Dr. D. Ángel Zúñiga Cabrera, Hospital Universitario La Fe ...

Dr. D. Ángel Zúñiga Cabrera, Hospital Universitario La Fe

Dra. D. Arantxa Lafuente Sanchis, Hospital Universitario de la Ribera

CERTIFICAN:

Que la presente Tesis Doctoral titulada “Prevalencia alélica de las mutaciones

en los genes BRCA1 y BRCA2 en mujeres con cáncer de mama en el departamento de

salud de la ribera en la comunidad valenciana”, ha sido realizada por Dª Mª Montserrat

Ortiz Mengual bajo nuestra dirección, en el programa de Doctorado Investigación y

Desarrollo para la obtención del título de Doctor por la Universidad Católica de

Valencia San Vicente Mártir.

Para que así conste a los efectos legales oportunos, se presenta esta tesis

doctoral y se extiende la presente certificación en Valencia a 24 de julio de 2017.

Fdo.: Ángel Zúñiga Cabrera Fdo.: Arantxa Lafuente Sanchis

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALENCIA

“San Vicente Mártir”

TESIS DOCTORAL

PREVALENCIA ALÉLICA DE LAS MUTACIONES EN LOS GENES BRCA1 Y BRCA2 EN MUJERES CON CÁNCER DE MAMA EN EL

DEPARTAMENTO DE SALUD DE LA RIBERA EN LA COMUNIDAD VALENCIANA.

ALELLIC PREVALENCE OF BRCA1 AND BRCA2 GENE MUTATIONS IN WOMEN WITH BREAST CANCER IN THE DEPARTMENT OF

HEALTH LA RIBERA IN THE VALENCIAN COMMUNITY.

Presentado por: Dª Montserrat Ortiz Mengual

Dirigido por:

Dr. Ángel Zúñiga Cabrera Dra. Arantxa Lafuente Sanchis

Valencia, a 7 de Abril de 2017

AGRADECIMIENTOS Me gustaría agradecer en estas líneas a todas esas personas que han ido apareciendo en este

arduo camino y se han quedado para darme su apoyo y han hecho posible llegar a la

finalización de esta tesis. Gracias a todos aquellos que formáis parte de mi camino por

hacerme crecer como persona día a día.

A mis directores de tesis, los doctores Ángel Zúñiga y Arantxa Lafuente, por su constante guía,

su plena dedicación, su gran profesionalidad y paciencia para ayudarme a finalizar mi trabajo.

Han sido importantes no solo en el desarrollo de la tesis, sino también en mi formación como

investigadora.

A mis compañeras y amigas Isabel y Ángela que han aportado la ayuda necesaria tanto a nivel

profesional como personal para recorrer todo el camino necesario hasta la finalización de la

tesis.

A todas esas amigas tan especiales que me han brindado la mano y su más sincero apoyo en

aquellos momentos en los que no veía luz.

A mis padres, porque sin ellos nada sería posible, por darme el apoyo moral, emocional y

económico necesario para adquirir todos los conocimientos, valores y filosofía de vida

necesarios para llegar a alcanzar el final de esta etapa. A mi hermana por su apoyo y valoración

incondicional, que hacen que siempre me esfuerce por superarme, seguir luchando y no

defraudarla.

A mi familia, que con sus ánimos y enseñanzas me han permitido aprender y crecer cada día

como persona y por lo tanto como profesional, porque una persona es lo que es también por

la gente que la rodea.

A Carles, que siempre me ha apoyado en los buenos y aún más si cabe en los malos momentos,

por ser siempre esa brisa de aire fresco cuando parece que no hay nada que hacer, por ser la

vela de este barco y ayudarme a navegar este mar, en algunos momentos, de mucho oleaje.

Gracias

El éxito en la vida no se mide por lo que has logrado, sino por los obstáculos que has tenido que

enfrentar en el camino.

Mahatma Gandhi

5

RESUMEN

El cáncer de mama es la neoplasia más común en la mujer y una de las principales causas

de muerte entre los 45 y 50 años. El primer factor de riesgo es la edad, siendo el segundo

los antecedentes familiares, de modo que es necesario realizar un estudio molecular de

los genes BRCA1 y BRCA2 para determinar si se trata de cáncer de mama hereditario o

no.

En este estudio se han determinado las mutaciones presentes en los genes BRCA1 y

BRCA2 en pacientes de riesgo, así como la prevalencia de dichas mutaciones en el

Departamento de Salud de la Ribera en la Comunidad Valenciana. También se ha

realizado una caracterización de estas pacientes para conocer el perfil de las que acuden

a la Unida de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama.

En nuestro estudio, el perfil más frecuente son mujeres (92.67%) con antecedentes

familiares de cáncer de mama y ovario (70.14%), y pre-menopáusicas (82.37%). La

prevalencia poblacional encontrada en nuestro estudio mediante secuenciación de NGS

y Sanger para mutaciones patológicas en los genes BRCA1 y BRCA2 causantes de cáncer

de mama/ovario hereditario ha sido de un 7.37%. El análisis de dosis génica por técnica

de MLPA (P002 para BRCA1 y P045 para BRCA2; n=164) no detectó grandes

reordenamientos de los genes BRCA en ninguno de los pacientes estudiados. Además se

ha observado una prevalencia de mutación distinta entre ambos genes, siendo el BRCA2

de mayor prevalencia. De todas las mutaciones patológicas, la más prevalente en

nuestro entorno es la deleción de 5 nucleótidos del exón 23 (c.9026_9030delATCAT).

Palabras clave: cáncer de mama, BRCA1, BRCA2

6

ABSTRACT

Breast cancer is the most common form of cancer in women and the leading cause of

cancer death among women between the ages of 45 and 50. The first risk factor is age;

the second is the family history, therefore, it is necessary to do a molecular study of the

BRCA1 and BRCA2 genes to know if the breast cancer is hereditary or not.

In this study, the mutations presents in the BRCA1 and BRCA2 genes have been

determined at risk patients and the prevalence of these mutations in the Department of

Health of the Ribera in the Valencian Community too. It has also been done a

characterization of these patients to know which the women’s profile is coming to the

Family Risk Unit of Breast Cancer.

In our study, the most frequent profile were women (92.67%) with a family history of

breast and ovarian cancer (70.14%), and premenopausal women (82.37%). The

population prevalence for pathological mutations in BRCA1 and BRCA2 genes causing

hereditary breast/ovarian cancer that we found in our study was 7.37% and we have

used NGS and Sanger sequencing these. Genetic dose analysis by MLPA technique (P002

for BRCA1 and P045 for BRCA2; n = 164) did not detect large rearrangements of BRCA

genes in any of the patients studied. In addition, a distinct mutation prevalence has been

observed between both genes, and we have observed that the one with the highest

prevalence was the BRCA2 gene. The most prevalent mutation of all pathological

mutations in our environment is the deletion of 5 nucleotides of exon 23

(c.9026_9030delATCAT).

Key word: breast cancer, BRCA1, BRCA2

7

INDICE

ABREVIATURAS

11

1. INTRODUCCIÓN 13

1.1. Cáncer de Mama. 13

1.1.1. Definición y clasificación 13

1.1.2. Incidencia 16

1.1.3. Biología Molecular del cáncer y Oncogénesis 16

1.1.4. Etiología 20

1.1.5. Cáncer de Ovario 25

1.2. Clínica en el cáncer de cama. 25

1.2.1. Diagnóstico 25

1.2.2. Pronóstico 27

1.2.3. Tratamiento 33

1.3. Cáncer de Mama hereditario. 34

1.3.1. Teoría de la doble mutación de Knudson. 34

1.3.2. Predisposición genética al cáncer de Mama. 35

1.3.3. Genes BRCA1/BRCA2. 37

8

1.3.4. Pérdida de función de los genes BRCA1/BRCA2. 42

1.3.5. Penetrancia de las mutaciones en genes

BRCA1/BRCA2.

43

1.4. Técnicas moleculares diagnósticas. 46

1.4.1. Estudios genéticos 46

1.4.2. Importancia clínica del estudio genético. 49

1.4.3. Asesoramiento genético y aspectos psicológicos y

éticos.

52

2. JUSTIFICACIÓN 53

3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 54

3.1. Hipótesis de trabajo. 54

3.2. Objetivos Primario y Secundarios. 54

4. MATERIAL Y MÉTODOS 55

4.1. Ámbito de estudio. 55

4.2. Diseño de estudio. 55

4.3. Periodo de estudio. 55

4.4. Selección de pacientes. 55

4.5. Tamaño muestral. 56

4.6. Análisis genético. 56

4.6.1. Método de extracción de ADN a partir de sangre

periférica.

56

4.6.2. Medición de concentración de material genético 58

9

4.6.3. Estudio mutacional de los genes BRCA1 y BRCA2

por NGS (Next Generation Sequencing).

59

4.6.4. Análisis Bioinformático de los datos de NGS. 63

4.6.5. Estudio mutacional de los genes BRCA1 y BRCA2. 64

4.6.6.Estudio de dosis génica de los genes BRCA1yBRCA2 67

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 70

5.1. Características clínicas de los pacientes estudiados. 70

5.2. Aná lisis de grandes deleciones y reordenamientos de los

genes BRCA1/BRCA2 mediante técnica de MLPA.

79

5.3. Análisis de secuencias. 81

5.4. Pacientes detectados con mutaciones patológicas. 86

6. CONCLUSIONES 100

7. BIBLIOGRAFÍA

8. ANEXOS

102

118

11

ABREVIATURAS

ABBI: Advanced Breast Biopsy Instrumentation

ACOG: Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología

ADN/DNA: Ácido Desoxiribonucleoico

ARN/RNA: Ácido Ribonucleico

BAG: Biopsia con Aguja Gruesa

BIC: Breast Cancer Information Core

BRCA: gen/proteína de susceptibilidad para el cáncer de mama

BRCT: región genoma

CA: colección de amplicones

CaM: cáncer de mama

CaOv: cáncer de ovario

CDI: carcinoma ductal infiltrante

CDIS: carcinoma ductal in situ

CIIS: carcinoma intraductal in situ

CSE: cuadrante superior externo

CSI: cuadrante superior interno

Del.: deleción

dNTP: deoxinucleotidos-trifosfato

EDTA: Ácido Etilendiaminotetraacético

FAD: fibroadenoma

HPNCC: cáncer colorrectal hereditario no polipósico

IHQ: inmunohistoquímico

Ins.: inserción

mARN: ARN mensajero

MIDs: códigos de barras moleculares

MLPA: Amplificación Múltiple de Sondas Ligando-Dependientes

MD: mama derecha

MI: mama izquierda

MND: mutación nueva no descrita

MP: Mutaciones Patológicas

12

NGS: Secuenciación de Nueva Generación

NP: variantes no patológicas o benignas

PAAF: Punción Aspiración con Aguja Fina

PET o PET-TAC: Tomografía de Emisión de Positrones

PET-TAC: Tomografía de emisión de Positrones

PLMF: polimorfismo

PN: Mutaciones Nuevas (No descritas)

PP: probablemente patológica

PTT: Test de la Proteína Truncada

RMM: Resonancia Magnética de Mama

VSCD: variante de significado clínico desconocido

13

1. INTRODUCCIÓN

1.1. CÁNCER DE MAMA

1.1.1. Definición y Clasificación.

La mama es un tejido glandular con una gran cantidad de tejido adiposo, que la

constituye en un 90%, además se integran al tejido los conductos galactóforos y la

glándula mamaria, encargados ambos de la producción y secreción de leche materna.

Las glándulas mamarias se distribuyen por toda la mama, aunque las dos terceras partes

del tejido glandular se encuentran en los 30 mm más cercanos a la base del pezón. Estas

glándulas drenan en el pezón por medio de ductos, cada uno de los cuales tiene su

propia apertura o poro. La intrincada red formada por los ductos se ordena de forma

radial y converge en el pezón.

El cáncer se origina cuando las células saludables de la mama empiezan a cambiar y

proliferar sin control, formando una masa o un conglomerado de células denominado

tumor. Un tumor puede ser canceroso o benigno, siendo canceroso cuando tiene la

capacidad de crecer y diseminarse a otras partes del cuerpo.

El cáncer de mama (CaM) se disemina cuando crece en otras partes del cuerpo o cuando

las células cancerosas se desplazan a otros sitios del cuerpo a través de los vasos

sanguíneos y/o linfáticos, por un proceso denominado metástasis. El cáncer de mama

con mayor frecuencia se disemina a los ganglios linfáticos regionales. Los ganglios

linfáticos regionales se encuentran debajo del brazo, en el cuello, debajo del esternón o

inmediatamente arriba de las clavículas. Cuando el cáncer se disemina a otras partes del

cuerpo, con mayor frecuencia se ven afectados los huesos, los pulmones y el hígado.

Con menos frecuencia, el cáncer de mama puede diseminarse al cerebro.

Existen diversas clasificaciones anatomo-patológicas para el CaM de las cuales la

presentada por la Organización Mundial de la Salud (WHO, Lakhani y cols., 2016) es la

más reconocida e incluye:

Carcinoma invasivo no especializado

Carcinoma pleomórfico

Carcinoma con células estromales gigantes tipo osteoclastos

14

Carcinoma con características coriocarcinomatosas

Carcinoma con características melanocíticas

Tipos especiales:

Carcinoma lobulillar invasivo

o Carcinoma lobulillar clásico

o Carcinoma lobulillar sólido

o Carcinoma lobulillar alveolar

o Carcinoma lobulillar pleomórfico

o Carcinoma tubulolobulillar

o Carcinoma lobulillar mixto

Carcinoma tubular

Carcinoma cribiforme

Carcinoma mucinoso

Carcinoma con características medulares

o Carcinoma medular

o Carcinoma medular atípico

o Carcinoma invasivo NST con características medulares

Carcinoma con diferenciación apocrina

Carcinoma con diferenciación de células en anillo de sello

Carcinoma micropapilar invasivo

Carcinoma metaplásico sin tipo especializado

o Carcinoma adenoescamoso de bajo grado

o Carcinoma metaplásico tipo fibromatoso

o Carcinoma de células escamosas

o Carcinoma de células fusiformes

o Carcinoma metaplásico con diferenciación mesenquimal

Diferenciación condroide

Diferenciación ósea

Otros tipos de diferenciación mesenquimal

Carcinoma metaplásico mixto

Carcinoma mioepitelial

15

Tipos raros

Carcinoma con características neuroendocrinas

o Tumor neuroendocrino bien diferenciado

o Carcinoma neuroendocrino poco diferenciado (carcinoma de células

pequeñas)

Carcinoma secretor

Carcinoma papilar invasivo

Carcinoma de células acinares

Carcinoma mucoepidermoide

Carcinoma polimórfico

Carcinoma oncocítico

Carcinoma rico en lípidos

Carcinoma de células claras ricas en glucógeno

Carcinoma cebaceo

Tumores de tipo anexos a glandula salival/ anexos cutáneos

o Cilindroma

o Hidroadenoma de células claras

Tumores epiteliales-mioepiteliales

Adenoma pleomorfico

Adenomioepitelioma

o Adenomioepitelioma con carcinoma

Carcinoma adenoide cistico

El cáncer, en general, es una situación médica multicausal en la que se producen

alteraciones del ADN. Cuando se hace referencia específicamente a la glándula mamaria,

ésta podría dar origen a un tumor maligno en cualquiera de las estructuras celulares que

la conforman. Sin embargo, los casos más frecuentes en cuanto a su origen histológico

y su localización son los originados en las estructuras glandulares. Dentro de éstos, los

tumores más frecuentes a nivel mundial son los de tipo ductal (alrededor del 85% de los

casos) y lobulillar. Cualquiera de estos, por su extensión microscópica, se clasifican en

no invasivos o in situ e invasivos o infiltrantes. El carcinoma lobulillar in situ no se

16

considera un verdadero cáncer, pero constituye un factor de riesgo de aparición de

cáncer invasor.

1.1.2. Incidencia.

El cáncer de mama es la neoplasia más frecuente en la mujer (con excepción del cáncer

de piel), y una de las principales causas de muerte entre los 45 y 50 años (Heredia AM y

cols., 2007). Durante las últimas décadas se ha registrado un aumento progresivo de la

incidencia de la enfermedad. El riesgo de desarrollar cáncer de mama a lo largo de la

vida es aproximadamente una de cada ocho mujeres. Entre las mujeres menores de 40

años es 1 cada 228; entre los 40 y los 59 años 1 cada 24; y entre las mujeres de 60 a 79

años 1 cada 14 (Jemal A y cols. 2004). Los hombres, aunque en una proporción muy

inferior a las mujeres, también son susceptibles de padecer cáncer de mama (Friedman

LSy cols., 1997; Volgestein B y cols., 2002; Antoniou A y cols., 2003). Más de la mitad de

los casos se diagnostican en los países desarrollados: 370.000 casos al año en Europa

(27,4%) y 230.000 en Norteamérica (31,3%). La prevalencia más baja la tienen países

como Japón, Tailandia, Nigeria e India (www.aecc.es).

La tasa ajustada mundial es de 37,4 casos/100.000 h/año.

Europa del Norte, de 82,5 casos/100.000 h/año

Europa del Sur, de 62,4 casos/100.000 h/año

España, de 50,9 casos/100.000 h/año

Norteamérica, de 99,4 casos/100.000 h/año

Países en desarrollo, de 23,8 casos/100.000 h/año.

1.1.3. Biología Molecular del cáncer y Oncogénesis.

Para el desarrollo de una célula normal a una célula tumoral, pueden acontecer dos

sucesos vitales: que se produzca un daño o lesión a nivel del ADN o que este esté

alterado por mutaciones hereditarias y que no permitan una correcta reparación del

ADN o bien no se repare. Esta célula tumoral deberá sobrevivir y multiplicarse sin

17

control, escapando a los mecanismos reguladores del organismo, para desarrollar el

tumor (Haagensen C, 1973). Así pues, el cáncer es una enfermedad debida a una

mutación en el ADN que conlleva mutaciones genéticas, y que pueden producir:

• Activación de los oncogenes, como los factores de crecimiento, receptores de los

factores de crecimiento, señales de transducción o factores reguladores de la

transcripción.

• Inactivación de genes supresores, como Rb1, p53, APC, NF1, WT1, DCC, p16, BRCA,

PTEN, etc...

• Alteración en los genes responsables de la estabilidad del genoma, como los genes

reguladores de la apoptosis (Bcl2, Bad, Bax, Bak) o genes reparadores del ADN.

Actualmente, se sabe que es más bien la acumulación de cambios genéticos y

epigenéticos los que van a hacer que una célula adquiera características cancerígenas.

Las alteraciones epigenéticas hacen referencia a cambios en la expresividad de genes

estructuralmente normales. La mayor o menor metilación de los genes hacen que estos

se expresen más o menos. Así, la metilación de un gen con función supresora

comportará que este no se exprese y así que no efectúe su acción supresora, resultando

en una mayor activación del ciclo celular (Esteller M, 2008).

Estas células tumorales van a ser capaces de eludir los mecanismos fisiológicos de

diferenciación a la vez que generan señales de crecimiento propio y utilizan los factores

de crecimiento. Además, pueden evitar los factores inhibidores del crecimiento y van a

anular los sistemas de muerte celular programada o apoptosis.

Por lo tanto, sus características principales van a ser:

• Inmortalidad

• Inestabilidad genética

• Proliferación independiente de nutrientes y GF

• Pérdida de inhibición por contacto

• Metástasis.

18

Hanahan D y Weinberg RA (2000) describieron que las células tumorales han de

presentar 6 alteraciones esenciales en su fisiología que conjuntamente comportarán

crecimiento maligno:

1. Autosuficiencia en la producción de señales de crecimiento.

2. Insensibilidad a las señales anticrecimiento.

3. Evasión de la apoptosis.

4. Pérdida de la limitación al potencial reproductivo.

5. Estimulación de la angiogénesis.

6. Invasión de tejidos y metástasis.

En una revisión posterior de los mismos autores (Hanahan D y cols., 2011), exponen que

subyacente a estas seis características se encuentra la inestabilidad genómica, la cual

genera la diversidad genética, y la inflamación que fomentan estas funciones distintivas.

El avance conceptual que se ha dado en la última época ha añadido dos marcas

distintivas más a la lista: la reprogramación de la energía metabólica y la evasión de la

destrucción por el sistema inmune. Además de las células cancerígenas, los tumores

presentan otra dimensión de complejidad: contienen un repertorio de células normales

que constituyen un microambiente tumoral. De la misma manera, se conoce que para

el proceso de invasión y metástasis es imprescindible una relación continua entre el

tumor y el tejido sobre el que este asienta. El reconocimiento de la aplicabilidad

generalizada de todos estos factores afectará de manera creciente al desarrollo de

nuevas terapias contra el cáncer.

En cuanto a las metástasis, son la causa del 90% de las muertes producidas por el cáncer.

En el desarrollo de éstas tienen un protagonismo esencial las moléculas de adhesión de

la superficie de las células tumorales. Entre ellas, las cadherinas, responsables de las

interacciones célula-célula, y las integrinas, responsables de las interacciones matriz

extracelular-célula. También las proteasas extracelulares que degradan la matriz

extracelular y que son producidas por células del estroma y células inflamatorias, son

necesarias para el proceso de invasión y metástasis.

19

Actualmente las teorías de mecanismos de metástasis son:

•”Soil and seed”: cada órgano ofrece unas condiciones distintas para anidar y crecer

“friendly environment” para determinados tumores.

•”Homing”: cada órgano posee factores quimotácticos que atraen y facilitan la

extravasación y anidamiento de células malignas circulantes (Quimokinas).

•Barrera Física: el tamaño de las células determina su localización.

•Firma genética: en el tumor primario ya existen las células “metastatizantes” (una en

1 millón).

•“Pre-niche”: Células derivadas de la médula ósea que expresan VEGFR 1 (FLT1) se

asientan en sitios “pre-metastásicos específicos” y forman agrupaciones celulares antes

de que acudan las células cancerígenas.

Mención especial tienen también las células madre o stem cells tumorales, ya que cada

vez hay más datos que defienden la existencia de estas células. Tienen una capacidad de

autorenovación constante y han perdido la capacidad de regulación del crecimiento,

pero tienen capacidad de diferenciación. Así se convertirían en las proveedoras de

nuevas células tumorales para el tejido canceroso. Parece que las stem cells tumorales

se mantienen en general en estado quiescente, explicando la resistencia a los

tratamientos antineoplásicos y la recidiva tumoral.

Historia natural:

Hay muchos modelos que explican la capacidad de crecimiento y división celular, pero

es cierto que básicamente se dividen en dos: el de crecimiento exponencial, en el que la

lesión mamaria sigue una tasa de multiplicación exponencial; y el modelo de crecimiento

Gompertziano, en el que el tumor crecería más rápidamente en fases iniciales

disminuyendo la velocidad paulatinamente a medida que es de mayor tamaño (Collins

V y cols., 1956; Gilewski T y cols., 1996).

El tiempo que tarda el cáncer de mama en duplicar su tamaño es muy variable, pero en

general, el tamaño de los tumores se duplica cada 100 días. Por tanto, una sola célula

maligna tarda unos 10 años en convertirse en una masa clínicamente detectable de 1cm,

20

si bien en este mismo período un tumor de 1cm ya ha experimentado 30 de las 40

duplicaciones de tamaño que, según los cálculos, se asocian a enfermedad mortal. Es

más, el tamaño medio que tiene el tumor cuando se detecta (antes de la mamografía)

es de 2.5cm, un tamaño que se asocia a una incidencia de afectación linfática del 50%

(Wertheimer MD y cols., 1986).

En un principio el carcinoma mamario crece limitado a la mama, ya sea intraductalmente

o infiltrando el parénquima. Esta infiltración tiende a producirse siguiendo estructuras

mamarias, como los conductos, fascias y el tejido graso menos resistente por lo que

adquiere una forma estrellada e irregular en vez de un contorno redondeado. Además

de esta diseminación y crecimiento locales, el cáncer de mama se disemina a distancia

por los conductos linfáticos. Los ganglios más frecuentemente afectados son los axilares,

seguidos de los de la mamaria interna y en tercer lugar los supraclaviculares. Por último,

cabe mencionar la posibilidad de diseminación hemática, preferentemente en hueso,

pulmón e hígado, pero suele ocurrir en estadios muy avanzados que previamente ya han

dado algún síntoma local o axilar (González-Merlo J y cols., 2000).

1.1.4. Etiología.

El cáncer de mama ha sido objeto de infinidad de estudios acerca de los posibles factores

de riesgo que influyen en su aparición. Aunque se desconoce la causa desencadenante,

cada día se sabe más acerca de la multitud de factores que influyen en su promoción.

Hay que tener en cuenta que la gran mayoría de mujeres (85%) que presenta cáncer de

mama no tienen ningún factor de riesgo identificable además de la edad, por lo que

debemos considerar que todas las mujeres corren riesgo (Volgestein B y cols., 2002;

Narod SA y cols., 2004).

Existen diversos modelos matemáticos para realizar una valoración individual del riesgo

inmediato y a largo plazo, aunque el más ampliamente utilizado es el “Índice de Gail”

que se basa en la cuantificación de cinco variables en un programa de cribaje. Los riesgos

relativos se multiplican, obteniendo un riesgo sumatorio. Además, los oncólogos pueden

calcular el riesgo de una paciente usando el algoritmo de la página web del National

Cancer Institute: http://bcra.nci.nih.gov/bcr/. En ella, se analizan distintos factores

como la edad, raza-etnia, edad de la primera menstruación, edad en el primer

21

embarazo, historia previa de lesiones “in situ”, biopsias anteriores y antecedentes

familiares que se trata del factor más importante.

- Edad: Es el factor de riesgo individualmente más importante, ya que a medida que

aumenta la edad, el riesgo relativo de muerte por cáncer de mama va incrementándose.

