AISLAMIENTO DE E. COLI Y PLÁSMIDOS CON RESISTENCIA ADIVERSOS ANTIBIÓTICOS

OBJETIVOS. Preparar medio nutritivo para el crecimiento de bacterias y agar mac-conkey.

Aislar, identificar y verificar si hay resistencia a la ampicilina y otros antibióticos

por el microorganismo de interés.

FUNDAMENTO TEORICO.La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo que permite el aislamiento de

bacterias que han sufrido transformaciones genéticas. En algunos casos, por ejemplo, se

utiliza cristal violeta, sales biliares, acida sódica, telurito potasio, antibióticos, etc., en la

concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinados

microorganismos.

La Escherichia coli (pronunciado /eske'rikia 'koli/), también conocida por la abreviación de

su nombre, E. coli, es quizás el organismo procariota más estudiado por el ser humano.

Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos

animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados,

dado que es un organismo ubicuo. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore

von Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium coli. Posteriormente la

taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor.

Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican

y transcriben independientes del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en

bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su

tamaño varía desde 3 a 10 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su

tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. Los vectores plasmídicos

permiten clonar ligandos de DNA exógeno de hasta 4 kb ya que un tamaño mayor a éste

dificulta la clonación en estos vectores. El término plásmido fue presentado por primera

vez por el biólogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952.1

Las moléculas de ADN plasmídico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual

que el ADN de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera de los

mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN

cromosomal, los plásmidos no tienen proteínas asociadas.

En general, no contienen información esencial, sino que confieren ventajas al

hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo más común es el

de los plásmidos que contienen genes de resistencia a un determinado antibiótico, de

manera que el plásmido únicamente supondrá una ventaja en presencia de ese

antibiótico.

Hay algunos plásmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el

cromosoma bacteriano. Estos rompen momentáneamente el cromosoma y se sitúan en

su interior, con lo cual, automáticamente la maquinaria celular también reproduce el

plásmido. Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.

Los plásmidos se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética por su

capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal así como

también porque es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias

genéticas.

Los plásmidos usados en Ingeniería Genética suelen contener uno o dos genes que les

confieren resistencia a antibióticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay

otros métodos de selección además de la resistencia a antibióticos, como los basados en

fluorescencia o en proteínas que destruyen las células sin uso de antibióticos. Estos

nuevos métodos de selección de plásmidos son de uso frecuente en agrobiotecnología,

debido a la fuerte crítica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de

antibióticos en los organismos modificados genéticamente.

Resistencia a los antibióticos

Los plásmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que les confieren una

ventaja selectiva, lo que les da la habilidad de hacer a la bacteria resistente a los

antibióticos.

Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de

replicación u ORI (un punto inicial para la replicación del ADN), lo cual habilita al ADN

para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal. Los plásmidos de la

mayoría de las bacterias son circulares, pero también se conocen algunos lineales, los

cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayoría de eucariotas.

TiposUna forma de agrupar plásmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los

plásmidos conjugativos contienen “tra-genes”, los cuales ejecutan complejos procesos de

conjugación, como la transferencia sexual de plásmidos a otra bacteria. Los plásmidos

no-conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugación, de allí que ellos pueden

transferirse únicamente con la asistencia de los plásmidos conjugativos y lo hacen “por

accidente”. Una clase intermedia de plásmidos son los “movilizables” los cuales llevan

solo un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden “parasitar” un

plásmido conjugativo, transfiriéndose a una alta frecuencia solo en su presencia.

Es posible para plásmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple.

Siete tipos diferentes de plásmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero normalmente

plásmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos

sobrevive en la línea celular, debido a la regulación de las funciones vitales de los

plásmidos. Por lo tanto, los plásmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de

compatibilidad.

Otra forma de clasificar plásmidos es por función. Hay 5 clases principales: Plásmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son capaces de

conjugarse.

Plásmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir

resistencia contra antibióticos o venenos. Históricamente conocidos como

Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plásmidos.

Col-plásmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la

producción de) colinas y proteínas que pueden matar a otra bacteria.

Plásmidos degradativos: los cuales habilitan la digestión de sustancias

inusuales como tolueno o ácido salicílico.

Plásmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patógeno.

Los plásmidos pueden pertenecer a más de uno de estos grupos funcionales.

Los plásmidos solo pueden coexistir como una o más copias en cada bacteria, debido a

la división celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.

