AR
Fig. 18 Relación de aspecto de las partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C), de residuo de
agave sin tratamiento (M0) y lignocelulosas después de diferentes tratamientos (M1, M2, M3, M4).
64
Si se supone una elipse hipotética para las partículas, no existe una relación coherente entre el eje
mayor y el eje menor, con los diferentes tratamientos para los componentes de las tres
autofluorescencias. Ninguno de los espectros mostró diferencia significativa entre las diferentes
muestras.
6.5.6 Dimensión fractal
Fig. 19 Dimensión fractal (DF BCFA) de las partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C), de
residuo de agave sin tratamiento (M0) y lignocelulosas después de diferentes tratamientos (M1, M2, M3,
M4).
La M4 en el espectro azul mostró una diferencia significativa p<0.05 con un valor de dimensión
fractal de 0.5 con respecto a las muestras M0-M3 con valores de alrededor de 1.2. La reducción de
este valor significa un cambio en la conformación fractal de la muestra de área a línea. Por otro
lado, en el espectro verde solo hay diferencia estadística entre M4 con M0 y M2. De manera similar,
65
para el espectro rojo la muestra M4 presenta diferencia entre M0, M2 y M3; la muestra M2 presenta
diferencia con M1.
6.5.7 Lagunaridad (área)
Fig. 20 Lagunaridad de área (λBC) de las partículas de fluorescencia azul (A), verde (B) y roja (C), de residuo
de agave sin tratamiento (M0) y lignocelulosas después de diferentes tratamientos (M1, M2, M3, M4).
66
6.5.8 Textura (Dimensión fractal y lagunaridad)
Fig. 21 (A) Dimensión fractal de textura (DFSBLA) y (B) lagunaridad de textura (λSBLA) de las lignocelulosas
sin tratamiento (M0) y por la aplicación de diferentes tratamientos (M1, M2, M3, M4).
La lagunaridad de área y de textura no presenta diferencia significativa entre las muestras.
6.6 Síntesis y análisis de copolímeros
6.6.1 Porcentaje de injerto
El porcentaje de injerto de los productos de la copolimerización con los tres materiales más ricos
en material lignocelulósico fueron bajos con relación al obtenido por (A S Singha & Rana 2010),
quienes lograron hasta un 40 % de injerto en A. americana.
Cuadro 7. Porcentaje de injerto en los copolímeros
Lignocelulosa - Copolímero Injerto (%)
M2 - MSA 3.72 ± 0.8
M3 - MCA 5.42 ± 1.1
M4 - MBL 4.19 ± 0.9
Existe dificultad en la determinación de estos valores ya que durante la activación de los sitios de
reacción por 24 h en medio ligeramente ácido se pueden liberar o hidrolizar algunos componentes
que se pierden durante la filtración y hacer que estos valores cambien.
67
6.6.2 Termogravimetría
En la Fig. 22 se presentan los termogramas correspondientes a los productos de la reacción con
MMA y los materiales lignocelulósicos obtenidos con los tratamientos M2, M3 y M4. Se nota en
esta figura que el producto más estable es el MCA, que fue producido con la fibra tratada con
NaOH al 4 % y el menos estable fue el obtenido con el material lignocelulósico con extracción
acuosa, en éste se tiene una pérdida de alrededor del 20 % en una temperatura menor a 100 °C en
cambio el más estable presenta solo un 4 % en una temperatura menor a 300 °C similar al producto
obtenido con la fibra blanqueada, pero en el que la pérdida es casi del 13 %. La mayor pérdida de
masa se da entre 300 y 350 °C en la que se pierde entre 60 y 70 %.
Fig. 22 Estabilidad térmica de los copolímeros usando lignocelulosa proveniente de A. salmiana. (a) Curvas
termogravimétricas y (b) espectro termogravimétrico diferencial. MSA (copolímero con lignocelulosa M2),
MCA (copolímero con lignocelulosa M3) y MBL (copolímero con lignocelulosa M3).
68
6.6.3 Microscopia confocal de copolímeros
Con esta técnica se apreciaron los diferentes componentes por autofluorescencia de los mismos.
La lignina y la celulosa fueron los que se percibieron mejor, se puede apreciar cómo se encuentran
inmersos. También se aprecia el material copolimerizado con las fibras. En el que se puede ver
con más claridad es en la MCA. En los recuadros de la imagen 1 se presentan la autofluorescencia
de los materiales lignocelulósicos.
69
Fig. 23 Microscopia confocal (20X) de los materiales lignocelulósicos (M2, M3 y M4) y material
copolimerizado correspondiente (MSA, MCA y MBL)
70
6.6.4 Microscopia MEB-AR
Se aprecian los cambios en la disgregación de los componentes del material lignocelulósico. El
material con blanqueamiento es el que se aprecia más separado. Se ve que, aunque se eliminan las
otras fibras siguen estando las fibras familiares de celulosa. También se nota que el material que
se forma con la M3, tiene en su superficie algunas zonas con formación de copolímero.
Fig. 24. Micrografía MEB-AR del copolímero MCA (usando lignocelulosa M3)
71
6. CONCLUSIONES
1. Derivado del análisis de la composición de las pencas residuales de A. salmiana, se
identificó además de celulosa, una concentración valiosa de glucosa y fructosa susceptible
de ser debidamente aprovechable. Ya que se recuperan con facilidad por extracciones
acuosas.
2. Mediante los tratamientos de desintegración empleados para enriquecer la concentración
de celulosa se identificó que la extracción acuosa genera el mejor rendimiento, seguido del
tratamiento alcalino, alcanzando 53 y 76 % de celulosa, respectivamente. Al neutralizar el
extracto alcalino, se pueden recuperar algunas hemicelulosas precipitándolas con etanol.
3. Los análisis generados por Espectroscopia de IR, Termo gravimetría, Difracción de rayos
X y Microscopia Confocal y de Barrido de Electrones, dan cuenta del incremento en la
celulosa al aplicar la extracción etérea, extracción acuosa, tratamiento alcalino y
blanqueamiento.
4. Las características de los materiales lignocelulosicos obtenidos con los tratamientos en el
nivel de extracción acuosa, tratamiento alcalino y blanqueamiento son susceptibles de ser
utilizados en la copolimerización con algún monómero vinílico, debido al bajo índice de
cristalinidad y alta desintegración del material que se apreció por DRX y microscopia SEM.
5. El material engrapado necesita ser optimizado considerando tanto condiciones de reacción,
como de tamaño de partícula y en especial tratamientos que reduzcan la cristalinidad para
mejorar la disponibilidad de los sitios de reacción.
72
Nomenclatura
I.C. Índice de cristalinidad
𝐼𝑐 Intensidad de la fracción cristalina (22 – 23 °)
𝐼𝑎 Intensidad de la fracción amorfa (18 – 19 °).
ΔE* Diferencia de color entre tratamientos
CI Índice de color
C* Intensidad de color
H* Ángulo de color
L* Luminosidad de 0-100
a*Componente cromático entre verde y rojo
b*Componente cromático entre azul y amarillo
73
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