Alrededor del 94% de todos los cánceres de mama afectan a mujeres mayores de 40

años (Han W y cols., 2004). Sin embargo, los tumores diagnosticados en mujeres de

menos de 35 años, tienen peor pronóstico, tanto en intervalo libre de enfermedad como

en supervivencia global, debido a que suelen ser más proliferativos, considerando esto

un factor de mal pronóstico independiente (Park BW y cols., 2002). Este último punto

sigue siendo controvertido ya que otros autores no encuentran diferencias cuando

analizan estadio por estadio y creen que el peor pronóstico sería por un retraso

diagnóstico, como pasa en el cáncer de mama en la paciente gestante (Hickey M y cols.,

2009).

- Raza: La raza y la etnia modifican el riesgo de cáncer de mama. Así el cáncer de mama

es más frecuente en las mujeres afroamericanas con menos de 50 años con respecto a

las mujeres blancas, se presenta en estadios más avanzados y la mortalidad es 1.41

veces mayor. Estas diferencias no son explicables y no son atribuibles a las diferencias

socioeconómicas ni al acceso a los recursos sanitarios (Lannin DR y cols., 1998). Se

observa un cambio de riesgo que experimentan las mujeres que emigran, de países de

baja prevalencia a otros de mayor prevalencia

(http://www.cdc.gov/spanish/cancer/breast).

- Historia ginecológica: Las tres fechas de la vida de la mujer que ejercen un impacto importante

sobre la incidencia del cáncer de mama son la edad de la menarquia, la edad del primer

embarazo a término y la edad de la menopausia (Cnattingius S y cols., 2005; Eden JA, 2010)). De

hecho, estos tres factores pueden ser responsables de 70 a 80 % de la variabilidad de frecuencia

del cáncer de mama que se observa en países diferentes. La lactancia materna es aún en la

actualidad un tema de debate (Yang L y cols., 2008) aunque un metaanálisis reciente

indicó que la lactancia materna disminuía el riesgo de cáncer de mama en un 10-20%

aproximadamente y que el efecto se limitaba a las mujeres premenopáusicas (Martin

RM y cols., 2005).

22

- Patología mamaria benigna: El antecedente de patología mamaria benigna ha sido

considerado como un factor de riesgo especialmente en aquellas que habían requerido

una biopsia (Gail MH y cols., 1989). La clasificación más utilizada sigue siendo la de Page

y Dupont (Dupont WD y cols., 1985; Fizgibbons PL y cols., 1998). En ésta, las lesiones

benignas de tipo no proliferativo no están asociadas con riesgo de cáncer de mama

subsecuente, las lesiones proliferativas sin atipias tienen un RR de 1.5-2 y las lesiones

proliferativas con atipias tienen un RR de 4-5 para cáncer de mama. En este caso, si en

la paciente existe historia familiar de cáncer de mama el riesgo estimado se eleva con

un RR de 11 (Voguel VG y cols., 1998). El carcinoma lobulillar in situ es un marcador de

riesgo de la neoplasia con un aumento del riesgo de 8-10. También se incluye en esta

categoría al carcinoma ductal in situ pero solo aquellas lesiones de pequeño tamaño, de

bajo grado, sin fenómenos de comedonecrosis y en las que se ha descartado la

microinvasión.

- Historia familiar: Sólo el 10% de los casos de cáncer de mama en el ser humano

guardan relación directa con mutaciones de la línea germinal, aunque este porcentaje

aumenta hasta el 30% en pacientes diagnosticadas antes de los 30 años. Sólo 1 de cada

9 mujeres que contraen cáncer de mama tiene un pariente de primer grado afectado y

la mayoría de las mujeres con un pariente afectado nunca tendrán cáncer de mama.

Diversos genes participan en los casos familiares siendo los dos genes que más se

relacionan con la herencia familiar del cáncer mamario el BRCA1 y el BRCA2, ambos de

alta penetrancia como se explicará más adelante (Olopade OI y cols., 2008). Diversos

estudios demuestran una relación significativa entre la edad temprana del diagnóstico

y la frecuencia de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, lo que además se asocia

también a receptores hormonales y HER2/neu negativos (Musolino A y cols., 2007). Más

importante todavía que la participación que tengan estos genes en las formas

hereditarias de cáncer de mama es su implicación en el cáncer de mama esporádico.

Cerca del 40% de los cánceres de mama en el ser humano presentan una mutación de

p53 como defecto adquirido.

- Patrón mamográfico: Aunque sigue siendo un tema controvertido, el patrón o

densidad mamográfica es considerado por múltiples autores como un factor

independiente de riesgo (Martin LJ, 2008; Boyd NF, 2009). Un estudio reciente relaciona

23

el hábito alcohólico con un aumento en la densidad mamográfica, así como el efecto del

alcohol sobre la mama que puede ser modificado por el tabaco (Cabanes A y cols., 2011).

- Hormonas exógenas: Los metaanálisis más fiables respecto a la utilización de

anticonceptivos orales sugieren que estos fármacos sólo tendrían cierto interés

epidemiológico en mujeres jóvenes y con uso prolongado en las cuales podría haber un

mínimo aumento del riesgo con un muy bajo riesgo global (Nyante SJ y cols, 2008). Más

controvertidos son los datos en torno a la hormonoterapia sustitutiva (TSH) (Lyytinen H

y cols., 2009). El estudio WHI, demostró un aumento en el riesgo de cáncer de mama e

incidentes cardiovasculares adversos, aunque disminuían las fracturas óseas y el cáncer

colorectal (Rossouw JE y cols., 2002). Un estudio reciente, revela que en EEUU hubo una

disminución en el uso de la THS posterior al estudio WHI y también cayó la incidencia de

cáncer de mama en estas pacientes, aunque la relación causa-efecto es controvertida

(Chlebowski RT y cols., 2009).

- Factores alimentarios, peso y ejercicio: La variación geográfica en la incidencia del

cáncer de mama es considerable y se ha relacionado con la cantidad de grasa animal de

la dieta, sobretodo en la mujer postmenopáusica (Thiébaut AC y cols., 2007). No hay

discusión en que hay una mayor incidencia de cáncer de mama en los países que

consumen dietas abundantes y poco favorables (rica en grasas) y que no practican

ejercicio físico (Zaridze DG y cols., 2002). Sin duda, la mayor actividad física reduce el

riesgo de cáncer de mama en las mujeres posmenopáusicas (McTiernan A y cols., 2003;

Friedenreich CM y cols., 2008).

- Alcohol: La asociación entre el consumo de alcohol y el incremento del riesgo de

padecer cáncer de mama está firmemente demostrada, probablemente por el aumento

de los niveles de estradiol en la fase periovulatoria (Tjonneland A y cols., 2007), y esta

asociación parece más fuerte en el cáncer de mama hormono sensible (Li CI y cols.,

2010).

- Tabaco: Los resultados son muy dispares en cuanto al hábito tabáquico, aunque hay

más estudios a favor (Boffeta P y cols., 2011) que en contra de este incremento del

riesgo (Magnusson C y cols., 2007).

24

- Radiaciones: La exposición a las radiaciones ionizantes ha sido claramente establecida

como uno de los factores de riesgo para el desarrollo de cáncer de mama (Ng AK y cols.,

2009).

- Xenoestrógenos: Tienen un efecto similar a los estrógenos producidos naturalmente

(Buteau-Lozano H y cols., 2008). Un estudio reciente evidencia que el bisfenol A, es capaz

de inducir la transformación neoplásica de las células epiteliales de la mama (Fernandez

SV y cols., 2010).

1.1.5. Cáncer de ovario.

A diferencia del cáncer de mama, el cáncer de ovario representa solamente el 4% de los

tumores en la mujer, pero a pesar de ello es la quinta causa de muerte. Se ha observado

que la supervivencia al año es del 76% mientras que a los 5 años es del 46%. Uno de los

principales problemas para un diagnóstico precoz es que en su estadio inicial no produce

sintomatología por lo que únicamente un 24% es detectado de forma localizada.

Los factores de riesgo en el cáncer de ovario son similares a los del cáncer de mama,

siendo la edad el principal factor de riesgo seguida de la historia familiar de cáncer de

mama, de ovario o cáncer colorrectal. Cuando mediante un estudio genético se

determina la presencia de mutación en los genes BRCA1, BRCA2 o HNPCC, el riesgo de

desarrollar cáncer de ovario a lo largo de la vida del paciente poseedor de la mutación

es del 40-60% (Ford D y cols., 1998).

Los pacientes portadores de mutación en BRCA1 presentan una mayor predisposición

de desarrollar cáncer de ovario. Existen estudios que muestran una asociación entre la

localización de la mutación en el gen BRCA1 y el riesgo de padecer cáncer de mama u

ovario de modo que mutaciones localizadas en el extremo 5’ del gen se correlacionan

con un mayor riesgo de cáncer de ovario, mientras que mutaciones en el extremo 3’

confieren una mayor susceptibilidad al cáncer de mama. En la zona central del gen, entre

los codones 145 y 1433, existe una región donde cualquier mutación tiene una

implicación similar para el desarrollo de ambos tipos de cáncer (Trimble EL y cols., 2010).

Las mutaciones presentes en el gen BRCA2 están menos relacionadas con el cáncer de

ovario, solamente hay un dominio OCCR (Ovarian Cancer Cluster Region) cuyas

25

mutaciones parecen conferir mayor riesgo a desarrollar cáncer de ovario (Rebbeck TR y

cols., 2015).

La mayoría de familias con cáncer de ovario hereditario presentan mutaciones en el gen

BRCA1, solamente una pequeña proporción las presenta en el BRCA2. La probabilidad

de cáncer de ovario en familias con mutaciones en BRCA1 es de 28-44%, mientras que

para el BRCA2 es del 27% (Ben-David Y y cols., 2002). El cáncer de ovario hereditario

asociado a BRCA1 aparece de 10 a 15 años antes que el cáncer de ovario asociado al

BRCA2 que se diagnostica a las mimas edades que el esporádico (Rebbeck TR y cols.,

2015).

1.2. CLÍNICA EN EL CÁNCER DE MAMA

1.2.1. Diagnóstico.

El signo más frecuente y principal para el diagnóstico del cáncer de mama es la

tumoración, pero existen otros signos como son la retracción del pezón, la “piel de

naranja” o la secreción sanguinolenta por los pezones.

El diagnóstico se va a realizar en varias fases y presenta diversos algoritmos de actuación

que podemos seguir en función de los resultados se vayan determinando para cada

prueba realizada al paciente (Oncoguía CV, 2012). Se encuentra la fase de diagnóstico

clínico que consiste en la inspección y palpación de la mama y regiones ganglionares de

la paciente por parte del profesional de la salud, ya que la sensibilidad de la mamografía

es del 85-90% en mujeres mayores de 50 años, del 75% en mujeres entre 40-50 años y

menor en pacientes menores de 40 años. En estos casos el resultado de la exploración

es el que hace continuar con el proceso diagnóstico, ya que hay cánceres que no se

detectan mediante mamografía (Carney PA, 2003).

En segundo lugar se encuentra el diagnóstico radiológico, en esta etapa las técnicas que

se usan son principalmente la mamografía que es la técnica principal utilizada en la

exploración radiológica de la mama y ésta puede ser suficiente para el diagnóstico por

si sola o requerir el complemento con otras técnicas como son la ecografía, resonancia

magnética y la punción. Pero en cualquier caso se trata del estudio inicial que permite

26

elaborar un informe, describir una lesión, localizar con exactitud, valorar el grado de

sospecha para el cáncer y recomendar la confirmación diagnóstica (Vizcaino I y cols.,

2001). La ecografía mamaria es un método complementario a la exploración clínica o

mamográfica y en ningún caso sustituye a la mamografía para el cribado de cáncer de

mama debido a sus limitaciones (Metha TS, 2003). También se encuentran

procedimientos intervencionistas de mama cuyo objetivo es la obtención de muestra

para poder realizar el estudio citológico, histológico, inmunohistoquímico o para

resolver un problema clínico mamario y disminuir así el número de procedimientos

quirúrgicos, pero con una seguridad diagnóstica similar (Rutgers EJT, 2005). También se

utilizan la galactografía establecida para la detección de una masa intraductal

permitiendo la señalización de la misma y se realiza cuando la paciente presenta

secreción espontánea no lechosa, hemorrágica o con citología patológica por uno o

varios orificios, generalmente unilateral (Slawson SH y cols., 2001). Otra técnica es la

Resonancia Magnética (RMN) de mama que consiste en una técnica de imagen de gran

sensibilidad para la detección del cáncer de mama aunque presenta unas limitaciones

en cuanto a la especificidad que obligan a restringir sus indicaciones y asociarla por tanto

a las otras modalidades de imagen como son la mamografía o la ecografía mamaria

(Sentís M y cols., 2005). Y también encontramos la Tomografía de emisión de Positrones

(PET o PET-TAC) para la cual actualmente no hay establecida ninguna indicación para el

diagnóstico del cáncer de mama aunque se recomienda en determinadas ocasiones

(Rodríguez-Garrido M y cols., 2004).

En el caso del diagnóstico anatomopatológico se encuentran procedimientos

intervencionistas de mama como son la PAAF (Punción Aspiración con Aguja Fina) que

puede ser utilizada como técnica de elección o como apoyo para el diagnóstico tanto en

lesiones mamarias como en adenopatías axilares hasta para posibles recidivas o

metástasis cutáneas (Anastasiadis PG y cols., 2001). La BAG (Biopsia con Aguja Gruesa),

es un procedimiento diagnóstico para la obtención transcutánea de tejido mamario con

agujas de grosor variable y se obtienen a modo de cilindros que serán procesados

mediante la técnica histológica convencional. Gracias a la obtención de varios cilindros

se evita la cirugía abierta para el diagnóstico de patología benigna permitiendo el

diagnóstico de malignidad y una adecuada programación del tratamiento (Jacobs TW y

27

cols., 2002). La ABBI (Advanced Breast Biopsy Instrumentation), consiste en una

señalización de lesiones mediante la colocación de un marcador metálico, sirve para

llevar a cabo un diagnóstico histológico (Lifrange E y cols., 2001). Neumoquistografía,

indicada en el tratamiento de quistes somáticos, sirve para la detección de masas y

nódulos en la pared o interior de una lesión quística o cuando los hallazgos ecográficos

no reúnen todos los criterios de benignidad (Thurfjell E, 2001).

1.2.2. Pronóstico.

Los factores pronósticos nos informan sobre la historia natural y la evolución de la

enfermedad, sin tratamiento. Reflejan la mayor o menor agresividad de la enfermedad.

Los factores predictivos nos informan sobre la probabilidad de respuesta o resistencia

tumoral a un tratamiento determinado. De esta manera el concepto de “factores

predictivos” se va imponiendo al de “factores pronósticos” en un intento de poder

predecir cuales son los tumores que responderán a un medicamento en particular y no

a otro. Aun así, existen factores pronósticos de larga tradición que aún son necesarios a

la hora de tomar decisiones en el manejo de las pacientes. Primero se van a detallar

aquellos factores pronósticos morfológicos que constituyen indicadores pronósticos

clásicos y que pueden determinarse de forma rutinaria; después aquellos otros

indicadores “nuevos” de más reciente introducción y basados en marcadores

moleculares del tumor.

Factores pronósticos clásicos-morfológicos:

- Tamaño tumoral: Es uno de los principales factores pronósticos y está directamente

relacionado con el riesgo de recidiva, metástasis axilares y a distancia, y supervivencia

(Goyal A y cols., 2004). La relación entre el tamaño y el pronóstico es prácticamente

lineal, a mayor tamaño peor pronóstico y viceversa. La incidencia de metástasis

ganglionares en tumores de menos de 1 cm es del 5-25% y en los mayores de 5 cm del

75-80%. Otro aspecto muy importante es la probabilidad de recidivas en tumores

menores de 1 cm que ronda el 12%, mientras que la observada en los casos entre 1 y

2cm es del 28% (Waljee JF y cols., 2008).

28

- Afectación ganglionar axilar: La afectación ganglionar axilar sigue siendo el factor

pronóstico independiente más importante en el cáncer de mama. Cerca del 70% de las

enfermas con ganglios positivos recidivan a los 10 años, mientras que solo recidivan el

30% de las enfermas con ganglios negativos. Es necesario tener en cuenta tres factores:

el tipo de afectación ganglionar, el número de ganglios afectados y su localización según

define la clasificación TNM. En cuanto al valor del número de ganglios afectos, podría

separar dos grupos con diferente riesgo, cifrándose la supervivencia libre de

enfermedad en un 20-30% superior cuando el número de ganglios afectados es inferior

a 4 (Escobar PF y cols., 2006). Así como el tratamiento quirúrgico conservador ha ido

desplazando a la clásica mastectomía en la mayoría de pacientes, la linfadenectomía

axilar está siendo desplazada por la detección y exéresis del ganglio centinela. La técnica

de la biopsia selectiva del ganglio centinela mediante la cual se detecta y extirpa el

primer ganglio en el que drena la linfa, ha hecho que el estudio anatomopatológico de

este ganglio sea cada vez más preciso. A causa de estas limitaciones de muestreo se han

desarrollado nuevas técnicas moleculares. La más importante es el OSNA (One-step-

nucleic acid amplification) que mediante la detección de la Citokeratina 19 (CK19),

específica de células epiteliales, va a permitir un estudio intra-operatorio del ganglio

entero con alta sensibilidad, sin necesidad de un estudio postoperatorio, con una cirugía

de un solo tiempo y la posibilidad de guardar tejido para estudio histológico o

posteriores estudios. Todo esto con un alto grado de automatización y sobre todo de

estandarización (Tsujimoto M y cols., 2007; Schem C y cols., 2009).

- Tipo histológico: En cuanto al tipo histológico, clasificaremos los tipos histológicos en

aquellos que son los más habituales: ductal infiltrante (80%), lobulillar infiltrante (5-

15%) y mixtos, frente a otros tipos que tienen mejor o peor pronóstico.

- Mejor pronóstico: rara afectación axilar. CIS de bajo grado, papilar, tubular,

mucinoso (coloide), medular y adenoide quístico

-Peor pronóstico: mayor afectación axilar. CIS de alto grado, inflamatorio, con

células “en anillo de sello”, micropapilar y carcinosarcoma.

El carcinoma ductal infiltrante y el carcinoma lobulillar tienen pronósticos similares con

una tendencia favorable para el lobulillar infiltrante.

29

- Grado histológico: Aunque no se utiliza en el estadiaje, el grado histológico también es

importante como indicador pronóstico y junto con el tipo histológico y tamaño. Además,

está en relación con el tamaño tumoral, afectación ganglionar, recidiva y supervivencia.

El sistema de gradación establecido por Scarff-Bloom-Richardson y posteriormente

modificado por Elston es uno de los más utilizados (Bloom HJG y cols., 1957; Fisher ER y

cols., 1980; Elston CW, 1993). En este índice se tienen en cuenta tres factores: la

formación de túbulos, el pleomorfismo nuclear y el número de mitosis. Con estos tres

parámetros y mediante un sistema de puntuaciones se puede clasificar el grado

histológico o de diferenciación celular en tres grados: grado I (bien diferenciado), grado

II (moderadamente diferenciado) y grado III (pobremente diferenciado), (Elston CW,

2005).

- Invasión vascular linfática: La invasión de espacios linfovasculares tumorales o

peritumorales está en relación con la afectación de ganglios linfáticos y metástasis a

distancia. Además, está asociada a un riesgo relativo de recurrencia del 4.7 en pacientes

con ganglios negativos y parece un factor de mal pronóstico independiente del estado

hormonal de la paciente y del tamaño tumoral en algunos estudios (Mascarell I y cols.,

1998). En un estudio prospectivo de 2606 casos vieron que, en pacientes con ganglios

negativos, la presencia de invasión vascular linfática aumentaba estadísticamente el

riesgo de metástasis a distancia, disminuyendo la supervivencia libre de enfermedad y

la supervivencia total (Colleoni M y cols., 2007).

- Componente in situ (Componente intraductal extenso): No se ha demostrado que la

presencia de carcinoma in situ tenga valor pronóstico independiente. La importancia de

éste en el carcinoma invasivo, radica en la posibilidad de recidiva local si el margen de

resección no es suficientemente amplio y en la indicación de tratamiento mediante

radioterapia. Se define el componente intraductal extenso, como la presencia de más

del 25% del área de la lesión infiltrante y además en la periferia del mismo; o también

cuando la lesión es mayoritariamente intraductal con pequeños focos de tumor

infiltrante en la periferia del mismo. Éstas pacientes tienen mayor frecuencia de

márgenes afectos y más recidivas locales. Por tanto, en estos casos es importante

extirpar la lesión con un margen de seguridad suficientemente amplio (al menos 1cm).

30

Para la clasificación TNM, se mide sólo el componente infiltrante del tumor (Tresserra F

y cols., 2008).

- Necrosis tumoral: La necrosis tumoral es un fenómeno que se observa en tumores de

alto grado, poco diferenciados y por tanto de mal pronóstico. Es importante señalar su

presencia y su extensión en relación con el área tumoral en el informe

anatomopatológico (Tresserra F y cols., 2008).

Factores pronósticos moleculares:

- Receptores hormonales: Los receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP) han

sido de los primeros factores moleculares en utilizarse en la práctica clínica ya que

contribuyen en la regulación de la proliferación y diferenciación celular mamaria y, sobre

todo, son imprescindibles para la selección de pacientes que se beneficiarán de un

tratamiento hormonal mejorando el pronóstico y supervivencia de estas enfermas. Se

recomienda su detección en el tumor primario, recurrencias y en las lesiones

metastásicas (Hammond ME y cols., 2010).

- HER2/neu: HER2/neu (c-erb-B2) es un protooncogen localizado en el cromosoma

17q21 que codifica un receptor de la tirosinaquinasa transmembrana (ERB2 o p185) que

comparte una extensa similitud con el receptor del factor de crecimiento epidérmico

(EGFR). Está sobreexpresado aproximadamente en el 20% de los tumores de mama,

asociándose a un peor pronóstico. Las alteraciones de HER2/neu han sido registradas en

un 40-60% de los casos de CDIs, y están más extendidas en los subtipos comedo que en

los cribiformes, lo cual indica que existe un papel en la progresión de las lesiones

premalignas (Walker RA y cols., 1997). Se considera positivo si se detecta una alta

expresión IHQ (+++/+++ en más del 30%). Si la expresión es moderada debe

comprobarse si está amplificado mediante técnicas de inmunofluorescencia (FISH

superior a 2 es +) (Wolf A y cols., 2007). Actualmente, la técnica de hibridación in situ,

ya sea fluorescente (FISH) o con otros métodos de revelado (CISH, SISH) se considera el

gold standard en la valoración de la amplificación del gen ERBB2 (HER2/neu) en el cáncer

de mama (Sáez A y cols., 2006). La sobreexpresión HER2/neu se correlaciona con peor

31

pronóstico tumoral, menor intervalo libre de enfermedad y supervivencia global,

presencia de metástasis en ganglios axilares, hormonoindependencia, mayor capacidad

proliferativa y resistencia al tamoxifeno. Numerosos estudios randomizados han

demostrado que el uso de Trastuzumab debe considerarse como una parte integral de

la terapia adyuvante de pacientes con cáncer HER-2 positivos de mama (Romond EH y

cols., 2005; Dahabreh IJ y cols., 2008). También es un indicador fiable a la sensibilidad

celular ante la quimioterapia, esencialmente de las antraciclinas y los taxanos. Por otro

lado, los tumores de mama que no expresen RE ni RP ni HER2, los llamados “triple

negativos” tienen peor pronóstico (Kammori M y cols., 2008).

- Ki 67: Ki-67 es un antígeno nuclear de naturaleza proteica y es indicador de

proliferación celular demostrando ser un marcador pronóstico y predictivo de respuesta

al tratamiento en cáncer de mama. La actividad de este antígeno también se detecta por

el anticuerpo monoclonal MIB-1. En la práctica clínica debemos considerar que la

presencia de <10% o >20% de células con positividad nuclear, nos va a separar los

tumores con baja y alta actividad proliferativa. Viale G y cols. (2008) concluyen que Ki-

67 se comporta como un factor pronóstico en cáncer de mama ya que niveles elevados

de expresión se asocian a un peor pronóstico y a una supervivencia libre de progresión

más pobre, y como factor predictivo de respuesta a tratamiento hormonal adyuvante.

- p53: El gen supresor tumoral o antioncogen p53 que interviene en el control del ciclo

celular, como mediadora de la diferenciación, de la reparación del DNA y de la apoptosis.

Este gen se activa cuando la célula sufre daños en su DNA o cuando es sometida a estrés

celular, por eso se le ha llamado “guardián del genoma”. Alrededor de un tercio de los

cánceres de mama presentan mutaciones del gen p53. La hiperexpresión de la proteína

p53 mutada podría ser un factor independiente de predicción de supervivencia libre de

enfermedad y de supervivencia global, en pacientes con ganglios negativos, lo que

implicaría un peor pronóstico. Con respecto a la correlación entre la sobreexpresión de

p53 y otros factores clínicos y pronósticos hay gran variabilidad entre los distintos

estudios, aunque sí parece haber acuerdo en que p53 es un factor pronóstico

independiente que se relaciona con la agresividad tumoral, asociándose a positividad

para c-erb-B2, Ki67 y RE (Dookeran KA y cols., 2010)

32

- Angiogénesis: La neoangiogénesis está regulada por el factor del endotelio vascular

(VEGF), cuya presencia se asocia a un peor pronóstico (Bertolini F y cols., 2009). VEGF

está estrechamente relacionado con el receptor de estrógeno, sobreexpresándose

cuando éste se activa y favoreciendo la formación de nuevas yemas vasculares. Además,

también se correlaciona con el indicador de proliferación Ki67 y la aneuploidía de los

tumores mamarios (Applanat MP y cols., 2008).

- Perfil genético: El primer trabajo que examinó los patrones de expresión genética en

cáncer de mama fue publicado por Perou en la revista Nature el año 2000 (Perou C y

cols., 2000). Demostró que la heterogeneidad morfológica de los tumores mamarios

puede reclasificarse en 4 grupos principales: luminal A, luminal B, HER2 amplificado y

similar a basal (basal-like) en base a los estudios de reordenamiento genético. Poco

después (Sorlie T y cols., 2001) se demostró que los dos primeros son de mejor

pronóstico y que los tumores con fenotipo de células basales y los Her-2 positivos tienen

peor pronóstico. Los basal-like están relacionados con un comportamiento más

agresivo, con tendencia a desarrollar metástasis y con un fenotipo “triple negativo”

(para los receptores de estrógenos, de progesterona y para el HER2), que los excluye de

las terapias diana hormonal y anti HER2, aunque pueden responder bien a la

quimioterapia neoadyuvante y adyuvante.

En este contexto, los tests genéticos pronóstico están cobrando actualmente mayor

importancia en la práctica clínica. Los progresos en las técnicas genéticas han permitido

que el diagnóstico del cáncer de mama también pueda beneficiarse de la nueva era

genómica. De estos nuevos avances caben destacar los ADN microarray. Estos

microarrays nos permiten definir un perfil de expresión genética, que puede medir

desde unos cuantos genes hasta miles de ellos de forma simultánea (Checa T y cols.,

2008). Actualmente los cuatro tests genéticos predictivos más empleados son:

- Oncotype DX (Genomic Health Inc, Redwood, CA)

- MammaPrint (Agendia, Slotervaart Hospital, Amsterdam, Holanda)

- Rotterdam Signature Test (Erasmus MC/Daniel den Hoed Cancer Center, Roterdam)

- H/I Test, Breast Cancer Gene Expression Ratio (Avaria Dx Inc, Carlsbad, CA).

33

1.2.3. Tratamiento.

El tratamiento de una paciente con cáncer de mama se aborda desde distintos frentes

como la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia y la hormonoterapia. Para poder llevar

a cabo una correcta elección del tratamiento, se debe tener en cuenta tanto las

características tumorales, principalmente el estadio, así como el estado y actitud del

paciente de cara al tratamiento y a la enfermedad (Oncoguia CV, 2012).

En el caso de carcinomas in situ, como son tumores localizados que no presentan

metástasis, no se consideran una lesión propiamente neoplásica sino que se podría

considerar como un factor de riesgo de padecer carcinoma de mama en el futuro. El

tratamiento más adecuado va a ser la cirugía, consistente en una mastectomía uni o

bilateral sin biopsia selectiva del ganglio centinela ni linfadenectomia axilar (NCI, 2004;

Burnstein HJ y cols., 2004). Además puede ir acompañado de radioterapia (Singletary E

y cols., 2002), o tratamientos sistémicos como quimioterapia o hormonoterapia

adyuvante según proceda pero solamente en el caso de que sea ductal in situ, ya que el

lobulillar no va a requerir de estos tratamientos adicionales para reducir el número de

recidivas ya sean locorregionales o a distancia (Cohen M, 2004).

En el otro extremo se encuentran los pacientes con un tumor en estadio IV, que se

considera una enfermedad diseminada, por lo tanto incurable, y cuya supervivencia

global está entre 24 y 36 meses. El objetivo en este caso será un tratamiento únicamente

paliativo y con el fin de mejorar la calidad de vida de la paciente, y como última instancia

si es posible aumentar la supervivencia. El tratamiento se va a basar en hormonoterapia

y quimioterapia mediante distintos mecanismos y dosis (Mouridsen H y cols. 2003). Las

combinaciones más activas son las de Taxanos y Antraciclinas que producen un modesto

aumento en la supervivencia (Alba E y cols., 2003). Se puede realizar un tratamiento con

anticuerpos monoclonales, pero este tratamiento sólo va a ser útil para pacientes que

presenten cáncer de mama con sobreexpresión de HER2 (Burnstein HJ y cols., 2004). La

radioterapia en esta etapa del cáncer va a tener un papel importante en la disminución

de síntomas, pero no se va a buscar curar la enfermedad, sino que lo que se busca es

maximizar el bienestar de la paciente (Oncoguia CV, 2012).

34

1.3. CÁNCER DE MAMA HEREDITARIO

1.3.1. Teoría de la doble mutación de Knudson.

A lo largo del siglo XX se realizaron numerosas descripciones clínicas de agrupaciones

familiares de cáncer, sin embargo fueron la teoría de Knudson a principios de los años

setenta (Knudson AG, 1971), junto con el descubrimiento en el año 1986 del primer gen

de susceptibilidad al cáncer, Rb, implicado en el retinoblastoma familiar (Friend SH y

cols., 1986), los dos hitos que marcaron una nueva era en el campo del cáncer

hereditario. La teoría de Knudson se basó en la observación de 48 casos de

retinoblastoma, un tumor maligno de retina. En el año 1971, Knudson desarrolló su

teoría de two-hits, o “doble mutación”, basándose en la observación de que los casos

de retinoblastoma hereditario presentaban una edad de aparición mucho más temprana

que los casos esporádicos (casos únicos sin antecedentes familiares). Según la hipótesis

de Knudson, la enfermedad está causada por dos eventos mutacionales, que afectarían

a las dos copias del gen causante de la enfermedad. En la forma hereditaria, una

mutación (alteración en la información genética) se encontraría en la línea germinal,

transmitiéndose de generación en generación y confiriendo a los portadores una

susceptibilidad muy alta a padecer el cáncer. Esta susceptibilidad se heredaría de forma

autosómica dominante, es decir, un gen anormal de uno de los padres sería suficiente

para causar la susceptibilidad a sufrir la enfermedad, aunque la segunda copia del gen

del otro progenitor fuera normal. La segunda copia se alteraría a nivel somático, en este

caso la retina, y es entonces cuando se produciría el tumor. En las formas no

hereditarias, ambas mutaciones ocurrirían a nivel somático.

35

Figura 1. Modelo de transmisión hereditaria de mutaciones germinales en genes

supresores de tumores propuesto por AG Knudson en 1971. La alteración de la segunda

copia del gen en la célula somática suele producirse por pérdida alélica (pérdida de un

fragmento del cromosoma que contiene el gen).

1.3.2. Predisposición genética al cáncer de mama.

El cáncer de mama mayoritariamente tiene un carácter esporádico, lo que implica la

ausencia de una susceptibilidad heredada de desarrollar el cáncer. Sin embargo, los

avances en genética han permitido demostrar la base hereditaria para un subgrupo de

este tipo de cáncer, en los que las mutaciones de genes críticos se encuentran presentes

en las células somáticas y son heredadas de los progenitores (Rebbeck TR y cols., 2015). El

patrón de herencia de la enfermedad se ajusta a la Teoría de la doble mutación

propuesta por AG. Knudson en 1971.

Existe entre un 5-10% donde aparece esta predisposición hereditaria de desarrollar la

enfermedad (Claus EB y cols., 1996; Hall MJ y cols., 2009), de modo que la mutación

aparece en un gen que se hereda de forma mendeliana e incrementa el riesgo de la

persona portadora de desarrollar cáncer de mama a lo largo de su vida. Como esta

mutación se hereda a partir de la célula germinal de uno de los parentales, el individuo

va a presentar dicha mutación heredada en todas las células de su organismo. Además,

existe un 15% adicional de mujeres con cáncer de mama, que aunque no presenten un

36

patrón de herencia claro, sí que presentan algún antecedente familiar que lleva a

sospechar que consiste en un cáncer de mama hereditario (Rebbeck TR y cols., 2015).

Se han identificado 2 genes de susceptibilidad principales: el gen BRCA1 localizado en el

brazo largo del cromosoma 17 (17q21) que fue aislado en 1994 (Miki Y y cols. ,1994), y

el gen BRCA2 localizado en el brazo largo del cromosoma 13 (13q12) que fue aislado a

finales de 1995 (Wooster R y cols., 1995). Ambos genes son genes supresores de

tumores.

Aunque en principio estos dos genes parecían explicar la mayor parte de los casos de

cáncer de mama hereditario (Easton DF y cols., 1995), estudios posteriores demuestran

que dichas probabilidades fueron sobreestimadas ya que los estudios se habían

realizado en familias cuya carga genética era muy elevada. Hoy día se sabe que la

contribución de dichos genes al cáncer de mama hereditario está presente pero es más

modesta de lo que se pensaba, ya que todavía existen muchos casos que no pueden ser

explicados por la presencia de mutaciones en éstos genes. Se postula la existencia de un

posible BRCA3, pero hasta el momento no se ha localizado. Además, se sabe que hay

otros genes relacionados con el cáncer de mama, como CHEK2, TP53, pero éstos confieren

un riesgo mucho menor, de un 5%, 1% respectivamente (Figueroa L y cols., 2009). En la

mayoría de los casos están implicados en otras enfermedades sindrómicas con alta tasa

de incidencia de cáncer de mama (Nik-Zainal S, 2016). Se han identificado otros genes

cuyas mutaciones son poco frecuentes, pero que también presentan una correlación con

el cáncer de mama y ovario hereditario, como son los genes ATM, CDH1, CHEK-2, PALB2,

PTEN, STK11, MLH1 y MLH2. Mutaciones germinales en otros genes se han visto que

tienen mayor implicación como son los genes NBN, RAD51C, PALB2, BRIP1, BARD1. El

estudio mediante secuenciación individual de cada uno de ellos es ineficiente y muy

caro, de modo que gracias a las nuevas tecnologías de NGS se pueden realizar paneles

de secuenciación para determinar simultáneamente la presencia de mutaciones en

todos estos genes (Tung N y cols., 2015).

37

1.3.3. Genes BRCA1/BRCA2.

BRCA1

El gen BRCA1 es un gen de gran tamaño. Su secuencia de 5.592 nucleótidos, se extiende

a lo largo de 100 Kb de DNA genómico. El ARNm transcrito es de 7,8 Kb y se traduce a

una proteína de 1.863 aminoácidos. Su asociación con el cáncer de mama se conoce

desde 1990, cuando se mapeó por ligamiento un gen de susceptibilidad a cáncer de

mama en el cromosoma 17, en el intervalo 17q12-21 (Hall MJ y cols., 1990). El gen BRCA1

(OMIM #113705) fue identificado posteriormente por clonación posicional en 1994

(Miki y cols.1994), encontrándose que contenía 24 exones, 22 de los cuales codifican

para una proteína de 1863 aminoácidos. La región codificante comienza en el exón 2; el

exón 11 es el de mayor tamaño abarcando aproximadamente el 60% de todo el gen. Las

mutaciones en este gen se han identificado entre el 15 y 20% de las mujeres con historia

familiar de cáncer de mama y entre un 60 y 80% de mujeres con historia familiar de

cáncer de mama y ovario. Así las mujeres en donde se han detectado mutaciones en

este gen tienen entre un 60 y 80% de mayor riesgo de presentar este tipo de cáncer que

aquéllas que no las tienen (Morgan D y cols., 2009).

Figura 2.- Estructura del gen BRCA1. Se indican las mutaciones y variantes del gen en

familias españolas con cáncer de mama y cáncer de ovario hereditario (Baiget M y cols.,

2001).

38

Estructuralmente, BRCA1 es una fosfoproteína nuclear de 220 KDa, en donde la región

amino terminal contiene dominios proteicos tipo RING, los cuales consisten en motivos

estructurales de dedos de zinc, que están relacionados con la capacidad para

interaccionar físicamente con otras proteínas. La región acídica carboxilo terminal se

caracteriza por contener dominios de coactivación transcripcional y en donde se ha

demostrado que BRCA1 es capaz de unirse a proteínas que forman parte de la

maquinaria basal de transcripción como la RNApol-II y la Helicasa A (Scully R y cols.,

2000; Nathanson K y cols. 2001).

Figura 3.- Estructura de la proteína BRCA1. Los motivos estructurales de “dedos de zinc”

presentes en la región amino terminal de la proteína están asociados a interacciones

proteína-proteína. BRCA1 tiene una localización esencialmente nuclear. Esta proteína es

capaz de relocalizarse hacia los sitios donde se lleva a cabo síntesis de DNA, como en

fase S y durante los procesos de reparación que ocurren después de daño genotóxico.

Una de las regiones más importantes en la proteína es el dominio BRCT, localizado en la

región carboxilo terminal, en el cual se encuentran los motivos estructurales para unión

a proteínas que forman parte de la maquinaria basal de transcripción. Esta zona es la

responsable de la actividad coactivadora transcripcional de esta proteína en genes como

p21 y BclX.

Tanto BRCA1 como BRCA2 son capaces de unirse a la proteína RAD51 que es la homóloga

estructural y funcional en mamíferos de Rec A en E.coli. Estas proteínas son

indispensables en los mecanismos de reparación asociados a daño por rotura de la doble

39

hebra de DNA (DSBR) a través del mecanismo de recombinación homóloga (Yuan S y

cols., 1999). Además se ha demostrado que BRCA1 forma parte del multicomplejo que

incluye a las proteínas básicas para reparación como MSH2, MSH6, MLH1, ATM y BLM.

Este complejo funciona como controlador del daño al ADN. BRCA1 además es capaz de

interaccionar con la proteína p53 en sitios múltiples estimulando así la actividad

transcripcional de esta proteína (Tung N y cols., 2015).

A nivel molecular las pacientes con alteraciones en el gen BRCA1 tienen una alta

frecuencia de mutaciones en p53 y menor sobre-expresión de Her2/neu. Todos estos

hallazgos incluyen tanto factores pronósticos favorables como adversos (Xu X y cols.,

2001).

Desde el aislamiento del gen BRCA1, se han descrito más de 1600 variantes en secuencia

(incluyendo mutaciones, polimorfismos y variantes de significado incierto) (Breast

Cancer Information Core. http://www.nhgri.nih.gov/

Intramural_research/Lab_transfer/BIC 1997. Accessed 25 Jan 2017). Inicialmente solo 8

mutaciones fueron asociadas a enfermedad (Fútrela PA y cols., 1994), posteriormente

esta lista se ha incrementado. La mayor parte de estas variaciones incluyen mutaciones

de tipo frameshift o corrimiento en el marco de lectura, sin embargo, existen un gran

número de mutaciones tipo missense que son responsables de un mal funcionamiento

de la proteína. Se han reportado también diversas deleciones intrónicas como fuente de

mutación en BRCA1. Se presupone que este tipo de mutaciones tienen una alta

frecuencia debido a la presencia de diversas regiones Alu existentes en estas regiones,

lo cual facilita una alta frecuencia de inter-recombinación. No presenta “hot spots”,

excepto en población de judíos Ashkenazi, donde se informan frecuentemente dos

mutaciones; la 185delAG y 5382insC (Narod SA y cols., 2011).

BRCA2

Un segundo gen de susceptibilidad a cáncer fue encontrado un año después que BRCA1

(Wooster R y cols., 1995), se denominó BRCA2 (OMIM #600185) y está localizado en el

brazo largo del cromosoma 13 en la región q12.3. Las mutaciones de BRCA2 son las

causantes de cáncer en aproximadamente 35% de los casos de cáncer de mama

40

familiares y está asociado a cáncer de mama en varones, cáncer de ovario, próstata y

páncreas (Morgan D y cols., 2009). BRCA2 es un gen con 27 exones distribuidos en 70Kb

de ADN genómico que codifica una proteína de 3.418 aminoácidos con un marco de

lectura de 10.3 Kb (Bignell G y cols., 1997). Tanto BRCA1 como BRCA2 tienen un exón 11

muy largo y el sitio de traducción inicia en el exón 2.

Figura 4.- Estructura del gen BRCA2. Se indican las mutaciones y variantes del gen en

familias españolas con cáncer de mama y cáncer de ovario hereditario (Baiget M y cols.,

2001).

BRCA2 se une a BRCA1 y a RAD 51 lo cual la involucra en mecanismos básicos de

reparación, es decir, esta proteína está involucrada en los procesos para el

mantenimiento de la integridad genómica (Chen PL y cols., 1998). BRCA2 se ha asociado

también a procesos relacionados con el remodelamiento de la cromatina durante la

formación del sinaptonema en la recombinación homóloga en situaciones de daño al

ADN, en donde éste es un mecanismo de reparación importante, como en la persistencia

de cadena sencilla por detenimiento de la horquilla de replicación por formación de

fotoaductos por radiación U.V. (Scully R y cols., 2000). Los niveles más altos de expresión

se observan en mama, timo y en menor grado en pulmón, ovario y bazo.

41

Figura 5.- Estructura de la proteína BRCA2. Los sitios para su interacción con BRCA1 no

han sido mapeados. La región central denominada OCC es donde se encuentran con

mayor frecuencia las mutaciones asociadas a riesgo de cáncer de ovario.

Toda la información acerca de las funciones celulares de BRCA1/2 está asociada a la

interacción de estas proteínas con la maquinaria básica de reparación y con procesos de

remodelamiento de la cromatina. (Chen J y cols., 1998)Como es sabido todos los

mecanismos de reparación están presentes de manera constitutiva en todas las células

y son activos de manera independiente a la fase del ciclo celular. La manera de explicar

el porqué es precisamente en cáncer de mama en donde se han asociado alteraciones

en la función de BRCA1/2, es debido a que durante el metabolismo estrogénico se

generan especies altamente reactivas capaces de formar estructuras aberrantes

(aductos) en el ADN. Estos productos se encuentran en mayor cantidad en aquellos

órganos que responden fuertemente a estrógenos como la mama y el ovario. En

pacientes con mutaciones germinales en BRCA1/2 los mecanismos básicos para

detección y reparación de daño están alterados lo cual permite el acúmulo de

mutaciones asociadas a la formación de estos aductos (Venkitaraman AR y cols., 2001).

El riesgo para cáncer de mama en personas con mutaciones en este gen se estima entre

un 60 y un 85%, y el riesgo para cáncer de ovario entre un 10 y 20% (Morgan D y cols.,

2009).

La prevalencia de mutaciones en BRCA2 en la población general es desconocida, se ha

estimado por estudios poblacionales en 1-2 personas por mil (Satagopan JM y cols., 2001;

Esteban-Cardeñosa E y cols., 2008). Se han descrito mutaciones muy particulares en dos

42

grupos étnicos específicos: población de Islandia donde la mutación 999del5 ocurre en

el 0.6% de los casos y en 7.7% de mujeres y 40% de hombres con cáncer de mama

(Thorlacius S y cols., 1996); judíos Ashkenazi donde la mutación 6174delT ocurre con

una frecuencia de cerca de 1% (Offit K, 2006).

1.3.4. Pérdida de función de los genes BRCA1/BRCA2.

Las proteínas BRCA1 y BRCA2 actúan en las vías de reparación del ADN y su inactivación

debido a la presencia de una mutación en uno de ambos genes, provoca inestabilidad

genética, de modo que confieren una mayor predisposición de desarrollar cáncer de

mama así como un riesgo de desarrollar otros tipos de cáncer (Cavanagh H y cols., 2015),

debido a que se origina indirectamente la aparición de un tumor por acumulación de

mutaciones en otros genes reguladores directos del ciclo celular, ya que no han podido

ser reparados (Kinzler KW y cols.,1997).

De acuerdo con la Teoría de la doble mutación de AG Knudson (1971) en los genes

BRCA1 y BRCA2, la alteración de la segunda copia del gen en la célula somática, se

produce mayoritariamente por perdida alélica por deleción de un fragmento del

cromosoma que contiene la copia normal del gen (pérdida de heterocigosidad). Es

necesario que se dé la pérdida del segundo alelo (alelo sano) para que se desencadene

el proceso neoplásico, ya que aún con una sola copia funcional del gen se sigue

produciendo el funcionamiento normal del ciclo celular (Narod S y cols., 2004).

También se han descrito centenares de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 que

suelen consistir en pequeñas inserciones o deleciones que provocan un cambio en la

pauta de lectura, provocando la aparición de un codón de parada prematuro, cuya

consecuencia es el truncamiento de la proteína y por lo tanto la pérdida de función; en

otras ocasiones se puede ver alterado el proceso de eliminación de intrones

generándose un transcrito anómalo, o mutaciones no sinónimas, que son aquellas en

las que se produce un cambio de un nucleótido que provoca un cambio aminoacídico en

la proteína (Narod SA y cols., 2011).

Otro mecanismo de pérdida de función detectado en los genes BRCA1 y BRCA2 es

mediante una hipermetilación que silencia el gen. La hipermetilación es un proceso

43

mediante el cual se produce la metilación de islas CpG que encontramos en las regiones

promotoras, tanto del BRCA1 (Smith TM y cols., 1996) como del BRCA2 (Davis PL y cols.,

1999). Al producirse dicha metilación, se impide la transcripción del gen, ya sea porque

la proteína necesaria para la transcripción ya no es capaz de unirse al promotor o porque

proteínas represoras que presentan afinidad por las zonas metiladas se unen al

promotor inhibiendo la transcripción (Chan KY y cols., 2002).

Aunque en general existe una gran heterogeneidad alélica, algunas mutaciones se

presentan repetidamente en familias no emparentadas. Ciertas poblaciones presentan

unas pocas mutaciones con una frecuencia inusualmente alta. Se trata de mutaciones

“fundadoras”. Aparecen en individuos de una población pequeña y tras generaciones

sucesivas con un cierto grado de endogamia, aumenta su presencia en la población,

pasando a ser una alteración altamente recurrente o, incluso, característica. La

mutación 185delAG es la más frecuente en el gen BRCA1. Aparece en pacientes de etnia

judía en general, aunque con mayor prevalencia en la Ashkenazi, y todos los portadores

comparten un haplotipo común (Satagopan JM y cols., 2001). En la actualidad, es una

de las mutaciones recurrentes en población española, debido a la presencia histórica de

judíos en la península Ibérica. Otras mutaciones frecuentes son: en BRCA1, la 243delA

(localizada en Cataluña) y la 330A>G (de origen gallego); y en BRCA2, las 3036del4

(común en Europa), 6857delAA (origen catalán) y 9254del5 (presente en Cataluña y

Levante), (Diez O y cols., 2003).

1.3.5. Penetrancia de las mutaciones en genes BRCA1/BRCA2.

La penetrancia de ambos genes no es completa. Junto con la mutación se hereda la

susceptibilidad y una alta probabilidad de riesgo, aunque no es del 100%. La penetrancia

varía según la población estudiada y es generalmente más alta en familias con múltiples

casos comparada con series de pacientes no seleccionados. Esta variación es debida a la

heterogeneidad alélica (distintas mutaciones pueden causar distintos riesgos de cáncer),

así como a factores modificadores, genéticos y ambientales (Chen S y Parmigiani G, 2007).

44

En los estudios iniciales, el riesgo de padecer cáncer de mama superaba el 80% para

ambos genes a los 70 años de edad. Sin embargo, estos estudios sobreestimaban los

valores al estar basados en familias de muy alto riesgo, con numerosos casos de cáncer.

En diversos estudios más recientes con pacientes no seleccionados según su historia

familiar, los riesgos acumulados estimados fueron menores. El riesgo de cáncer de

mama a los 70 años fue de un 65% para BRCA1 y de un 45-80% para BRCA2.

Adicionalmente, las mujeres con cáncer de mama y mutaciones en BRCA1 o BRCA2

tienen un riesgo del 40% de desarrollar un segundo cáncer de mama a lo largo de su vida

y hasta 10 veces más riesgo de desarrollar un cáncer de ovario, comparadas con mujeres

no portadoras de mutación(Chen S y Parmigiani G, 2007).

La presencia de mutaciones en el gen BRCA2 se asocia con un aumento del riesgo de

cáncer de mama masculino (5-10% para BRCA2 a lo largo de la vida). Además, aumentan

su riesgo de cáncer de próstata (16% a los 70 años) y los portadores menores de 65 años

tienen hasta 7 veces más riesgo de padecer cáncer de próstata que los no portadores.

El riesgo en portadores de mutación en BRCA1 es menor que para BRCA2, pero dobla el

de la población general. Por lo tanto, una proporción de hombres con cáncer de próstata

precoz presenta mutaciones y debe investigarse su historia familiar por la posible

repercusión en las mujeres de la familia. Por último, ambos genes incrementan

ligeramente el riesgo de cáncer de colon, páncreas y otras neoplasias en dichas familias

(Cavanagh H y cols., 2015).

Los riesgos citados se han estimado sólo en familias de alto riesgo o en poblaciones

concretas, como la judía Ashkenazi. El cálculo de los riesgos asociados es de extrema

importancia para basar las decisiones clínicas posteriores. Debería realizarse en cada

población específica, para considerar el bagaje genético y los factores ambientales

propios (Antoniou A y cols., 2003; Morgan D y cols., 2009).

Es importante tener en cuenta que la penetrancia varía según la población estudiada

debido a otros factores diversos que no están relacionados con la genética. Por ejemplo,

el uso de anticonceptivos orales, la ooferectomía y la paridad, tienen influencia en el

riesgo de desarrollar cáncer de ovario (Petrucelli N y cols., 2005; Morgan D y cols., 2009).

Además a medida que las mujeres portadoras conocen su estatus genético, la

45

prevalencia del cáncer hereditario irá disminuyendo si se toman medidas preventivas

como la mastectomía y la ooforectomia profiláctias (Metcalfe KA y cols., 2008; Calderón

Del Valle SA y Gallón-Villegas LJ 2012).

Existen diversos modelos que se utilizan para la estimación del riesgo genético de

desarrollar cáncer de mama atendiendo a distintos factores:

Modelo de Couch: para el cálculo del riesgo se basa en la edad media de cáncer de

mama en la familia de la portadora. Otros factores que introduce son la historia familiar

de cáncer de mama o de cáncer de mama/ovario. El problema de éste modelo es que se

realizó con un número relativamente pequeño de familias (Couch FJ y cols., 1997).

Modelo de Frank: este modelo permite estimar la probabilidad de que una mujer con

cáncer de mama diagnosticado antes de los 50 años sea portadora de una mutación en

BRCA1 o BRCA2, basándose exclusivamente en la historia familiar (Frank TS y cols.,

1998).

Modelo BRCAPRO: utiliza un método matemático probabilístico basada en la herencia

mendeliana y aplica las bases del teorema de Bayes. Estima la probabilidad de ser

portador de una mutación en BRCA1 o BRCA2 según la historia familiar. La limitación es

que la muestra seleccionada se compone de mujeres con una importante historia

familiar de cáncer de mama y ovario, por lo tanto predice correctamente el riesgo

cuando se trate de familias con alto riesgo de presentar mutaciones BRCA (Berry DA y

cols., 2002; Euhus DM y cols., 2002).

Modelo de la Hoya: estima la probabilidad de presentar mutación en BRCA1 o BRCA2

mediante el desarrollo de una regresión logística. Tiene en cuenta el número de casos

de cáncer de ovario, la existencia de cáncer de mama y ovario en una misma persona, el

cáncer de mama bilateral, cáncer de mama en varones y la edad media de diagnóstico

de cáncer de mama (De la Hoya M y cols., 2002).

Ningún modelo matemático ha sido convenientemente validado, de modo que muchos

especialistas en cáncer familiar, optan por definir criterios de riesgo para la

recomendación del análisis genético.

46

1.4. TÉCNICAS MOLECULARES DIAGNÓSTICAS

El enorme tamaño de los genes BRCA1 y BRCA2, y la variedad en la localización y

tipología de las mutaciones hace que su análisis sea laborioso y complejo mediante la

secuenciación enzimática de Sanger (Sanger F y cols., 1974), pero ahora con la nueva

tecnología de NGS ha aumentado la eficiencia, y disminuido el tiempo de respuesta y el

coste económico de la secuenciación. Debido a la gran heterogeneidad de alteraciones

posibles las técnicas empleadas deben ser diversas y de gran capacidad de detección, y

realizarse tras una precisa selección de los pacientes a los que se les va a realizar el

estudio genético (Strom CM y cols., 2015).

1.4.1. Estudios genéticos.

Secuenciación Masiva (Next Generation Sequencing, NGS)

El enfoque de secuenciación paralela masiva o de próxima generación (NGS) para el

análisis de ADN representa un número potencial de ventajas sobre los métodos

tradicionales, incluyendo la habilidad de secuenciación completa de grandes números

de genes (cientos a miles) en una sola prueba. Además, las NGS pueden detectar,

simultáneamente, supresiones, inserciones, copiar alteraciones numéricas,

translocaciones y sustituciones de bases. La secuenciación NGS está cambiando el

diagnóstico genético debido a su enorme capacidad y favorable relación coste-

efectividad (Storm CM y cols., 2015). Este ensayo se basa en el uso de dos tecnologías

claves:

- Amplificación por PCR múltiples

- MPS (Secuenciación Masiva en Paralelo)

La secuenciación masiva es una técnica que se basa en fragmentar el genoma en

millones de partes de pequeño tamaño, capturar los fragmentos pertenecientes a los

exones de los genes o los genes incluyendo exones e intrones, secuenciar esos miles de

fragmentos y, posteriormente, ensamblarlos de tal forma que se pueda leer de forma

ordenada el genoma o exoma. De esta manera, se puede examinar si existen o no

47

mutaciones, pequeñas delecciones, inserciones o grandes reestructuraciones que

expliquen la susceptibilidad familiar al cáncer. Los programas de análisis bioinformático

procesan la información generada y permite la detección y evaluación tanto de variantes

descritas, como el descubrimiento de nuevas variantes en los genes BRCA1/BRCA2, de

una forma rápida y eficaz (Feliubadaló L y cols., 2013; D’Argenio V y cols., 2015;).

Secuenciación mediante el método de Sanger

El método de secuenciación por dideoxinucleótidos (ddNTP), mejor conocido como el

método Sanger se basa en el proceso biológico de la replicación del ADN. El método de

secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo de dideoxinucleótidos que

carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos

nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede

continuar elongándose. La ADN-polimerasa necesita de este grupo para añadir el

siguiente nucleótido por lo que el polímero naciente se termina. Además cada ddNTP

correspondiente a cada base, va marcado con un fluorocromo distinto, de modo que va

a permitir determinar la secuencia separando por tamaños los distintos fragmentos

amplificados y detectar un pico de fluorescencia correspondiente a cada base (Sanger F

y cols., 1975). Mediante esta técnica se aborda el estudio de mutaciones puntuales, y

pequeñas deleciones o inserciones en los genes BRCA1/BRCA2.

Técnica MLPA

La técnica de MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) se basa en una

detección simultanea del número de copias de una secuencia diana mediante la

hibridación genómica del ADN con una mezcla de sondas específicas (Schouten JP y cols.,

2002). Cada sonda está constituida por un oligonucleótido sintético y un fragmento

derivado del bacteriófago M13. Cada uno de estos segmentos presenta una secuencia

de hibridación que es complementaria a la secuencia diana y una secuencia de unión a

cebadores que son común para todas las sondas. El fragmento derivado del

bacteriófago, presenta además una secuencia de relleno que varía de tamaño para cada

sonda, de modo que nos permitirá diferenciar los productos amplificados por tamaño.

Cuando ambas partes de la sonda hibridan de forma específica sobre el ADN problema,

se produce la ligación de ambos fragmentos de la sonda y la posterior amplificación de

48

la secuencia. Las sondas que no hayan hibridado o no se hayan ligado, no serán

amplificadas. La cantidad relativa de producto amplificado se corresponde con el

número de copias de la secuencia diana. Los productos amplificados son identificados y

cuantificados mediante electroforesis capilar (Madrigal S, 2008).

La técnica de MLPA se aplica en el estudio genético de BRCA1 y BRCA2 para el estudio

de pérdida de dosis génica. Permite la detección de grandes deleciones que mediante la

secuenciación convencional de Sanger no se pueden detectar.

Figura 6.- Representación esquemática de la técnica de MLPA (Multiplex Ligation-

Dependent Probe Amplification).

Resultados de la prueba molecular

En este tipo de pruebas moleculares se pueden tener tres posibles resultados:

- Resultado negativo: Es cuando no hay mutación detectable en el gen; puede

ser erróneo ya que una mutación indetectable puede estar presente en el

individuo o la familia. Se debe tener información acerca de la sensibilidad de

las pruebas de laboratorio utilizadas para tener en cuenta un posible

resultado falso negativo.

- Resultado indeterminado: a) cuando el significado clínico de un resultado

molecular no puede ser interpretado: esto sucede cuando un miembro de la

familia no está disponible para la prueba molecular, en este caso el gen

mutante original de la familia no es identificado. Es importante que el familiar

que solicite la prueba entienda que aun cuando la prueba sea negativa, el

49

resultado debe ser considerado indeterminado y los miembros de la familia

tendrán que seguir tratándose como individuos de alto riesgo; b) cuando se

detecta una variante genética de significado incierto: el resultado deberá

considerarse indeterminado. El laboratorio es incapaz de interpretar si este

resultado se considera como variante normal o no.

- Resultado positivo: Indica la presencia de una mutación patogénica y, por lo

tanto, el individuo estará en riesgo incrementado de desarrollar cáncer. Este

riesgo puede variar de familia en familia debido a otros genes modificadores,

estilo de vida o la presencia de otros factores de riesgo epidemiológico

(Ochoa-Carrillo FJ y cols., 2006).

1.4.2. Importancia clínica del estudio genético.

El diagnóstico molecular identifica individuos, tanto sanos como ya afectados, que

pueden beneficiarse de opciones médicas específicas para su alto riesgo heredado y que

suelen consistir en supervisión y detección precoz, cirugía profiláctica o quimioprofilaxis

(Metcalfe KA y cols, 2008).

- Detección precoz. Incluye la autopalpación de las mamas a partir de los 18

años de edad y el inicio de mamografías anuales, así como ecografías

transvaginales y determinación del marcador tumoral CA-125 cada 6 o 12

meses, para la detección precoz del cáncer de mama y del cáncer de ovario,

respectivamente. Estas prácticas deberían iniciarse a los 25 años de edad o

al menos 10 años antes del diagnóstico del primer caso de cáncer de mama

en la familia (ACOG, 2009; Pinto AE y cols., 2013). Estas recomendaciones se

basan en opiniones de expertos, aunque los datos preliminares obtenidos en

portadoras de BRCA1 apoyan estas medidas. Existen trabajos que indican la

necesidad de incorporar la resonancia magnética para aumentar la

sensibilidad respecto a la mamografía en portadoras de una mutación

(Metcalfe KA y cols, 2008).

- Cirugía profiláctica. La mastectomía profiláctica bilateral reduce el riesgo de

aparición de cáncer de mama en un 90%, aunque no desaparece totalmente

50

la posibilidad de malignización de tejido residual (Calderon del Valle SA y

cols., 2012). Debe considerarse en mujeres cuyas mamografías son de difícil

interpretación (mamas fibroquísticas o mamas muy densas en mujeres

jóvenes), con lesiones premalignas de alto riesgo o en aquellas cuyas

parientes de primer grado han sufrido cáncer de mama o cáncer de ovario

con rápidos desarrollos, no detectados a pesar de un seguimiento regular.

Obviamente, tiene efectos considerables de tipo físico y psicológico (Rojas-

May G, 2006; Metcalfe KA y cols, 2008).

La salpingo-ooforectomía bilateral reduce el riesgo de cáncer de ovario, para

el que no existe una forma eficaz de detección precoz, en más del 90%,

aunque se han documentado casos de carcinomatosis peritoneal después de

la ooforectomía. Si se realiza antes de la menopausia (especialmente antes

de los 40 años de edad), reduce también el riesgo de cáncer de mama a la

mitad (Metcalfe KA y cols., 2014). Es una de las opciones más recomendadas

para mujeres con riesgo, especialmente cuando han cumplido sus

expectativas de maternidad. El uso posterior de terapia hormonal sustitutiva

no parece alterar la reducción del riesgo (Calderon del Valle SA y cols., 2012;

Morales-Chamorro R y cols., 2015).

- Quimioprevención. Es un área controvertida en general y, especialmente, en

el cáncer de mama hereditario. El uso del tamoxifeno administrado durante

5 años parece ser efectivo en la reducción del riesgo (cerca del 40%) en

mujeres con antecedentes familiares o personales, como una biopsia con

cambios premalignos (Poveda M y cols., 2003). Sin embargo, existen dudas

acerca de cuál es el grado de riesgo que requiere el uso de este fármaco y a

qué edad debe comenzarse su administración. Teniendo en cuenta que los

tumores de portadoras de mutación en BRCA1 son RE- (receptores de

estrógenos negativos) en la mayoría de los casos, mientras que los de BRCA2

suelen ser tumores RE+ (receptores de estrógenos positivos), existen dudas

acerca de la utilidad del tamoxifeno en portadoras de BRCA1.

Adicionalmente, el tratamiento con tamoxifeno reduce hasta la mitad el

riesgo de cáncer de mama contralateral en portadoras de mutación

(Calderon del Valle SA y cols., 2012).

51

En la actualidad se están llevando a cabo diversos estudios de prevención con

éste y otros fármacos (otros moduladores de los receptores de estrógenos,

inhibidores de aromatasas, etc.), en mujeres a riesgo portadoras o no de

mutaciones para obtener datos más concluyentes (Morales-Chamorro R y

cols., 2015).

- Terapia hormonal. Se ha evidenciado un ligero incremento del riesgo de

cáncer de mama por el uso de contraceptivos orales en general,

independientemente del riesgo familiar. Otros estudios muestran este

aumento en mujeres con mutaciones en BRCA1, especialmente en las

tratadas hace décadas, con dosis de estrógenos orales superiores a las

actuales (Eisen A y cols., 2008). No parece haber un riesgo mayor relacionado

con BRCA2, pero el número estudiado de mujeres hasta ahora es menor. Por

el momento, aunque parece haber un ligero aumento de riesgo y las mujeres

deben ser informadas al respecto, no se contraindica su uso (Rodríguez S y

cols., 2006).

El uso de contraceptivos orales durante 6 o más años se ha asociado con una

reducción de cerca del 60 % en el riesgo de cáncer de ovario en mujeres

portadoras de mutaciones en BRCA1 o BRCA2 (Metcalfe KA y cols, 2008).

Actualmente también se recomienda la realización de RM en el esquema de

seguimiento debido a que en estudios prospectivos se ha demostrado

consistentemente que la sensibilidad de esta técnica es mayor que la de

cualquier otra modalidad. De modo que se ha demostrado que la RM

combinada con la mamografía y el examen clínico tienen una mayor

sensibilidad para detectar cáncer de mama en pacientes de alto riesgo

(Warner E y cols., 2004).

- Nuevas Terapias (Olaparib). Se están utilizando el fármaco Olaparib para

pacientes portadores de mutación en BRCA y con cáncer de mama y/o ovario,

así como otros tipos de cáncer cuya asociación con mutaciones germinales

en BRCA se ha visto relacionada (Kaufman B y cols., 2015). El olaparib es un

inhibidor oral de la poli ADP ribosa polimerasa (PARP). La función de PARP es

la reparación del daño celular. Uno de los mecanismos alternativos a las PARP

consiste en la intervención de dos proteínas, BRCA1 y BRCA2. Cuando uno de

52

estos genes tiene una mutación, el daño al ADN no puede repararse

adecuadamente y, como resultado, las células tienen más probabilidad de

presentar alteraciones genéticas adicionales que pueden conducir al cáncer.

El olaparib actúa selectivamente sobre líneas celulares con BRCA mutante o

con baja expresión BRCA, especialmente con respecto al BRCA2, ya que al

tener dicho gen mutado y sin posibilidad de reparar el daño en el ADN, la vía

alternativa que utiliza la célula para la reparación sería la PARP y como el

fármaco inhibirá dicha vía, la célula entrará en apoptosis. Por ello, se espera

que el fármaco tenga efectos mínimos sobre las células normales (sin

mutaciones o heterocigóticas para BRCA1 o BRCA2), (Lowery MA y cols., 2011;

Kaufman B y cols., 2015).

1.4.3. Asesoramiento genético y aspectos psicológicos y éticos.

Debido a la complejidad clínica del síndrome, al requerimiento de considerable

información de antecedentes familiares y personales, y a la laboriosidad y complejidad

del análisis molecular, estos estudios se realizan en centros que dispongan de un equipo

profesional multidisciplinar.

El proceso de asesoramiento comprende una sesión informativa sobre los riesgos de

cáncer propios y de transmisión a los hijos, la posibilidad del análisis genético y la

variedad de resultados posibles, las opciones y limitaciones clínicas y terapéuticas

posteriores al análisis, etc. Debe ofrecerse también información acerca de las

limitaciones y contratiempos que acompañan al proceso y respetarse el derecho a

rechazarlo. Solamente con el previo consentimiento se procede al análisis genético. En

ausencia de un beneficio anticipado para niños o adolescentes, se recomienda posponer

el análisis hasta que el individuo pueda tomar sus propias decisiones en la edad adulta.

Una vez conocido el resultado, se discuten las pautas clínicas de actuación y las

repercusiones familiares (ASCO, 2003). En caso de existir una mutación, es el propio

probando quien debe comunicarlo a sus parientes. Toda la información debe tratarse

de forma confidencial y privada. Deben discutirse las dudas acerca del riesgo de

discriminación social o laboral, así como de alteraciones psicológicas. Aunque,

generalmente, se observa una disminución de la ansiedad una vez conocido el resultado

53

del análisis, cualquiera que sea éste, debe existir la capacidad de proporcionar ayuda

psicológica (Ochoa-Carrillo FJ y cols.; 2006; Rojas-May G, 2006).

2. JUSTIFICACIÓN

Alrededor de un 5-10% de los casos de cáncer de mama se atribuyen a genes de

predisposición de alto riesgo y herencia autosómica dominante, y poco menos de la

mitad de ellos son debidos a mutaciones en los genes BRCA1/BRCA2 (Belman J y cols.,

2011). Sólo una minoría de casos se deben a mutaciones presentes en genes de riesgo

intermedio o moderado como TP53 (síndrome de Li-Fraumeni), PTEN (síndrome de

Cowden), ATM (ataxia telangectasia), etc… (Tung N y cols., 2015; Nik-Zainal S y cols., 2016).

Generalmente estos cánceres de mama se reconocen por aparecer a edades muy

tempranas y/o estar asociados a fuerte agregación familiar.

Aunque las mutaciones en los genes BRCA1/BRCA2 son raras en la población general

(0,2%), responden de casi la mitad de los casos de cáncer de mama y ovario hereditarios.

Su importancia radica en su elevada penetrancia: las mutaciones de BRCA1 predicen un

riesgo acumulado a los 75 años de un 65% (51-75%), y un riesgo de un cáncer de ovario

de un 39% (22-51%); el riesgo asociado a BRCA2 es de un 45% (33-54%) para el cáncer

de mama y de un 11% (4-18%) para el cáncer de ovario (Calderón del Valle SA y cols.,

2012). No obstante en familias con múltiples casos de cáncer de mama y ovario estos

riesgos son aún mayores.

La justificación de la detección de pacientes portadores de mutaciones en los genes

BRCA1/BRCA2 es la realización de un seguimiento para detectar precozmente la

aparición de tumores. Las recomendaciones de este seguimiento incluyen:

- Autoexploración mamaria mensual postmenstrual (18 a 25 años).

- Exploración clínica mamaria realizada por un médico experto desde los 25-35

años con periodicidad de 6-12 meses.

- Mamografía/ecografía anual a partir de los 25-35 años.

- Exploración ginecológica con ecografía transvaginal y determinación sérica de

CA125, con una periodicidad semestral o anual a partir de los 25-35 años.

54

- En varones con mutaciones en BRCA2 (riesgo de cáncer de mama 6%); sólo se

recomienda advertir al paciente y a su médico un alto índice de sospecha ante

cualquier síntoma. Se aconseja una exploración prostática anual (mediante tacto

rectal) y determinación serológica del PSA a partir de los 40-50 años.

3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

3.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO

Las mutaciones encontradas en los genes BRCA1 y BRCA2 están implicadas en la

aparición del cáncer de mama hereditario. Además la prevalencia alélica de dichos genes

está condicionada por el sustrato étnico de la población local.

3.2. OBJETIVOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS:

OBJETIVO PRIMARIO

Identificar mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 en pacientes con cáncer de mama

que cumplan criterios de riesgo hereditario y conocer la prevalencia de dichas

mutaciones en el Departamento de Salud de la Ribera de la Comunidad Valenciana.

OBJETIVOS SECUNDARIOS

- Caracterizar el tipo de paciente que acude a la Unidad de Riesgo Familiar del

Departamento de Salud de la Ribera.

- Determinar qué mutaciones de los genes BRCA1 y BRCA2 están presentes en nuestra

población de riesgo de cáncer de mama y de ovario.

- Conocer la distribución alélica en los genes BRCA1 y BRCA2 en la población de riesgo

del Departamento de salud de la Ribera de la Comunidad Valenciana.

- Detectar familias portadoras de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 del

Departamento de Salud de la Ribera.

55

4. MATERIAL Y MÉTODOS

4.1. ÁMBITO DE ESTUDIO

El estudio se ha realizado en el Área de Diagnóstico Biológico del Hospital Universitario

La Ribera (Alcira). Este hospital pertenece al Departamento de Salud La Ribera de la

Comunidad Valenciana y atiende a una población de 220.676 habitantes, según censo

de 2016 del banco de datos municipales ARGOS de la Generalitat Valenciana

(http://www.argos.gva.es/bdmun/pls/argos_mun/DMEDB_COMADATOSINDICADORES

.DibujaPagina?aNComaId=20&aNIndicador=2&aVLengua=c) repartidos en 36

municipios.

4.2. DISEÑO DEL ESTUDIO

Estudio observacional descriptivo.

4.3. PERIODO DE ESTUDIO

Desde el 1 Enero de 2011 hasta el 14 de Junio de 2016.

4.4. SELECCIÓN DE PACIENTES

Los criterios de selección para indicar el estudio de los genes BRCA1 y BRCA2 pueden

diferir en función de la guía clínica aunque suelen ser bastante similares, y la mayoría de

ellas comparten unas tasas de detección de mutaciones, que suelen ser de al menos el

10%. Estos criterios se revisan y modifican periódicamente en función de la evidencia y

conocimientos científicos que se vayan adquiriendo (Morales-Chamorro R y cols., 2015). En

la Comunidad Valenciana los criterios de selección han sido recogidos en la Oncoguía

(2012) y se recomienda el estudio genético en aquellas mujeres en las que se sospeche

un Cáncer de Mama y Ovario Hereditario. Los criterios clínicos de sospecha que se han

empleado consisten en:

56

Familias con un único caso de cáncer de mama

o Cáncer de mama diagnosticado antes de los 30 años, o

o Cáncer de mama primario bilateral antes de los 40 años, o

o Un cáncer de mama y un cáncer de ovario en la misma paciente.

Familias con dos casos en familiares de primer grado

o Dos cánceres de mama diagnosticados, al menos uno antes de los 50

años, bilateral, o

o Dos o más casos de cáncer de ovario (independientemente de la edad),o

o Un cáncer de mama y un cáncer de ovario en dos familiares

(independientemente de la edad), o

o Un cáncer de mama/ovario en una mujer y un cáncer de mama en un

varón (independientemente de la edad)

Familias con tres o más casos afectados por cáncer de mama:

o al menos dos en familiares de primer grado (madres, hijas o hermanas).

4.5. TAMAÑO MUESTRAL

Se ha realizado un estudio de las mutaciones de los genes BRCA1 y BRCA2 a un total de

300 pacientes, de los cuales se observa que un 7.33% (22/300) corresponde a varones y

el otro 92.67% (278/300) corresponde a mujeres. Mayoritariamente son de origen

caucásico y han sido remitidas desde el servicio de Ginecología y Oncología.

La media de edad de las mujeres estudiadas es de 41.63 ± 21.21 años con un rango de 20 a

77 años y en el caso de los varones de 52 ± 16.06 años con un rango desde 28 a 75 años.

4.6. ANÁLISIS GENÉTICO

4.6.1. Método de extracción de ADN a partir de sangre periférica.

El ADN genómico de cada paciente incluido en nuestro estudio se obtiene a partir de

muestras de sangre periférica anticoagulada con EDTA utilizando procedimientos

automatizados de extracción de ácidos nucleicos. Se utiliza un equipo Maxwell™

57

(Promega Corporations, USA) con protocolos específicos para los distintos tipos de

muestra y de ácidos nucleicos. El empleado en este estudio ha sido el protocolo para

extracción de ADN a partir de muestras de sangre periférica (Maxwell 16 LEV Blood DNA®

kit), en tandas de 16 muestras.

1.- Se prepara 1 eppendorf de 1.5ml por cada una de las muestras a extraer donde se

mezcla: 30μl de “proteinasa K” + 300 μl de “Lysis Buffer” + 300 μl de sangre bien

homogenizada por inversión del tubo de hemograma. Se homogeniza la mezcla

mediante vórtex y se da un spin para que todo el contenido del tubo quede abajo. Se

incuba la muestra durante 20 minutos a 56˚C.

2.- Se prepara el equipo para realizar la extracción de ADN a partir de sangre periférica

según indicaciones del fabricante. Se saca la bandeja donde se colocan los reactivos

necesarios que proporciona el kit para la extracción de ADN. Se coloca el rack con los

reactivos necesarios y un eppendorf de 1ml en la posición correspondiente donde se

añaden 120 μl de “Elution buffer”. También se inserta una punta en la posición proximal

del rack.

3.- Una vez finalizada la incubación a 56˚C, todo el volumen de muestra hemolizada se

introduce en la última posición del rack y se homogeniza bien con la pipeta.

4.- Se introduce la bandeja en el equipo donde inicia la extracción que dura 40 minutos.

5.- Se prepara un tubo de rosca y un eppendorf bien rotulados con número de petición,

fecha y prueba. En el tubo de rosca se guarda sangre periférica del paciente sin extraer

mientras que en el eppendorf se va a guardar la extracción de ADN a partir de la sangre

que se ha realizado.

6.- Cuando el equipo ha finalizado la extracción, avisa mediante una señal acústica, de

modo que se saca la bandeja, se desechan los racks y se recoge el eppendorf con la

extracción. Se da un spin para que las partículas de suciedad que puedan quedar en la

muestra precipiten al fondo y se recupera el sobrenadante donde se encuentra el ADN.

58

4.6.2. Medición de concentración de material genético.

Una vez extraído el ADN, se debe medir la concentración obtenida y su grado de pureza.

Se emplea un espectrofotómetro NANODROPTM (Thermo Scientific, EEUU), que necesita

muy poca cantidad de muestra para conocer la concentración de la misma. Éste trabaja

con un software específico, Nanodrop®.

Los pasos a realizar son los siguientes:

1- Quitar esponja que protege al espectrofotómetro.

2- Encender programa.

3- Calibrar máquina con buffer AE (1μl)

4- Realizar un blanco con el buffer y debe repetirse hasta que de un valor 0.

5- Limpiar cada vez que cambiemos muestra.

6- Poner 1μl muestra.

7- Anotar nº de muestra en ID.

8- Medir con F1, Realizando dos mediciones.

9- Anotar ng/μl en el tubo eppendorf.

Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos nucleicos

absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico presenta un

máximo a λ ≈ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción en particular depende de la

secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración a

partir del valor de A260. Así, una unidad de absorbancia a 260nm corresponde

aproximadamente a una concentración de 50 μg/ml de ADN doble hebra, 33 μg/ml de

fragmentos cortos de ADN monohebra (oligodesoxinucleótidos). En las preparaciones

de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los

aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva

a sobrestimaciones de la concentración. Dado que el máximo de absorbancia de las

proteínas se encuentra en λ ≈ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de

origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra

hará que el cociente A260/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros.

Para el ADN doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8. La

59

estimación de la pureza de la muestra de ADN y de su contaminación por impurezas es

necesaria para conocer si es apta para el estudio genético por PCR.

4.6.3. Estudio de los genes BRCA1 y BRCA2 por NGS (Next Generation

Secuencing).

Estudios recientes ponen de manifiesto la mayor eficacia de la técnica NGS (Next

Generation Secuencing) para el manejo clínico de las mujeres afectadas por cáncer de

mama, para la prevención y, sobre todo, para la identificación de familiares sanos de

alto riesgo. La técnica de NGS es más sensible, más rápida, más fácil de usar y menos

costosa que el método convencional de Sanger y en consecuencia es un método seguro

para la detección molecular rutinaria de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2

(D’Argenio V y cols., 2015; Strom CM y cols., 2015)

Mediante la técnica NGS se puede realizar el estudio completo de los genes BRCA1 y

BRCA2, ya que se trata una técnica de secuenciación masiva. Se ha utilizado el ensayo

BRCA MASTR Dx® de Multiplicom™, que está diseñado para amplificar por PCR todas las

regiones codificantes de los genes BRCA1 y BRCA2, mediante la utilización de cinco

mezclas de cebadores multiplexados. Se requiere una cantidad de ácidos nucleicos para

llevar a cabo la realización de dicha técnica de 20-50 ng de ADN genómico extraído a

partir de una muestra de sangre periférica de los pacientes. A los amplicones resultantes

de las PCRs iniciales se les agrega el adaptador para su identificación, utilizando el kit

Illumina MiSeq™, y secuenciando mediante el uso del instrumento MiSeq™ de acuerdo

con el fabricante.

El primer paso consiste en amplificar todas las regiones codificantes de los genes BRCA1

y BRCA2 como se ha dicho anteriormente y son amplificadas mediantes cinco PCR

multiplex separadas. Se utiliza una polimerasa de inicio en caliente y se preparan cinco

reacciones, cada una con un Plex Mix distinto, que presenta distintas parejas de

cebadores, y la polimerasa, obteniéndose así las cinco PCR multiplex para cada paciente.

60

Figura 7.- Representación esquemática de cómo se ubicarían los cebadores al hibridar

en la cadena de ADN para la realización de la PCR multiplex y la incorporación de los tags

en la copia de los fragmentos de interés para la posterior PCR universal.

Cada cebador viene marcado con unas tag que van a ser importantes para la realización

de las PCR universales para poder incorporar los identificadores a cada uno de los

pacientes.

Para 8 reacciones se mezclan 80 μl de mezcla PCR Plex + 0.6μl de Taq ADN Polimerasa

como indica el protocolo de la casa comercial. Se repartirán 10μl del mix

correspondiente a cada Plex para cada uno de los pacientes, al que se le añade 5μl de

ADN del paciente correspondiente para llevar a cabo la PCR, cuyo protocolo es:

Programa de PCR:

DESNATURALIZACIÓN 98° 10’

DESNATURALIZACIÓN 95° 45’’

ALINEAMIENTO 60° 45’’ 20ciclos

EXTENSIÓN 68° 2’

EXTENSIÓN FINAL 72° 10’

FINAL DE LA REACCIÓN 4° 1h Max.

61

Una vez realizada la primera PCR multiplex, se realiza un control de calidad con gel de

agarosa al 2%, para comprobar la presencia de amplicones. Si la amplificación ha sido

exitosa se detectará una banda claramente visible pero dispersa entre los 250-500pb.

Una vez comprobado que la PCR multiplex se ha realizado con éxito, las cinco Plex PCRs

para los amplicones derivados de BRCA MASTR Dx®, en primer lugar se van a diluir

1/1000 cada una de las reacciones de PCR multiplex y posteriormente se etiquetan

utilizando el kit MID Dx® para Illumina MiSeq™, mediante el cual se va a incorporar un

identificador molecular MID y los adaptadores p7 y p5, que son necesarios para la

secuenciación en el instrumento MiSeq™. Se va a incorporar en la reacción de PCR

universal una combinación adaptador p7 y p5 exclusivo para cada uno de los pacientes

para poder lograr la identificación y diferenciación entre cada uno de ellos, esencial para

la óptima realización y diferenciación de los pacientes al secuenciar toda la colección de

amplicones juntas.

Figura 8.- Representación esquemático de cómo se unirían los adaptadores para cada

uno de los pacientes en la amplificación de los productos de PCR de los plex de la

reacción inicial y como se incorporan junto con las copias de las cadenas de ADN para

una óptima secuenciación final e identificación de cada uno de los pacientes analizados.

El protocolo a seguir para realizar esta segunda PCR es el siguiente:

Universal PCR mix 10μl

Reactivo de Amplificación 10μl

MIP p7 primer 2μl

MID p5 primer 2μl

Taq ADN Polimerasa 0.125μl

62

Se repartirá del mix general 24μl para cada reacción y 1μl del resultado de la dilución

previamente realizada.

Para llevar a cabo la adición de los adaptadores, el programa que debe llevarse a cabo

en el termociclador es el siguiente:

Programa de PCR:





EXTENSIÓN FINAL 72° 10’

FINAL DE LA REACCIÓN 4° 12h Max.

Una vez realizada la PCR universal, se realiza un segundo control de calidad con gel de

agarosa al 2% cargando 5μl de PCR de cada pocillo. En este caso, si la PCR Universal se

ha realizado con éxito, se debe de observar una banda ancha y difusa entre 350-550pb.

Los amplicones etiquetados resultantes de cada PCR, se van a mezclar por cada

individuo aplicando un esquema de mezcla específico para cada ensayo, de modo que

se van a mezclar 8μl de la PCR plex 1; 11μl de la PCR plex 2; 13μl de la PCR plex 3; 8μl de

la PCR plex 4; y 10μl de la PCR plex 5, obteniéndose así una colección de amplicones (CA)

para cada uno de los pacientes y cada colección de amplicones va a contener 93

amplicones diferentes.

A continuación se realiza la purificación de cada una de las CA para eliminar los residuos

de la PCR que hayan podido quedar y no interfieran en la posterior secuenciación de los

fragmentos. La purificación se va a realizar mediante el uso de perlas magnéticas

Agencourt AMPure XP® (Beckman-Coulter™). Estas, mediante utilización del protocolo

63

especificado por el fabricante, van a permitir la eliminación de todos los residuos

presentes en las PCR y la obtención de las CA purificadas.

Finalmente se realiza la combinación de las diferentes CA de cada uno de los pacientes

para obtener un POOL equimolar de cada uno de ellos. Calculando el volumen de cada

CA mediante la fórmula:

Se diluye cada CA hasta obtener una concentración 4nM con tampón TAE 1X hasta un

Vfinal de 100μl. Luego se procede a combinar un volumen equimolar idéntico de cada

una de ellas obteniéndose de este modo el POOL equimolar de las CA de todos los

pacientes.

El POOL equimolar se analiza posteriormente en un equipo Illumina MiSeq™.

4.6.4 Análisis Bioinformático de los datos de NGS.

Los datos obtenidos mediante el equipo MiSeq™ se cargan al programa informático

DNAnexus™, que genera los archivos con la anotación de las posiciones cromosómicas

de las variantes detectadas.

Los archivos que se generan son de mapeado cromosómico, datos estadísticos y las

variantes encontradas en la secuenciación de los genes. Se emplea el archivo de

variantes.txt que se analiza con el programa Excel™ (Microsoft Office) donde están

recogidos todos los datos obtenidos de cada uno de los pacientes. Las variantes

detectadas posteriormente se comprueban si están registradas en las bases de datos

Breast Cancer Information Core (BIC) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de

Estados Unidos, ClinVar del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI)

y la base de datos HGMD® (Human Gene Mutation Database); de modo que se revisa y

comprueba la presencia y descripción de cada una. De todas ellas, se eliminan del

análisis las mutaciones intrónicas que se encuentran a una distancia mayor a 10

nucleótidos del exón tanto upstream como downstream, ya que es poco probable que

afecten el splicing del RNAm y por lo tanto no van a tener repercusión clínica. Del mismo

modo las mutaciones sinónimas tampoco se van a tener en cuenta, ya que no se va a

64

producir cambio aminoacídico en la proteína y por lo tanto ésta no se va a ver afectada

en su estructura y función. Tampoco se debe tener en cuenta aquellas mutaciones que

se repiten sistemáticamente dentro de una tanda de pacientes así como en la mayoría

de pacientes de estudio, ya que son artefactuales y no van a tener implicación

patológica. Se aplica por último un filtro de frecuencia alélica (MAF) considerando como

clínicamente relevantes aquellas que aparecen en la población general con una

frecuencia alélica inferior al 0,02%, considerando el resto polimorfismos. Para las

mutaciones no descritas anteriormente se realiza un análisis mediante software de

simulación como son Polyphen® o Mutation Taster®, que realizan un estudio

comparativo del cambio de aminoácido producido en función de las propiedades de

cada aminoácido, haciendo una estimación de la afección de la proteína frente a dicho

cambio y por tanto la modificación funcional que puede sufrir. Cuando se detecta una

mutación patológica en alguno de los pacientes por NGS se realiza una posterior

confirmación mediante el método directo de Sanger (Sanger F y cols., 1974). Las

variantes con relevancia clínica se nomenclaturan según la normativa de la Human

Genome Variation Society (HGVS). Como secuencias de referencia se emplean para el

gen BRCA1 la secuencia con código NM_007294.3 para la secuencia de nucleótidos y la

secuencia con código NP_009225.1 para la secuencia de aminoácidos. Para el gen BRCA2

las secuencias que se emplean son NM_00005959.3 y NP_000050.2 para la secuencia

de nucleótidos y aminoácidos respectivamente.

4.6.5. Estudio mutacional de los genes BRCA1 y BRCA2.

La metodología aplicada para la confirmación de mutaciones detectadas por NGS es la

secuenciación directa o de Sanger (Sanger F y cols., 1974), consiste en la amplificación

por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los genes BRCA1 y BRCA2 mediante la

utilización de oligonucleótidos cebadores específicos y la posterior secuenciación de los

fragmentos obtenidos. Los cebadores se diseñaron para incluir las regiones intrónicas

adyacentes a los exones, y así detectar posibles mutaciones que afectaran al splicing del

ácido ribonucleico mensajero (ARNm). El exón 11 del gen BRCA1 se amplifica

dividiéndolo en 12 fragmentos debido a su tamaño. En el caso del gen BRCA2, el exón

65

10 se divide en 4 fragmentos, y el exón 11 se divide en 16 fragmentos debido también a

su gran tamaño.

Los oligonucleótidos cebadores empleados en el estudio para la amplificación y

secuenciación de los exones de los genes BRCA1 y BRCA2 se diseñan de manera que las

regiones intrónicas adyacentes queden dentro del amplificado de modo que se puedan

detectar posibles mutaciones que afecten al splicing del ARNm, cuyas secuencias se

muestran en las tablas 1 y 2 del ANEXO I. La amplificación se realiza en un termociclador

GeneAmp® PCR System 2700 (Applied BiosystemsTM). El programa del termociclador y

las proporciones utilizadas de los reactivos han sido:

Mezcla de PCR (Vfinal=20 μl):

H2O 13,4 μl

Tampón 10X 2,0μl

MgCl2 1,0 μl

dNTPs 0,4 μl

Forward 0,4 μl

Reverse 0,4 μl

Polimerasa 0,4 μl

DNA 2,0 μl

Programa de PCR:

DESNATURALIZACIÓN 94⁰C---------5’

CICLOS DE PCR:

DESNATURALIZACIÓN 94⁰C---------30’’

ALINEAMIENTO 43⁰C---------30’’ 45ciclos

EXTENSIÓN 72⁰C---------45’’

EXTENSIÓN FINAL 72⁰C---------30’

66

La presencia de amplicones del tamaño adecuado se comprobó en un equipo de

electroforesis Quiaexcel® (QIAGEN™).

Posteriormente, se utiliza una alícuota de los productos de PCR para la reacción de

secuenciación con el sistema Big Dye Terminator Cycle Sequencing® (Perkin Elmer-

Applied ByosystemsTM). Dicha reacción se realiza en ambas direcciones, directa y reversa

utilizando los mismos cebadores que en la etapa de amplificación (tabla 1 y 2) a una

concentración de 5 μM con el siguiente protocolo:

Mezcla de PCR de secuencia: Vfinal=10 μl

H2O 6,45μl

Tampón 1,75μl

Big Dye 0,5 μl

Primer (F o R) 0,3 μl

Muestra de PCR 1,0 μl

Programa de PCR:





FINAL DE LA REACCIÓN 4° 10’

Los productos de PCR obtenidos en la etapa de secuenciación se purifican en placas

DyEx® (QIAGENTM) siguiendo las instrucciones del fabricante.

El secuenciador ABI-PRISM 3130 XL Genetic AnalyzerTM (PE-Applied BioSystems) se

programa siguiendo las instrucciones del fabricante. Su funcionamiento se basa en la

separación de los fragmentos mediante electroforesis capilar, excitación con luz láser de

los fluorocromos y análisis de los datos con un programa informático que muestra los

67

resultados en un electroferograma cuyos picos representan la posición de cada uno de

los nucleótidos de la secuencia de ADN procesada.

Las secuencias obtenidas se comparan con las secuencias revisadas del gen BRCA1 y

BRCA2 mediante el programa ChromasPRO™, que utiliza la herramienta Basic Local

Alignment Search Tool (BLAST). El programa compara las secuencias de nucleótidos o

proteínas de bases de datos de secuencia y calcula la significación estadística de las

coincidencias.

La presencia de dos nucleótidos en la misma posición (heterocigosis para una mutación

puntual) se pone de manifiesto por la superposición de dos picos en el

“electroferograma”, hecho que se comprueba en ambas direcciones de secuenciación.

La presencia de microinserciones o microdeleciones en un solo alelo provoca la

aparición en el “electroferograma” de picos desfasados de un alelo respecto a otro,

produciéndose un solapamiento de los mismos, dando a modo de una doble secuencia,

lo que se comprueba también en ambas direcciones.

4.6.6. Estudio de dosis génica de los genes BRCA1 y BRCA2.

Mediante la técnica de MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) se

puede determinar la dosis génica de cada gen y detectar grandes reordenamientos y

deleciones. La técnica consiste en una primera fase de hibridación con sondas específicas

para cada uno de los exones de los genes BRCA1 y BRCA2, una segunda fase de ligación

y por último una fase de amplificación por PCR con cebadores comunes. Posteriormente

se realiza un análisis de fragmentos con el equipo de secuenciación automática ABI-

PRISM 3130 XL Genetic AnalyzerTM (PE-Applied BioSystems). El análisis mediante MLPA

se realiza con un kit comercial SALSA MLPA P002BRCA1 Probemix (MRC HollandTM) para

el gen BRCA1, y SALSA MLPA P045BRCA2/CHEK Probemix (MRC HollandTM) para el gen

BRCA2, siguiendo las instrucciones del proveedor:

FASE 1: Desnaturalización del ADN e Hibridación con la sonda MLPA

Se separan 5 μL (20-500ng) del ADN genómico del paciente en tubos eppendorf de

0,2mL previamente rotulados, se centrifugan brevemente y se calientan, para su

desnaturalización, 5 minutos a 98ºC; bajando la temperatura a 25ºC antes de abrir el

68

termociclador. Mientras tanto, se añade, en un tubo eppenforf de 1mL, por cada

reacción: 1,5 μL de SALSA Probemix y 1,5 μL de MLPA buffer y se mezcla por repetido

pipeteo. De esta mezcla, se añaden con mucho cuidado 3 μL, a cada uno de los tubos

que contienen los 5 μL de ADN y se incuban 1 minuto a 95ºC, seguido de 16-18 horas a

60ºC.

FASE 2: Reacción de Ligación

En un tubo eppendorf de 1mL, se prepara la mezcla maestra de Ligasa 65. Por cada

reacción, se mezclan: 25 μL de agua de laboratorio, 3 μL de Ligase-65 buffer A, 3 μL de

Ligase-65 buffer B y después se añade 1 μL de Ligase-65. A continuación, se reduce la

temperatura del termociclador a 54ºC y se agregan 32 μL de la mezcla maestra de Ligasa

65 a cada tubo de 0,2mL que contiene 8 μL de ADN hibridado con las sondas. Una vez

añadida esta mezcla a todos los tubos, se deja 15 minutos más a 54ºC, seguido de 5

minutos a 98ºC, para inactivar la ligasa, y se baja la temperatura a 4ºC, para conservar

las muestras. Los productos de ligación se almacenaron en nevera a 4ºC, evitando la

exposición a la luz, un máximo de una semana.

FASE 3: Reacción de PCR

En un tubo eppendorf de 1mL se prepara, en hielo, la mezcla maestra de Polimerasa.

Por cada reacción, se mezclan: 5,5 μL de agua destilada, 2 μL de SALSA Enzime Dilution

Buffer, 2 μL de SALSA PCR-primer mix y antes de utilizar la mezcla, se añade 0,5 μL de

SALSA Polymerase. A continuación, en otro tubo eppendorf de 1mL se prepara la mezcla

maestra del tampón de PCR. Por cada reacción, se mezclan: 26 μL de agua destilada y 4

μL de 10xSALSA PCR buffer. Se añaden 30 μL de esta mezcla maestra a nuevos tubos

eppendorf de 0,2 mL previamente rotulados. Seguidamente, se les adicionan 10 μL de

su correspondiente reacción de ligación, que permanece a 4ºC. A continuación se hace

una breve centrifugación, para que los productos de la ligación bajen al fondo del tubo,

y se introducen en el termociclador a 60ºC. Posteriormente se añaden 10 μL de la mezcla

maestra de Polimerasa a cada uno e inmediatamente después, se empieza la reacción

de PCR.

69

Programa de PCR:




FINAL DE LA REACCIÓN 4° Conservar en nevera

Posteriormente los productos de la reacción de PCR se analizan en el secuenciador

automático ABI-Prism 3100XL Genetic Analyzer (Applied BiosystemsTM), para ello se

prepara en un tubo eppendorf de 1,5 mL una mezcla con 9 μL de HiDi formamida y 0,3μL

de marcador estándar GeneScan ROX 500TM (Applied BiosystemsTM), por reacción. Se

añaden 9,3 μL de esta mezcla y 0,7 μL de reacción de PCR en los pocillos de una placa

óptica de 96 pocillos MicroAmp® (Applied BiosystemsTM). A continuación, se incuba

durante 2 minutos a 94ºC, seguido de un choque térmico a 4ºC durante otros 5 minutos

antes de llevar la placa al secuenciador.

Tras la electroforesis capilar, se usa el programa GeneMapper (Applied BiosystemsTM),

con la opción Microsatélite default como método de análisis y GS500 como marcador

estándar. A continuación, se visualizan los electroferogramas y las tablas de cada uno

de los pacientes utilizando la herramienta: Display Plots, se exporta la tabla de datos y

se guarda para su posterior uso en el programa Coffalyser (MCR HollandTM).

Coffalyser es una macro creada para Excel (Coffalyser Home, 2007), que permite la

realización de un análisis estadístico de la mayoría de las MLPA probemix de MRC-

HollandTM, a partir de los datos importados de programas como GeneMapper o

GeneScan entre otros. Por cada proyecto realizado, se guarda un informe en formato

Excel, la gráfica Heatmap y el informe estadístico. Para el estudio se utiliza el histograma

para determinar las anomalías cromosómicas. Considerando como rango de normalidad

las ratios comprendidas entre 1,4-0,6. Así pues se valida como ganancia de dosis a

aquellas ratios superiores a 1,4, y pérdida de dosis a aquellas ratios inferiores a 0,6.

70

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. CARACTERÍSTICAS CLINICAS DE LOS PACIENTES

ESTUDIADOS

Al analizar la distribución de sexos entre el grupo de pacientes estudiados (n= 300), se

observa que hay un porcentaje mucho mayor de mujeres(n=278), un 92.67%, que de

hombres (n=22), que solo representan un 7.33% del total de pacientes estudiados. El

riesgo de desarrollar cáncer de mama a lo largo de la vida es aproximadamente una de

cada ocho mujeres. Entre las mujeres menores de 40 años es 1 cada 228; entre los 40 y

los 59 años 1 cada 24; y entre las mujeres de 60 a 79 años 1 cada 14 (Jemal A y cols.

2004). Los hombres, en una proporción muy inferior a las mujeres, también pueden

desarrollar cáncer de mama (Volgestein B y cols., 2002; Antoniou A y cols., 2003). Esta

diferente susceptibilidad entres sexos en esta patología es la que explica por tanto esta

desproporción en los pacientes objeto de este estudio.

Figura 9.- Representación gráfica de la distribución de sexos de los pacientes en el

estudio, correspondiendo un 7.33% (22/300) a varones y un 92.67% (278/300) a

mujeres.

Otro factor de riesgo para el desarrollo de cáncer de mama y de ovario son los

antecedentes familiares. Tanto en varones como en mujeres, se observa que la mayoría

de los pacientes a los que se les realiza el estudio presentan dichos antecedentes, con

familiares afectados por algún tipo de cáncer de mama u ovario. La presencia de

DISTRIBUCIÓN DE SEXOS

VARONES

MUJERES

71

antecedentes familiares aumenta también la probabilidad de que el paciente sea

portador de alguna mutación en los genes estudiados. Se observa que el porcentaje de

mujeres que presentan antecedentes familiares es mayor que en el caso de los varones.

Figura 10.- Representación gráfica de los antecedentes familiares de cáncer de mama

de los pacientes femeninos y masculinos del estudio, siendo de un 59.09% (13/22) para

los hombres y un 70.14% (195/278) para las mujeres.

Se ha observado que hay otros tipos de cánceres relacionados con mutaciones en

algunos de éstos dos genes BRCA, como son el cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer

de próstata, cáncer de colon, cáncer de páncreas…, aunque podemos observar que lo

que prevalece son los antecedentes familiares de Cáncer de Mama y Ovario (Friedenson

B, 2005; Cavanagh H y cols., 2015 ).

Figura 11.- Representación gráfica de los antecedentes familiares de otros tipos de

cáncer también relacionados con los genes BRCA respecto al total de pacientes con

antecedentes familiares de cáncer, siendo de un 12.62% (11/206) para las mujeres y

20% (3/15) para los hombres.

Antecedentes Familiares-mujeres

CON AF

SIN AF

Antecedentes Familiares-varones

CON AF

SIN AF

Antecedentes Familiares-mujeres

AF OTROC Ca

AF CaM

Antecedentes Familiares-varones

AF OTROS Ca

AF CaM

72

En cuanto a los antecedentes personales en los pacientes varones se observan tres

grupos. En primer lugar están los pacientes que acuden a consulta por presentar un

cáncer de mama, bien sea intraductal (4.5%; n=1) o ductal infiltrante (22.73%; n=5); el

segundo grupo de pacientes son los que acuden por presentar una neoplasia de próstata

(22.73%; n=5); y un tercer grupo que acude por presentar antecedentes familiares (50%;

n=11). La presencia de cáncer de mama en varones se considera un dato indicativo de

una alta probabilidad de que presente mutaciones en el gen BRCA2 (Gayther SA y cols.,

1997, Antoniou A y cols., 2003; Morgan D y cols., 2009). En el caso de la neoplasia de

próstata se solicita estudio genético de BRCA1/BRCA2 porque se ha descrito una

correlación entre la presencia de mutaciones en éstos, principalmente en BRCA2 y el

desarrollo de este tipo de cáncer (Gayther SA y cols., 1997; Cavanagh H y cols., 2015).

Figura 12.- Representación gráfica de los antecedentes personales por los que se realiza

el estudio a los pacientes varones: CDI de mama 22.73% (n=5); Ca. Intraductal 4.54%

(n=1); Neoplasia de Próstata 22.73% (n=5); Estudio Familiar 50% (n=11).

Al analizar los antecedentes personales en el caso de las mujeres, se observa que hay

gran variedad en cuanto a tipos de cáncer que presentan, pero si se considera

conjuntamente todos los tipos de cáncer de mama y ovario o la combinación de ambos

de ellos como un solo grupo, el porcentaje es del 79.85% (n= 222). Sólo un 16.19% (n=45)

de las pacientes acudieron por presentar antecedentes familiares. Dentro del grupo de

las pacientes con cáncer, los tipos de neoplasias mayoritarias son el CDI con un 35.61%

(n= 99) y el CDIS que corresponde a un 7.19% (n= 20); un segundo sería la neoplasias de

Antecedentes personales-varones

CDI mama

Ca Intraductal

Neo. Próstata

Estudio Familiar

73

ovario que representa el 12.95% (n=36); y por último sería el compuesto por pacientes

que presentan cáncer de mama y ovario simultáneamente con un 2.88% (n=8).

Figura 13.- Representación gráfica de los antecedentes personales por los cuales se les

ha realizado el estudio a las pacientes mujeres: Cáncer de mama 62.94% (n= 175);

Cáncer de Ovario 12.95% (n=36); Mama y Ovario 2.88% (n= 8); FAD 2.88% (n=8); Otros

1.08% (n= 3); Estudio Familiar16.19% (n= 45).

Si se compara con los varones se puede observar que hay un mayor porcentaje de

varones a los que se les pide el estudio molecular por antecedentes familiares (50%; n=

11/22) que en el caso de las mujeres (16.19%; n= 45/278), ya que el cáncer de mama en

estas es mucho más frecuente. Por otro lado también se puede observar que hay mucha

más variedad de tipo de cáncer con posible implicación de los genes BRCA1 y BRCA2 en

mujeres que en el caso de los varones.

En el caso de la menopausia, es otro factor de riesgo para identificar pacientes con

posible cáncer de mama hereditario, en el estudio es mucho mayor el porcentaje de

mujeres estudiadas en pre-menopausia (83.37%; n= 232) que en post-menopausia

(17.63%; n= 49) para un total de 278 mujeres. En pacientes pre-menopáusicas se

encuentra una mayor prevalencia de cánceres hereditarios provocados por alguna

mutación en alguno de los genes BRCA1/BRCA2. Por el contrario en pacientes

postmenopáusicas, la probabilidad de desarrollar un cáncer de tipo no hereditario es

mucho mayor.

Antecedentes personales-mujeres

CDI unilateralCDISCLICPICDI+CDISCDI+CLICDI+CDIS+CLICDI+CDIS+CLISCa. BilateralMama+OvarioMama+OtrosFADNeo. OvarioOtrosEstudio Familiar

74

Figura 14.- Representación gráfica de las edades a las que se diagnosticó el cáncer a las

pacientes estudiadas, correspondiendo un 82.37% (n= 232) a edad pre-menopáusica y

un 17.63% (n= 49) a edad post-menopáusica.

En el estudio IHQ (inmunohistoquímico) de los cánceres de las pacientes estudiadas se

observa que tanto para los receptores de estrógenos (RE) como para los receptores de

progesterona (RP) hay un mayor porcentaje de positivos (RE: 76,88% (n= 133) positivos;

RP: 71.09% positivos (n= 123). La detección de receptores de estrógenos y progesterona

tiene una gran importancia a la hora de seleccionar el tratamiento más adecuado, siendo

su presencia en el tumor un factor predictivo de la respuesta a la terapia endocrina. La

presencia de estos receptores hormonales relaciona con el intervalo libre de

enfermedad independientemente de la edad, menopausia, tamaño tumoral o

afectación de ganglios axilares, habiéndose demostrado que las pacientes RE positivo

tienen intervalos libres de enfermedad más prolongados (De Hollander P y cols., 2013;

Deluche E y cols., 2015).

Menopausia en pacientes con cáncer de mama para estudio genético.

PREMENOPAUSIA

POSTMENOPAUSIA

75

Figura 15.- Representación gráfica del estudio IHQ de los receptores hormonales en el

tejido mamario con afectación cancerígena. En los Receptores de Estrógenos

encontramos un 76.88% (n= 133) de positivos frente a un 23.12% (n= 40) negativos; en

el caso de los Receptores de Progesterona encontramos un 71.09% (n= 123) de los

resultados positivos frente a un 28.91% de negativos (n= 50).

En el caso del receptor Her2/neu, la mayoría de los cánceres de mama de los pacientes

del estudio eran negativos. Los casos de cáncer de mama con amplificación del gen HER2

o sobreexpresión de la proteína HER2 se denominan HER2 positivos en el informe

anatomopatológico. Los casos de cáncer de mama de receptores HER2 positivos tienden

a crecer más rápido, y es más probable que se extiendan y se vuelvan a formar, en

comparación con los casos de cáncer de mama HER2 negativos. Existen tratamientos

farmacológicos específicos para los casos de cáncer de mama de receptores HER2

positivos. El medicamento que se utiliza con más frecuencia es HerceptinTM (nombre

genérico: Trastuzumab), que se une a los receptores HER2 de las células cancerosas e

impide que estos reciban señales de crecimiento. Al bloquear estas señales, Herceptin

puede ayudar a desacelerar o incluso interrumpir el crecimiento del cáncer de mama.

Otra opción para algunas mujeres que padecen cáncer de mama de receptores HER2

positivos en estadio avanzado es TykerbTM (nombre genérico: Lapatinib), (De Hollander

P y cols., 2013; Gampenrieder SP y cols., 2013; Deluche E y cols., 2015).

R.Estrógenos

POSITIVOS

NEGATIVOS

R.Progesterona

POSITIVOS

NEGATIVOS

76

Figura 16.- Representación gráfica de los resultados obtenidos mediante el análisis

inmunohistoquímico de la sobreexpresión de receptores HER2 en tejido mamario con

afectación cancerígena. Se observa que existe un 32.10% (n= 52) de resultados positivos

y un 67.90% (n= 110) de resultados negativos en los pacientes incluidos en el estudio.

En nuestro grupo de pacientes un 15.43% (n= 25) fueron triple negativos, en su mayoría

se trata de pacientes con CDI. Con la denominación triple negativo nos referimos a

pacientes que en el estudio inmunohistoquímico son negativos para los receptores de

estrógenos, progesterona y HER2. Está descrito que alrededor del 10 al 20% de los casos

de cáncer de mama son triple negativo (Kammori M y cols., 2008). Como las hormonas

no colaboran con el crecimiento, es poco probable que el cáncer responda a las

hormonoterapias, incluyendo Tamoxifeno®, Arimidex® (nombre genérico: anastrozol),

Aromasin® (nombre genérico: exemestano), Femara® (nombre genérico: letrozol) y

Faslodex® (nombre genérico: fulvestrant). Tampoco es probable que un cáncer de mama

triple negativo responda a los medicamentos que tienen como diana al HER2, como

Herceptin® (nombre genérico: trastuzumab) o Tykerb® (nombre genérico: lapatinib),

(Pinto AE y cols., 2013).

Además, el cáncer de mama triple negativo presenta las siguientes características:

Suele ser más agresivo que otros tipos de cáncer de mama.

Las tasas de supervivencia a cinco años también suelen ser más bajas

HER2

POSITIVOS

NEGATIVOS

77

Suele ser de grado más alto que otros tipos de cáncer de mama.

Usualmente se trata de un tipo de célula denominado “basaloide”.

Figura 17.- Representación gráfica de los resultados obtenidos de las pacientes que

presentan triple negativo, que son aquellas que tanto RE, RP como HER2 presentan

resultado negativo en el análisis inmunohistoquímico correspondiente, frente a las

pacientes que presentan al menos uno de ellos positivo. Se observa que un 15.43% (n=

25) son pacientes triple negativo frente un 84.57% (n= 162) que presentan algún

resultado positivo.

Se estima que el 11% de los cánceres de mama asociados con mutaciones en BRCA1 son

triple-negativos, se diagnostican a temprana edad y son del tipo basal (Young RS y cols.,

2009). La proporción de cánceres asociados a mutaciones BRCA1, que son negativos

para los receptores de estrógenos, es inversamente proporcional a la edad de la

paciente, esto quiere decir que a medida que el cáncer se diagnostica de forma más

temprana, es más probable que los receptores estrogénicos resulten negativos. El 81%

de los cánceres BRCA1 diagnosticados en pacientes menores de 45 años son negativos

para los receptores de estrógenos, mientras que el porcentaje disminuye a 65% en

aquellos cánceres diagnosticados después de los 65 años (Foulkes WD y cols., 2004). En

contraste con la alta proporción de cánceres asociados con mutaciones en BRCA1 que

RECEPTORES

3NEGATIVO

POSITIVO

78

son negativos para los receptores de estrógenos, sólo 15% de los que son triple

negativos están asociados con mutaciones BRCA1 (Dent R y cols., 2007).

En este estudio, las pacientes a las que se le ha detectado una mutación patológica en

el gen BRCA1 (n= 10), siete presentaban cáncer de mama, todos CDI y un 70% son triples

negativas. En el caso de las pacientes a las que se les ha detectado la presencia de una

mutación patológica en el gen BRCA2 (n= 10), seis presentan cáncer de mama, y ninguna

es triple negativa, aunque hay un tres casos donde el resultado del HER2 es negativo. En

general, los cánceres asociados con mutaciones en BRCA1 son ductales infiltrantes, de

tipo basal, con un alto grado histológico, con características medulares, infiltración

linfocitaria, patrón de crecimiento sincitial y resultan ser triple negativos. Además se

asocian con un comportamiento más agresivo y tienen un peor pronóstico. Esta es la

razón por la cual los cánceres de mama que se diagnostican a temprana edad tienen la

indicación de realizárseles una prueba genética, mientras que los relacionados al BRCA2

parecen no diferir de los cánceres de origen no hereditario (Petrucelli N y cols., 2005).

En resumen, el fenotipo de los cánceres asociados con las mutaciones del BRCA1 se

caracterizan por lo siguiente (Foulkes WD y cols., 2004):

Receptores de estrógenos negativos 75%, que coincide con este estudio, ya que

un 75% de las pacientes con mutación patológica en BRCA1 con cáncer de

mama presentan los RE negativos.

Expresión del Her2/Neu negativa 95%, en este estudio el resultado de HER2

negativos también es del 75%.

La presencia de carcinoma in situ es rara, en este estudio solamente en uno de

los casos con Mutación Patológica en BRCA1 y cáncer de mama presenta

conjuntamente un diagnóstico de CDI junto con CDIS.

Y el fenotipo de los cánceres asociados con las mutaciones del BRCA2 por lo siguiente

(Foulkes WD y cols., 2004):

79

Receptores de estrógeno positivo 75%, en este estudio, las pacientes con

mutación patológica en BRCA2 y cáncer de mama son en un 100% de los casos

RE positivos.

Expresión del Her2/Neu negativa 95%, en este estudio el resultado de HER2

negativos es del 67% de las pacientes.

La presencia conjunta de carcinoma in situ es común, en este estudio se

encuentra en una de las pacientes.

5.2. ANÁLISIS DE GRANDES DELECIONES Y REORDENAMIENTOS

DE LOS GENES BRCA1/BRCA2 MEDIANTE TÉCNICA DE MLPA

Se ha realizado un estudio piloto por MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe

Amplification) de 164 pacientes incluidos con el objetivo de determinar si presentan

deleciones o duplicaciones que provoquen un cambio en la dosis génica alterando la

función de los genes BRCA. El estudio por MLPA solamente se realiza a estos pacientes

porque se trata de un estudio piloto mediante el cual no se ha encontrado ningún

paciente positivo para ella y la baja incidencia de este tipo de alteraciones mostrada en

otras publicaciones nos conduce a finalizar el análisis, aunque podría realizarse para

complementar el estudio mutacional.

Para llevar a cabo el análisis de los pacientes mediante esta técnica, se han utilizado los

kits comerciales SALSA MLPA P002BRCA1 Probemix (MRC HollandTM) para el gen BRCA1,

y SALSA MLPA P045BRCA2/CHEK Probemix (MRC HollandTM) para el gen BRCA2. Las

sondas que lleva el kit para el gen BRCA1 son para los exones 1a, 1b, 2, 3, y del 5 al 24

con dos pares de sondas para el exón 11 y el 13 junto con sondas control. Para el BRCA2,

las sondas incluidas en el kit son para los exones del 1 al 27 con dos sondas para el exón

1, 3, 11 y 13, junto con sondas control.

En este estudio mediante esta técnica realizada a los 164 pacientes, no se ha encontrado

ningún paciente con duplicaciones, deleciones o reordenamientos que modifiquen la

dosis génica de BRCA1 o BRCA2. En un trabajo publicado en Asturias, se detectaban

mediante la misma técnica que un 1,17% de las pacientes analizadas (n=256)

80

presentaban alteraciones en la dosis génica del BRCA1 (Blay P y cols., 2013). En otro

estudio realizado en población alemana se detectaron reordenamientos mediante MLPA

en un 2.1% de las pacientes analizadas también en el gen BRCA1 (n=1506), (Engert S y

cols., 2008). Dada la baja incidencia publicada, la no detección en nuestro caso se podría

explicar por no haber alcanzado aún un tamaño muestral suficiente, aunque la incidencia

de estas es muy baja en la población en general como se demuestra en otros estudios

(Engert S y cols., 2008; Blay P y cols., 2013).

Tabla 3.- Representación numérica de los ratios obtenidos para el estudio mediante

MLPA del gen BRCA1 de 7 pacientes para las distintas sondas del kit SALSA MLPA

P002BRCA1 Probemix (MRC HollandTM).

81

Figura 18.- Diagrama de barras en el que se representa el ratio de dosis génica de un

paciente para cada sonda del kit SALSA MLPA P045BRCA2/CHEK Probemix (MRC

HollandTM). Se observa que el valor de la dosis génica está alrededor de 1 por lo tanto se

considera un paciente normal.

5.3. ANÁLISIS DE SECUENCIAS

El análisis mediante la técnica de Next Generation Secuencing (NGS) de los pacientes de

estudio de los genes BRCA1 y BRCA2 y posterior confirmación por el método de Sanger

ha permitido la determinación de mutaciones en ambos genes.

En cuanto a los cambios en la secuencia de nucleótidos de los genes BRCA1 y BRCA2 se

han encontrado todos los tipos de mutaciones (ver Figura 19): polimorfismos en los

que el cambio de un nucleótido no afectaba a su traducción en la proteína (mutaciones

sinónimas); mutaciones de un nucleótido que cambiaban la codificación de un

aminoácido en la cadena proteica (mutaciones missense); mutaciones que introducían

un codón de parada originando una proteína truncada (mutaciones nonsense);

pequeñas deleciones o inserciones; o mutaciones localizados en las zonas intrónicas

que pueden afectar al proceso de maduración o splicing del ARNm. Todas estas

mutaciones tendrán un carácter patológico o no dependiendo de cómo afectan a la

funcionalidad de la proteína BRCA1 y BRCA2. En el caso de las mutaciones missense y

nonsense, en el análisis de las secuencia en el eletroferograma, se observa del mismo

modo, un doble pico correspondiente a un cambio de nucleótido en una posición en

concreto que provoca un cambio de aminoácido, como sucede en la missense o la

00,20,40,60,8

11,2

13-0

31.6

FRY

13-0

31.8

…13

-031

.8…

13-0

31.8

…13

-031

.8…

13-0

31.8

…13

-031

.8…

13-0

31.8

…13

-031

.8…

13-0

31.8

…13

-031

.8…

13-0

31.8

…13

-031

.8…

13-0

31.8

…13

-031

.8…

13-0

31.8

…13

-031

.9…

22-0

27.5

HCS

20 c c c c

Series2

82

aparición en esa posición debido al cambio nucleotídica de un stop codón prematuro,

lo que sucede en la nonsense, que produce una interrupción en la síntesis de la

proteína y por lo tanto una proteína truncada sin sentido. Lo mismo sucede entre las

deleciones e inserciones, que en análisis de imagen en el eletroferograma, se observa a

partir del punto donde se produce el cambio una doble secuencia, pero el concepto es

distinto, en la deleción en una de las cadenas de ADN se escinden un número concreto

de nucleótidos, mientras que en la inserción se insertan.

(a) Mutación sinónima: p.e. en el paciente 58 de los 300 pacientes se encuentra la

mutación p.Ser1436Ser con cambio de nucleótido Timina por una Citosina.

(b) Mutación missense: p.e. en el paciente 14 de los 300 pacientes se encuentra la

mutación p.Gln356Arg con cambio de nucleótido Adenina por Guanina. La imagen del

electroferograma es la misma cuando es una nonsense.

(c) Deleción: p.e. en el paciente 18 de los 300 paciente donde se observa la escisión de

5 nucleótidos en el exón 23 del gen BRCA2 (p.Tyr3009_His3010fsTer6), recogida como

83

patológica en BIC, se observa a modo de doble secuencia a partir del punto de la

deleción. La imagen del electroferograma es la misma cuando es una inserción.

Figura 19.- Ejemplos de distintas mutaciones encontradas en el estudio. (a) Mutación

sinónima; (b) mutación missense o nonsense; (c) deleción o inserción.

Las mutaciones encontradas se han clasificado en cuatro grupos atendiendo a su valor

clínico: Variantes sin significado clínico o Variantes de significado clínico desconocido

(VSCD); Mutaciones patológicas (MP); y Mutaciones nuevas o no descritas (MND). Para

poder llevar a cabo esta clasificación se ha utilizado como referencia la base de datos

BIC (Breast Cancer Information Core), ClinVar y la base de datos HGMD. En el caso de

las mutaciones nuevas o no descritas, se han utilizado programas de simulación

mediante los cuales se realiza una estimación de la afectación del cambio a la

funcionalidad proteica y por tanto hace una estimación de la implicación patológica de

dicha mutación en base a las características aminoacídicas de la sustitución y dichos

programas son Polyphen v2.0 y Mutation Taster.

En las tablas del ANEXO II se recogen las distintas mutaciones encontradas en el estudio

y la agrupación se distribuye en dichas tablas en función de su clasificación como

Variantes Benignas o variantes sin significado clínico (VB), variantes de significado clínico

desconocido (VSCD), mutaciones patológicas (MP) o mutaciones no descritas o nuevas

(MND) para cada uno de los genes BRCA1 y BRCA2 por separado.

Para todas las mutaciones encontradas en esta población se ha calculado tanto la

prevalencia poblacional como la prevalencia alélica. El valor de la prevalencia alélica

debería ser la mitad que el de la poblacional, ya que en la primera, para realizar el cálculo

se cuentan todos los individuos de la población y en la segunda se tiene en cuenta que

cada individuo es poseedor de dos alelos para cada gen. Lo que sucede es que en

ocasiones se va a poder observar que la prevalencia alélica es mayor que la poblacional

y esto es debido a que se encuentran individuos homocigotos para un cambio, de modo

que el cambio lo encontramos en ambos alélos. Este hecho se observa principalmente

en las mutaciones sin significado clínico, ya que el cambio no es deletéreo para el

paciente y puede poseerlo en homocigosis.

84

En el caso del BRCA1, se observa que en las variantes sin significado clínico presentan

una prevalencia poblacional de 372.64% y la alélica es de 221.54%, estos resultados

mayores que cien son debidos a que cada paciente puede poseer más de un cambio de

este tipo. De éstas mutaciones se puede observar que las más prevalentes son la S1613G,

la S1436S, la P871L y la E1038G, la primera con una prevalencia poblacional de 56.58%

y las otras tres con una prevalencia poblacional sobre 52%, pero al observar la

prevalencia alélica se observa que es de 34.54% para la primera y entre un 30-32% para

las otras tres, de modo que se puede determinar que se encuentran más homocigotos

para la primera mutación. En el caso de variantes de significado clínico incierto se

observa que en general la prevalencia poblacional es de 31.17% mientras que la alélica

es de 12.96%. De este grupo de mutaciones la más prevalente es la Q356R con una

prevalencia poblacional del 12.76% y una prevalencia alélica 6.38%. Si se analizan las

mutaciones patológicas encontradas en la población las prevalencias, en general es de

2.93% para la poblacional y 1.5% para la alélica. En este gen han sido 7 las mutaciones

encontradas de este tipo, en el exón 2 la c.66_67delAG, en el exón 11 la

c.2866_2870delTCTCA, la c.4035_4035delA y la c.4065_4068delTCAA, en el exón 13 la

c.4307_4308delCT y finalmente en el exón 18 la p.Arg1699Trp y la p.Ala1708Glu. En

otros estudios se ha encontrado que la mutación más prevalente también es la

c.66_67delAG (Cardeñosa E. y cols., 2008). La siguiente mutación con mayor prevalencia

es la c.4307_4308delCT, la cual en este estudio presenta una prevalencia de 0.41%

mientras que en otros estudios es de un 1.28% (De Juan I y cols., 2013), la diferencia que

encontramos puede ser debida al tamaño poblacional del estudio. En el caso de las

mutaciones nuevas se observa que la prevalencia de estas mutaciones en la población

es 9.19% para la poblacional y 4.61% para la alélica, pero de todas las mutaciones, la más

prevalente es la p.Met751Lys con una prevalencia poblacional de 3.14% y una

prevalencia alélica de 1.57%.

En el caso del gen BRCA2, se observa que las variantes sin significado clínico presentan

una prevalencia poblacional de 498.39% y una prevalencia alélica de 367.51%, de modo

que también se observa que la prevalencia alélica no es la mitad que la poblacional,

debido a los pacientes que son homocigotos para algunas de las mutaciones. La

mutación de este tipo encontrada en la población con mayor prevalencia es la A2466V

85

con una prevalencia poblacional i alélica de 97.37%, de modo que en este caso todos los

pacientes a los que se les ha encontrado la mutación la presentan en homocigosis, y la

p.Lys1521= con una prevalencia poblacional de 75.17% y una prevalencia alélica de

72.24%. En el caso de las variantes de significado clínico incierto se observa que la

prevalencia poblacional general para este gen es de 18.08% y la alélica es de 9.03%. La

mutación con mayor prevalencia en la población de este tipo es la p.Arg2034Cys con una

prevalencia poblacional de 4.17% y alélica de 2.08%. Para las mutaciones patológicas se

observa en general una prevalencia poblacional de 3.91% y la prevalencia alélica es de

1.93%, siendo las más prevalentes la deleción c.9026_9030del5 ATCAT (o 9254del5) con

una prevalencia poblacional de 1.39% y una prevalencia alélica de 0.69%, y la mutación

p.Arg3128Ter con una prevalencia poblacional de 0.77% y una alélica de 0.39%. Estas

son las mutaciones patológicas más prevalentes en nuestra población, resultado que

concuerda con el obtenido en otros estudios realizados en población española (Diez O y

cols., 2010). En el caso de mutaciones nuevas encontramos que la prevalencia

poblacional es de 12.62% mientras que la alélica es de 6.31% en general, siendo la más

prevalente la p.Ala483= con una prevalencia poblacional de 3.64 y 1.82% de prevalencia

alélica.

De estos resultados se puede determinar que en el caso de las variantes sin significado

clínico se observa una elevada presencia de mutaciones en ambos genes en la población

estudiada. En el caso de las variantes de significado clínico incierto se observa que hay

un mayor prevalencia en el gen BRCA1 que en el gen BRCA2. En el caso de las mutaciones

patológicas se observa una clara diferencia entre ambos genes siendo el BRCA2 más

prevalente, dato que se observa en diferentes estudios en población española (Diez O y

cols., 2010; De Juan I y cols., 2013). Las mutaciones patológicas que se ha detectado con

mayor frecuencia han sido la deleción c.9026_9030del5ATCAT del gen BRCA2 que se ha

encontrado en 5 pacientes y la p.Arg3128Ter que se ha detectado en 2 pacientes. En el

caso de las mutaciones nuevas se observa que en ambos genes se detectan gran

variedad de cambios que no están descritos, pero que sería de interés estudiar para

determinar su implicación en el desarrollo del cáncer de mama/ovario hereditario en

nuestra población.

86

5.4. PACIENTES DETECTADOS CON MUTACIONES PATOLÓGICAS.

Se ha encontrado un total de 18 pacientes a los que se les ha detectado una mutación

patológica, de los cuales solamente uno es un varón de 66 años que fue remitido para

la realización del estudio por ser poseedor de antecedentes familiares y presentar un

hermano con la misma mutación. Las otros 17 son mujeres con una media de edad de

43.12 ± 6.36 años y con un rango de 28 a 76 años.

Del total de las 17 pacientes con mutación patológica, dos de ellas presentaron un CDI

y otra un CDIS + un CDI en la mama derecha, las tres con resultados triple negativos;

otras tres presentaron CDI cuyos resultados IHQ fueron positivo para receptores

hormonales y negativo para el Her2; otras pacientes presentaron CDI, CDIS o cáncer de

mama bilateral con resultados positivos tanto para receptores hormonales como para

Her2; cinco de las pacientes presentaron neoplasia de ovario, siendo en uno de los casos

bilateral; y finalmente se encontraron mutaciones patológicas en dos pacientes que

fueron remitidas por FAD y estudio familiar. Del total de pacientes con mutaciones

patológicas, un 61.11% presentaron mutaciones en el gen BRCA2 mientras que un

38.89% las presentaron en el gen BRCA1.

Paciente 1: Mujer de 42 años de edad remitida por el Servicio de Oncología a la Unidad

de Riesgo Familiar de Cáncer de mama del Hospital Universitario de la Ribera. Acude a

urgencias por dolor en el hipogastrio donde se le detectó por radiografía una tumoración

abdominal y fue remitida para valoración ginecológica. Se le solicitó una Ecografía

abdominal y posterior TAC de pelvis sin contraste y TAC abdomino-pélvico con contraste

mediante las cuales se observó la presencia de masas ováricas bilaterales concordantes

con neoplasia bilateral, sin evidencia metabólica de carcinomatosis peritoneal ni

afectación adenopática retroperitoneal. Además se observó en la analítica un resultado

positivo para el marcador Ca125 (>35U/ml). El diagnóstico final fue cáncer de ovario

bilateral. La paciente se sometió a una Salpingooferectamía bilateral. En cuanto a los

antecedentes personales tuvo la menarquía a los 11 años, 1º hijo a los 23 años, después

de 3 hijos se realizó ligadura de trompas por laparoscopia. La historia familiar de cáncer

que presentó era: padre con cáncer de pulmón, madre con cáncer de ovario pre-

87

menopausia, una hermana con cáncer de ovario pre-menopausia a los 47 años, otra

hermana con CDI de mama izquierda pre-menopausia a los 41 años y tía materna con

bultoma de mama. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia

de ésta paciente se puede observar en la figura 20 del ANEXO III.

La mutación que se detectó a esta paciente fue una deleción de dos nucleótidos

correspondientes a Alanina y Guanina en la posición 66 (c.66_67delAG) en el exón 2 del

gen BRCA1. Esta mutación provoca la síntesis de una proteína truncada con pérdida de

función y por lo tanto tiene un carácter patológico con un incremento en el riesgo de

desarrollar cáncer de mama y ovario hereditario. Se solicita una ampliación del estudio

a sus familiares.

Paciente 2: Mujer de 28 años de edad que fue remitida por el Servicio de Oncología a la

Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera.

Las pruebas realizadas para el estudio de la paciente fueron ecografía de mama, biopsia

por escisión y posterior intervención para la resección del CSE de la mama derecha (MD).

A esta paciente se le diagnosticó un CDI de MD con extensión a márgenes de resección.

El estudio inmunohistoquímico (IHQ) demostró que era un caso de triple negativo para

receptores hormonales (RE y RP) y Her2. En cuanto a los antecedentes personales tuvo

la menarquía a los 11 años de edad y era nuligesta. Los antecedentes familiares que

presentó la paciente por cáncer era hermana con cáncer de estómago a los 37 años.

La mutación que se le detectó a esta paciente fue una deleción de AG en el exón 2 del

gen BRCA1 en la posición 66 (c.66_67delAG), produciendo una pauta de lectura

incorrecta y por lo tanto una proteína BRCA1 truncada, de modo que se describe en BIC

como patológica.

Paciente 3: Mujer de 49 años de edad fue remitida por el Servicio de Oncología a la


Se practicó una ecografía abdominal junto con una citología del líquido peritoneal cuyo

resultado dio negativo para células malignas pero el Ca125 fue elevado (1203 U/ml).