Algunos plásmidos incluyen un sistema de adición o “Sistema de Muerte

Postsegregacional” (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto

un veneno de larga vida y un antídoto de vida corta. Las células hija que retienen una

copia del plásmido sobreviven, mientras que una célula hija que falla al integrar el

plásmido muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo

de la célula padre. Este es un ejemplo de plásmidos como el ADN replicante.

Extracción del ADN plasmídico

En el maxiprep se cultivan volúmenes mucho más grandes de bacterias en suspensión.

Esencialmente, este es un escalado de la preparación mini-prep, el cual es seguido por

una purificación adicional. Esto resulta en una cantidad relativamente grande (0,5 -1 mg)

de ADN plásmido muy puro.

En los últimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar la

extracción plasmídica a varias escalas, purezas y niveles de automatización.

Las bacterias resistentes en la población humana

Como hemos mencionado anteriormente las resistencias bacterianas han sido

identificadas desde hace mucho tiempo, aunque quizás no tan bien la magnitud de su

impacto en salud pública y salud animal. Si bien no hay demasiados datos en lo que

hace a resistencias en bacterias que afectan seres humanos, la mayor información

proviene, en forma bastante lógica, del campo hospitalario.

Un listado de las bacterias resistentes de mayor trascendencia en infecciones hospitalarias, debería incluir a:

Estafilococos meticilino-resistentes

Enterobacter cloacae

Enterococos

Pseudomonas aeruginosa

Por su parte, en la población urbana o rural, las infecciones por microorganismos resistentes serían causadas por:

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pyogenes

Escherichia coli

Mycobacterium tuberculosis

Neisseria gonorrheae

Salmonella

Campylobacter

Clases de medios de cultivo Medios generales. En éstos se desarrollan una gran variedad de

microorganismos.

Medios de enriquecimiento. Favorece el crecimiento de un determinado

microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto celular.

Medios selectivos. Permiten el desarrollo de un microorganismo determinado,

inhibiendo el desarrollo de otros.

Medios diferenciales. Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades

de un microorganismo determinado

MATERIALES. Tubos de ensayo.

Aza.

Discos de antibiótico.

Estufas de cultivo.

Mechero.

Preparaciones a cantidades necesarias de: Agar mac-conkey.

Agar nutritivo.

Medio de nutritivo liquido: Extracto de levadura 5 g.

Triptona y peptona 10g.

Cloruro de sodio 10g.

Agua destilada csp. 1000ml.

PROCEDIMIENTOPara esta práctica traer una muestra que contenga escherichia coli específica y

exclusivamente, ya que no nos interesa saber ni investigar e. coli en muestras x.

Colocar al frente nuestro el mechero y la muestra que contiene los

microorganismos, así como es resto del material.

Flamear el filamento del aza, hasta que alcance el rojo incandescente.

Realizar todas las operaciones en la proximidad de la llama, introduzca el aza de

la siembra a la muestra. Trasfiera el inoculo al medio de cultivo solido (medio

mac-conkey ) y siembra de zigzag sobre la superficie.

Inocular a 37º c por 24 horas o el tiempo necesario para que se desarrollen las

bacterias.

Aislamiento de identificación. Después del desarrollo bacteriano en la caja Petri, transfiera una colonia con el

asa, siembre por agotamiento por estrías en agar nutritivo preparado la anterior

clase práctica.

Colocar los discos de antibiótico que se les proveerán, equidistantes entre sí.

Incubar a 24-48 h horas a 37ºc.

Analizar e interpretar los resultados, como un antibiograma cualquiera.

ESQUEMAMartesDesinfectamos el área de trabajo

Preparar nuestros materiales

Realizar la siembra: introducir el aza de la siembra a la muestra

Identificar la muestra

MiércolesColocar los discos de antibiótico

Observados el desarrollo de e.coli

JuevesRealizados las diferentes lecturas de los 3 grupos

RESULTADO

Sea identificado presencia de e. coli lo cual cambia de color, con un olor fétido y de

presencia característico.

Se ha observado que hay más sensibilidad en los antibióticos más comúnmente

conocidos.

ANTIBIÓTICOS 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO

CROCIPNalAMCERY

sensible

sensible

resistentesensible

resistente

sensible

sensible

resistentesensible

sensible

resistenteresistentesensible

CONCLUSION.Se ha realizado las respetivas siembras en el agar mac-conkey y agar nutritivo en el cual

observamos el desarrollo bacteriano en la caja Petri después Colocamos los discos de

antibiótico en el medio de cultivo y se observa mayor sensibilidad en los antibióticos

usados mas comúnmente.