Presentaba un adenocarcinoma seroso pobremente diferenciado ovárico bilateral con

una extensión al epiplón, mesenterio, capa serosa uterina y apendicular. Se sometió a

la paciente a una laparotomía, histerectomía, una doble anexectomía, se realizó una

88

resección peritoneo-parietal y visceral, linfadenectomía pélvica bilateral y para-aórtica.

También se llevó a cabo una resección de la cúpula, una resección del peritoneo parietal.

En cuanto a los antecedentes personales de la paciente tuvo la menarquia a los 14 años

y 1º hijo a los 27 años y menopausia a los 38 años. Los antecedentes familiares que

presentó la paciente fueron su madre con cáncer de mama pre-menopáusico a los 45

años de edad, tía materna cáncer de mama pre-menopausia a los 45 años y una familiar

de primer grado con cáncer de ovario a los 37 años. Otros antecedentes de cáncer en la

familia fueron un hermano con cáncer gástrico y el abuelo materno también con cáncer

gástrico. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta

paciente se puede observar en la figura 21 del ANEXO III.

La mutación que se le encontró a esta paciente fue una deleción de 5 nucleótidos en la

posición 2866 (c.2866_2870delTCTCAdel5) en el exón 11.8 del gen BRCA1 y esta

deleción provoca una proteína BRCA1 truncada no funcional debido a la incorporación

de un stop codón prematuro. Mutación descrita en BIC como patológica.

Figura 22.- Electroferograma de la secuencia de nucleótidos de una deleción de 5

nucleótidos en la posición 2806 (c.2806__2870delTCTCAdel5), descrita en la base de

datos BIC como patológica.

Paciente 4: Mujer de 44 años fue remitida por el médico de atención primaria a la

Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera

por notarse un bulto en el CSI de la MD. Las pruebas realizadas a la paciente fueron

mamografía, ecografía, biopsia de mama ecoguiada (BAG) y una inyección de marcador

de hidrogel, además de una resección del cuadrante afecto de la mama. En la resonancia

magnética se ven imágenes sugestivas de neoplasia de mama sin infiltración

metastásica. A esta paciente se le diagnosticó un CDI de la MD. En el estudio IHQ de los

receptores hormonales así como del Her2, la determinación fue positiva, obteniéndose

89

un resultado de RE 80%, RP 80% y Her2:+++. En cuanto a los antecedentes personales,

la paciente tuvo la menarquía a los 13 años y dio a luz a su primer hijo a los 34 años. Los

antecedentes familiares que presentaba era una hermana pre-menopáusica con CDI +

CDIS de mama izquierda a los 38 años, madre con cáncer de mama y padre con neoplasia

de próstata. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta


La mutación que se le detectó a esta paciente fue una deleción de 4 nucleótidos TCAA

en la posición 4065 (c.4065_4068delTCAA) en el exón 11 del gen BRCA1. Está deleción

produce un cambio en la pauta de lectura introduciendo un stop codón prematuro a los

10 nucleótidos provocando una interrupción en la síntesis de la proteína y dando lugar

a una proteína truncada con una alteración en su funcionalidad. En la base de datos BIC

se describe como una mutación patológica.

Paciente 5: Mujer de 38 años remitida por el Servicio de Oncología a la Unidad de Riesgo

Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. Las pruebas

realizadas a la paciente para su diagnóstico fueron ecografía mamaria, mamografía y

resonancia magnética. El diagnóstico de la paciente fue CDI en la MD bien diferenciado

con extensión axilar. A esta paciente se le realizó una mastectomía radical bilateral y

tratamiento con quimioterapia y Taxotere. Posteriormente se le realizó una

ooferectomía profiláctica y una reconstrucción mamaria bilateral. En cuanto a los

antecedentes personales, la paciente tuvo la menarquía a los 13 años y dio a luz a su

primer hijo a los 27. Los antecedentes familiares de cáncer que presentó fueron la de

una tía materna con cáncer de mama pre-menopausia a los 35 años, abuela materna

con posible cáncer de ovario, otra tía materna con posible cáncer de ovario y madre con

CDIS. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta


La mutación que se le detectó a esta paciente fue una deleción de 2 nucleótidos CT en

la posición 4307 (c.4307_4308delCT), en el exón 13 del gen BRCA1 produciendo una

pauta de lectura incorrecta y por lo tanto una proteína disfuncional. Ésta también tiene

un carácter patológico según la base de datos BIC.

90

Figura 25.- Cromatrograma de la secuencia de nucleótidos donde se observa la deleción

de los nucleótidos CT en la posición 4307 (c.4307_4308delCT), descrita en la base de

datos BIC como mutación patológica y por lo tanto con implicación en el desarrollo de

cáncer de mama/ovario hereditario.


de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. Se le

realizó una ecografía vaginal mediante la cual se pudo observar un gran mioma

intramural. Mediante resonancia magnética se determinó que la paciente presentaba

masas complejas con lóculos quísticos de contenido líquido con pequeño nivel hemático

y se determinó que radiológicamente se trataba de un tumor probablemente de origen

ovárico sólido-quística, uni o bilateral (cistoadenoma-carcinoma). Fue diagnosticada de

una neoplasia de ovario. En cuanto a los antecedentes familiares que presentó la

paciente fueron su madre fallecida probablemente por una neoplasia de ovario hace 30

años y su hermana que falleció por neoplasia de mama hace 25 años. El árbol

genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta paciente se puede

observar en la figura 26 del ANEXO III.

La mutación detectada fue un cambio de aminoácido de Arginina (R) por Triptófano (W)

en el codón 1699 (p.Arg1699Trp) en el exón 18 del gen BRCA1 descrita previamente

como patológica en BIC.

91

Figura 27.- Electroferograma de la secuencia de nucleótidos de una mutación puntual

donde se produce un cambio del aminoácido R por una W (p.Arg1699Trp) localizada en

el exón 18 del gen BRCA1.

Paciente 7: Mujer de 37 años de edad remitida de la Unidad de Planificación Familiar a

la Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera

para realizar valoración de Historia familiar y seguimiento. Se le realizaron exploraciones

ecográficas anuales donde no se observaron nódulos dominantes ni áreas de mala

transmisión acústica en el seno del parénquima glandular. En 2011 y 2012 se realizó una

RM bilateral con contraste con secuencias dinámicas sin alteraciones significativas y con

una captación glandular difusa. En el 2013 se realizó una mamografía bilateral y

tomosíntesis donde no se observaron nódulos dominantes, microcalcificaciones

sospechosas y distorsiones en la arquitectura glandular. En 2015, cuando la paciente

tenia 41 años, se realizó una nueva RM bilateral con contraste mediante la cual se

identificó una área de captación no masa en CIE MD BIRADS 5 sugestiva de CDIS con un

pequeño foco de CDI y por tanto se remite a la paciente para completar el estudio

mediante la realización de ecografía de mama, biopsia ecodirigida e inyección de clip.

Finalemente se le diagnosticó un CDI con predominio de componente intraductal y CIS

de alto grado, multifocal alcanzando el borde inferior de reseccion de la mama derecha.

En el estudio IHQ que se realizó a partir del tejido biopsida se observaron que los

receptores hormonales (RE y RP) y el Her2 eran negativos. Por lo tanto se trataba de una

paciente triple negativa. En cuanto a los antecedentes personales, esta paciente tuvo la

menarquía a los 11 años y el primer hijo a los 30 años. Los Antecedentes Familiares que

presentó eran su madre con CaM pre-menopausia a los 32 años fallecida, tia materna

cáncer de mama post-menopausia a los 78 años, dos tias abuelas con cáncer de mama

una pre-menopausia a los 45 años y otra post-menopausica a los 57 años. El árbol

92

genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta paciente se puede

observar en la figura 28 del ANEXO III.

En esta paciente la mutación encontrada fue un cambio de un nucleótido citosina a una

adenina en la posición 5123 (c.5123C>A) que provoca un cambio de aminoácido Alanina

a Glutamina en el codón 1708 (p.Ala1708Glu) en el exón 18 del gen BRCA1. Dicho cambio

de aminoácido induce un cambio en la estructura de la proteina provocando un mal

funcionamiento de ésta. Esta mutación está descrita en BIC como patológica.

Paciente 8: Mujer de 34 años remitida desde el Servicio de Cirujía Plástica a la Unidad

de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. La

paciente llevaba prótesis mamaria PIP y sufrió una rotura de la prótesis izquierda y

sustitución. Se detectó por palpación un bulto y se solicitó una ecografia mediante la

cuál se detectó un nódulo correspondiente con FAD situado en CSE MI y se solicitaron

controles ecográficos. A los 6 meses se realizó la siguiente ecografía de mama bilateral

junto con mamografía y tomosintesis. Se observó que el nódulo había aumentado de

tamaño, y se asociaron microcalcificaciones en su interior y contornos mal definidos, por

lo tanto se estableció que se trataba de un BIRADS 5. En la misma mama se observó otro

nódulo, hipoecoico mejor definido, no descrito en la ecografía previa. Mediante la

mamografía se confirma la presencia de microcalcificaciones pleomórficas y siliconomas

en la axila sin evidenciar adenopatías de aspecto neoplásico. Se citó para realizar una

biopsia ecodirigida de ambas lesiones y se obtuvo un fragmento. Finalmente el

diagnóstico que se realizó fue CDI de mama izquierda. En el estudio IHQ se determinaron

los receptores hormonales y el Her2 cuyos resultados obtenidos fueron: RE 40%; RP

100%; y Her2 -. Se realizó una RM bilateral con contraste. Se realizó una mastectomia

radical modificada y eliminación de las protesis. Se le proporcionó un trataminto con

Tamoxifeno durante 5 años. En cuanto a los antecedentes personales, esta paciente

tuvo la menarquia a los 14 años y era nuligesta. No presentaba antecedenetes familiares

de cáncer, pero tras la detección de la mutación se le realiza el estudio a sus 5 hermanos

y se observó que 3 de ellos también eran portadores de la mutación. El árbol genealógico

correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta paciente se puede observar en

la figura 29 del ANEXO III.

93

La mutación encontrada en esta paciente fue una inserción del nucleótido Timina en la

posición 3263 (c.3263_3264insT) en el exón 11 del gen BRCA2, que provoca un cambio

en la pauta de lectura introduciendo un stop codon prematuro a los 10 nucleótidos, de

modo que al traducirse a proteina va a provocar la aparición de una proteina BRCA2

truncada y con perdida de función. Mutación descrita en BIC como patológica.

Paciente 9: Mujer de 32 años remitida por su médico de Atención Primaria a la Unidad

de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera por

palpación de bulto en mama derecha y por su historia familiar de cáncer de mama para

estudio y valoración. Se realizó estudio ecográfico mediante el cual se observó que se

trataba de un FAD. En cuanto a los antecedentes personales, la paciente tuvo la

menarquía a los 11 años y era nuligesta. Los antecedentes familiares que presentaba de

Cáncer era madre afecta de neoplásia de mama pre-menopausia a los 28 años, abuela

materna cáncer de mama/cerebral pre-menopausia antes de los 50 años, tia abuela

cáncer de tiroides.

La mutación que se encontró en esta paciente era una deleción del nucleótido Citosina

en la posicón 5120 (c.5120_5121delC) en el exón 11 del gen BRCA2. Dicha deleción

introduce un cambio en la pauta de lectura introduciendo un stop codon prematuro a

los 5 nucleótidos, de modo que al traducirse la proteina, va a obtenerse una proteina

BRCA2 truncada y con perdida de fucnionalidad. Esta mutación se decribe en BIC como

patológica.

Paciente 10: Varón de 66 años de edad remitido desde el Servicio de Oncología a la


Este paciente fue remitido para consejo genético por antecedentes familiares de

neoplasias de colon, páncreas, mama y próstata. Los antecedentes familiares que

presentó este paciente fueron su madre con cáncer de vesícula a los 74 años, un

hermano con un tumor pélvico a los 66 años, un hermano con cáncer de próstata a los

60 años, un sobrino con cáncer de páncreas a los 44 años y una sobrina fallecida por

cáncer de mama pre-menopausia a los 21 años de edad. El árbol genealógico

correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta paciente se puede observar en

la figura 30 del ANEXO III.

94

En este paciente se detectó la mutación c.5722_5723delCTCT en el exón 11 del gen

BRCA2 que se trata de una deleción de 4 nucleótidos que provocan un cambio en la

pauta de lectura y por tanto la obtención de una proteína BRCA2 truncada. Descrita

también como patológica en BIC.

Paciente 11: Mujer de 34 años de edad remitida por el Servicio de Ginecología a la

Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de mama del Hospital Universitario de la Ribera. Se

le diagnosticó mediante ecografía un adenocarcinoma endometrioide moderadamente

diferenciado ovárico y al análisis bioquímico resultó positivo para el marcador tumoral

Ca125 (>35U/ml). La paciente se sometió a una ooferectomia. En cuanto a los

antecedentes personales, tuvo la menarquía a los 11 años y era una paciente nuligesta.

La historia familiar de cáncer que presentó era la de su padre fallecido por cáncer de

pulmón.

La mutación que se detectó en esta paciente fue una inserción de un nucleótido

correspondiente a una Guanina en la posición 6024 (c.6024_6025insG) en el exón 11 del

gen BRCA2. Esta mutación provoca la síntesis de una proteína truncada con pérdida de

función y por lo tanto tiene un carácter patológico con un incremento en el riesgo de

desarrollar cáncer de mama hereditario. Al detectarse la mutación, la paciente se

sometió a una mastectomía profiláctica bilateral con reconstrucción inmediata.

Figura 9.- Electroferograma de la secuencia de nucleótidos donde se observa la inserción

de una G en la posición 6024(c.6024_6025insG), descrita en la base de datos BIC como

patológica y por lo tanto con implicación en el desarrollo de cáncer de mama hereditario.

95

Paciente 12: Mujer de 59 años remitida desde atención primaria a la Unidad de Riesgo

Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera por palpación del

nódulo en mama izquierda de 3 meses de evolución sin secreción por el pezón. Se le

realizó una mamografía con tomosíntesis y ecografía de mama mediante las cuales se

observó un nódulo en la mama izquierda correspondiente a BIRADS 5 y dos adenopatías

en la axila izquierda con morfología redondeada sugestivas de metástasis. Se le

recomendó realizar una biopsia guiada ecográficamente y una RM de mama bilateral con

contraste. Se le diagnosticó un CDI de mama izquierda. En el estudio IHQ del tejido

biopsiado se determinó que lo receptores hormonales y el Her2 eran positivos: RE100%,

RP10%, Her2+++. Se le proporcionó quimioterapia neoadyuvante a lo que respondió

bien. Se le realizó una mastectomía radical modificada de la mama izquierda y posterior

radioterapia. En cuanto a los antecedentes personales, esta paciente tuvo la menarquia

a los 14 años y el primer hijo a los 25 años sin lactancia materna. Los antecedentes

familiares de cáncer que presentó la paciente fueron padre con cáncer de colon, madre

con cáncer oral, hermano con cáncer de mama, dos tías maternas cáncer de mama y dos

sobrinas maternas con cáncer de mama pre-menopausia a los 35 años y post-

menopausia a los 58 años.

La mutación encontrada en esta paciente fue una deleción de 14 nucleótidos en la

posición 8976 (c.8976_8989delATCATCAGATTTAT) en el exón 23 del gen BRCA2

produciendo un cambio en la pauta de lectura y por tanto la introducción de un stop

codón prematuro que en la traducción de la proteína cesará la incorporación de los

aminoácidos correspondientes produciéndose una proteína BRCA2 truncada

disfuncional. La mutación se describe en BIC como patológica.


de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. Las

pruebas realizadas para el estudio de la paciente fueron ecografía y biopsia con arpón

sobre las microcalcificaciones y se determinó que la paciente presentaba un carcinoma

intraductal in situ (CIIS). El seguimiento médico que siguió esta paciente fue la

realización de tratamiento con radioterapia y Tamoxifeno previamente a la operación.

Se observó que posteriormente al tratamiento tanto la mama derecha, la mama

96

izquierda como las axilas se encontraban libres de adenopatías. También se le realizó un

seguimiento a la paciente mediante mamografía bilateral. En cuanto a los antecedentes

personales, la paciente tuvo la menarquía a los 13 años de edad y el primer hijo a los 24

años. Los antecedentes familiares de cáncer de mama que presentó esta paciente fue el

de su madre con cáncer de mama pre-menopausia y su hermana con cáncer de mama

pre-menopausia. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia

de ésta paciente se puede observar en la figura 31 del ANEXO III.

La mutación que se detectó en esta apaciente fue una deleción de 5 nucleótidos

(c.9026_9030delATCAT) en el exón 23 del gen BRCA2, descrita como patológica en BIC

como se ha comentado anteriormente.


de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. La

paciente acudió a la consulta por un sangrado postmenopáusico y se le practicó un TAC

abdomino-pélvico con contraste y una analítica para marcadores tumorales. En el TAC

se apreciaba una gran masa pélvica sólida y lobulada con una porción quística posterior,

también un lóbulo líquido que desplazaba hacia la derecha el recto. También se

observaron dos nódulos en la reflexión peritoneal de 1 ,2 y 3 cm sugestivos de implantes

tumorales. No se identificaron lesiones en el marco óseo que sugirieran enfermedad

metastásica. En el caso de los marcadores solicitados presentó el Ca125 un poco por

encima del rango normal (56 U/ml). Por lo tanto se le diagnosticó a la paciente un

carcinoma indiferenciado de ovario izquierdo con extensión a la capa serosa uterina. Se

realizó una laparotomía y una resección del muñón rectal junto con una posterior

quimioterapia. En cuanto a los antecedentes familiares que presentaba la paciente

fueron: madre con neoplasia de mama a los 63 años, una hermana con neoplasia de

mama + endometrio post-menopausia a los 52 años y otra sobrina con neoplasia de

mama pre-menopausia a los 50 años. Era una paciente con 5 hijos y menopáusica desde

los 50 años de edad.

La mutación que se detectó fue una deleción de 5 nucleótidos en el exón 23 del gen

BRCA2 (c.9026_9030delATCAT) ya descrita anteriormente. Descrita como patológica en

BIC.

97

Paciente 15: Mujer de 45 años de edad remitida por el Servicio de Ginecología a la


En primer lugar en la exploración física de la paciente se palparon mamas nodulares

destacando un nódulo para-areolar en la mama derecha doloroso por lo cual se le

solicitó a la paciente una mamografía y una ecografía mamaria en la que se le detectaron

microcalcificaciones periareolares en la mama derecha correspondientes a un nódulo

sólido, palpable y de bordes parcialmente mal definidos con microcalcificaciones en su

interior. También se detectó otro nódulo de bordes parcialmente definidos no palpable

correspondiente a un nódulo hipoecoico lobulado compatible con una adenopatía

intramamaria patológica. También se pudo identificar en la axila derecha varias

adenopatías patológicas. Posteriormente le practicaron la biopsia (BAG) del nódulo

retroareolar derecho, una PAAF y una resonancia magnética nuclear. Los resultados

obtenidos permitieron realizar el diagnótico de la paciente determinando un CDI de MD

con receptores hormonales positivos: RE 80%, los RP 60% y el HER2 negativo. Se le

practicó una mastectomía radical unilateral y se le administró posteriormente

quimioterapia neoadyuvante. Se le recomendó una mastectomía profiláctica

contralateral desde la Unidad de Mama que se realizó junto con una histerectomía y una

ooforectomia bilateral. En cuanto a los antecedentes personales, la paciente tuvo la

menarquía a los 14 años siendo ésta regular hasta el momento. También tuvo el primer

hijo a los 21 años. En cuanto a los antecedentes familiares indicaban que tenía madre

con cáncer de mama post-menopausia a los 70 años, una tía paterna con neoplasia de

mama pre-menopausia a los 35 años, una segunda tía materna con cáncer de mama

post-menopausia y una prima segunda con neoplasia de mama pre-menopausia a los 40

años de edad.

La mutación que se le detectó a esta paciente fue una deleción de 5 nucleótidos en el

exón 23 del gen BRCA2 (c.9026_9030delATCAT), la misma que la detectada en pacientes

anteriores y está descrita como patológica en la base de datos BIC.

98


de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. En primer

lugar se le realizó una mamografía de dos proyecciones de la mama izquierda,

resonancia magnética bilateral con contraste con secuencia dinámicas, ecografía de

mama para realizar la reevaluación, biopsia de mama ecodirigida y BAG. Con el estudio

ganglionar se determinó ausencia de malignidad. Se realizó el estudio IHQ de los

receptorers hormonales a partir de los cilindros biopsiados de las mamas y la

determinación que se hizo fue para la mama derecha: RE 90%; RP 50%; HER2 +. Para la

mama izquierda: RE 95%; RP 10%; HER2 +. Finalmente se le diagnosticó un cáncer de

mama bilateral: en la mama izquierda presentaba un CDI mientras que en la mama

derecha se detectó un CLI. La paciente se sometió a una mastectomía radical modificada

bilateral con reconstrucción total de mama. Se realizó un vaciamiento axilar y una

biopsia del ganglio centinela obteniéndose un resultado negativo para malignidad. Se

sometió a quimioterapia con Tamoxifeno. Finalmente se llevó a cabo la reconstrucción

mamaria. En cuanto a los antecedentes personales, la menarquia la tuvo a los 11 años y

era una paciente nuligesta. Los antecedentes familiares de cáncer de mama que

presentó esta paciente fue el de una tía paterna con cáncer de mama pre-menopausia

a los 36 años. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de

ésta paciente se puede observar en la figura 32 del ANEXO III.

La mutación que se encontró en esta paciente fue una deleción de 5 nucleotidos en el

exón 23 del gen BRCA2 (c.9026_9030delATCAT). Esta deleción tiene una implicación

patológica en el desarrollo de cáncer de mama hereditario y confiere riesgo familiar

como se observa en BIC.


de Cáncer de Mama del hospital Universitario de la Ribera para valoración de historia

familiar y seguimiento. A los 51 años, mediante mamografía con tomosíntesis de

seguimiento (por Hª Familiar), resonancia magnética de mama y biopsia ecodirigida, se

le diagnosticó un CDI de mama derecha con afectación axilar. En el estudio IHQ se realizó

la determinación de los receptores hormonales así como del HER2 dando un resultado

de RE 90%; RP 40% y Her2-. Se le proporcionó quimioterapia neoadyuvante y posterior

mastectomía radical modificada de la mama derecha. Se le realizó radioterapia por

99

afectación de adenopatías retropectorales. En cuanto a la historia personal, la paciente

tuvo la menarquia a los 11 años y el primer hijo a los 19 años. Los antecedentes

familiares que presentó esta paciente fueron madre con cáncer de mama post-

menopausia a los 53 años, hermana cáncer de mama pre-menopausia a los 42 años y tío

materno cáncer de mama a los 72 años.

La mutación encontrada en esta paciente fue un cambio del nucleótido Citosina por

Timina en la posición 9382 que se traduce en un cambio de aminoácido Arginina (R) por

un stop codón (X) en el codón 3218 (p.Arg3128Ter) en el exón 25 del gen BRCA2. De

modo que la síntesis de la proteína termina de forma prematura obteniéndose una

proteína truncada disfuncional. Dicha mutación está descrita en BIC como patológica.


de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera por presentar molestias en

mama derecha y una historia familiar relevante para valoración. Se le realizó una

resonancia magnética con contraste y se diagnosticó un FAD. En cuanto a los

antecedentes personales, la paciente tuvo la menarquía a los 13 años y era nuligesta.

Los antecedentes familiares que presentó fueron madre con cáncer de mama pre-

menopausia los 50 años, tía materna cáncer de mama bilateral pre-menopausia a los 50

años, primas hermanas con cáncer de mama pre-menopausia y tío abuelo materna con

cáncer de mama.

La mutación encontrada en esta paciente fue un cambio de nucleótido Citosina por

Timina en la posición 9382 que se traduce en un cambio de aminoácido Arginina (R) por

un stop codón (X) en el codón 3218 (p.Arg3128Ter) en el exón 25 del gen BRCA2. De

modo que la síntesis de la proteína termina de forma prematura obteniéndose una

proteína truncada disfuncional. Dicha mutación está descrita en BIC como patológica.

100

6. CONCLUSIONES

En nuestro estudio los pacientes que se realizaron el estudio genético de BRCA1 y

BRCA2 fueron mayoritariamente mujeres (92.67%) con antecedentes familiares de

cáncer de mama y de ovario principalmente (70.14%) y pre-menopáusicas (82.37%).

Las pacientes femeninas que acudieron a la Unidad de Riesgo familiar en un 83.81%,

de los casos presentaban algún tipo de cáncer y sólo un 16.19% acudió por consejo

genético por presentar antecedentes familiares.

Las neoplasias más frecuentes en el grupo de pacientes femeninas fueron

mayoritariamente de mama (62.94%) siendo el más frecuente el CDI (35.61%). Los

cánceres de ovario representaron el 12.95% y las pacientes que presentaron cáncer

de mama y de ovario simultáneamente fueron un 2.88%.

Los pacientes varones que acudieron a la Unidad de Riesgo de Cáncer de Mama

Familiar, un 27,26% por presentar algún tipo de cáncer de mama, un 22,74% cáncer

de próstata y un 50% por consulta de consejo genético por antecedentes familiares.

En nuestro estudio la prevalencia poblacional de mutaciones patológicas de los

genes BRCA1/BRCA2 causantes de cáncer de mama y ovario hereditario ha sido de

un 7.37%.

La técnica de MLPA dirigida a la detección de alteraciones en la dosis génica de

BRCA1/BRCA2 no ha detectado ningún caso de grandes duplicaciones, deleciones o

reordenamientos en los 164 pacientes analizados.

En el caso de las variantes sin significado clínico se observa una elevada presencia de

mutaciones en ambos genes en la población estudiada, siendo más frecuentes en el

gen BRCA1 que en el gen BRCA2.

En el caso de las variantes de significado clínico incierto, se observa que hay un

mayor prevalencia en el gen BRCA1 que en el gen BRCA2.

101

En el caso de las mutaciones nuevas se observa que en ambos genes se pueden

detectar gran variedad de cambios que todavía no se han descrito, pero que sería de

interés estudiar para determinar su implicación en el desarrollo del cáncer de

mama/ovario hereditario en nuestra población.

Se ha encontrado un total de 18 pacientes a los que se les ha detectado una

mutación patológica, de los cuales solamente uno es un varón. Las otras 17 son

mujeres con una media de edad de 43.12 años (SD= 6.36) con un rango de 28 a 76

años; diez de ellas con cáncer de mama y cinco con cáncer de ovario. Es importante

ampliar el estudio a la familia de éstas pacientes para determinar los pacientes de

riesgo y poder realizar un seguimiento y profilaxis adecuados.

La mutación patológica que se ha detectado con mayor frecuencia ha sido la deleción

c.9026_9030del5ATCAT en el exón 23 del gen BRCA2 que se ha encontrado en un

total de 5 pacientes.

Del total de pacientes con mutaciones patológicas un 61.11% presentaron

mutaciones en el gen BRCA2 y un 38.89% en el gen BRCA1.

102

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118

8. ANEXOS

ANEXO I

Tabla 1.- Lista de cebadores empleados en el estudio para la amplificación de los exones

del gen BRCA1. El diseño de los cebadores se hace de manera que las regiones intrónicas

adyacentes queden dentro del amplificado de modo que se puedan detectar posibles

mutaciones que afecten al splicing del ARNm.

GEN EXÓN CEBADORES

BRCA1 2 F: GAA GTT GTC ATT TTA TAA ACC TTT R: TGT CTT TTC TTC CCT AGT ATG T BRCA1 3 F: TCC TGA CAG AGC AGA CAT TTA R: TTG GAT TTT CGT TCT CAC TTA BRCA1 5 F: CTC TTA AGG GCA GTT GTC AG R: TTC CTA CTG TGG TTG CTT CC BRCA1 8 F: GCATTGTACCTGCCACAGTA R:ACCAGCTTCATAGACAAAGGTTCT BRCA1 9 F: TTGGTCATTTGACAGTTCTGCAT R:TTGTGGGTTGTAAAGGTCCCA BRCA1 11.1 F: CCA AGG TGT ATG AAG TAT GT R: GAT CAG CAT TCA GAT CTA CC BRCA1 11.2 F: CTC ACT AAA GAC AGA ATG R: CTT TCT GAA TGC TGC TAT BRCA1 11.3 F: CAG AAA CTG CCA TGC TTC AGA R: AGG CTT GCC TTC TTC CGA TA BRCA1 11.4 F: GTT CAC TCC AAA TCA GTA GAG AG R: CAG CTT TGC TTT TGA AGG CAG BRCA1 11.5 F: CCT AAC CCA ATA GAA TCA CTC G R: GAA CCA GGT GCA TTT GTT AAC TTC BRCA1 11.6 F: CAG CGA TAC TTT CCC AGA GC R: GTC CCT TGG GGT TTT CAA A BRCA1 11.7 F: CTG GAA GTT AGC ACT CTA GG R: GTT GCA CAT TCC TCT TCT GC BRCA1 11.8 F: CCG TTT TCA AAT CCA GGA AA R: TGA TGG GAA AAA GTG GTG GT BRCA1 11.9 F: GAG GCA ACG AAA CTG GAC TCA R: CTC AGG TTG CAA AAC CCC TA BRCA1 11.10 F: AAC AGA GGG CCA AAA TTG AA R: GGG TGA AAG GGC TAG GAC TC BRCA1 11.11 F: AAA GCG TCC AGA AAG GAG AGC R: GCC TTT GCC AAT ATT ACC TGG BRCA1 11.12 F: CAT TGA AGA ATA GCT TAA ATG R: CCT GGT TCC AAT ACC TAA GTT BRCA1 13 F: GGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCR: GCTTAAGATATCAGTGTTTGG BRCA1 18 F: GGCTCTTTAGCTTCTTAGGAC R: TCTGAGGTGTTAAAGGGAGG BRCA1 19 F: CCTCTCTATCTCCGTGAAAAGAGR: CTATATGACTGAATGAATATCTCTGG BRCA1 20 F: CTGCTCCACTTCCATTGAAG R: GAGATTTTTGTCAACTTGAGGG

119

GEN EXÓN CEBADORES BRCA2 2 F: CCAGCGCTTCTGAGTTTTAC R: GTGACGTACTGGGTTTTTAGC BRCA2 3 F: GGGTCACAAATTTGTCTGTCAC R: GTAGTTCTCCCCAGTCTACC BRCA2 10.1 F: GTG CTT CTG TTT TAT ACT TT R: CCA TTA GAT TCA AAT GTA G BRCA2 10.2 F: CTC ATT TGT ATC TGA AGT GG R: GAG AGA TGA AGA GCA GCA TC BRCA2 10.3 F: GCC ATT AAA TGA GGA AAC AG R: GAT AAT GGA AGC TGG CCA GC BRCA2 10.4 F: CTG TTT GCT CAC AGA AGG AG R: GAT TCA GGT ACC TCT GTC BRCA2 11.1 F: AGT GAA TGT GAT TGA TGG TAC R: CAT GCT GCA GCC AAG ACC TCT BRCA2 11.2 F: GAA GGA CAG TGT GAA AAT G R: CCT TTC TTG AAG GTG ATG C BRCA2 11.3 F: AAG ATG TAT GTG CTT TAA ATG R: CTC CTC TGC AAG AAC ATA AAC BRCA2 11.4 F: AGA CAC AGG TGA TAA ACA AG R: CAA GGT ATT TAC AAT TTC AA BRCA2 11.5 F: GCT CTC TGA ACA TAA CAT TAA G R: CAT TAT GAC ATG AAG ATC AG BRCA2 11.6 F: TAT CTT AAA GAC CAC TTC TG R: TGA AAC AAC AGA ATC ATG AC BRCA2 11.7 F: CTT CTG CAG AGG TAC ATC R: CAG TAA ATA GCA AGT CCg BRCA2 11.8 F: TTT GAT GGC AGT GAT TCA AG R: CTT ATG TCA GAA TGT AAT TC BRCA2 11.9 F: ATC AGA AAC CAG AAG AAT TG R: ATC TCA ATG GTC TCA CAT GC BRCA2 11.10 F: CAG AGA GGC CTG TAA AGA C R: GAA GTC TGA CTC ACA GAA G BRCA2 11.11 F: TGA AAA TTC AGC CTT AGC R: GCA TCT TTT ACA TTG GAT BRCA2 11.12 F: GTA TTG AGC CAG TAT TGA AG R: TGC CTC GTA ACA ACC TGC CAT BRCA2 11.13 F: GTT TCA GTA AAG TAA TTA AG R: AGA TTT TCC ACT TGC TGT GC BRCA2 11.14 F: AAG TCA GTC TCA TCT GCA A R: GAA ACT TGC TTT CCA CTT G BRCA2 11.15 F: CAT CTG CTT TCT CTG GAT TTA R: ATG TTC TCA ACA AGT GAC ACT BRCA2 11.16 F: ATG TTG AAG GTG GTT CTT CAG R: GTG ATT GGC AAC ACG AAA GG BRCA2 23 F: GAGGATCTGTATTTATTTTGAAAC R: GCTAACTGTATGTTAGCTCTTTC BRCA2 25 F: GGAAAACCTGAGCTTTCGCCA R: AGCTATTTCCTTGATACTGGACTGT BRCA2 27 F: GGGGAGGGAGACTGTGTGTAAT R:ACCAATACGGAATCGGGCAA

Tabla 2.- Lista de cebadores empleados en el estudio para la amplificación de los exones

del gen BRCA2. El diseño de los cebadores se hace de manera que las regiones intrónicas

adyacentes queden dentro del amplificado de modo que se puedan detectar posibles

mutaciones que afecten al splicing del ARNm.

120

ANEXO II

GEN EXON MUTACIÓN NM_007294.3

MUTACIÓN NP_009225.1

TIPO MUTACIÓN

PREV. ALELICA

PREV. POBLAC.

BIC ClinVar HGMD

BRCA1 9 c.591C>T p.Cys197= SINONIMA 0.33% 0.66% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o ovario? BRCA1 11.1 c.839C>T p.Ala280= SINONIMA 0.18% 0.36% NP BENIGNA No incluida BRCA1 11.5 c.2082C>T p.Ser694= SINONIMA 28.47% 48.08% NP BENIGNA No incluida BRCA1 11.5 c.2077G>A p.Asp693Asn MISSENSE 5.92% 12.19% NP BENIGNA Mutación relacionada con

exposición a radiación BRCA1 11.6 c.2311T>C p.Leu771= SINONIMA 26.48% 44.25% NP BENIGNA No incluida BRCA1 11.7 c.2612C>T p.Pro871Leu MISSENSE 31.55% 52.41% NP CL1 BENIGNA Mutación asociada con bajo

riesgo de Cáncer cervical BRCA1 11.9 c.3113A>G p.Glu1038Gly MISSENSE 31.27% 52.11% NP BENIGNA Mutación asociada a

Endometriosis BRCA1 11.10 c.3548A>G p.Lys1183Arg MISSENSE 30.03% 52.08% NP BENIGNA Mutación asociada a baja

protección frente CaM BRCA1 11.11 c.3600G>C p.Gln1200His MISSENSE 0.18% 0.36% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 13 c.4308T>C p.Ser1436= SINONIMA 31.76% 52.46% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA1 15 c.4535G>T p.Ser1512Ile MISSENSE 0.33% 0.41% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 16 c.4837A>G p.Ser1613Gly MISSENSE 34.54% 56.58% NP BENIGNA No incluida

Tabla 4.- GRUPO 1 BRCA1: VARIANTES BENIGNAS O PROBABLEMENTE BENIGNAS



TIPO MUTACIÓN

PREV. ALELICA

PREV. POBL.

BIC ClinVar HGMD

BRCA1 5 c.199G>T p.Asp67Tyr MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD BENIGNA Cáncer de mama y/o ovario? BRCA1 11.1 c.981A>G p.Thr327= MISSENSE 0.18% 0.35% VSCD VSCD CL2 No incluida BRCA1 11.2 c.1067A>G p.Gln356Arg MISSENSE 6.38% 12.76% VSCD BENIGNA Mutación asociada con CaM y/o Ov BRCA1 11.5 c.1945G>C p.Glu649Gln MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL4 No incluida BRCA1 11.6 c.2183G>A p.Arg728Lys MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA1 11.7 c.2521C>T p.Arg841Trp MISSENSE 1.55% 3.10% VSCD BENIGNA Cáncer de ovario? BRCA1 11.7 c.2632 G>A p.Ala878Thr MISSENSE 0.35% 0.69% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA1 11.7 c.2635G>A p.Glu879Lys MISSENSE 0.35% 0.69% VSCD VSCD CL4 No incluida BRCA1 11.8 c.2662C>T p.His888Tyr MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA1 11.8 c.2733A>G p.Gly911= MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL2 No incluida BRCA1 11.9 c.3024G>A p.Met1008Ile MISSENSE 0.18% 0.35% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 11.9 c.3119G>A p.Ser1040Asn MISSENSE 0.17% 5.99% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 11.11 c.3601 G>A p.Gly1201Cys MISSENSE 6.75% 10.95% NoDes VSCD No incluida BRCA1 11.11 c.3708T>G p.Asn1236Lys MISSENSE 0.18% 0.37% VSCD VSCD CL3 Cáncer de mama y/o ovario? BRCA1 11.11 c.3739G>A p.Val1247Ile MISSENSE 0.55% 1.09% VSCD BENIGNA No incluida BRCA1 11.12 c.3785C>T p.Ser1262Leu MISSENSE 0.35% 0.35% VSCD VSCD CL4 No incluida BRCA1 11.12 c.4039A>G p.Arg1347Gly MISSENSE 0.33% 0.66% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 16 c.4956G>A p.Met1652Ile MISSENSE 0.99% 1.97% VSCD BENIGNA Cáncer de mama y/o ovario? BRCA1 18 c.5152+5G>A IVS18+5 MISSENSE 0.35% 0.70% VSCD VSCD CL4 Mutación asociada con CaM y/o Ov BRCA1 19 c.5176A>G p.Arg1726Gly MISSENSE 0.18% 0.35% VSCD VSCD CL2 No incluida

Tabla 5.- GRUPO 2 BRCA1: VARIANTES DE SIGNIFICADO CLÍNICO INCIERTO

121



TIPO MUTACIÓN

PREV. ALELICA

PREV. POBL.

BIC ClinVar HGMD

BRCA1 2 c.66_67delAG p.Leu22_Glu23LeuValfsTer17

FRAMESHIFT 0.39% 0.77% Patológica CL5

Patológica Mutación relacionada con CaM

BRCA1 11.8 c.2866_2870 delTCTCA

p.Ser956_Gln957fsTer11

NONSENSE 0.18% 0.35% Patológica CL5

Patológica Murtación relacionada con cáncer de mama

BRCA1 11.12 c.4035_4035 delA

p.Glu1345=fsTer20


Patológica NO INCLUIDA

BRCA1 11.12 c.4065_4068 delTCAA

p.Asn1355_Gln1356?fsTer10


Patológica Mutación Relacionada con CaM

BRCA1 13 c.4307_4308delCT

p.Ser1436PhefsTer2


Patológica NO INCLUIDA

BRCA1 18 c.5095C>T p.Arg1699Trp MISSENSE 0.18% 0.35% Patológica CL5

Patológica Mutación relacionada con CaM y Ca Colorrectal

BRCA1 18 c.5123C>A p.Ala1708Glu MISSENSE 0.18% 0.35% Patológica CL5

Patológica Mutación relacionada con CaM

Tabla 6.- GRUPO 3 BRCA1: MUTACIONES PATOLÓGICAS



TIPO MUTACIÓN

PREV. ALELICA

PREV. POBL.

POLYPHEN MUTATION-TASTER

BRCA1 11.1 c.859 A>G p.Asn287Asp MISSENSE 0.18% 0.35% 0.947 PP PLMF BRCA1 11.4 c.1521 A>T p.Arg507Ser MISSENSE 0.91% 1.83% 0.995 PP PLMF BRCA1 11.5 c.1954 A>G p.Lys652Glu MISSENSE 0.18% 0.35% 0.132 BENIGNA PLMF BRCA1 11.6 c.2252 T>A p.Met751Lys MISSENSE 1.57% 3.14% 0.051 BENIGNA PLMF BRCA1 11.9 c.3072 C>A p.Ser1024Arg MISSENSE 0.35% 0.70% 0.894 PP PLMF BRCA1 11.9 c.3184 G>A p.Gly1062Ser MISSENSE 0.18% 0.35% 0.882 PP PLMF BRCA1 11.12 c.3839 C>G p.Ser1280Cys MISSENSE 0.35% 0.70% 0.030 BENIGNA PLMF BRCA1 11.12 c.3943 C>G p.Pro1315Ala MISSENSE 0.35% 0.70% 0.664 BENIGNA PLMF BRCA1 12 c.4226 A>T p.Gln1409Leu MISSENSE 0.33% 0.66% 0.033 BENIGNA Causal de enfermedad BRCA1 13 c.4337 A>T p.Glu1446Val MISSENSE 0.21% 0.41% 0.146 BENIGNA PLMF

Tabla 7.- GRUPO 4 BRCA1: MUTACIONES NUEVAS NO DESCRITAS

GEN EXON MUTACION NM_00005959.3

MUTACION NP_000050.2

TIPO MUTACIÓN

PREV. ALELICA

PREV. POBL.

BIC ClinVar HGMD

BRCA2 2 c.-26G>A IVS1-26 g>a 5’ UTR 17.53% 39.82% NP CL1 BENIGNA Protección frente a cáncer de mama esporádico

BRCA2 10.1 c.865A>C p.Asn289His MISSENSE 2.78% 5.56% NP BENIGNA Riesgo reducido de cáncer de mama

BRCA2 10.2 c.1114C>A p.Asn372His MISSENSE 18.30% 30.91% NP CL1 VSCD Asociada a cáncer de mama

BRCA2 10.2 c.1365A>G p.Ser455= SINONIMA 3.46% 6.91% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 10.4 c.1786G>C p.Asp596His MISSENSE 0.37% 0.75% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 10.4 c.1792A>G p.Thr598Ala MISSENSE 0.19% 0.37% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 11.2 c.2229T>C p.His743= SINONIMA 3.38% 6.76% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.3 c.2803G>A p.Asp935Asn MISSENSE 0.34% 0.68% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o

ovario?

122

BRCA2 11.4 c.2971 A>G p.Asn991Asp MISSENSE 3.43% 6.85% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.5 c.3396A>G p.Lys1132= SINONIMA 24.74% 45.29% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.7 c.3807T>C p.Val1269= SINONIMA 15.29% 26.80% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.8 c.4068G>A p.Leu1356= SINONIMA 1.62% 3.24% NP BENIGNA No incluida BRCA2 11.8 c.4258G>T p.Asp1420Tyr MISSENSE 0.18% 0.36% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o

ovario? BRCA2 11.9 c.4563A>G p.Leu1521= SINONIMA 72.24% 75.17% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.11 c.5199C>T p.Ser1733= SINONIMA 0.17% 0.35% NP BENIGNA No incluida BRCA2 11.11 c.5312G>A p.Gly1771Asp MISSENSE 0.52% 1.04% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o

ovario? BRCA2 11.13 c.5744C>T p.Thr1915Met MISSENSE 1.89% 3.78% NP CL1 BENIGNA Asociada con riesgo de

cáncer de mama BRCA2 11.13 c.5976A>G p.Ser1992= SINONIMA 0.17% 0.34% NP CL2 BENIGNA No incluida BRCA2 11.15 c.6347A>G p.His2116Arg MISSENSE 0.17% 0.34% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o

ovario? BRCA2 11.16 c.6513G>C p.Val2171= SINONIMA 62.37% 68.29% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 14 c.7242A>G p.Ser2414= SINONIMA 22.04% 39.47% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 14 c.7397C>T p.Ala2466Val MISSENSE 97.37% 97.37% NP CL1 BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 15 c.7469T>C p.Ile2490Thr MISSENSE 0.66% 1.32% NP CL1 BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 18 c.8182G>A p.Val2728Ile MISSENSE 0.33% 0.66% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 22 c.8851G>A p.Ala2951Thr MISSENSE 0.33% 0.66% NP CL1 BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 27 c.9976A>T p.Lys3326Ter NONSENSE 2.30% 4.61% NP BENIGNA Asociada con riesgo de

cáncer de mama BRCA2 27 c.10234A>G p.Ile3412Val MISSENSE 0.33% 0.66% NP CL1 BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 3’UTR c.*105A>C 3’UTR_105A>

C 3’ UTR 16.45% 32.89% NP CL1 BENIGNA No incluida

Tabla 8.- GRUPO 1 BRCA2: VARIANTES SIN SIGNIFICADO CLÍNICO



TIPO MUTACIÓN

PREV. ALELICA

PREV. POBL.

BIC ClinVar HGMD

BRCA2 3 c.125A>G p.Tyr42Cys MISSENSE 0.22% 0.44% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 3 c.223G>C p.Ala75Pro MISSENSE 0.22% 0.44% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 3 c.280C>T p.Pro94Ser MISSENSE 0.22% 0.44% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 11.13 c.5836T>C p.Ser1946Pro MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 11.13 c.5925T>G p.Cys1975Trp MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL4 No incluida BRCA2 11.14 c.6100C>T p.Arg2034Cys MISSENSE 2.08% 4.17% VSCD BENIGNA Asociada con riesgo de Leucemia BRCA2 11.15 c.6215C>G p.Ser2072Cys MISSENSE 0.34% 0.68% VSCD VSCD CL3 Cáncer de mama BRCA2 11.15 c.6323G>A p.Arg2108His MISSENSE 0.85% 1.69% VSCD BENIGNA No incluida BRCA2 11.15 c.6443C>A P.Ser2148Tyr MISSENSE 0.17% 0.34% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 11.16 c.6613G>A p.Val2205Met MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 11.16 c.6803G>A p.Arg2268Lys MISSENSE 0.33% 0.66% VSCD VSCD CL3 Cáncer de mama? BRCA2 19 c.8359C>T p.Arg2787Cys MISSENSE 0.33% 0.66% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 27 c.10110G>A p.Arg3370= SINONIMA 0.33% 0.66% VSCD VSCD CL2 No incluida

Tabla 9.- GRUPO 2 BRCA2: VARIANTES DE SIGNIFICADO CLÍNICO INCIERTO

123



TIPO MUTACIÓN

PREV. ALELICA

PREV. POBL.

BIC ClinVar HGMD

BRCA2 11.4 c.3264_3265insT p.Pro1088_Gln1089fsTer10


Patológica Cáncer de mama

BRCA2 11.11 c.5120delC p.Thr1707MetfsTer5 FRAMESHIFT 0.17% 0.35% Patológica No descrita BRCA2 11.13 c.5722_5723delCT p.Leu1908ArgfsTer53 FRAMESHIFT 0.17% 0.35% Patológica

CL5 Patológica No descrita

BRCA2 11.14 c.6024_6025insG p.Lys2008_Gln2009fsTer8


Patológica No descrita

BRCA2 23 c.9026_9030delATCAT;c.9254del5

p.Tyr3009_His3010fsTer6



BRCA2 23 c.8975_9100del126 p.Pro2992_Gln3034? FRAMESHIFT 0.17% 0.35% Patológica CL5

Patológica Cáncer de mama y/o ovario

BRCA2 25 c.9382C>T p.Arg3128Ter NONSENSE 0.39% 0.77% Patológica CL5


Tabla 10.- GRUPO 3 BRCA2: MUTACIONES PATOLÓGICAS



TIPO MUTACIÓN

PREV. ALELICA

PREV. POBL.

POLYPHEN MUTATION-TASTER

BRCA2 4 c.401 T>C p.Ler134Pro MISSENSE 0.33% 0.66% 0.001 BENIGNA Causal de enfermedad

BRCA2 10.3 c.1449 A>G p.Ala483= SINÓNIMA 1.82% 3.64% PLMF BRCA2 11.1 c.1934 G>T p.Arg645Ile MISSENSE 0.35% 0.70% 0.899 PP PLMF BRCA2 11.1 c.2181 A>G p.Ser727= SINÓNIMA 0.35% 0.69% PLMF BRCA2 11.3 c.2451 G>T p.Lys817Asn MISSENSE 0.34% 0.68% 0.003 BENIGNA PLMF BRCA2 11.3 c.2793 A>G p.Gly931= SINÓNIMA 0.17% 0.34% PLMF BRCA2 11.4 c.3152 T>C p.Leu1051Ser MISSENSE 0.17% 0.34% 0.084 BENIGNA PLMF BRCA2 11.5 c.3159 A>G p.Leu1053= SINÓNIMA 0.35% 0.69% PLMF BRCA2 11.5 c.3248 A>G p.Asn1083Asp MISSENSE 0.35% 0.69% 0.047 BENIGNA PLMF BRCA2 11.8 c.4090 A>G p.Ile1346Val MISSENSE 0.18% 0.36% 0.008 BENIGNA PLMF BRCA2 11.8 c.4284 A>C p.Ala1395= SINÓNIMA 0.36% 0.72% Causal de enfermedad BRCA2 11.8 c.4303 A>C p.Asn1435His MISSENSE 0.18% 0.36% 0.999PP PLMF BRCA2 11.9 c.4584 C>T p.Ser1528= SINÓNIMA 0.17% 0.35% Causal de enfermedad BRCA2 11.12 c.5395 G>A p.Ala1799Thr MISSENSE 0.17% 0.34% 0.000 BENIGNA PLMF BRCA2 11.12 c.5430 T>A p.Val1810= SINÓNIMA 0.34% 0.68% PLMF BRCA2 11.14 c.6182 C>A p.Ala2061Glu MISSENSE 0.17% 0.35% 1.000 PP Causal de enfermedad BRCA2 11.15 c.6257 T>A p.Ile2086Asn MISSENSE 0.34% 0.68% 0.133BENIGNA PLMF BRCA2 11.16 c.6660 A>G p.Glu2220= SINÓNIMA 0.17% 0.35% Causal de enfermedad BRCA2 27 c.9676 T>C p.Tyr3226His MISSENSE 0.33% 0.66% 0.021 BENIGNA PLMF

Tabla 11.- GRUPO 4 BRCA2: MUTACIONES NUEVAS NO DESCRITAS

124

ANEXO III

Figura 20.- Árbol Genealógica 1. Árbol genealógico de la familia de la paciente 1 a la que se ha detectado la MP c.66_67delAG; p.Leu22_Glu23LeuValfsTer17 en el exón 2 del gen BRCA1.

Figura 21.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 3 a la que se ha detectado la MP c.2866_2870delTCTCA en el exón 11 del gen BRCA1.

125

Figura 23.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 4 a la que se ha detectado la MP c.4065_4068delTCAA en el exón 11 del gen BRCA1.

Figura 24.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 5 a la que se ha detectado la MP c.4307_4308delCT en el exón 13 del gen BRCA1.

126

Figura 26.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 6 a la que se ha detectado la MP p.Arg1699Trp en el exón 18 del gen BRCA1.

Figura 28.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 7 a la que se ha detectado la MP p.Ala1708Glu en el exón 18 del gen BRCA1.

127

Figura 29.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 8 a la que se ha detectado la MP c.3263_3264insT en el exón 11 del gen BRCA2.

Figura 30.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 8 a la que se ha detectado la MP c.5722_5723delCTCT en el exón 11 del gen BRCA2.

128

Figura 31.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 8 a la que se ha detectado la MP c.9254delATCATC en el exón 23 del gen BRCA2.

Figura 32.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 16 a la que se ha detectado la MP c.9254delATCATC en el exón 23 del gen BRCA2.

129

Figura 33.- Leyenda para la interpretación de los árboles genealógicos

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