CUESTIONARIO.1.- ¿Qué componentes tiene el medio de cultivo mac-conkey?

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

  Peptona 17.0Suspender 50 g del polvo por litro de

agua destilada. Reposar 5 minutos y

mezclar hasta uniformar. Calentar

suavemente y hervir 1 a 2 minutos

hasta disolver. Esterilizar en

autoclave a 121°C durante 15

minutos.

  Pluripeptona 3.0

  Lactosa 10.0

  Mezcla de sales biliares 1.5

  Cloruro de sodio 5.0

  Agar 13.5

  Rojo neutro 0.03

  Cristal violeta 0.001

pH final: 7.1 ± 0.2

2.- ¿Qué diferencia hay entre el medio nutritivo líquido y el sódico?

- Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta

razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto

principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente

cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada

concentración.

- Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente

gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal

obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas

bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a

temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es

la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos.

3.- ¿para que se utiliza el medio nutritivo, y que contiene?El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de

bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativas altas temperaturas.

Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se

distinguen mejor las colonias pequeñas.

En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia

espesa, con colonias difícilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente

(p/v):1

0,5 % de peptona;

0,3 % de extracto de carne/extracto de levadura;

1,5 % de agar;

0,5 % de cloruro de sodio;

agua destilada;

pH casi neutro (6,8) a 25 °C.

El caldo nutritivo se hace exactamente igual, excepto por la omisión del agar.

4.- ¿Qué microorganismos se usan comúnmente en el estudio de laboratorio de biotecnología?

Levaduras

Mohos

bacterias

5.- ¿Cuáles son las ventajas de usar microorganismos en las técnicas biotecnológicas?Ventajas

Ofrece los medios para producir alimentos de mejor calidad, en forma más eficiente y

segura para la salud y el medio ambiente.

Desde el punto de vista productivo, el uso de estas nuevas tecnologías.

permite aumentar la competitividad de países agroexportadores como la Argentina.

aumentando los rendimientos, disminuyendo los costos y aumentando la seguridad

de la cosecha.

generar innovaciones y mejoras en los alimentos conduciendo a prácticas agrícolas

más ecológicas, contribuyendo a una agricultura sustentable, que utiliza con respeto

los recursos del medio ambiente y sin hipotecar generaciones futuras.

6.- ¿Qué particularidades tiene la e. coli para ser usada en biotecnología?

Mayor velocidad específica de crecimiento que las levaduras y células de mamíferos; fácil

manipulación genética, no posee requerimientos costosos asociados a medios de cultivo o

equipamiento a diferencia de las células de organismos superiores; existencia de gran variedad

de vectores de expresión estables, y ser un microorganismo aprobado por las entidades

reguladoras para su utilización como hospedero en la producción de biofármaco.

7.- ¿Qué son los plasmodios y donde se encuentran?Un plasmodio es una célula multinucleada formada por fusión de varias (al contrario que

el sincitio, que es también multinucleado, pero en ese caso por división celular sin citocinesis,

solo cariocinesis). Estos agregados tienen forma de masa gelatinosa, y suelen producirse en

alguna etapa del ciclo vital de algunos protistas.

Se encuentran en ambientes húmedos deslizándose muy lentamente por el suelo en busca

de las partículas de alimento.

8.- ¿Qué otro microorganismo está siendo usado en reemplazo de e. coli, qué ventajas tiene?Salmonella cholerausis

9.- ¿Qué otros medios podemos emplear en el laboratorio en lugar de mac-comkey?Agarnsalmonella- shiguella

10.-¿qué medio se utiliza generalmente en la clínica para realizar los antibiogramas?Método de difusión en agar.

BIBLIOGRAFIA.

https://biotaetscientia.wordpress.com/tag/medio-de-cultivo/

https://www.google.com.bo/search?q=ventajas+de+usar+microorganismos+en+las+t %C3%A9cnicas+biotecnol%C3%B3gicas&oq=ventajas+de+usar+microorganismos+en+las+t%C3%A9cnicas+biotecnol%C3%B3gicas&aqs=chrome..69i57.374j0j8&sourceid=chrome&es_sm=93&ie=UTF-8#q=Qu%C3%A9+otro+microorganismo+est%C3%A1+siendo+usado+en+reemplazo+de+e.+coli

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm