Ecofisiología de anuros: aspectos del catabolismo del nitrógeno … · Facultad de Ciencias...

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Tesis de Posgrado

Ecofisiología de anuros: aspectosEcofisiología de anuros: aspectosdel catabolismo del nitrógeno endel catabolismo del nitrógeno en

condiciones fisiológicas y de estréscondiciones fisiológicas y de estrésambientalambiental

Rovedatti, María Gabriela

1995

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.

Cita tipo APA:Rovedatti, María Gabriela. (1995). Ecofisiología de anuros: aspectos del catabolismo delnitrógeno en condiciones fisiológicas y de estrés ambiental. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2776_Rovedatti.pdf

Cita tipo Chicago:Rovedatti, María Gabriela. "Ecofisiología de anuros: aspectos del catabolismo del nitrógeno encondiciones fisiológicas y de estrés ambiental". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 1995.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2776_Rovedatti.pdf

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BIBt-IOTECA CEHÏ'RAL‘Fam-JLer DEcuewcms EXAC’i'AS

:v NAÏURALES / um

Universidad de Buenos AiresFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DEDOCTORA EN CIENCIAS BIOLOGICAS

ECOFISIOLOGIA DE ANUROS: ASPECTOS DELCATABOLISMODEL NITROGENOEN

CONDICIONESFISIOLOGICASYDE ESTRESAMBIENTAL

AutoraLic. en Cs. Biológicas María Gabriela Rovedatti

DirectorProf. Dr. Alfredo Salibián

82 2 6 9 "'. Lugarde Trabajo

oratorio del Programa de Ecofisiología AplicadaDepartamento de Ciencias Básicas

Universidad Nacional de Luján

—1995- ¡92776;

LJÉLU

A mis hijos,Francisco y Mateo Dennehy.

Sección Página

Agradecimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Resumen 7

Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ll

Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

l. INTRODUCCION GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161.1 RELACION ENTRE LA MODALIDAD DEL CATABOLISMO

DEL NITROGENO Y EL HABITAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161.1.1. Animales amoniotélicos, ureotélicos, y uricotélicos . . . . . . . . 161.1.2. Algunas anomalías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171.1.3. Enzimas del metabolismo de excreción nitrogenada . . . . . . . l71.1.4. Ia arginasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191.1.5. La uricasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1.2. ONTOGENESIS DE ALGUNAS ENZIMAS DELCATABOLISMO DE PRODUCTOS NITROGENADOS . . . . . . . . 22

1.3. RESPUESTA DEL METABOLISMO NITROGENADOFRENTE AL ESTRES AMBIENTAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

1.3.1. La osmolaridad externa como estresante . . . . . . . . . . . . . . 241.3.2. El cadmio como estresante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2. HIPOTESIS Y OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3. MATERIALES Y METODOS GENERALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303.1. OBTENCION Y MANTENIMIENTO DE LOS ANIMALES . 303.2. OBTENCION Y MANTENIMIENTO DE LOS EMBRIONES

Y LARVAS EN CONDICIONES CONTROL . . . . . . . . . . . . .. 303.3. MEDIOS DE DESARROLLO EXPERIMENTALES PARA

EMBRIONES Y LARVAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323.4. EXTRACCION DE ORINA Y SANGRE . . . . . . . . . . . . . . . .. 323.5. EXTRACCION DE HIGADO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 323.6. PREPARACION DE LOS HOMOGENATOS . . . . . . . . . . . . . . . 323.7. DETERMINACION DEL PESO HUMEDO Y SECO DE LOS

EMBRIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333.8. TECNICAS ANALITICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.8.1. Urea en orina y plasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333.8.2. Amonfaco en orina y plasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

8.2. MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 728.4. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 738.5. DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

9. CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

BIBLIOGRAFIA CITADA i

INDICE DE TABLAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

INDICE DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .viii

3.8.3. Acido úrico en orina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333.8.4. Proteínas totales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.8.5. Actividad de la arginasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343.8.6. Actividad de la uricasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.9. TRATAMIENTO ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS . . . . . 35

4. EXCRECION DE PRODUCTOS NITROGENADOS URINARIOS ENANUROS DE DIFERENTE HABITAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

4.1. INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364.2. MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

4.2.1. Preadaptación de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364.3. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374.4. DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5. ACTIVIDAD DE LA ARGINASA HEPATICA Y PERFIL DE LOSPRODUCTOS NITROGENADOS URINARIOS EN ADULTOS DEBUFO ARENARUM SOMET'IDOS A DISTINTA INGESTA PROTEICA . . . . . 43

5.1. INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435.2. MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445.3. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465.4. DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

6. ONTOGENESIS DE LA ARGINASA EN BUFO ARENARUM: EMBRIONESDESARROLLADOS EN CONDICIONES ESTANDAR Y DEDIFERENTE OSMOLARIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

6.1. INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506.2. MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

6.2.1. Obtención de los embriones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506.2.2. Toma de muestras para la medición de la actividad de la

arginasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 516.2.3. Tratamiento estadístico de los resultados . . . . . . . . . . . . . . 51

6.3. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 516.3.1. Embriones desarrollados en solución de Holtfreter . . . . . . . . 516.3.2. Embriones desarrollados en medios de diferente

osmolaridad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S4

6.3.3. Actividad de la arginasa en hígado de larvas . . . . . . . . . . . . 636.4. DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

6.4.1. Embriones en condiciones control . . . . . . . . . . . . . . . . . . 646.4.2. Embriones en condiciones experimentales: adaptación a

diferentes medios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

7. ACTIVIDAD DE LA URICASA EN EMBRIONES, LARVAS Y ADULTOSDE BUFO ARENARUM Y LEPTODACTYLUS OCELLATUS . . . . . . . . . . . . . 67

7.1. INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 677.2. MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 677.3. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 687.4. DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

8. EFECTO DEL CADMIO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA ARGINASAHEPATICA DE BUFO ARENARUM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

8.1. INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

A ¡min

- A la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CIC) porhaberme permitido acceder a las Becas de Iniciación y Perfeccionamiento.

- A la Universidad Nacional de Luján por las Becas de Perfeccionamiento y FormaciónSuperior, y por proporcionarme lugar de trabajo y apoyo económico para asistir a diversoscursos y congresos científicos en el país y en el exterior.

- Al Dr. Alfredo Salibián, por haberme abierto las puertas de su Laboratorio y formado casidesde cero en lo que es un trabajo científico: las técnicas de laboratorio, el análisis einterpretación de datos, la redacción de trabajos científicos etc., y por tener el privilegiode haber sido dirigida por un científico que tiene como valores fundamentales además dela honestidad intelectual y la vocación por el trabajo, la camaradería y el interés por el otrocomo persona. Y por último, no puedo dejar de mencionar y agradecer la confianza y elempuje que me brindó en la fase final de la realización de esta Tesis.

- A la Dra. Cristina Maggese (Cátedrea de Embriología Animal, Departamento de CienciasBiológicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA) por su apoyo como consejerade estudios.

- A la Prof. Beatriz Gonzalez (Cátedra de Biometría, Depto de Ciencias Biológicas,Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA) y al Prof. Carlos Cappelletti (Facultad deCiencias Veterinarias, UBA) por orientarme en el análisis estadístico de una parte de losdatos de esta Tesis.

- A Carolina Loez por la traducción del resumen al francés.

- A la Prof. Alicia Carles (División Lenguas Extranjeras, Depto de Educación, UniversidadNacional de Luján) por la revisión del inglés en el resumen y a la Prof. Marta Morelli deOntiveros (Cátedra de Lengua Española, Profesorado en Letras, Universidad Nacional deSalta, Sede Regional Tartagal) por la revisión de la sintaxis de toda la Tesis.

- A Patricia Castañé por su amistad, por facilitar mi aprendizaje en el primer acercamientoa este tema, y por ocho años compartiendo experimentos en el Laboratorio en el marco deuna excelente convivencia.

—A Sandra Demichelis, por haber estado simpre dispuesta a ayudar, y por alentarme enmomentos difíciles.

- A Roberto Yoshihara y Javier Katz, quienes brindaron su colaboración técnica con unagran dedicación, y sobre todo por su inestimable compañerismo.

- A Carolina Loez, Mirta Topalián, Lucrecia Ferrari, Fernando de la Torre y MaríaEugenia García, por hacer del Laboratorio un lugar donde valía la pena pasar la mayorparte del día; donde se escuchaba y se era escuchado, y donde se podía recibir un cariñosoconsejo que mucha veces ayudaba a vivir.

- A Alejandro Dennehy, mi marido, por estar siempre al lado mío y de mi lado; porayudame de mil maneras, y porque sin su comprensión, que llegó muchas veces más alláde lo imaginable, hubiese sido imposible la realización de esta Tesis.

- A Roberto Rovedatti, mi padre, por millones de cosas, pero en este caso cabe elinculcarme la inquietud por conocer y el gusto por estudiar.

- A Con'na Gómez Villafañe, mi madre, por otro millón de cosas y en especial por suapoyo incondicional como sólo ella puede hacerlo.

A todos, Muchas Gracias.

RmSe estudiaron aspectos del catabolismo de productos nitrogenados en anuros de diferentes

especies, en distintos momentos de su ciclo de vida, en condiciones fisiológicas y de estrésambiental.

Se evaluaron los productos de excreción nitrogenada urinaria (amoniaco, urea y ácidoúrico), la urea en plasma y la actividad específica de la arginasa y la uricasa.

Se obtuvo el perfil de los productos de excreción nitrogenada urinaria de adultos Bufoarenarum, Leptodactylus ocellatus, Bufo granulosus, y Bufo chilensis de habitat terrestre,semiacuático, cavícola y montañoso respectivamente. La urea fue el componentemayoritario en la orina de todas las especies y se hallaron pequeñas cantidades de ácidoúrico en las tres primeras.

Se estudió el efecto de la dieta y el ayuno sobre el metabolismo de sustanciasnitrogenadas para lo cual se dosó la actividad de la arginasa hepática, los productos deexcreción nitrogenada urinaria y la urea en plasma en adultos de Bufo arenamm sometidosal consumo de diferentes cantidades de proteína. El ayuno redujo significativamente laactividad específica de la arginasa y aumentó el contenido total de proteínas hepáticas. Lapartición de los productos excretados resultó independiente de la ingesta de proteínas.

Se realizó un seguimiento de la actividad de la arginasa en homogenatos totales deembriones a lo largo de 17 estadios y el primer estadío larval de Bufo arenamm incubadosen solución de Holtfreter diluída. La enzima fue detectada a partir del estadío de tuboneural y se observó un pequeño incremento en los estadios tempranos, el cual se tornó máspronunciado en la fase embrionaria final. La actividad se duplicó en el primer estadío larvalcoincidiendo con el momento en que los animales comienzan a alimentarse.

La actividad de la arginasa hepática en larvas de Bufo arenarum de estadio 29 fuenotablemente más alta que en el homogenato total de larvas de estadio 26; no obstante, lamisma se mantuvo dos órdenes de magnitud por debajo de la actividad determinada en elhígado de adultos.

Se evaluó la actividad de la arginasa embrionaria de Brgfoarenarum, en homogenatostotales en condiciones de estrés osmótico, desarrollando a los animales desde la fecundaciónen: agua destilada (simulando una sobrehidratación) y en solución de Holtfreter concentrada(simulando una ligera deshidratación) y se comparó con animales desarrollados encondiciones control (mantenidos en solución de Holtfreter). En los tres grupos la actividadcreció a lo largo del tiempo. A partir del estadio de circulación branquial la actividad fuemenor en el grupo de solución concentrada. En el último estadío embrionario, opérculocompleto, la actividad específica de los tres grupos no presentó diferencias significativas.

El estudio de la actividad de la uricasa hepática en homogenatos totales de embrionesdesde el estadío de opérculo completo, de larvas (estadio 29), juveniles (estadío 35) y

7

Resúmen

adultos de Blgfoarenarum indicó que la misma aumentó a medida que avanzó el desarrollosiendo significativa la diferencia entre el adulto y los estadios larvales. En hígado de larvasde estadío 29 mantenidas en solución de Holtfreter, agua destilada y solución de Holtfreterconcentrada se encontró que la uricasa aumentó en la situación concentrada.

Se comparó la actividad de la uricasa hepática de adultos de Bufo arenarum yLeptodaclylus ocellarus siendo significativamente menor la de la segunda especie.

Se evaluó la actividad de la arginasa en hígado de adultos de Bry‘oarenarum inyectadoscon cadmio, considerando a este metal como otro factor estresante ambiental. La mismadisminuyó significativamente después de la inyección de cantidades subletales del metal.

Se concluyó:

l. El perfil de excreción nitrogenada no sería el mejor indicador de los ambientes queocupan los anfibios adultos en cuanto a la disponibilidad de agua; la on'na de los adultosde todas las especies estudiadas presentó cantidades medibles de ácido úrico.

2. La cantidad de proteínas ingerida por los anuros adultos modifica la actividad de laarginasa.

3. La actividad de la arginasa se detecta tempranamente en los embriones de Bufoarenarum y se incrementa a lo largo del desarrollo.

4. La arginasa embrionaria se ve reducida frente a un estrés osmótico al comienzo deldesarrollo.

5. La uricasa aparece mas tadfamente en los embriones de Bufo arenamm que la arginasay se incrementa a lo largo del desarrollo.

6. La actividad de la uricasa hepática en adultos podría ser considerada como unparámetro indicador del grado de terrestrialidad de los anuros ureotélicos.

7. En hígado de larvas la uricasa aumenta debido al estrés osmótico.

8. El cadmio inyectado a Brgfoarenarum adultos provoca una reducción en la actividadde la arginasa hepática.

Palabras clave: Bufo arenamm - Leptodactylus ocellatus - Bufo chilensís - quogranulosus - metabolismo nitrogenado - anuros adultos - embriones - larvas - excreciónnitrogenda urinaria - ontogénesis - arginasa - uricasa - estrés osmótico - cadmio subletal.

SumaWe studied aspects of nitrogen catabolism of different species of anurans, in varios

stages of their life cycle, under physiological and stress conditions.

Urinary nitrogen waste products (urea, ammonia and uric acid), plasma urea and thespecific activity of arginase and uricase were evaluated; urine of adult of all studied speciescontained mensurable amounts of uric acid.

The nitrogen waste product profile of Bufo arenarum, Leptodaclylus ocellalus, Bigfogranulosus, and Bufo chilensís of terrestrial, semi-aquatic, fossorial, and mountainoushabitats respectiver was obtained. Urea was the principal component in the urine of all thespecies, and small amounts of uric acid were found in the three first ones.

The effect of diet and fasting on the nitrogen metabolism was studied. For this purpose,detenninations of specific activity of hepatic arginase, urinary nítrogen excretion productsand plasma urea were made in adult Bufo arenarum submitted to diets with different levelsof protein. Fasting reduced arginase specific activity and increased total hepatic proteincontent. The distribution of excreted products proved to be independent of the ingestedproteins.

A screening of arginase activity in total homogenates of embryos was made along l7stages and in the first larval stage of Bufo arenarum raised in Holtfreter solutions. Theenzyme was detected from the stage of neural tube and a gradual increase in the earlystages was observed, which became more pronounced at the end of embryonic development.The activity increased two fold at the beginning of larval stages when the animals start tofeed.

Hepatic arginase activity in Bufo arenarum tadpoles of stage 29 was remarkably higherthan in total homogenates of stage 26 tadpoles; however, it remained two magnitude ordersbelow the adult hepatic activity.

Embryonic arginase activity of Bufo arenarum was evaluated in total homogenates inmild osmotic stress conditions, developing the animals from fertilization in: distilled water(simulating an overhydratation) and concentrated Holtfreter solutions (simulating slightdehydratation) and was compared with animals in control conditions ( raised in Holtfretersolutions). In the three groups the activity increased with time. From the stage of gillcirculation on the activity was lower in the group of concentrated solution. In the lastembryonic stage, complete operculum, the specific activity of the three groups did notpresent significant differences.

The study of hepatic uricase activity in total homogentes of embryos beginning at thestage of complete operculum, of tadpoles (stage 29), juveniles (stage 35) and adults of Bufoarenarum indicated that it was higher as the development advanced, the difference between

9

Summary

the adults with respect to the other two stages being significant. In tadpoles of stage 29 livermantained in Holtfreter solution, distilled water and concentrated Holtfreter solution it wasfound that uricase was increased in the concentrated situation.

Hepatic uricase activity of adult BIJo arenarum and uptodactylus ocellatus wascompared, the one of the second species being significantly lower.

Hepatic arginase activity of adult quo arenarum injected with cadmium was evaluatedconsiden'ng this metal as an anthropogenic environmental stressant. It decreasedsignificantly after the injection of sublethal amounts of the metal.

It was concluded that:

l. The nitrogen excretion profile would not be the best indicator of the environment ofthe adult amphibians in terms of water availability.

2. Arginase activity is modified by the amount of proteins taken by adult anuran.

3. Arginase activity is detected early in Bigfoarenarum embryos and it increases alongits development.

4. Osmotic stress reduced embryonic arginase activity at the beginning of thedevelopment.

5. Uricase appears later than arginase in Bufo arenarum embryos, and it increases alongthe development.

6. Adult hepatic uricase activity could be considered as an indicator parameter of theterretriality of ureotelic anurans.

7. Osmotic stress increased tadpole liver uricase activity.

8. Cadmium injected to adult Bufo arenarum provokes reduction in hepatic arginaseactivity.

Key words: Bufo arenamm - Leptodactylus ocellatus - Bufo chilensis - quo granulosus nitrogen metabolism - adult anuran - embryos - larvae - urinary nitrogen excretion

ontogeny - arginase - un'case - osmotic stress - cadmium sublethal.

RmChez des anoures de différentes especes, les aspects du catabolisme des produits azotes

pendant différentes périodes du cycle de vie ont été étudiés, aussi bien dans des conditionsphysiologiques que lors d’un "stress" de l’environnement.

On a évalué les produits d’excrétion azotée urinaire (ammoniac, urée et acide urique),l'urée dans le plasma, et les activités spécifiques de l’arginase et de l’uricase.

Le profil des produits d’excrétion azotée urinaire des adultes de Bufo arenamm,Leptodaclylus ocellatus, Bufo granulosus et Bufo chilensis a été obtenu. Ces especes ont,respectivement, un habitat terrestre, semi-aquatique, cavemicole et montagneux. L’urée aété le composant majoritaire dans l’urine de toutes les especes et chez les trois premieres,on a trouvé des petites quantités d’acide urique.

Pour étudier l’effet de la diete et du jéune sur le métabolisme des substances azotées,on a mesuré l'activité de l’arginase hépatique, les produits d’excrétion azotée urinaire etl’urée dans le plasma chez des adultes de Bufo arenarum soumis a la consommation dedifférentes quantités de protéine. Le jéune réduisit de facon significative l’activité spéeifiquede l’arginase et augmenta le contenu total de protéines hépatiques. La répartition desproduits excrétés résulta indépendante de l’ingestion des protéínes.

On a suivi l’activité de l’arginase dans des homogénats totaux d’embryons au long de17 stades de vie et le premier stade larval de quo arenamm incubés dans une solution deHoltfreter diluée. L’enzyme a été détecté a partir du stade tube neural et on a observé unelégere augmentation dans les premiers stades, plus marquée encore dans la phaseembryonnaire finale. L’activité a été doublée dans le premier stade larval en méme tempsque les animaux commencaient a s'alimenter.

L’activité de l’arginase hépatique chez des larves de Bufo arenarum du Stade 29 futnotablement plus levée que dans l’homogénat total de larves du stade 26; pourtant cetteactivité s’est maintenue deux ordres de magnitude au dessous de l’activité hépatique desadultes.

On a évalué l‘activité de l’arginase embryonnaire de Bufo arenarum, dans deshomogénats totaux, dans les conditions de stress osmotique, en développant les animaux desla fécondation dans: de l’eau distillée (en simulant une surhydratation) et en solution deHoltfreter concentrée (en simulant une déshydratation) en comparant avec les animauxincubés dans des conditions contrólées (animaux mantenus en solution de Holtfreter). Dansles trois groupes l’activité augmenta avec le temps. A partir du stade de circulationbranchiale elle a été inférieure chez le groupe de solution concentrée. Dans le demier stadeembryonnaire, opercule complet, l’activité spécifique des trois groupes ne présenta pas dedifferences significatives.

Résumé

L’étude de l’activité de l’uricase hépatique dans des homogénats totaux d’embryonsdepuis le stade d’opercule complet, de larves (stade 29), de jeunes (stade 35) et d’ adultesde Bufo arenarum indiqua que cette activité augmenta a mesure que le développementavanqa, la difference étant significative entre les adultes et les stades larvaux. Dans le foiede larves de stade 29 maintenues dans une solution de Holtfreter, eau distillée et en solutionde Holtfreter concentrée, l’uricase augmenta dans le demier cas.

On a comparó l’activité de l’uricase hépatique des adultes de Bufo arenarum et deLeptodactyllus ocellatus, celle de la seconde espece ayant été significativement inférieure.

On a évalué l’activité de l’arginase du foie des adultes de qu’o arenamm injectés avecdu cadmium, en considérant ce métal comme un autre facteur de stress de l’environnement.L’activité diminua significativement apres l’administration de quantités subléthales du metal.

Nous avons conclu que:

l. Le profil de l’excrétion azotée ne serait pas le meilleur indicateur des environnementsqu’occuppent les amphibiens adultes quant a la disponibilité d’eau; l’urine des adultes detoutes les especes étudiées presenta des quantítés mesurables d’acide urique.

2. La quantité de protéines consommée par les anoures adultes modifie l’activíté del’arginase.

3. L’activité de l’arginase se detecte tót chez les embryons de quo arenarum etaugmente au cours du développement.

4.L'arginase embryonnaire réduit face a un stress osmotique au commencement dudéveloppement.

S. L’uricase apparaít plus tardivement chez les embryons de Bufo arenarum quel’arginase et augmente au cours du développement.

6. L’activité de l’uricase hépatíque chez les adultes pourrait étre considérée comme unparametre indicateur du degré de terrestrialité des anoures uréotéliques.

7. Dans le foie des larves l’uricase se modiñe a cause du stress osmotique.

8. Le cadmium injecté aux adultes de Bufo arenarum provoque une réduction del’activité de l’arginase hépatique.

Mots-clé: Bufo arenarum - Leptodactyllus ocellatus - Bufo chilensis - Bufo granulosus- métabolisme azoté - anoures adultes - embryons - larves - excrétion azotée urinaire ontogénese - arginase - uricase - stress osmotique - cadmium subléthal.

momUntersucht wurden verschiedene Gesichtspunkte des Stickstofflcatabolismus von Anuren

unterschiedlicher Arten in den jeweiligen Abschnitten ihres Lebenszyklus unterphysiologischen Bedingungen und UmweltstreB.

Ausgewertet wurden die sückstoffhaltigen Hamausscheidungen (Ammoniak, Hamstoffund Hamsáure), darüber hinaus der Plasmahamstoff und die spezifischen Aktivitáten derArginase und der Urikase.

So hat man das Profil der stickstofflialtigen Han ' " v t ¿"he von Bufoarenarum, Leptodactylus oceIIatus, Bufo granulosus und Bufo chilem'is entsprechend ihrenterrestn’schen, amphibischen, hóhlenartigen und gebirgigen natürlichen Lebensráumenerhalten. Der Hamstoff war jeweils die Hauptkomponente des Urins aller untersuchtenArten, bei den drei erstgenannten fanden sich darüber hinaus geringe Mengen Harnsáureim Urin.

Es wurden die Auswirkungen von Diát und Nahrungsentzug auf den Metabolismus derstickstoffhaltigen Substanzen untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Aktivitñt derLeberarginase, der stickstofflialtigen Han L " g , ‘ "u- und des Plasmahamstoffesvon adulten Individuen der Art Bufo arenamm 18 Tage lang dem Verbrauch derunterschiedliehen Proteinmengen angepaBt. Durch den Nahrungsentzug wurde diespezifische Aktivitát der Arginase signifikant gesenkt und gleichzeitig ein Anstieg desGesamtgehaltes der Leberproteine erreicht. Die Teilung der Ausscheidungsprodukte warunabhángig von der Proteinverdauung.

Der Verlauf der Arginaseaktívitát wurde in einer Langsstudie (17 Stadien) anvollstandigen Embi, L a ‘ und dem ersten Larvenstadium von Bufo arenarumin 10%iger Holtfreterlósung verfolgt. Die Enzymaktivitát wurde von Beginn desNeuralrohrstadiums an registn'ert. Dabei wurde ein geringtïigiger Anstieg in den frühenStadien beobachtet, der sich in der spáten Embryonalphase ausgeprágter darstellte. DieAktivitát verdoppelte sich im ersten Larvenstadium, welches zeitlich mit der erstenNahrungsaufnahme der Tiere zusammentrifft.

Bei Haltung in künstliehem SüBwasser war die Aktivitát der Leberarginase von Larvenvon Bufo arenarum im Stadium 29 deutlich hóher als die der vollstandigenLarvenhomogenate im Stadium 26. Sie bewegte sich jedoch immer noch zweiGróBenordnungen unter der Leberaktivitát der Erwachsenen.

Die Aktivitát der embryonalen Arginase von Bufo arenarum wurde unterStandardbedingungen (die Tiere wurden in 10%iger Holtfreterlósung gehalten) undosmotischem StreB an vollstandigen Homogenaten ausgewertet. Dabei wurde dieEntwieklung der Tiere von der Befruchtung an in: destilliertem Wasser (eineHyperhydratation simulierend) und lOfach konzentrierter Holtfreterlósung (eine leichteDehydratation simulierend) beobachtet. In den 3 Beobachtungsgruppen wuehs im Verlaufder Zeit die Aktivitñt. Vom Stadium des Kiemenkreislaufs an war die Aktivitát in der

13

Zusammenfassung

der Zeit die Aktivitát. Vom Stadium des Kiemenkreislaufs an war die Aktivitñt in derGruppe der konzentrierten Lósung geringer. Im letztem Embryonalstadium mitvollstándigem Kiemendeckel zeigte die Aktivitát der 3 Gruppen keine signifikantenUnterschiede.

Gemessen wurde die Aktivitát der Urikase an vollstándigen Embi, L a ‘ vonBufo arenarum. Diese konnte vom Stadium des vollstandigen Kiemendeckels an gemessenwerden. Das Studium der Aktivitát der Leberurikase von Larven (Stadium 29),Heranwachsenden (Stadium 35) und Erwachsenen derselben Art zeigte, daB selbige in demMaBe ansteigt, in dem die Entwicldung fortschreitet, wobei der Unterschied zwischen denErwachsenen auf der einen und den beiden anderen Stadien auf der anderen Seite deutlichwar. In den Larvenlebem des Stadiums 29 ergab sich beim Vergleich von Holtfreterlósung,destilliertem Wasser und konzentrierter Holtfreterlósung ein Anstieg der Urikase zumkonzentrierteren Milieu hin.

Beim Vergleich der Aktivitát der Leberun'kase von Bufo arenarum und Leptodactylusocellatus ergab sich bei der zuletztgenannten Art ein signifikant niedrigerer Wert.

Untersucht wurde die Aktivitñt der Leberarginase von Erwachsenen der Art Bufoarenarum nach Simulation einer Umweltbelastung antropogenen Ursprungs am Beispiel vonCadmium, welches injiziert wurde. Dabei verringerte sich diese signifikant bei den beidenzur Anwendung gelangten Metallinjektionen in Hóhe von 2.8 bzw. 5 mg Cadmium/kgGewicht.

SchluBfolgerung:

l. Das Profil der “" ' ‘ " L " o kann nicht unbedingt als bestgeeigneterIndikator der I L L " a bezüglich der Wasserverfügbartkeit, unter denen dieErwachsenen leben, betrachtetïwerden.

2. Bei erwachsenen Anuren schwankt die Aktivitát der Arginase in Abhángigkeit vonder aufgenommenen Proteinmenge.

3. Die Aktivitát der Arginase ist bereits früh bei Embryonen von Bufo arenarumnachweisbar und steigt im Verlauf der Entwicklung an.

4. Bei der embryonalen Arginase ergeben sich unter StreBbedingungen Veránderungen.

5. Die Urikase der embryonalen Stadien von Bufo arenarum erscheint spáter als dieArginase und steigt im weiteren Verlauf der Entwicldung an.

6. Die Aktivitñt der Leberurikase bei Erwachsenen kónnte als Hinweis auf den Grad derAffinitát zum terrestrischen Lebensraum der ureotelischen Anuren betrachtet werden.

7. Die Urikase der Larvenleber verándert sich unter osmotischen StreBbedingungen.

Zusammenfassung

8. Die erwachsenen Anuren reagieren auf Verunreinigungen wie Cadmium mit einerVeránderungder Aktivitátder ubemginm.

introducción

1 INTRODUCCION GENERAL

1.1 RELACION ENTRE LA MODALIDAD DEL CATABOLISMODEL NITROGENO Y EL HABITAT

1.1.1. Animales amoniotélicos, ureotélicos, y uricotélicos

Los anfibios son una Clase de transición en la colonización de la tierra. A lo largo desu ciclo de vida casi todos ellos permanecen, en mayor o menor grado, dependientes de ladisponibilidad de agua dulce del ambiente .

Este grupo de animales fue, evolutivamente, el primero dentro de los vertebrados queemergió del agua e invadió el medio terrestre; sin embargo, los anfibios no lograron unatotal independencia del agua ya que sus huevos deben mantenerse continuamente húmedospuesto que la membrana semipermeable del huevo ofrece poca resistencia frente a ladesecación es asi que los embriones y larvas son casi siempre acuáticos y amoniotélicos.

Se han realizado muchos estudios en especies de anfibios que tienen que experimentarcambios en la disponibilidad ambiental de agua en algún momento de su ciclo de vida, apartir de la posible existencia de una relación entre la disponibilidad de agua y la naturalezay proporción de los productos finales excretados del catabolismo de compuestosnitrogenadas.

El criterio de clasificación de los animales respecto de los productos finales nitrogenadosdel catabolismo proteico excretados ha puesto énfasis en la molécula dominante: amoniaco,urea o ácido úrico. En los vertebrados los productos finales del catabolismo de las proteinasson excretados principalmente por la orina. La hipótesis clásica predice que la abundanciarelativa de agua en el ambiente determinará la partición de estos productos finales (Hill yWyse, 1989). En el caso particular de los anfibios, éstos no pueden producir una orinahiperosmótica por carecer de asa de Henle ni poseen glándulas capaces de secretar sales,de manera que las formas químicas del nitrógeno excretado están correlacionadas con ladisponibilidad de agua; asi, los anfibios acuáticos excretan la mayoria de sus desechosnitrogenados en forma de amoniaco (Jungreis, 1976).

El amoniaco, para los animales acuáticos, es un producto de excreción adecuado a causade a su alta solubilidad, su elevado coeficiente de difusión debido a su bajo peso molecular,y porque las membranas biológicas son en su mayoria permeables al NH, pero no al NH].A causa de su alta toxicidad las concentraciones sanguíneas de iones amonio y amoniacoson siempre bastante bajas, manteniéndose en alrededor de 0,5 mM en ranas acuáticas.

Introducción

La urea predomina en especies más terrestres, es también un producto muy soluble ytiene la ventaja de ser menos tóxica. En los anuros adultos la urea urinaria es la resultantede varios factores entre los que destacamos las propiedades funcionales del sistema excretory dos mecanismos bioquímicos alternativos confluyentes y asociados a sendos procesoscatabólicos: el ciclo de la urea y la degradación de las purinas.

Por último, en ambientes donde la disponibilidad de agua esta restringida, algunas ranasarbóreas como Chiromantis xerampelina y Phyllomedusa sauvagii producen ácido úrico(Loveridge, 1970; Shoemaker y col. , 1972); esto se interpretó como una respuesta evolutivaa sus habitats caracterizados por la escasez de agua liquida (Campbell, 1991).

También, algunos de esos productos de excreción cumplen otros roles adicionales. Elamoniaco actúa, antes de su eliminación, como factor regulador del balance ácido-base, ésterecciona con el agua para formar amonio e hidroxilo (Withers, 1992). La urea participacomo control osmótico de los fluidos corporales por medio de la reabsorción de agua através del riñón, en particular en el caso de un déficit o un exceso de Na+ (Schoffeniels,1991). Se comprobó experimentalmente que en el anuro acuático Xenopus laevis se producíay acumulaba urea en condiciones de privación de agua. Al ser ubicados nuevamente en elagua se excretaba la urea acumulada en sus fluidos corporales y subsecuentemente losanimales volvían a excretar amoniaco (Duellman y Trueb, 1986; King y Goldstein, 1985).Asimismo, según datos de McNabb y McNabb (1980) y de Shoemaker y McClanahan(1975), el ácido úrico podría estar también involucrado, en forma complementaria, en laregulación iónica.

1.1.2. Algunas anomalías

Con el tiempo surgieron datos que cuestionaron la hipótesis clásica de correlación directaentre amoniaco - habitat acuático; urea - habitat terrestre; y ácido úrico - habitat terrestrey alejado del agua: a) Withers y col. (1982) mostraron la existencia de anuros adaptadosnaturalmente a condiciones ambientales caracterizadas fundamentalmente por su escasadisponibilidad de agua con sólo el 0,1-0,3% de su N-un'nario total correspondiente a ácidoúrico; b) Salibián y Fichera (1984) encontraron que la orina de Bufo arenamm contenía,además, cantidades detectables de ácido úrico; c) en Caudiverbera caudiverbera, anurototalmente acuático, el amoniaco daba cuenta sólo del 15-50% del N-urinario (Espina ycol., 1980) y d) Zamorano y col. (1988) hallaron que el 80% de los productos nitrogenadosexcretados de las larvas acuáticas permanentes de Caudiverbera caudiverbera era urea.

1.1.3. Enzimas del metabolismo de excreción nitrogenada

Las respuestas adaptativas de los organismos a los cambios en su entorno se manifiestanen los diferentes niveles de organización (l-lochachka y Somero, 1984); a nivel molecular,puede modificarse el funcionamiento de los sistemas enzimáticos. Así, el conocimiento delos cambios ontogenéticos en el funcionalismo del ciclo de la urea asociados con latransición agua - tierra aparece como un tema de interés para el estudio de la adaptaciónde los anuros a ambientes caracterizados por tener distinta cantidad de agua disponible.

l7

Introducción

Vinculado con lo expuesto debe señalarse que algunos autores han encarado, en anurosadultos, el estudio de las enzimas hepáticas asociadas a las vías metabólicas que conducena los productos de excreción nitrogenada. Balinsky y colaboradores (1976) demostrarondiferencias en las actividades de las enzimas del metabolismo de la urea y del ácido úricoentre adultos del anuro uricotélico Chimmantis xerampelina y otros anfibios ureotélicos.Ellos concluyeron que sus resultados podrían sugerir que la adaptación al uricotelismoinvolucraría tres clases de cambios enzimáticos: a) la disminución de la actividad de lasenzimas del ciclo de la urea; b) una menor actividad de las enzimas de la degradación delácido úrico; y c) el incremento del nivel de por lo menos una enzima clave de la biosfntesisdel ácido úrico. Dichos autores postularon que este modelo no requeriría de la adquisiciónde nuevas enzimas, sino sólo de un cambio en las actividades de las preexistentes. Así, conreferencia a esto, Salibián y Fichera (1984) agregaron que estos mecanismos brindarfan alos adultos la capacidad bioquímica potencial de colonizar exitosamente ambientes diferentesde los que ocupan actualmente, particularmente en cuanto a la disponibilidad de agua.

Balinsky (1972) esquematizó los caminos metabólicos que conducen a los diferentesproductos de excreción nitrogenada (Figura l).

Introducción

Figura N° 1: Esquema de los caminos metabólicos que conducen a los principales productosde excreción nitrogenada (de Balinsky, 1972).

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1.1.4. La arginasa

La arginasa (L-arginina amidinohidrolasa; E.C. 3.5.3.1.) (IUBMB, 1992)es una enzimaampliamente distribuida que se encuentra en diversas formas moleculares y en una variedadde organismos como bacterias, plantas, invertebrados y vertebrados.

En el hígado de vetebrados participa del llamado ciclo de la urea catalizando la hidrólisisde arginina a omitina y urea; uno de los átomos de nitrógeno requerido para la formaciónde urea proviene del amoniaco mientras que el segundo proviene del aspartato. En dichosanimales esta vía metabólica se compartimentaliza entre las mitocondrias y el citosol en elque se halla la arginasa (Campbell y col., 1987).

El ciclo de la urea se presenta en el siguiente esquema (Figura 2).

Introducción

Figura N° 2: Ciclo de la urea mostrando la compartimentalización de sus etapas en elcitosol y en la mitocondria (de Lehninger, 1981).

Ciloaol

Grupo aminoocido entrante(via glutomato-dnhidrogonono

mitocondriol)

NH]—ñ— NH:

UreaMembrana intima

OrnIUno

\ 2ATP+co,+NH.+H.o5- S

bOM ...|.|_o . ‘ I_ 1.-.Úw+ñ . . -.Sldoma de transport. Omnuno

de membrana específico. _ de lo orn'rüno

Argmma Foofoto dooarbomllo

2..Fumorato

4- Oltrullno P'

Arginínoauccínato

CltrullnoANP+PP. Mítoeondria

Aaportoto

— NHI

Grupo omino entrante(por la vla de troneomlnoclon

procedente del glutamato)

Enzimas participantes del ciclo: l- carbamil fosfato sintetasa, 2- omitina transcarbamilasa, 3argininosuccinato sintetasa, 4- argininosuccinato ligasa, 5- arginasa.

La arginasa fue aislada en anuros ureotélicos y uricotélicos tanto en el hígado como enel riñón y se han descripto sus características bioquímicas (Carlisky y col., 1968; Mora y

20

Introducción

col, 1965; Peiser y Balinsky, 1982; Shoemaker y McClanahan, 1982; Venkatalm'shnan yReddy, 1983).

La actividad de esta enzima es considerablemente alta en especies ureotélicas;consecuentemente es considerada como enzima marcadora del ureotelismo.

1.1.5. La uricasa

La uricasa (urato oxidasa; E.C. 1.7.3.3.) está involucrada en el catabolismo de laspurinas y cataliza la reacción inicial de la degradación de los uratos, habilitade la vía deconversión del ácido úrico en urea, siendo esta última excretada por via urinaria (Brown,1964). Está situada en los peroxisomas de todos los animales que la poseen; no obstante,su ubicación dentro de ellos varía de especie a especie. Esto es, la uricasa está presente enforma soluble en la matriz de los peroxisomas en peces y en el hígado de anfibios mientrasque en el hígado de mamíferos se encuentra en forma insoluble en el “core” (nucleoide) delos mismos (Fujiwara, 1987). Su actividad es notablemente más baja en las especiesuricotélicas.

Se observó que en el hígado de larvas de Nectums maculosus y Rana catesbeiana ladegradación del ácido úrico conducía a la urea. La formación de urea a partir de urato enel hígado disminuía luego de la metamorfosis y se postuló que la razón de esta declinaciónsería la pérdida de uno o más pasos enzimáticos en el hígado durante la metamorfosis. EnRana hexodaclyla esta vía metabólica no pudo ser demostrada en adultos a causa de laausencia de la uricasa. En el hígado de Xenopus laevis la actividad de la uricasa es baja;sin embargo, en otras especies de anfibios se ha encontrado que la actividad de uricasa escomparable en el hígado y el riñón (Balinsky, 1970).

Sabiendo que la urea también puede sintetizarse por degradación de purinas vía ácidoúrico, podría considerarse que en especies ureotélicas, como las del género Bufo, laactividad de las enzimas que participan en estos tramos metabólicos (ácido úrico-urea)serían indicadoras indirectas de la importancia de esta via. Es así que si comparamos laactividad de la uricasa hepática de anuros, las diferencias entre animales uricotélicos yureotélicos (como B. arenarum) aparecen de manera concluyente ( Tabla N° l).

21

Introducción

Tabla N’ l: Actividad de la uricasa en higado de algunos anuros. Datos en nmol/min.gpeso húmedo, medias i ESM; entre paréntesis número de experimentos (de Salibián yFichera, 1984).

Especie Actividad Referencia

A.Ureotelicos

Bufo arenarum 1463 :1; 141 (4) Shoemaker y McClanahan, 1982

Bufo regularis 1870i 291 (ll) Balinsky y col., 1976

Bufo carens 1870 i 191 ( 3) Balinsky y col., ¡976

B. Uricotélicos

Phyllomedusa sauvagii 184 i 44 ( 6) Shoemaker y McClanahan, 1982

Phyllomedusa hypochondrialis 123 i 42 (4) Shoemaker y McClanahan, 1982

Griromanlis xerampelina 133 i 26 (3) Balinsky y col., 1976

1.2. ONTOGENESIS DE ALGUNAS ENZIMAS DELCATABOLISMO DE PRODUCTOS NITROGENADOS

Los anfibios no ingieren alimento durante el periodo embrionario por lo tanto elcontenido del huevo suministra la energia y los metabolitos organicos necesarios para eldesarrollo. En estos estadios tempranos el contenido de nitrógeno permenece prácticamenteconstante lo cual significa que los cambios en la concentración de los diferentes compuestosnitrogenados seria el resultado de reacciones de interconversión. En el periodo larva], porel contrario, hay crecimiento, ingesta de alimento y excreción de nitrógeno.

En el desarrollo embrionario y larval los anuros terrestres excretan amoniaco y urea enproporciones variables. Durante el desarrollo embrionario de algunos anuros se hanidentificado pequeñas cantidades de urea en el medio de incubación durante lasegmentación. Se han encontrado, además, cantidades crecientes de amoniaco en nivelesbastante superiores a los de la urea (Bretos y col, 1967.). Los embriones de la rana

22

Introducción

marsupial Gastrotheca riobambae excretan urea, manteniéndose un patrón excretorureotélico a lo largo de todo el periodo larval. Esto fue interpretado como una adaptaciónal prolongado período de incubación en el saco materno y a su desarrollo en cantidadeslimitadas de agua (Alcocer y col., 1992).

En urodelos se ha comprobado alguna actividad arginásica durante la gastrulación,después de la cual esta actividad se incrementa hasta la eclosión. Si bien con muy bajaactividad, el ciclo de la urea completo ha sido detectado en el estadio temprano de néurula(Balinsky, 1970).

En el periodo larval inicial los anuros terrestres son amoniotélicos evolucionandogeneralmente al ureotelismo hacia el final de la metamorfosis cuando los animales emergendel agua. En esta transición larva - juvenil se observa una correspondencia entre losprincipales productos nitrogenados y la actividad de las enzimas asociadas al catabolismode las proteínas ligado, a su vez, a una transición paralela en su modelo alimentario: de unrégimen herbívoro a uno camivoro. Al aproximarse el final de la metamorfosis los anfibiospreservan su equilibrio hidromineral excretando menos orina y desarrollando otro tipo deexcreción nitrogenada; es asi que existe un incremento gradual de la actividad de lasenzimas del ciclo de la urea; este incremento de actividad deviene muy rápido durante lametamorfosis misma (Balinsky, 1970, Hourdry, 1993).

1.3. RESPUESTA DEL NIETABOLISMO NITROGENADOFRENTE AL ESTRES ANIBIENTAL

El estrés ambiental ha tenido diversas definiciones dentro del marco de laecotoxicologfa. Podemos mencionar la que considera al estrés como un estado producidopor un factor ambiental que extiende las respuestas adaptativas de un animal más allá desu rango normal, o que perturba su normal funcionamiento hasta un extremo tal en que seven reducidas significativamente las chances de supervivencia. Asimismo, se ha definidoal estresante como toda condición o situación que le provoque al sistema una movilizaciónde sus reservas y un aumento del gasto de energia (Mayer y col., 1992).

Los cambios en las actividades enzimáticas frente al estrés quimico especifico y noespecífico producen alteraciones en la función del animal. Básicamente existen cuatro tiposde respuesta de las enzimas: l) inhibición directa de la enzima, 2) inducción de la enzimapor cierta clase de sustancias, 3) aumento de enzimas séricas a través del daño de tejidosy 4) alteraciones en la actividad enzimática como resultado de cambios en las víasmetabólicas o flujos (Mayer y col., 92.33,).

En los puntos anteriores ha quedado expuesto que en los anuros el catabolismo desustancias nitrogenadas sufre cambios a lo largo del desarrollo y que en los adultos de lasdistintas especies existe una variación del perfil de excreción nitrogenada que se veríareflejada en la actividad relativa de las enzimas que participan en estas vias metabólicas.Resultó de interés, entonces, estudiar también la respuesta de las enzimas intervinientes encondiciones alejadas de las fisiológicas habituales para estos animales. En este caso se

23

Introducción

eligieron dos tratamientos en los que los anuros se expusieron a una situación de estrés quepodria reflejarse en el metabolismo de sustancias nitrogenadas: una condición relativamente"natural" como es un cambio en la osmolaridad del medio externo y otra por inyección deun contaminante ambiental en solución como un caso de factor estresante antropogénico.

1.3.1. La osmolaridad externa como estresante

La diversidad de ambientes que ocupan los anuros y su relativa dificultad para resistira la desecación debido a la permeabilidad de su piel ha despertado el interés por el estudiode la respuesta de este grupo de animales al estrés osmótico. La osmolaridad en los fluidoscorporales de los tejidos embrionarios se encuentra entre 100 y 120 mOsm/kg; en laslarvas, de 150 a 200 mOsm/kg y en adultos entre 200 y 320 mOsm/kg (Degani y Nevo,1986).

Los anuros adultos que pueden sobrevivir en medios de alta salinidad incrementan laconcentración osmótica de sus fluidos corporales y de esta forma mantienen un pequeñogradiente a favor del ingreso osmótico de agua. Esto se logra en parte por el aumento delas concentraciones de sodio y cloruros, pero la caracteristica distintiva de la mayoria delas especies que toleran salinidad alta, es la acumulación de altos niveles de urea en susfluidos corporales. La urea acumulada se debe por un lado a la disminución de la tasa deproducción de orina a causa de la reducción del ingreso de agua osmótico; no obstantetambién están implicados algunos cambios en los niveles de los sustratos y de las enzimasasociados al ciclo de la urea (Shoemaker, 1987).

Asi, al estudiar la actividad de las enzimas del ciclo de la urea en anuros adultos encondiciones de estrés osmótico a largo plazo (Balinsky, 1981; Jones, 1982; Shoemaker yMcClanahan, 1982) se encontró que la sintesis de urea se aceleraba y la actividad de lasenzimas del ciclo de la urea aumentaban enormemente, como puede apreciarse en la Figura3.

24

Introducción

Figura N° 3: Cambios relativos en las actividades enzimáticas del ciclo de la urea hepáticode tres especies de anuros adultos aclimatados a altas salinidades. Para Xenopus laevis yBufo viridis los valores son de animales que se encuentran en NaCl (600 mOsm)comparados con animales en agua corriente. Para Rana cancrivora los datos son deanimales en NaCl (800 mOsm) comparados con animales en NaCl (100 mOsm). CPS:carbamilfosfato sintetasa, OTC: omitina transcarbamilasa, ASS: argininosuccinato sintetasa,ASL: argininosuccinato ligasa, ARG: arginasa ( de Shoemaker y col., 1992).

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En general, las larvas de anfibios parecen ser menos tolerantes a condiciones desalinidad elevada que los adultos lo cual se correlaciona con una menor capacidad para lasíntesis y retención de urea. Por otra parte, en las larvas las células epidérmicas de la pielno pueden transportar iones activamente (Burggren y Just, 1992). Sin embargo, existen

25

Introducción

larvas de algunas especies de anuros que aumentan la tasa de excreción de urea encondiciones de restricción de agua (Shoemaker y McClanahan, 1973)

En osmolaridades ambientales de lO a 15 mOsm/l las larvas de diversas especies deanfibios pueden osmoregular pero a presiones osmóticas externas de entre 200 y 300mOsm/l pierden esa capacidad. En este último caso mantienen un gradiente osmóticolevemente positivo respecto del medio. Las larvas de Xenopus laevis pueden tolerar 330mOsm de salinidad y permanecen ligeramente hiperosmóticas respecto del ambienteaumentando su concentración de electrolitos (Shoemaker y col., 1992).

Minotti y col. (1983) comunicaron la tolerancia de todos los estadios embrionarios deBufo arenaan al agua destilada; Ferrari y col. (1988) demostraron que larvas jóvenes dela misma especie toleran soluciones comprendidas entre 0 y 20 mOsm sin cambiosimportantes en sus porcentajes de humedad y contenido de agua. En embriones de anurostambién se han evaluado los efectos tóxicos a corto plazo de concentraciones de NaCl yKCl tan altas como 0,1 - 0,7 96, observándose desde alteraciones morfológicas en eldesarrollo hasta mortalidad total en menos de 24 horas (Padhye y Ghate, 1992).

Por otra parte, se ha observado que durante la fase larval, el contenido de agua decrecea medida que el peso seco relativo aumenta, por lo tanto se podría pensar que la presiónosmótica del plasma debería cambiar durante el desarrollo. En efecto, la presión osmóticaplasmática de Rana catesbeiana se incrementa gradualmente desde alrededor de 180mOsm/l, en larvas jóvenes, hasta alrededor de 200 mOsm/l en las ranas de recientemetamorfosis. Ademas, se demostró que la presión osmótica del medio afecta la tasa deproducción de proteínas en los glóbulos rojos. Entonces, podría pensarse que si la capacidadsintética de las células nuevas que aparecen en los estadios larvales tardfos (célulasintestinales, células de la vejiga urinaria, etc.) se ve modificada de manera tan drástica acausa de la presión osmótica, los cambios de la presión osmótica del plasma, siendo éstosrelativamente pequeños pero sostenidos en el tiempo, tendrían también otros efectosfisiológicos asociados (Burggren y Just, 1992).

1.3.2. El cadmio como estresante

El cadmio está considerado como uno de los elementos traza más tóxicos del ambiente;en la tecnología moderna tiene una amplia aplicación, por ejemplo como agente colorantey estabilizante de pigmentos para pinturas, en la industria electrónica. La presencia delcadmio también es significativa en fertilizantes (Hansen, y col., 1989; Page y col.,l986).El interés por estudiar sus efectos sobre el metabolismo de organismos que son acuaticosen al menos una porción de su ciclo de vida se basa principalmente en la creciente descargade este metal por parte de las industrias en los cuerpos de agua dulce.

El cadmio está presente en los organismos como consecuencia exclusiva de lacontaminación ambiental (Nriagu y Sprague, 1987); por encima de ciertas cantidades estóxico para todos los sistemas biológicos estudiados y no tiene funciones fisiológicasestablecidas (U.S.Health Human Service, 1993). Sus propiedades químicas pueden explicarsus efectos biológicos debido a su interacción con macromoléculas: a) presenta afinidad por

26

Introducción

los grupos sulfuro de las proteínas; b) posee características químicas semejantes al Zn (cofactor de muchas enzimas) y c) siendo similar al calcio en cuanto a carga y tamaño puedereemplazar a este metal (Jacobson y Turner, 1980).

Cuando el cadmio penetra en el organismo se acumula primeramente en el hígado y elriñón perturbando la homeostasis metabólica de estos órganos e induciendo la síntesis deproteínas detoxificantes: las metalotioninas (Nomiyama, 1986).

Se pueden mencionar diversos estudios en los que se comprueba el efecto del cadmiosobre enzimas hepáticas. Se informó que el cadmio tomado por las células del parénquimahepático se concentraba primariamente en la mitocondn'a alterando sus funciones (Müllery Ohnesorge, 1984; Müller, 1986). Así también se observó que entre otros efectos seproducía la inhibición de algunos componentes de la cadena respiratoria y del ciclo deácidos tricarboxflicos y se demostró que enzimas del citosol como la alcohol deshidrogenasay la glutatión reductasa poseían sensibilidad al metal (Hellstom Lindahl y Oskarsson, 1989).En cultivos celulares de riñón de bovinos se comprobó la citotoxicidad del cadmioparalelamente con un decrecimiento de la síntesis de proteínas y de la inhibición de enzimascomo la succinato deshidrogenasa, fosfatasa ácida y fosfatasa dependiente de potasio(Bracken y Sharma, 1985).

Se ha estudiado el efecto de exposiciones de cadmio en larvas de Bufo arenarum y seha calculado la CLSOde 48 y 96 hs. en 2,52 y 2,08 mg de cadmio/l. Asimismo, se evaluóel efecto de concentraciones subletales de cadmio en el balance hfdn'co de estos animales(Muiño y col., 1990). Perez Coll y col. (1985) ex usieron a embriones de Bufo arenamma concentraciones de CdCl2 de 6.107 a 1,5.10 mol de Cd'z/l durante la gastrulaciónencontrando como resultado desarrollo anormal.

En otras especies de anuros se ha estudiado también la toxicidad del cadmio en huevos,embriones, larvas y adultos acuáticos (Devillers y Exbrayat, 1992; WHO, 1992).

En hepatocitos de ratas inyectadas con cadmio, Aoki y col. (1988) encontraronvariaciones en la actividad de una enzima del ciclo de la urea, la omitina transcarbamilasa,la cual se unía al cadmio. Estos autores sugirieron que la síntesis de urea podría verseafectada a partir de la inhibición de esta enzima. De allí resulta el interés por evaluar, anivel del metabolismo nitrogenado hepático, la respuesta al metal como estresante ambientalsobre el modelo de anfibios.

27

Hipótesis

2 HIPOTESIS Y OBJETIVOS

Las hipótesis de este trabajo fueron las siguientes:

a- El perfil de los productos de excreción nitrogenada permitiría caracterizar losambientes que ocupan los anuros adultos en cuanto a la disponibilidad de agua.

b- La cantidad de proteínas ingerida por los anuros adultos modificar'fa el catabolismoproteico a nivel de la actividad de alguna de las enzimas que participan en él, así como anivel de las concentraciones de sus productos finales mayoritarios excretados.

c- La transición vida acuática - vida terrestre que caracteriza el desarrollo temprano delos anuros terrestres se verla asociada a cambios en la actividad de las enzimas de los ciclosdegradativos de los productos nitrogenados.

d- En los anuros terrestres la arginasa y la uricasa, como enzimas marcadoras del ciclode la urea y del catabolismo de las purinas respectivamente, confluirian en su funcionalismopara convertir la mayor parte del N catabólico en urea y su actividad podría ser indicadoraindirecta para discriminar entre animales ureotélicos y no ureotelicos.

e- El estrés ambiental provocaría cambios en la actividad de las enzimas involucradasen el metabolismo de productos nitrogenados de anuros en distintas etapas de su ciclo devida.

e.l) Frente a un estrés osmótico los embriones de anuros tendrían la capacidad deadaptarse a ambientes con distinta disponibilidad de agua mediante cambios en laactividad de las enzimas mencionadas.

e.2) Un contaminante ambiental cuyo órgano blanco sea el hígado seria capaz demodificar la actividad de la arginasa hepática.

Consecuentemente, en este trabajo se plantearon los siguientes objetivos:

a- Comparar los principales productos de excreción urinaria y la urea plasmática enanuros de diferente habitat.

b- Estudiar la actividad de dos enzimas involucradas en el catabolismo de productosnitrogenados urinarios: la arginasa y la uricasa.

b. l) Determinar la importancia de las condiciones de alimentación de los animalesadultos sobre la actividad la arginasa.

b.2) Conocer la ontogénesis de la argínasa y la uricasa en Bufo arenamm.

28

Hipótesis

b.3) Comparar la actividad de la arginasa y la uricasa en adultos de anuros queposeen difierente habitat.

c- Estudiar la actividad de la arginasa y la uricasa durante diferentes etapas deldesarrollo de Br4foarenarum en condiciones de estrés ambiental.

c.l) Medir la actividad de la arginasa en embriones en ambientes con distintaosmolaridad.

c.2) Evaluar la actividad de la uricasa en larvas desarrolladas en ambientes de diferenteosmolaridad.

0.3) Dosar la actividad de la arginasa hepática de adultos inyectados con cadmio.

29

Materiales y Métodos

3 MATERIALES Y METODOSGENERALES

3.1. OBTENCION Y MANTENIMIENTO DE LOS ANIMALES

Los adultos de Blgfo arenarum, Leptodacrylus ocellarus, y quo granulosus fueroncapturados en la provincia de Buenos Aires, y los de Bufo chilensis en los valles de lascordillera chilena central, cerca del Cajón del Maipo. Los animales fueron mantenidos encautiverio en recipientes aireados con libre acceso al agua y alimentados semanalmente porla fuerza con carne vacuna.

Durante los experimentos fueron aclimatados en un baño termostatizado con aguacirculante Lauda modelo K2R o bien en una cámara de cultivo Ghilon modelo TC 120 contemperatura y fotoperíodo programables.

3.2. OBTENCION Y MANTENIIWIENTO DE LOS ENIBRIONESY LARVAS EN CONDICIONES CONTROL

Se indujo la ovulación de las hembras maduras con un macerado de hipófisis homólogay/o gonadotrofina coriónica (Endocorion, ELBA), luego de la desmedulación, se extrajeronlos ovocitos directamente del ovisaco los cuales fueron fecundados pincelando las ristras conuna suspensión de espermatozoides en solución de Holtfreter al 10 %.

La solución de Holtfreter 10 % contenía Na: 6,0 mM; Ca: 0,09 mM y K: 0,07 mM(11,5 mOsm). El desarrollo de los embriones se efectuó en dicha solución, en cajas Petride vidrio, a razón de aproximadamente 50 embriones por caja a 20 °C y fotoperíodo 12/12en cámara de cultivo.

Las larvas fueron mantenidas a temperatura ambiente en agua dulce artificial (Na: 1,5mM; Ca: 0,8 mM; K: 0,1 mM; 5,1m0sm), en bandejas de plástico de 2 litros decapacidad, a razón de aproximadamente 40 larvas por bandeja y alimentadas con alimentopara peces molido Shulet. Todas las soluciónes eran renovadas 5 veces por semana.

El diagnóstico de los estadios se efectuó en base a las tablas de Del Conte y Sirlin(1951) para embriones y de Echeverría y Fion'to de López (1981) para larvas (Tabla N°2).

30


Tabla N" 2: Cuadro comparativo de los estadios de desarrollo Bufo arenarum segúndistintos autores: Del Conte y Sirlin, 1951; Echeverría y Fiorito de López, 1981; Martiny col., 1985; y Gosner, 1960.

Del Conte Echeverría Martin Gosnery Sirlin y Fiorito y col.

Embriones l al 25 - - l al 25Larvas 26 I 26

27 II 27III 28IV 29

28l V 30

VI 31

28|| VII 3233

VIII 34

28... IX 35

37XI 38

39

29 XII 40XIIIXIVXV 41

30 XVI3l

32 XVII 42XVIII 43

33 Xlx 44

34 XX 4535 46

31


3.3. NIEDIOS DE DESARROLLO EXPERIIVIENTALES PARAENIBRIONES Y LARVAS

Se ensayaron las siguientes condiciones experimentales: agua destilada y solución deHoltfreter concentrada (115 mOsm), a 20°C y fotoperíodo 12/12 para los embriones.

Los embriones desarrollados en agua destilada continuaron en este medio al pasar alestado larval y se los mantuvo renovándola 5 veces a la semana hasta que alcanzaron elestadío 29 (en un lapso de aproximadamente 6 meses). El mismo procedimiento se siguiópara los embriones que habían desarrollado en solución de Holtfreter concentrada; altransformarse en larvas se las colocó en agua dulce artificial concentrada (100 mOsm).

3.4. EXTRACCION DE ORINA Y SANGRE

La orina fue extraída introduciendo el extremo de una pipeta en la cloaca y presionandosuavemente el abdomen. Se analizó orina limpia, sin heces.

En animales desmedulados, la sangre se extrajo por punción cardíaca con una jeringade plástico previamente enjuagada con citrato de sodio 3,8%. Se separó el plasma pordecantación en algunos casos y en otros por centrifugación a 220g por 10 minutos; elplasma obtenido se conservó en heladera a 5°C durante 24 - 48 horas hasta su análisis.

3.5. EXTRACCION DE HIGADO

Se anestesió cada larva con frío ( O °C) y se extrajo el hígado bajo lupa.

Luego de desmedularlos, se colocó a los adultos sobre hielo, se les abrió el abdomeny se extrajo el hígado.

3.6. PREPARACION DE LOS HOMOGENATOS

Los homogenatos fueron preparados sobre hielo utilizando un homogeneizador vidrioteflón a 5000 rpm. Como medio de homogeneización se usó buffer Tris HCl 10 mM, pH9 para el caso de la arginasa y buffer Tris HCl lO mM - sacarosa 0,25 M para la uricasa.

Los homogenatos totales de embriones se realizaron con 150-300 embriones,morfológicamente normales, llevando a un volumen de l a 3 ml. Para disolver la gelatinaque rodea las ristras de embriones en los primeros estadios se efectuó un tratamiento cortocon ácido tioglicólico neutralizado al 2 % y posteriormente se lavó 3-4 veces con soluciónde Holtfreter al 10 %.

32


En el caso de las larvas se extrajeron 3-7 higados y se realizó el homogenato llevandoa un volumen final similar al usado para los embriones.

El homogenato de higado de adultos se efectuó manteniendo una relación peso/volumende 1:20 y llevando a un volumen final de lO ml.

3.7. DETERMINACION DEL PESO HUNIEDO Y SECO DE LOSENIBRIONES

Para determinar los pesos húmedos se pesaron 10 embriones colocados en un dispositivo"ad hoc" (conos de papel de aluminio numerados y pesados), a los que se les habia extraidopreviamente el agua con papel de filtro. Se obtuvo el dato de peso seco pesando esosdispositivos después de colocar las muestras a 100°C durante 24 - 48 hs.

3.8. TECNICAS ANALITICAS

Todas las mediciones se llevaron a cabo por duplicado; en algunos casos por triplicado.

Las determinaciones de urea, amoniaco y ácido ún'co se realizaron usando "kits" dereactivos donados por los Laboratorios Wiener (Rosario, Argentina).

3.8.1. Urea en orina y plasma

La urea en on'na y plasma fue dosada colorimétricamente por descomposición conureasa. La ureasa degrada a la urea produciendo C02 y NH3; se hizo reaccionar a esteúltimo con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol (Fawcetty Scott, 1960). Las lecturas se hicieron a 540 nm. El resultado final se obtuvo luego derestar la cantidad de amoniaco encontrado y se expresó como ¡tg/ml de N-urea.

3.8.2. Amoniaco en orina y plasma

El amoniaco en orina se midió por el mismo método pero omitiendo el agregado deureasa. Se usó como estandar una solución recientemente preparada de cloruro de amonio,las lecturas se hicieron a 540 nm. Los resultados se expresaron como pg/ ml de N-amoniaco

3.8.3. Acido úrico en orina

El ácido úrico en orina fue medido colorimétricamente según Henry y col. (1957) porreacción en medio alcalino de carbonato de sodio con el reactivo fosfo-litio-túngstico

33


produciendo color azul. Las lecturas se hicieron a 710 nm. Los resultados se expresaroncomo ¡Lg/mlde N-ácido úrico.

El nitrógeno total fue considerado como la suma de las cantidades de N de amoníaco,urea y ácido úrico.

3.8.4. Proteínas totales

Las proteínas totales se midieron de acuerdo a la técnica de Lowry y col. (1951) sobreuna alícuota de homogenato usando albúmina bovina cristalizada como patrón. Las lecturasespectrofotométricas se realizaron a 750 nm. Los resultados se expresaron como mg deproteínas/embrión o bien como mg de proteínas/g de tejido fresco.

3.8.5. Actividad de la arginasa

Se utilizó la técnica descripta por Shoemaker y McClanahan (1982). Las mezclas deactivación, incubadas 15 minutos a 25 °C, fueron las siguientes:

Maleato de Mn 0,05 M Homogenato¿mil (ml)

Homogenato totalde embriones 2,0 1,0

Hígado de larvas 1,0 0,5

Hígado de adulto(+ 2ml de bufferal finalizar laactivación) 4,0 l ,0

La mezcla de reacción contenía 0,2 ml homogenato activado y 0,1 ml de L-arginina 0,7M, pH 9,5. Se incubó durante 30 minutos a 25°C y se detuvo la reacción con 0,2 ml deNaHzPO40,4 M y calentando 5 minutos en Baño María. Se efectuaron blancos de reactivosy de tejido (deteniendo la reacción a tiempo cero). En algunos casos, la mezcla deincubación fue mantenida a -18 °C por 4-6 días, procedimiento que no afectó la actividadenzimática.

34


Previa centrifugación de la mezcla de incubación a 5 °C y a 2000 g, se determinó en elsobrenadante la urea obtenida en la reacción por el método antes indicado.

Los resultados se expresan en nmoles o nmoles de urea .min". g" tejido fresco y ¡nmoleso nmoles de urea. min". g" de proteína.

3.8.6. Actividad de la uricasa

Se tomó como base la técnica de Shoemaker y McClanahan (1982). El homogenato secentrifugó a 12.000 g durante lO minutos, el sobrenadante (Sn l) se centrifugó nuevamentea 12.000 g durante 10 minutos (Sn 2) y se dosó la enzima en la mezcla del sobrenadantel y el 2 (Sn l + 2). Se utilizó como sustrato de la enzima ácido úrico en LiC03. Para elhígado de adultos, la mezcla de reacción contenía 60 pl de (Sn 1 + 2) y 1,4 ml de ácidoúrico 0,06 mM en buffer borato 50 mM burbujeado con oxígeno durante 10 minutosinmediatamente antes de la lectura de la enzima. Para el hígado de larvas y embriones secolocó en la cubeta 150 ¡41del (Sn l + 2) y 1,3 ml del ácido úrico oxigenado. Se midióel descenso de absorbancia a 293 nm y a 25°C durante 7 - 10 minutos.

Los resultados se calcularon según lo indicado en el Worthington Enzyme Manual(1972) y se expresaron en nmol ácido úrico. min". g" tej fresco y nmol ácido úrico. min".g'l de proteína.

Las centrifugaciones se realizaron en un equipo refrigerado Sorvall modelo RC-SB. Laslecturas espectrofotométricas se llevaron a cabo en un equipo Shimadzu Graphicord UV240; en el caso de la uricasa se utilizó una celda termostatizada.

3.9. TMTANIIENTO ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS

Todos los resultados fueron expresados como medias i ESM. 1.a normalidad de losdatos se evaluó por el método de Kolmogorov - Smimov y se verificó la homogeneidad delas var-lanzas por el método de Bartlett.

Los datos de porcentaje se trataron con la transformación sen'l y con los datos deactividad enzimática por gramo de proteínas se utilizó la transformación logaritmica.

Las diferencias estadísticas entre grupos se evaluaron mediante ANOVA de un factorcon comparaciones múltiples por el método de Scheffé. Las diferencias entre grupos dedatos que resultaron no seguir una distribución normal se analizaron mediante el métodode Kruskal-Wallis. El índice fiducial utilizado (0,05) se indica en cada Tabla.

Cuando correspondió se realizó un análisis de correlación o una regresión simple linealo exponencial; en el caso de la regresión lineal se compararon las pendientes de distintostratamientos mediante un análisis de covarianza (Draper y Smith, 1981; Zar, 1984).

35

Excreción y habitat

4 EXCRECION DE PRODUCTOSNITROGENADOS URINARIOS EN

ANUROS DE DIFERENTE HABITAT

4.1. INTRODUCCION

Se estudiaron los productos de excreción urinaria en cuatro especies sudamericanas deamplia distribución, cuyos habitats están caracterizados por tener diferentes grados dedisponibilidad de agua.

Se midieron los principales productos de excreción en Bufo granulosus, un pequeño sapocavícola, en Leptodactylus ocellatus, un leptodactflido semi acuático; en juveniles de Bufoarenarum, una especie terrestre y en Bufo chilensis, una especie montañosa que habita laparte central y sur de Chile.

4.2. MATERIALES Y NIETODOS

Los animales utilizados, de ambos sexos, tenían los siguientes pesos corporales: Bufoarenarum, 20,1 i 2,0 g (n=43); Bufo granulosus, 19,4 i 1,5 g (n=26); Leptodacrylusocellatus, 48,3 i 4,2 g (n=24) y Bufochilensis, 63,0 i 5,2 (n=33).

4.2.1. Preadaptación de los animales

15 días antes del comienzo de los experimentos se suspendió la alimentación de losanimales; este período de ayuno aseguró que los animales hubieran alcanzado una tasa basalde excreción (Balinsky y Baldwin, 1962; Funkhouser y Goldstein, 1973; Salibián y Fichera,1984). Se los colocó a 23 °C en un baño de agua circulante en recipientes plásticosindividuales que contenían arena húmeda para los ejemplares de Bufo y agua para L.ocellarus, medios que eran renovados diariamente.

Al finalizar la adaptación se pesó a los animales, se extrajo orina y sangre y se midióurea, amoniaco y ácido úrico en orina y urea en plasma (ver Materiales y MétodosGenerales: 3.8.1, 3.8.2, 3.8.3).

Los resultados aquí presentados corresponden a 4-6 experimentos llevados a cabo a lolargo de l año.

36


4.3. RESULTADOS

Existió una variabilidad considerable en los datos de concentración dentro de cada grupoexperimental. Sin embargo, al expresar los datos en porcentaje los resultados fueronhomogéneos y comparables.

Anteriormente otros autores mostraron una gran variabilidad en las concentraciones delos productos nitrogenados urinarios en anfibios (Schmidt, 1968).

Todas las especies aquí estudiadas presentaron un marcado ureotelismo como se observaen las Tablas N° 3, 4 y 5.

Tabla No 3: Productos de excreción nitogenada urinan'a en anuros de diferente habitat.Datos en ¡ig N/ml; medias i ESM; entre paréntesis número de animales.

Especie N- NH3 N-Urea N-Acido Urico

L. ocellatus 105,8 i 15,5 (24) 1122,0 _-_i-_159,1 (24) 0,6 i 0,2 (16)

B. arenarum 43,7 i 2,7 (43) “86,5 i 150,7(43) 1,3 i 0,2 (35)

B. granulosus34,3 i 2,8 (26) 822,9 i 88,6 (26) 1,0 i 0,3 (22)

B. chilensis 52,7 i 6,0 (33) 1148,11 111,2 (33) NM

NM: no medido.

37


Tabla N° 4: Productos de excreción nitrogenada urinaria en anuros de diferente habitat.Porcentajes de los datos de la Tabla N° 2 respecto del N- total; medias i ESM; entreparéntesis número de animales.

Especie % N - NHJ % N - Urea % N - Ac. Urico

L. ocellatus 8,9 i 0,5* (24) 91,1 i 0,5" (24) 0,1 i 0,03 (16)

B. arenarum 4,3 10,3 (43) 95,3 i 0,4 (43) 0,1 j; 0,01 (35)

B. granulosus 4,6 i 0,5 (26) 95,3 i 0,4 (26) 0,1 i 0,02 (22)

B. chilensis 5,0 i 0,5 (33) 95,1 i 0,5 (33) NM

* Diferencias significativas respecto de las otras especies (Scheffé), p < 0,05.NM: no medido.

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Tabla N° 5: Relación entre N-urinario y plasmático en anuros sudamericanos de diferentehabitat. Medias i ESM; n: número de experimentos. La relación U/P fue calculadautilizando los datos de la Tabla 2 que corresponden a los animales en los que la ureaplasmática fue medida.

Urea plasmática

Especies n ug-N/ml mMl UIP

L. ocellatus 10 213,8 i 39,7“ 7,6 5,2*

B. arenanan 33 555,3 i 38,3 19,8 l,8

B. granulosus 20 539,4 i 61,9 19,3 1,8

l Calculado a partir de las medias de los valores de N-urea.* Diferencias significativas con respecto a las demas especies, p < 0,05.

La concentración del N-urea en los animales de las especies de Bufo representó el 95,3 95,7 % del nitrógeno total y en L. ocellatus, un anuro semiacuático, alcanzó el 91 %.

Otro resultado de estos experimentos fue la evidencia de la presencia de ácido úrico enla orina de los animales de las especies de Bufo y en L. ocellatus, aunque en cantidades tanpequeñas como aproximadamente el 0,1 % del N- total. Es oportuno señalar que Salibiány Fichera (1984) comunicaron que en la on'na de Bufo arenarum también se hallaroncantidades detectables de creatinina.

Es de señalar la similitud, aparentemente independiente de la especie considerada, dela concentración total de desechos nitrogenados la cual osciló entre 900 y 1200 ¡lg/ml.

Por otra parte, también vale la pena mencionar la falta de correlación entre la particiónde los productos de excreción y el peso corporal de los animales. Se realizó un análisis decorrelación que en todos los casos resultó no significativo (Tabla 6).

39


Tabla N° 6: Coeficientes de correlación entre el peso corporal y los productos deexcreción nitrogenada urinaria y la urea plasmática en anuros de diferente habitat (U: Nurea urinaria; P: N-urea plasmática; NH3: N-amoníaco urinario).

Especie Producto Coeficiente de correlación raw-m,2

B. arenarum U -0,0360 0,294

NH; 0,0693 0,294

U/P 0,0376 0,334

B. granulosus U -0,0210 0,374

NH3 0,0374 0,374

U/P -0,4554 0,423

L. ocellatus U -0,24ll 0,388

NH3 -0, 1247 0,388

U/P -0,l94l 0,576

B. chilensis U 0,1060 0,334

NH3 -0, 1054 0,334

40


4.4. DISCUSION

Con el objeto de obtener resultados homogéneos y comparables, todas estas medicionesfueron llevadas a cabo en muestras tomadas de animales aclimatados a condiciones estándarde temperatura e ingesta de alimento.

Los resultados mostraron que la urea fue el componente mayoritario en la orina de lastres especies de quo estudiadas, sin encontrar diferencias que pudieran ser atribuidas a lascaracterísticas de sus habitats naturales en términos de disponibilidad de agua; la relaciónentre las concentraciones de N-urea y N-amoníaco (U/A) variaron entre 21,8 y 27.

En Leptodactylus ocellatus se encontraron diferencias significativas en los porcentajesde N-amoníaco y N-urea respecto de las especies de Brgfohabiendo aumentado el primeroy disminuido el segundo. Dado que se trata de una rana de habitos semiacuáticos podríaafirmarse que la diferencia en la disponibilidad de agua del habitat se veria reflejada endichos porcentajes con un claro y manifiesto predominio del N-NH,. Sin embargo, losresultados no permiten avalar dicho comportamiento ya que los porcentajes de N-NI-I3y deN-urea, si bien estadísticamente diferentes, fueron muy próximos a los hallados en lasespecies terretres. Estos resultados podrían ser tomados como "anómalos' ya que laconcentración de N-urea llegó al 91% del N-total excretado y la proporción U/A resultó ser10,6. Una "anomalía" similar fue informada por Espina y col. (1980) para Caudiverberacaudiverbera, un anuro totalmente acuatico, en el que el porcentaje del N-urea urinariarespecto del N total fue tan alto como el 86,4.

Se han encontrado "discrepancias" respecto del modelo clásico de patrones de excreciónen las ranas arborícolas Hyla pulchella e H. regilla y en la rana resistente a la desecaciónHyperolius nasutus (Shoemaker y McClanahan, 1975; Withers y col., 1982); todas ellaseran ureotélicas, mientras que el N-acido úrico excretado alcanzó solamente al 0,1-0,3%del N total. La concentración de ácido urico hallada en la orina de Brgfo arenarum(terrestre), de Bufo granulosus (cavíeola) y de Leptodactylus ocellatus (semiacuática) fuesimilar a la de las ranas anteriomente mencionadas, de las cuales se hubiese esperado quefuesen uricotélicas debido a su habitat. Estos hallazgos indican que, al menos en lasespecies aquí estudiadas, la estrategia seguida para la adaptación a habitats con diferentedisponibilidad de agua no se reflejó en un cambio del patrón urinan'o de excreciónnitrogenada pasando del amoniotelismo al ureotelismo paralelamente con la transición deun habitat semiacuático a uno terrestre.

Salibián y Fichera (1984) encontraron en especimenes de Bufo arenarum cuyo pesocorporal era dos veces y medio mayor que los usados en este grupo de experimentos, queel porcentaje de N-urea urinaria presentaba valores similares mientras que lasconcentraciones absolutas en animales mayores fueron tres veces menor que en losespecímenes más pequeños.

Existen datos de diferentes autores (Bentley, 1971; Schmidt, 1968) que muestran laexistencia de una buena correlación entre los habitats de los anuros y los niveles de N-ureaplasmática; los mismos eran mas altos en los animales terrestres y menores en las especiesacuáticas. Nuestros datos (Tabla 5) resultaron estar de acuerdo con esos hallazgos ya que

41


se observa una diferencia significativa entre L. ocellatus y las especies de Bufo. La mismadiferencia se notó cuando se consideró la relación entre el N-urea urinario y el N-ureaplasmático (UIP). Se sugiere que en estas especies, los habitats preferidos por los anurospodrían correlacionarse también con la concentración plasmática de urea.

Por último, la relación U/P, que fue siempre mayor que l, indicaría que el riñón podríaser un sitio de produción de urea, confirmando resultados previos de Carlisky (1970) paraB. arenarum y L. ocellatus. No puede dejar de considerarse a la reabsorción tubular deagua como un factor fisiológico adicional a tener en cuenta en la variación de este índice;no obstante, nuestros datos (Tabla 5) sugieren que la magnitud de dicho proceso ha de sermenor en los semiacuáticos Leptodactylus ocellatus que en las especies terrestres.

Arginasa y alimentación

5 ACTIVIDAD DE LA ARGINASA HEPATICA YPERFIL DE LOS PRODUCTOS NITROGENADOSURINARIOS EN ADULTOS DE BUFO ARENARUMSOMETIDOS A DISTINTA INGESTA PROTEICA

5.l. INTRODUCCION

Se acepta que la actividad de la arginasa hepática de los anfibios sería indicadora delfuncionalismo del ciclo de la urea y principal origen de la urea excretada; sin embargo, lainformación de la que se dispone no es concluyente.

Salibian y Fichera (1984) destacaron discrepancias en las mediciones de la actividad deenzimas del metabolismo de excreción nitrogenada urinaria para el caso de algunos anuros.Ellos encontraron importantes diferencias cuantitativas cuando se comparaban lasactividades de la arginasa hepática en distintas especies de Bufo y aún en la misma especie,entre diferentes autores como lo presenta la Tabla N° 7.

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Tabla N° 7: Actividad de la arginasa hepática en adultos de distintas especies de Bufo.Medias i Error estandar de la; n, número de animales( de Salibián y Fichera, 1984).

Especie n Actividad arginásica Referencia

(pmoles urea/min/g tej)

B. americanas 4 826,7 i 206,7‘ Boemke, 1973

B. arenarum 13 129,0 i 53,0 Carlisky y col., l968

B. arenarum 4 647,0 i 174,0 Shoemaker y McClanahan, 1982

B. paracnemis 3 145,0 i 69,0 Carlisky y col., 1968

B. marinas 3 375,0 i 59,3* Brown y Cohen, 1960

B. regulan's 2 2450,0 i 239,0 Balinsky y col., 1976

Estas diferencias se interpretaron como una consecuencia de las condicionesexperimentales seguidas en las que en las mayoría de los casos, se ignoraba factores comoel estado nutricional, la aclimatación y las condiciones ambientales (estación del año,temperatura, fotoperíodo) lo cual, se sabe, afecta el metabolismo proteico de los anfibiosy las actividades de las enzimas asociadas (Jungreis, 1976; Jungreis y Hooper, 1970 a y b).

El presente estudio fue llevado a cabo para determinar el efecto de diferentes niveles deingesta de proteínas sobre la actividad de la arginasa y sobre el perfil de la concentraciónde los productos nitrogenados urinarios en adultos de Bufo arenarum, en condiciones delaboratorio.


El diseño experimental se muestra en la Figura 4:

44


Figura N° 4: Diseño experimental.

MUESTREÜ

Animales alimentados(Grupo 2)

//// i oliasPeriodo oleEstandarizacion 18

. l I I I 0dIOS I I I I

-4 -3 -8 -118

//// i oliasAnimales en ayuno

t (Grupo1) ÍMUESTREÜ MUESTREÜ

Animales Control(Grupo 0)

Las mediciones realizadas en cada muestreo fueron: amoniaco, urea y ácido ún'co enon'na, urea en plasma, y proteínas y arginasa hepáticas (ver Materiales y MétodosGenerales).

Se utilizaron 31 ejemplares de Bufo arenarum de ambos sexos cuyo peso corporal era181,1 i 6,8 g (media i ESM) que fueron colocados a 25°C y fotoperi'odo 12/12 en unrecipiente con libre acceso al agua, la cual se cambiaba 5 veces por semana. Durante los4 pn'meros días se les suministró por la fuerza carne vacuna (0,5 g/ 100 g de peso corporal).

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La carne contenía 70% de agua, 28% de proteínas, 2% de lípidos y trazas de hidratos decarbono. Esta forma de alimentación era bien tolerada por los animales.

Luego del cuarto día los sapos fueron identificados individualmente y distribuidos al azaren 3 grupos denominados: Grupo 0 (n=7), Grupo l (n=12) y Grupo 2 (n=12). Semuestreo a los animales del Grupo 0 al final del período de estandarización nutricional (4dias); a los animales de Grupo l se les suspendió la alimentación y a los del Grupo 2 se loscontinuó alimentando 5 veces a la semana. Este esquema se mantuvo por un lapso de 18días al final del cual fueron tomadas las muestras.

5.3. RESULTADOS

Los resultados se muestran en las Tablas 8 y 9.

Tabla N° 8: Actividad de la arginasa y proteinas totales hepáticas en adultos de Blg'oarenarum sometidosa diferentes regímenes alimentarios. Datos como medias i ESM; entreparéntesis, número de animales.

GRUPO 0 GRUPO l GRUPO 2Control Ayuno Alimentados

Arginasa 4543,5 i 365,1 3075,3 i 276,111I 5058,01 471,6(¡tmol urea/min/g prot) (7)

Arginasa 563,4i 48,1 581,3i 47,0 725,4i 70,0(pmol urea/min/g tej) (7) (12) (12)

Proteínas 124,0 i 2,5 192,0 i 8,6"‘Jl|I 147,9 i 9,5(mg/8 tel) (7) (12) (12)

# Diferencias significativas respecto del Grupo 2, p < 0,01* Diferencias significativas respecto del control, p < 0,01

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Tabla N° 9: Concentración de los productos nitrogenados urinarios y de la urea plasmáticaen adultos de Bufo arenarum sometidos a diferentes regímenes alimentarios. Datos comomedias i ESM; entre paréntesis, número de animales.

GRUPO 0 GRUPO l GRUPO 2Control Ayunados Alimentados

N-Urea Urinaria 974,4 i 110,2 962,3 ¿1;147,6 119l,8 i 185,3(ug N/ml) ( ) (12) (12)

N-NH3Urinario 68,2 i 6,9 60,5 i 19,5 56,1 i 16,9(ug N/ml) (7) (12) (12)

N-Ac.Ur¡co Urinario 1,1 i 0,2 1,1 _-1_-0,3 0,8 i 0,2(ng N/ml) (7) (12) (12)

N-Total Urinario 1043,6 i 126,4 1023,9 1 160,6 1248,8 i 198,3(ug N/ml) (7) (12) (12)

% N-UreaUrinaria 93,9 i 1,1 94,1 i 1,6 95,8 i 0,9(7) (12) (12)

% N-NH3Urinario 6,0 i 1,1 5,8 i 1,6 4,1 i 0,9(7) (12) (12)

96N-Ac.UricoUrinario 0,10 i 0,01 0,10 i 0,02 0,06 i 0,01) (12) (12)

N-Urea Plasmática 749,8 i 68,8 1050,8 i 89,0 1208,] 1128,5"( )

* Diferencias significativas respecto del control, p < 0,05.

La actividad específica de la arginasa difirió significativamente entre los grupos, siendomayor en los animales alimentados (Grupo 2) con respecto a los ayunados; sin embargo,no se encontraron diferencias significativas en la actividad de la enzima cuando ésta eraexpresada por gramo de tejido fresco.


Las proteínas hepáticas mostraron un incremento significativo en los animales ayunadosrespecto del grupo control (Grupo 0); por otra parte, no hubo diferencias entre los Grupos0 y 2.

Los productos nitrogenados de excreción no mostraron diferencias significativas entrelos tres grupos; esto fue válido tanto para los valores absolutos como para los porcentajesrelativos. La urea fue el producto dominante con un 94 - 96% mientras que el amoníacoestaba presente en un 4 - 6 %; en todos los casos se encontró una cantidad detectable deácido úrico de alrededor del 0,1%. Estas proporciones se mantuvieron constantesindependientemente del tratamiento; no obstante, el N - total urinario se incrementó en elGrupo 2 aproximademente un 20%, si bien esta diferencia no fue significativa.

5.4. DISCUSION

Nuestros resultados indican que, en Bufo arenamm adulto, la actividad específica dela arginasa hepática se vió influenciada significativamente por la dieta: el ayuno redujo suactividad específica respecto del grupo sobrealimentado.

En relación a los controles, la actividad específica media del Grupo l se redujo en un32 % aunque dicho porcentaje no fue estadísticamente significativo, mientras que laactividad del Grupo 2 no se vió afectada; no se observaron cambios cuando la actividad seexpresó por gramo de tejido fresco.

Estos hallazgos podrían considerarse como evidencias de la sensibilidad de la maquinariabioquímica del hígado a reducciones a corto plazo del aporte externo de proteínas. Enmamíferos ayunados, los cambios en la actividad de la arginasa, fueron interpretados o biencomo una consecuencia de una variación en la masa de la enzima o bien por una regulacióna nivel de traducción por la modulación de la abundancia del ARN mensajero (Morris ycol., 1987).

En especies de Xenopus se observó una reducción en la actividad de la carbamilfosfatosintetasa (participante del ciclo de la urea) pasados los 130 días de ayuno, con lo cual seconcluyó que se produciría alguna declinación en la actividad de los caminos que conducena la formación de urea luego del comienzo del ayuno.

Podrían considerarse dos categorías dentro de los cambios enzimáticos a causa delayuno, una durante los períodos tempranos y medios que parecieran deberse a verdaderasadaptaciones del organismo a este estado nutricional alterado; aquí se encuadrarían losresultados presentados en este trabajo. La otra categoría correspondería a los cambios queocurren mayormente en las fases más tardías del ayuno, que serían probablemente elresultado del agotamiento de una parte importante de las proteínas tisulares (Merkle, 1990).

El contenido total de proteínas expresado por gramo de tejido fresco también fuemarcadamente afectado por el ayuno. Luego de 18 días de interrupción del alimento éstese elevó un 55%, lo que sugiere que el gasto metabólico de los animales provisto por el

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hígado podría haber sido cubierto principalmente por los lípidos y los carbohidratos deltejido. A pesar de que los Bufo arenamm son terrestres y están adaptados a vivir encondiciones de escasez de agua, este grupo particular de sapos del Grupo l podría haberpermanecido fuera del agua y relativamente quieto durante un lapso mayor que los otrosgrupos con el consecuente ahorro de energía. Por lo tanto no se puede descartar laposibilidad de una pequeña deshidratación de los animales luego de 18 días de ayuno comouna razón adicional para explicar la elevación de su contenido hepático de proteínas.Cuando los sapos fueron sometidos a un esquema alimentario intensivo rico en proteínasy pobre en lípidos (Grupo 2) el contenido de proteínas mostró valores comparables aaquellos del grupo control.

La partición del perfil de productos nitrogenados urinarios excretados fue independientede la ingestión de proteínas. Este hecho estuvo de acuerdo con Campbell y col. (1987)quienes afirmaron que el metabolismo hepático no se reflejarfa en todos los casos en losproductos finales nitrogenados sino más bien en sus actividades enzimáticas. La falta dediferencias importantes en estos parámetros está de acuerdo con los resultados de otrosautores que encontraron diferencias solamente luego de lapsos de ayuno mucho mayores(Grany y Piery, 1981; Merlde y Hanke, 1988). En experimentos en los cuales se sometíaa Xenopus laevis a períodos de ayuno de hasta 48 semanas se observó que las alteracionesdel amoniaco y la urea excretados se correlacionaban con las alteraciones de urea en plasmapero no con las de amoniaco en plasma. Este comportamiento diferencial de dichoscompuestos se explicó a través de sus principales sitios de formación dentro del organismo.La urea se produce en su mayor parte en el hígado mientras que el amoniaco se formaescencialmente en los riñones en donde participa del balance ácido - base (Merkle, 1990).

El hallazgo de pequeñas cantidades constantes de acido úrico el la orina de esta especieureotélica corrobora resultados previos en la misma especie (Salibián y Fichera, 1984).

Los valores de urea plasmática permanecieron iguales en el control y en los animalesayunados; este hecho podia ser interpretado como una respuesta fisiológica adaptativa delos sapos pn'vados de alimento con el objeto de mantener estable la presión osmótica de susfluido corporales. Por el contrario, en los animales sobrealimentados el N-urea plasmáticofue significativamente más alto que en los controles.

Varios autores han mostrado la importancia de la temperatura y fotoperl'odo ambientesy del origen geográfico y estación del año en los valores metabólicos ( Boemke, 1973,Jungreis y Hooper, 1970 a y b). En este estudio se mantuvieron todos esos factoresconstantes y aislados de otros tales como el ritmo endócrino. Dado que estos experimentosfueron llevados a cabo dentro de un lapso no mayor de 22 días, los datos no se vieronafectados por la variación circanual de los parámetros evaluados la cual se vió que existeen varias especies de anuros (Boemke, 1973; Byrne y White, 1975; Schlaghecke y Blum,1978).

49

Arginasa en embriones

6 ONTOGENESIS DE LA ARGINASAEN BUFO ARENARUM: EMBRIONESDESARROLLADOS EN CONDICIONESESTANDAR Y DE DIFERENTE OSMOLARIDAD

6.1. INTRODUCCION

Se ha demostrado la existencia de cambios en la actividad de la arginasa durante latransición larva - juvenil (Shoemaker y McClanahan, 1982; Balinsky, 1970). En este trabajose extendió el estudio de la actividad de la enzima a etapas embrionarias y larvalestempranas de Bufo arenarum mantenidos en solución de Holtfreter 10%, observando suevolución a lo largo del desarrollo.

Por otra parte, se evaluó la respuesta metabólica y la potencialidad de adaptaciónbioquímica de los embriones de esta especie a ambientes con distinta disponiblidad de aguasimulados mediante la exposición de los animales a soluciones con diferentes presionesosmóticas. De la misma cohorte se separaron distintos grupos y se los expuso a) acondiciones control en solución de Holtfreter; b) a agua destilada y c) a una solución deHoltfreter concentrada. De esta manera se intentó simular en el caso b) un medio hipotónicoen el que los embriones sufn'eran una sobrehidratación, y en el caso c) un ambienteconcentrado con la consecuente tendencia de los animales a la deshidratación.Asemejándose, en este último caso, a las condiciones que sufre un anfibio en su pasaje agua- tierra.

En este grupo experimental también se dosó la actividad de la enzima en hígado delarvas premetamórficas.

6.2. MATERIALES Y LIETODOS

6.2.1. Obtención de los embriones

Se extrajeron los ovocitos de hembras que tenian un peso corporal de 165,0 i 6,0 g (n= 20).

Se realizaron ll fecundaciones diferentes y en algunos casos se fertilizaron ristras deovocitos de 2 o 3 hembras con esperma de 2 o 3 machos.

Se determinó el peso húmedo y seco de los embriones de cada estadio estudiado segúnlo indicado en el punto 3.7. de Materiales y Métodos Generales.

50


6.2.2. Toma de muestras para la medición de la actividad de la arginasa

La actividad de la arginasa en embriones fue determinada según lo descripto en lospuntos 3.6 y 3.8.5 de Materiales y Métodos Generales en 17 diferentes estadios dedesarrollo, desde ovocito hasta opérculo completo, y en el primer estadío larval (26)caracterizado por la presencia de esbozos de los miembros posteriores.

La arginasa en hígado de larvas se determinó en el estadío 29.

6.2.3. Tratamiento estadístico de los resultados

La regresión exponencial de los datos de la actividad de la arginasa en embriones control(Tabla 10) se efectuó a partir de los valores originales sin transformar. El modelo ajustadofue Y= e'm‘; en este modelo la linealización se logra a través de una transformaciónlogaritmica.

Para los resultados de los experimentos correspondientes a embriones desarrollados enmedios de diferente osmolan'dad se efectuaron dos ANOVA de un factor, uno entre estadiosde desarrollo y el otro entre los tres tratamientos.

6.3. RESULTADOS

6.3.1. Fanriones desarrollados en solución de Holtfreter

El intervalo de peso húmedo y seco de los embriones fue 0,99 - 12,06 y 0,43 - 0,93mg/embrión respectivamente, siendo las medias i ESM 4,62 i 0,27 (n = 80 pool de 10embriones) y 0,71 i 0,01 (n = 80). Estos valores coinciden con los informados porHerkovits y col. (1983) para la misma especie.

En los ovocitos sin fertilizar y en los estadios embrionarios más tempranos, desde 2blastómcros hasta gástrula, la actividad específica de la arginasa se encontró por debajo delos límites de detección de la técnica utilizada.

La enzima empezó a ser detectada a partir del estadío de gástrula - surco neural. LaFigura 5 muestra la actividad especifica de la arginasa y la cantidad de proteinas a lo largodel desarrollo embrionario en donde se notó un incremento gradual de la actividadenzimática. En el inicio de los estadios larvales, cuando los animales comienzan sualimentación exógena, la actividad se incrementó considerablemente llegando a seraproximadamente el doble de la actividad encontrada en el estadío de opérculo completo.Se encontró una fuerte dependencia de la actividad específica de la enzima respecto deltiempo trascurrido desde la fertilización (Tabla 10).

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Por otra parte, cabe destacar que el contenido total de proteínas de los embriones nomostró variaciones significativas a lo largo de los estadios de desarrollo; el ANOVArealizado entre los distintos estadios fue no significativo (F del ANOVA= 1,27).


Figura N° 5: Actividad específica de la arginasa (nm urea.min". mg" proteína) y cantidadde proteínas totales (mg/embrión) en embriones de Bufo arenarum durante su desarrollo ensolución de Holtfreter diluída. La curva representa el ajuste a una regresión exponencial;las barras, las medias y las líneas el ESM; entre paréntesis, número de homogenatos. O:oocito (6), BL: blástula (3), LD: labio dorsal (2), G: gástrula (7), SN: surco neural (2),TN: tubo neural (7), BC: brote caudal (6), RM: respuesta muscular (10), LC: latidocardíaco (4), CB: circulación branquial (6), BA: boca abierta (7), CAC: circulación en laaleta de la cola (3), PO: pliegue opercular (3), ODC: opérculo derecho cerrado (9), OC:opérculo completo (12), L: primer estadío larval (11).

80 ARGINASA(nmol urea/nin ng prot) PREITEINAS(ng/embrion)

a 1.2

ARGINASA- PROTEINASm- - 1

- 0.8

— 0.6

i i — 0.4

’ = E 'v

g g E — 0.2J, e E

i I 7 ¡ o

IJ ILL) G SN TN El RN LC CB ¡A CAC PD IJIIC nc L

Estodlos de desarrollo

l l l l l J

0 100 zoo 300 350

Horus post-Fertlllzuclon

53


Tabla N” 10: Parámetros de la regresión exponencial de la arginasa y de la regresión linealdel contenido de proteínas en embriones de Bufo arenarum desarrollados en solución deHoltfreter.

Arginasa Proteínas

Pendiente 1,10 . 10'2 - 5,12 . 10"

Ordenada al origen - 0,65 0,47

Error estandar de lapendiente 9,74 . 10‘ 1,53 . 10*

Coeficiente de correlación 0,804 - 0,337

R - cuadrado (%) 64,7 * 11,3 *

Error estandar de laestimación 0,599 0,124

*: regraión significativa.

En la Tabla lO se observan los parámetros de la regresión exponencial de la actividadespecifica de la arginasa y los de la regresión lineal del contenido de proteínas. Si bienambas resultaron significativas, cabe destacar que la regresión de las proteínas sólo explicaun ll % de la variabilidad de los valores. Este resultado, sumado a la falta designificatividad encontrada en el ANOVA es lo que permitiría afirmar que no existencambios importantes en la cantidad de proteínas a lo largo del desarrollo.

6.3.2. Enbriones desarrollados en medios de diferente osmolaridad

Habiendo estudiado, en el experimento anterior, a partir de qué momento del desarrolloembrionario se detecta actividad de la arginasa, se eligieron en el presente experimentoalgunos estadios representativos para comparar esta actividad enzimática en condicionesalejadas de las fisiológicas para estos animales. la arginasa fue dosada en homogenatos deembriones incubados permanentemente en agua destilada y en solución de Holtfreterconcentrada (115 m0sm), usando como grupo control a animales mantenidos en soluciónde Holtfreter. Las actividades específicas se muestran en la Figura 6.

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Figura No 6: Actividad específica media de la arginasa en embriones de Bufo arenarumdesarrollados en medios de diferente osmolaridad (nmol urea. min". mg'l prot), las barrasrepresentan las medias y las líneas verticales el ESM. Estadio (número de homogenatos de150 - 300 embriones para control, concentrada y destilada). BC: brote caudal (n: 6, 3, 6);RM: respuesta muscular (n: 10, 4, 4); CB: circulación branquial (n: 6, 3, 5); PO: pliegueopercular (n: 3, 3, 3); ODC: opérculo derecho cerrado (n: 9, 3, 3); OC: opérculo completo(n: 12, 3, 6). *: Diferencias significativas respecto del control de cada estadío, p < 0,05.

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- Control [ZZ Culcentladz El lestilidi

La Figura 6 muestra que en los primeros estadios de desarrollo, tanto en los animalescriados en osmolaridad cero como en los de alta osmolaridad, la actividad de la arginasano fue sensible a variaciones de la presión osmótica del ambiente a las que fueronsometidos los animales. Sin embargo, la actividad decreció significativamente respecto del

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control en el grupo desarrollado en Holtfreter concentrado en los estadios de circulaciónbranquial, pliegue opercular y opérculo derecho cerrado.

Se observó que la actividad de la arginasa crecía a medida que avanzaba el desarrollodentro de cada grupo estudiado, con un importante incremento en opérculo completo. ElANOVA comparando los diferentesestadios dentro de cada grupo fue significativo (Fm=

Fm: 15,29; FW= 34,29). Sin embargo, las comparacionesmúltiplesp306X16,Z(Schefé) arrojaron como resultado un progresivo aumento de actividad en el grupo controly por el contrario una diferencia significativa solamente entre el estadío de opérculo derechocerrado y opérculo completo en los otros dos grupos.

Con el objeto de comparar la respuesta en la actividad de la arginasa en los tres gruposse efectuó una regresión lineal. Al comparar las regresiones (Figuras 7, 8 y 9) se observaque tanto los animales desarrollados en agua destilada como los de I-Ioltfreter concentradopresentaron rectas respecto del tiempo de desarrollo similares entre si y a la vez similaresal grupo control. La Tabla ll presenta los parámetros de dichas regresiones y muestra elestadístico hallado luego del análisis de covarianza para la comparación de las pendientes.

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Figura No 7: Recta de regresión de la actividad específica de la arginasa de embriones deBufo arenarum desarrollados en solución de Holtfreter diluída respecto de las horas postfecundación. Datos transformados (1000 x log actividad específica) correspondientes a losestadios de brote caudal (BC), respuesta muscular (RM), circulación branquial (CB),pliegue opercular (PO), opérculo derecho cerrado (ODC), y opérculo completo (OC).

4.20 —- 2

Ag A Éa A1 170-— A g A gu A

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57


Figura N° 8: Recta de regresión de la actividad específica de la arginasa de embn'ones deBufo arenarum desarrollados en solución de Holtfreter concentrada respecto de las horaspost fecundación. Datos transformados (1000 x log actividad específica) correspondientesa los estadios de brote caudal (BC), respuesta muscular (RM), circulación branquial (CB),pliegue opercular (PO), opérculo derecho cerrado (ODC), y opérculo completo (OC).

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58


Figura N” 9: Recta de regresión de la actividad específica de la arginasa de embriones deBufo arenarum desarrollados en agua destilada respecto de las horas post fecundación.Datos transformados (1000 x log actividad específica) correspondientes a los estadios debrote caudal (BC), respuesta muscular (RM), circulación branquial (CB), pliegue opercular(PO), opérculo derecho cerrado (ODC), y opérculo completo (OC).

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59


Tabla N° ll: Embriones de quo arenarum desarrollados en condiciones de diferenteosmolaridad: parámetros de la regresión lineal simple de la actividad específica de laarginasa respecto del tiempo post fecundación y estadístico del análisis de la covarianza parala comparación de pendientes. Datos correspondientes a los estadios brote caudal, respuestamuscular, circulación branquial, pliegue opercular, opérculo derecho cerrado, y opérculocompleto.

Control Holtfreter concentrado Agua destilada

Pendiente 3,90. 10" 3,75. 10" 4,48. 10"

Ordenada al origen 2,88 2,71 2,75

Error estandar dela pendiente 4,62. 10" 6,78. 10" 4,8010"

Coeficiente decorrelación 0,79 0,81 0,88

R- cuadrado (%) 61,93 65,74 78,4

Error estándar dela estimación 0,230 0,189 0,178

F (comparación de pendientes): 0,10F de tablas: 2,84

En la Tabla ll se aprecia que los parámetros de la regresión lineal de los tres casos sonsimilares. Con el análisis de la covan'anza esto se confirma, puesto que el estadísticohallado es menor que el de tablas, lo que indica que no existen diferencias significativasentre las pendientes.


Las proteínas totales de los estadios muestneados no mostraron diferencias significativasentre los tres grupos; los valores obtenidos son similares a los informados con anterioridadpara embriones de la misma especie provenientes de hembras cuyo peso era comparable alde las utilizadas en este experimento (Herkovits y col., 1983). Los datos se muestran en laFigura 10.


Figura N” 10: Contenido de proteínas del homogenato de embriones de Bufo arenarumdesarrollados en medios de diferente osmolaridad (mg/embrión). Estadio (número de casospara control, concentrada y destilada). BC: brote caudal (n: 6, 3, 6); RM: respuestamuscular (n: 10, 4, 4); CB: circulación branquial (n: 6, 3, S); PO: pliegue opercular (n:3, 3, 3); ODC: opérculo derecho cerrado (n: 9, 3, 3); OC: opérculo completo (n: 12, 3,6).

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- Collrnl {ZZ Concluida El! lestilafla

Asimismo, se efectuó una regresión lineal del contenido de proteínas respecto de lashoras post fecundación cuyos parámetros se muestran en la Tabla 12. Los tiempostranscurridos post fecundación para cada estadío se muestran en la Figura 5.


Tabla N° 12: Embriones de Bufo arenarum desarrollados en condiciones de diferenteosmolaridad. Parámetros de la regresión lineal simple y estadístico F del ANOVA de lacantidad de proteínas vs. el tiempo post fecundación. Datos correspondientes a los estadiosbrote caudal, respuesta muscular, circulación branquial, pliegue opercular, opérculo derechocerrado, y opérculo completo.

Control Holtfreter concentrado Agua destilada

Coeficiente decorrelación -0,46 -0,74 -0,81

R- cuadrado (95) 21,04 54,14 65,92

Error estandar dela estimación 0,10 0,05 0,05

F (ANOVA) 2,42 3,92 9,90

F (tablas) 3,20 3,63 3,42

6.3.3. Actividad de la arginasa en hígado de larvas

Se utilizaron entre 4 y 7 hígados por homogenato. El peso de los "pool" de hígados fue36,8 i 4,6 mg (n= 10 homogenatos;X i ESM).

Los resultados se muestran en la Tabla N° 13.

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Tabla N° 13: Actividad de la arginasa hepática en larvas de Bufo arenarum (Estadio 29).Datos en anl de urea. min". g" tej y en nmol. min". mg" prot. Medias i ESM, entreparéntesis numero de homogenatos preparados con 4 - 7 hígados.

Arginasa

pmol urea. min". g" tej. pmol urea. min“. g" prot.

1,27 _-l_-_0,70(10) 18,66i 8,38 (10)

6.4. DISCUSION

6.4.1. Embriones en condiciones control

La actividad específica de la arginasa en homogenatos totales de embriones desarrolladosen solución de Holtfreter fue detectada a partir del estadío de gástrula - surco neural. Seobservó un incremento en la actividad específica, el mismo fue pequeño en los estadiostempranos y más pronunciado al final del desarrollo embrionario. Dado que están referidasa embriones totales, estas preparaciones no permiten una localización precisa de la enzimadetectada; sin embargo, este incremento podría correlacionarse con el desarrollomorfogenético y funcional del hígado y del sistema excretor renal. En embriones de anurosla función excretora del pronefros y la presencia de un divertículo hepático fuerondescn'ptas en el estadío de brote caudal (Balinsky, 1978).

Se sabe que al comienzo de la metamorfosis se produce una diferenciación bioquímicaque trae como consecuencia la inducción del ciclo de la urea (Nener, 1988); aquí, se hamostrado la existencia de actividad específica de una de sus enzimas clave: la arginasa, enla fase embrionaria temprana, momento del desarrollo en que podría pensarse como"innecesaria" ya que el ciclo de la urea no es aún funcional. La presencia de actividad dela arginasa en los embriones de Bufo arenarum podría ser interpretada considerando queen los estadios tempranos de su desarrollo jugaría otros roles diferentes de la biosfntesis deurea. En efecto, en diversos tejidos, la arginasa ha sido asociada con el crecimiento, lasíntesis de proteínas, la formación de aminoácidos y con las reacciones de transaminaciónpara la síntesis de creatinina (Aminlari y Vaseghi, 1992; Knox y Greengard, 1964;Takiguchi y col., 1988).

Cabe mencionar que tanto en los embriones como en las larvas prometamórficas laarginasa estaría en exceso con respecto a la poca cantidad de urea formada, aún así no

64


podría funcionar cfclicamente ya que las otras reacciones del ciclo de la urea son muylimitadas.

El fenómeno de anticipación bioquímica ontogénética de un determinado caminometabólico fue descripta en anuros por Cohen (1966) quien mostró que la carbamilfosfatosintetasa y la arginina sintetasa se detectaban en etapas premetamórñcas de Ranacatesbeiana, momento en que son funcionalmente "innecesarias"; por otro lado Domm yJansens (1971) demostraron la existencia de varias enzimas del ciclo de la urea en larvasamoniotélicas de la rana Pseudopryne corroboree; también se puede mencionar, para el casode la aldosterona en Bw'o arenarum, a Castañé y col. (1987). Estos resultados pueden serconsiderados como la evidencia de un proceso acoplado de diferenciación bioquímicofisiológica.

En el primer estadío larval (estadio 26) la actividad específica se duplica, coincidiendocon el período en el se completa el tubo digestivo y los animales comienzan a alimentarse.En el hígado de larvas de estadío 29 la actividad aumenta considerablemente respecto delhomogenato total de larvas de estadio 26. Sin embargo, la actividad hepática de estas larvasprometamórficas fue considerablemente menor a la encontrada por Noguchi (1969) en elhígado de larvas de Rana catesbeiana.

6.4.2. Embriones en condiciones experimentales: adaptación a diferentes medios

En este trabajo se confirma la capacidad de los embriones de Bufo arenarum paradesarrollarse en agua destilada lo cual había sido mostrado anteriormente por Minotti y col.(1983) y por Castañé y col. (1987). Wallace (1991) encontró que el 96% de los embrionesde Triturus cristqu (urodelo) incubados en agua destilada tuvo un proceso normal deformación de la cabeza, y en 43 - 69 mM de NaCl sólo un 39% cumplió normalmente esaetapa del desarrollo. En el caso de Bufo arenarum se observó, cualitativamente, quetambién existió una menor mortalidad y malfomación externa en los animales mantenidosen agua destilada que en los desarrollados en solución de Holtfreter concentrada (60 mMde NaCl); también vale la pena mencionar que los animales que no fueron usados en losexperimentos continuaron viviendo en las soluciones experimentales durante 6 - 8 meses ymuchos de ellos completaron su metamorfosis.

La aclimatación a mayores niveles salinos no es muy común en los anfibios, y lasespecies capaces de adaptarse y soportar salinidades mayores que 150 mmol de NaCl/l sonaquellas que pueden mantener un gradiente osmótico favorable independientemente delestres osmótico. En algunos adultos y larvas esto se logra, principalmente, gracias a laacumulación de urea; en estos casos se vió que, a esa salinidad, aumentaban los niveles delas enzimas limitantes (Balinsky, 1981). Estos resultados, referentes a especies de anfibioscapaces de adaptarse al estrés osmótico, se contraponen con los resultados del presentetrabajo, en donde se observa que la actividad específica de la arginasa baja en el grupoincubado en solución concentrada respecto del control. Al interpretar estos resultados debetenerse en cuenta que éstos representan medidas hechas en un anuro del cual no se conoceque acumule urea en respuesta al estrés osmótico.

65


En animales criados en agua destilada o en la solución concentrada la actividadespecífica de la arginasa no mostró cambios en el primer período embrionario ( brote caudal- respuesta muscular). En Holtfreter concentrado, a medida que avanzó el desarrollo(circulación branquial, pliegue opercular, opérculo derecho cerrado), los niveles fueronsignificativamente menores que en el grupo control. Es interesante notar que este descensoen la actividad se corresponde con los estadios en que las branquias estan expuestas almedio externo concentrado. En ese lapso se establecen aquí procesos de intercambio iónico.De ellos el intercambio Na/NI-L+ es un mecanismo de eliminación de NH, alternativo queahora se suma al ciclo de la urea. Esta podría ser una explicación de la reducción observadaen la actividad de la arginasa de los animales hacia el final del desarrollo embrionario.

Si bien las pendientes de las rectas de regresión de la actividad de la arginasa respectode las horas post fecundación de los tres grupos no fueron significativamente distintas, seobservó que el comportamiento del grupo de Holtfreter concentrado difirió de los otrosgrupos, ya que el ANOVA realizado a lo largo del desarrollo para cada grupo mostró queexistían estadios en los que la actividad fue significativamente menor. Sin embargo, en laúltima fase del desarrollo embrionario, el estadío de opérculo completo, los valores seequipararon con el control, lo que sugerida una suerte de compensación de la maquinariabioquímica en el momento en que las branquias dejan de estar expuestas directamente almedio de incubación.

Los valores de la cantidad de proteínas del grupo control fueron comparables a losobtenidos en el punto 6.3.1. Para cada estadío, no se observaron diferencias significativasentre el control y los otros dos grupos. Dentro de cada grupo, a lo largo del tiempo, elcontenido de proteínas tendió a descender observándose diferencias significativas en losgrupos desarrollados en agua destilada y solución concentrada. Estos descensos podrian serexplicados como una indicación de procesos de diversificación metabólica concomitante conel desarrollo de los animales.

Uricasa en embriones, larvas y adultos

7 ACTIVIDAD DE LA URICASA EN EMBRIONES,LARVAS Y ADULTOS DE BUFO ARENARUM YLEPTODACTYLUS OCELLATUS

7.1. INTRODUCCION

Se estudió la actividad de la uricasa a) en distintas etapas del desarrollo de Bufoarenal-um; b) observando la respuesta de larvas de Bufo arenamm a condiciones dedesarrollo en medios de diferente osmolaridad y c) en adultos de especies con dísimilasociación al agua: Bufo arenamm (terrestre) y Leptodactylus ocellarus (semiacuática) conel objeto de determinar si este parámetro bioquímico particular permitfa separar a estas dosespecies considerando su grado de asociación al agua.


En Bufo arenarum se determinó a) la actividad de la uricasa en homogenatos totales deovocito, y en los estadios embrionarios: 2 blastómeros, gástrula, brote caudal, respuestamuscular, boca abierta, opérculo derecho cerrado, opérculo completo y en el primer estadiolarva] 26, todos desarrollados en solución de Holtfreter; b) la actividad de la uricasa enhígado de larvas de estadío 29 mantenidas en agua dulce artificial (peso promedio de los"pool" de hígados: 35,9 i 4,2 mg, n= 27 "pool" de hígados); c) en hígado de juvenilesde estadío 35 (peso de los "pool" de hígados: 38,6 i 8,4 mg, n= 5 "pool" de hfgados) yd) en hígado de adultos.

En hígado de larvas de estadío 29 se comparó la actividad de la enzima en animalescontrol (en agua dulce artificial) con otros dos grupos desarrollados, desde la fecundación,en medios de distinta osmolaridad: agua destilada y agua dulce artificial concentrada (VerMateriales y Métodos Generales, 3.3).

En Leptodacrylus ocellatur se midió uricasa en hígado de adultos.

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7.3. RESULTADOS

La actividad de la uricasa en homogenatos de embriones de Bing arenarum se encontrópor debajo de los límites de detección de la técnica utilizada en los ovocitos sin fecundary en los siguientes estadios embrionarios: 2 blastómeros, brote caudal, respuesta muscular,boca abierta y opérculo derecho cerrado.

En opérculo completo la actividad de la uricasa (nmoles de ácido úrico. min“' g" tej.,media i ESM) fue 0,11 j; 0,03 (número de homogenatos, n = 2) y la actividad específica(nmoles de ácido úrico. min". mg" de proteínas, media i ESM) fue 1,21 i 0,25 (n = 2).Para homogenatos totales de larvas de estadío 26 los valores fueron 0,27 i 0,01 (n = 2)y 4,12 i 0,51 (n = 2).

Otros resultados se presentan en las Tablas 14, 15 y 16.

Tabla N° 14: Actividad de la uricasa hepática en larvas de estadío 29, juveniles de estadío35 y adultos de Bufo arenarum. Datos en nmol de ácido úrico. min'| .g" de tejido. Mediasi ESM; entre paréntesis, número de homogenatos.

Estadio Uricasa

Larva (estadío29) 415,8 i 46,1(15)

Juvenil (estadío 35) 488,9 i 136,0 (5)

Adulto 785,0 i 126,0 (7)*

* Diferencia significativa con respecto a los otros estadios, p < 0,05.


Tabla N" 15: Actividad de la uricasa hepática en larvas de Bufo arenarum de estadío 29mantenidas en soluciones de diferente osmolaridad. Datos en nmol de ácido úrico. min".g" tej. Medias i ESM; entre paréntesis, número de homogenatos. ADA: agua dulceartificial (5,1 mOsm); ADE: agua destilada; ADA conc: agua dulce artificial concentrada(100 mOsm).

Condición Uricasa

ADA 415,81; 46,1(15)

ADE 621,7 i 119,9 (8)

ADA conc 1034,2 i 87,2 (4)*

* Diferencias significativas con respecto a losotros estadios, p < 0,05.

Tabla N° 16: Actividad de la uricasa en hígado de adultos de Bufo arenarum yLeptodactylus ocellatus. Datos en nmol de ácido úrico. min". g" de tejido. Medias i ESM;entre paréntesis, número de homogenatos.

Especie Uricasa

Bufo arenamm 785,0 i 126,1 (7)

uptodactylus ocellatus 283,0 i 20,6 (6)*

* Diferencias significativas, p < 0,05.


7.4. DISCUSION

Nuestros resultados indican que en los embriones de Bufo arenamm no se detectaactividad de la uricasa hasta el final del desarrollo embrionario, es decir en el estadio deopérculo completo. Si bien el número de experimentos es reducido se puede postulartentativamente que al transformarse en larvas (estadío 26) los valores de actividadenzimática en homogenatos totales aumentan considerablemente.

El hallazgo de actividad de la uricasa a partir de opérculo completo estaría indicando queuna parte de la urea urinaria de estos animales proviene de la degradación del ácido úricoen el hígado. Se detecta actividad de la uricasa hepática en Budaarenarum hacia el final deldesarrollo larva] (estadío 29) y en animales que completaron recientemente la metamorfosis(estadío 35); por otra parte, si tenemos en cuenta también los valores de actividad en hígadode adultos se podría afirmar que la actividad de la uricasa aumenta a medida que avanzael desarrollo dado que existe una diferencia significativa entre los adultos y los estadioslarvales.

Si comparamos los datos de la actividad de la arginasa en larvas prometamórficas yadultos (Tablas 13 y 8 respectivamente) con los de la actividad de la uricasa en los mismosmomento del ciclo de vida (tabla 17) podemos apreciar que el porcentaje de urea formadaen el ciclo de la urea aumenta enormemente al pasar al estado adulto.

Tabla N° 17: Porcentaje de la cantidad total de urea formada a partir del ciclo de la urea(arginasa) y del camino de la degradación de la purinas (uricasa) en hígado de larvasprometamórficas (estadío 29) y adultos de Bufo arenarum. Entre paréntesis, actividadpromedio de la arginasa y la uricasa en pmol de urea. min". g'l de tejido.

EstadioOrigen de la ureaformada Larva Adulto

Ciclo de la urea 60 99,7(1,27) (563.4)

Degradación de purinas 40 0,3(0.41) (0,73)

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La Tabla 14 presenta la actividad de la uricasa en larvas de Bufo arenarum de estadío29 mantenidas en soluciones de diferente osmolaridad. Se observa que la actividad de laenzima no es independiente de la presión osmótica del medio de desarrollo. En el grupomantenido en un ambiente de elevada osmolaridad (ADA concentrada) la actividad essignificativamente mayor que en el grupo control. De acuerdo con la hipótesis de laadaptación de la actividad de las enzimas a medios con escasa disponibilidad de agua sehubiera esperado que, con el aumento de la osmolaridad del medio externo, ocurriera unadisminución en la vía de degradación del ácido úrico. Sin embargo, en este caso, elaumento significativo de la actividad de la uricasa a 100 mOsm probablemente responda aotras causas. Dado que la osmolaridad del plasma aumenta paulatinamente en las etapasfinales de la metamorfosis afectando la síntesis de proteínas (Burggren y Just, 1992), elADA concentrada podría llegar a ser, en determinado momento del desarrollo, un mediohiposmótico respecto del medio interno. Así, la actividad de la uricasa se verla modificadarespecto de los animales control, mantenidos en contacto con un medio en el que las larvasson capaces de osmoregular.

Existe una manifiesta diferencia entre la actividad de la uricasa del hígado de adultos deBig/barenamm y de Leptodactylus ocellatus; los valores son superiores en Bufo arenarum.La diferencia señalada es nítida y de una magnitud tal que permite comparacionesinequívocas y válidas. Dado que Bufo arenarum es de hábitos terrestres y que el habitat deLeptodactylus ocellatus es semiacuático, la actividad de esta enzima podría ser consideradacomo parámetro indicador del grado de "terrestrialidad" en estos anuros ureotélicos.

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8 EFECTO DEL CADMIO SOBRE LAACTIVIDAD DE LA ARGINASAI-IEPATICA DE BUFO ARENARUM

8.1. INTRODUCCION

Los efectos de los contaminantes químicos pueden visualizarse a diferentes niveles deorganización, desde el nivel molecular hasta llegar al de población y ecosistema.Usualmente, las primeras respuestas a un cambio ambiental detectables y cuantificables sonlas alteraciones fisiológicas, bioquímicas o moleculares. Esto significa que, frente a cambiosquímicos del ambiente, las modificaciones de los sistemas bioquímicos frecuentemente sonindicadores más sensibles que otros a niveles de organización mayores (Stegeman y col.,1992).

La administración de ciertas dosis de cadmio en animales de laboratorio causa severodaño en el hígado. La reacciones bioquímicas de intoxicación y detoxificación contribuyenal desarrollo de estas lesiones a pesar de que se ignora hasta el momento, el mecanismoexacto implicado (Kershaw y Klaassen, 1991). La toxicidad del cadmio se podría explicarpor su unión a moléculas blanco; esto significa que ciertas proteínas (distintas de lasmetalotioninas) u otros contituyentes biológicos con alta afinidad por el cadmio, podrían seresas molécqu que indujeran la toxicidad (Sunaga y col., 1991). Demichelis y col. (1992)han demostrado recientemente que el cadmio inyectado se acumula en el hígado de adultosde Bufo arenamm.

En este experimento se estudió la respuesta de la actividad de la arginasa hepática deadultos de Bufo arenamm a inyecciones de cadmio con el objeto de evaluar si la toxicidadde este metal afecta el metabolismo de excreción nitrogenada.

8.2. MATERIALES Y METODOS

Se utilizaron 19 ejemplares adultos de Bufo arenarum de ambos sexos identificadosindividualmente cuyo peso corporal era de 105,3 i 4,5 g los cuales fueron colocados 5 díasantes del comienzo del experimento a 20 °C y fotoperíodo 12/12. Los animales fueronalimentados 5 veces por semana con carne vacuna de la misma composición que la indicadaen 5.2. a razón de l g/lOO g de peso corporal. Se los pesó y se los distribuyó al azar en

72

Arginasa y cadmio

3 grupos que recibieron o bien inyecciones de solución Ringer anfibio o bien una soluciónde CdClz en Ringer anfibio según el siguiente esquema:

Grupo ¡amiga Día de muestreoRings: Cadmio

l (Control) + 26

2 (Tratado) + 26

3 (Tratado) + 26

Los animales de los Grupos 2 y 3 recibieron dosis de 2,8 y 5 mg de Cd/kg de pesocorporal respectivamente, fraccionadas equitativamente en 3 inyecciones administradas aintervalos regulares a lo largo de 26 días. Estas cantidades subletales fueron elegidasteniendo en cuenta los datos que se encuentran en la bibliografía sobre la toxicidad delCdClz en anfibios (WHO, 1992; Devillers y Exbrayat, 1992).

El día del muestreo se pesó a los animales, se los desmeduló, se separó el hígado y selo pesó. Se dosaron proteínas hepáticas y arginasa hepática (Ver Materiales y MétodosGenerales, 3.8.4. y 3.8.5).

8.4. RESULTADOS

En las Tablas 18 y 19 se presentan los datos de la comparación del peso corporal inicialy final y el peso del hígado con respecto al peso corporal de los animales de cada grupoexperimental y el grupo control.

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Arginasa y cadmio

Tabla N’ 13: Pesos corporales de Bufo arenamm inyectados con cadmio al inicio de laadaptación a las condiciones de temperatura, fotoperíodo e inyección (inicial) y en elmomento de la toma de las muestras (final). Datos en g; medias i; ESM; entre paréntesis,número de animales.

Grupo Peso inicial Peso final

1 (Ringer) 95,0 i 5,6 (6) 91,3 i 3,3 (6)

2 (2,3 mg Cd/kg) 113,2 i 12,8 (4) 105,4 i 10,1 (4)

3 (5,0 mg Cd/kg) 106,4; 6,0 (9) 105,6i 4,4 (9)

Tabla N" 19: Peso de los hígados y porcentaje del peso del hígado respecto del pesocorporal de Bufo arenarum adultos inyectados con cadmio. Datos en g; medias i ESM;entre paréntesis, número de animales.

Grupo Peso Hígado 96 Hígado/Cuerpo

l (Ringer) 3,4 i 0,2 (6) 3,8 i 0,3 (6)

2 (2,8 mg Cd/kg) 4,4 ¿1;0,6 (4) 4,2 i 0,7 (4)

3 (5,0 mg Cd/kg) 4,1 i 0,3 (9) 3,8 i 0,2 (9)

El peso de los animales no varió significativamente (ANOVA) durante el experimento.Por otra parte, el tratamiento con cadmio tampoco modificó el peso del hígado yconsecuentemente la relación de pesos entre el hígado y el cuerpo, no siendo significativaslas diferencias entre los 3 grupos. Sin embargo, cabe agregar que el aspecto del hígado enlos animales intoxicados era diferente al de los controles, los primeros eran másconsistentes y de color más oscuro como lo muestran las fotografías (Figura ll).

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Arginasa y cadmio

Figura N° ll: A: Fotografía del hígado de Bufo arenarum inyectado con cadmio (2,8mg/kg de peso corporal) y el de animales control (inyectados con Ringer anfibio).B: Fotografía de los homogenatos de los mismos hígados donde puede apreciarse mejor ladiferencia de color entre los de animales tratados y los controles.

75

Arginasa y cadmio

Los resultados que se refieren a la actividad de la arginasa hepática se presentan en laTabla 20.

Tabla N° 20: Actividad específica de la arginasa hepática de adultos de Bufo arenaruminyectados con cadmio. Datos en pmol de urea. min". g" proteínas; medias :1; ESM; entreparéntesis, número de animales.

Grupo Arginasa

l (Ringer) 6609,89 i 406,04 (6)

2 (2,8 mg de Cd/kg) 2980,57 i 384,07 (4) *

3 (5,0 mg de Cd/kg) 4184,22 i 429,22 (9) *

* Diferencias significativas respecto del Grupo l (control).

La actividad específica de la arginasa disminuyó significativamente en los grupostratados con inyecciones de Cd respecto del Grupo l (control inyectado con solución deRinger); no se detectaron diferencias significativas entre la actividad de la arginasa entrelos animales de los Grupos 2 y 3.

8.5. DISCUSION

Los resultados indican que la actividad específica de la arginasa se vió afectada por elcadmio, en ambos tratamientos ésta disminuyó significativamente. Demichelis (1993) noencontró modificaciones en la actividad de la arginasa en Bufo arenarum adultos tras haberinyectado 2 mg de Cd/kg de peso a lo largo de 24 días; en el presente experimento seaumentó la dosis verificando un efecto del metal sobre esta enzima.

La actividad específica de la arginasa en los controles fue aproximadamente 30 % mayorque la presentada en la Tabla 8 (Grupo 2); no obstante, cabe destacar que en este caso lacantidad de alimento por unidad de peso corporal suministrada a animales de tamañoconsiderablemente menor fue el doble.

76

Arginnsa y cadmio

Se demostró que la actividad de la arginasa dependía de la presencia de cationesbivalentes como el manganeso, cobalto, níquel y en algunos casos hierro y cadmio (HirschKolb y 001., 1971). Maggini y col. (1992) postularon que la actividad de la arginasa seríamodificada por cambios en la concentración del cofactor manganeso. Es así que, teniendoen cuenta a dichos autores y a partir de los resultados obtenidos planteamos la hipótesis queel cadmio acumulado en un tejido blanco tendría un efecto competitivo sobre el cofactor dela arginasa; sin embargo, la misma no pudo ser confirmada por ensayos preliminaresrealizados in_vitLQ(Castañé, Demichelis y Salibián, inédito).

Tanto en los animales controles como en los tratados la comparación estadística de lospesos corporales, al inicio de la adaptación a las condiciones ambientales de alimentacióne inyección y al momento de la toma de muestras, no arrojó diferencias significativas locual indicarfa que en el lapso que duró el experimento, a) la cantidad de alimentosuministrada fue adecuada, vale decir que los animales no habrían tenido necesidad derecurrir a sus reservas lipídicas y b) el tratamiento con cadmio no afectó mecanismos quepodrían modificar el peso de los animales (entre otros, por ejemplo, el balance acuoso).

Arginnsa y cadmio

9 CONCLUSIONES

La urea fue el producto de excreción urinaria mayoritario en todas las especies de anurosestudiadas, independientemente del habitat que ocupan los adultos. Este resultado se alejarfade la hipótesis clásica que relaciona habitat con producto dominante.

Leptodaclylus ocellatus presentó un porcentaje de urea excretada significativamentemenor que las especies del género Bufo; no obstante, un 91 % de urea en orina podríaconsiderarse excesivamente alto y en consecuencia éste seria un resultado "anómalo"teniendo en cuenta que se trata de una rana de hábitos semiacuáticos.

La concentración de urea en plasma de adultos fue menor en L. ocellatus que en losejemplares de Bufo y en todos los casos la relación U/P (cociente entre urea urinaria y ureaplasmática) fue mayor que l lo cual indicarfa que el riñón podría ser un sitio de producciónde urea.

Una diferencia más nítida entre la especie semiacuática y las de hábitos terrestresestudiadas fue la relación U/P la cual fue significativamente mayor en L. ocellatus, estehecho indicaría, sumándose a lo mencionado en el párrafo anterior, que la magnitud de lareabsorción tubular de agua ha de ser menor en la primera especie respecto de las demás.Asimismo, la comparación de la actividad de la uricasa hepática entre adultos de L.ocellatus y B. arenarum dió como resultado que la misma fue significativamente menor enla especie semiacuática que en la terrestre; las medias de ambos valores tuvieron unarelación aproximada de 1:3. En estos casos estudiados la diferencia entre habitats se vióreflejada de manera mas concluyente mediante la actividad de dicha enzima que por lapartición de los productos de excreción nitrogenada urinarios.

El estado nutricional de los animales adultos y en particular la ingesta de proteínas,influye en el metabolismo hepático de sustancias nitrogenadas, puesto que se observó que,en Bufo arenarum adultos ayunados, la actividad específica de la arginasa disminuyó,aumentando la cantidad de proteinas. No se vieron modificados los productos de excreción.

El estudio de la ontogénesis de la arginasa en homogenatos totales de embriones de Bufoarenarum reveló que la actividad específica se registró tempranamente, a partir del estadíode surco neural y que la misma se incrementó a lo largo del desarrollo. Al pasar a la faselarva] existió un importante aumento en la actividad; asimismo, en higado de larvasprometamórficas, se observó que la actividad arginásica fue aproximadamente una vez ymedia mayor. La cantidad de proteínas totales se mantuvo constante durante el desarrolloembrionario.

La actividad de la uricasa hepática aumentó a lo largo del desarrollo de Bufo arenarum,fue menor en larvas prometamórficas y juveniles que en el adulto. Cuando se compararóla actividad media de la uricasa y la arginasa en larvas y adultos de esta especie, se observóque existía un aumento en la actividad de ambas enzimas. Mientras la actividad de la

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Conclusiones

arginasa aumentó 2 órdenes de magnitud al pasar al estado adulto, la uricasa no alcanzó aduplicar su valor. Este hecho puso de manifiesto que el aumento de las enzimas del ciclode la urea como efecto directo o indirecto de las hormonas liberadas durante lametamorfosis produjo una variación drástica en la proporción de las cantidades de la ureaurinaria provenientes de la degradación del ácido úrico y del ciclo de la urea.

Frente a un estrés osmótico, la respuesta de la actividad específica de la arginasa, enhomogenatos totales de embriones desarrollados en solución de Holtfreter concentrada,disminuyó respecto de los controles (animales mantenidos en Holtfreter diluída). Estefenómeno se presentó solamente en los estadios en que las branquias se encontrabanexpuestas. Interpretamos este hallazgo como una consecuencia secundaria del intercambioNa/NH4 propio del epitelio branquial que reduciría la disponibilidad de NI-I3ingresante enel ciclo de la urea. Esto podria explicar la disminución de la actividad de la arginasa.

Otra posible interpretación confluyente con la anterior es que el descenso de la actividadde la arginasa durante una buena parte del desarrollo embrionario en el grupo de Holtfreterconcentrado (una condición que simula una reducción en la disponibilidad de agua) daríala pauta que, frente a un estrés osmótico, los embriones serían capaces de realizarmodificaciones en el catabolismo de productos nitrogenados, favoreciendo tal vez otras víasmetabólicas alternativas como por ejemplo el camino degradativo del ácido úrico.

Si asumiéramos que el comportamiento bioquímico de estos embriones tempranosestaría relacionado con su capacidad evolutiva, podriamos considerar, entonces, que estarespuesta estaría de acuerdo con la hipótesis de Balinsky y col. (1976). Dicho autor postulóque los cambios en los habitats de anuros adultos se habrían producido junto con lamodificación de las actividades relativas de las enzimas intervinientes en el catabolismo desustancias nitrogenadas antes que por la sintesis de nuevas entidades bioquímicas.

La concentración del medio de incubación afectó la actividad de la uricasa hepáticade larvas prometamórficas de Bufo arenarum.

En Bufo arenarum adultos inyectados con cantidades subletales de cadmio se inhibió laactividad específica de la arginasa hepática respecto de los controles, lo que indicar-íaqueal menos parte del metabolismo nitrogenado se vería afectado por este contaminanteambiental.

La actividad de las enzimas que intervienen en las vías metabólicas que conducen a losproductos nitrogenados de excreción urinaria podrian llegar a ser detectadas tempranamenteen el desarrollo de los anuros y serían indicadoras del tipo de habitat que ocupan los adultospues se ha demostrado que son sensibles a los cambios ambientales incluídos los queproducen algún tipo de estrés.

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Bibliografía

BIBLIOGRAFIA CITADA

- Alcocer, I.; Santacruz, X.; Steinbeisser, H.; Thierauch, K.H. y del Pino, E.M. (1992)Ureotelism as the prevailing mode of nitrogen excretion in larvae of the marsupial frogGastrotheca riobambae (Fowler) (Anura, Hylidae). ngp, Mm, PhysiQL_1_0_lA(2): 229-231.

- Aoki, Y.; Sunaga, H. y Suzuki, K.T. (1988) A cadmium-binding protein in rat liveridentifiedas omitinecarbamoyltransferase.Mm. 1. 2in 735-742.

- Aminlari, M. y Vaseghi, T. (1992) Arginase distribution in tissues of domestic animals.QQmD-Mein. Rimini. .193B (2): 385-389.

- Balinsky, J.B. (1970) Nitrogen metabolism in amphibians. En Campbell, LW. (Ed.)mm mmm 9_fImagen metalnlismVolumen2, AcademicPress,Londres. pp. 519-637.

- Balinsky, J .B. (1972) Phylogenetic aspects of purine metabolism. S. Air. Mgi. .I. 4_6:993 997

- Balinsky,B.I. (1978)mmm a la emtnjglogïaEd. Omega, Barcelona,644 pp.- Balinsky, J.B. y Baldwin, E. (1962) Comparative studies of nitrogen metabolism in

Amphibia.Mm. 1. 32: 187-191.- Balinsky, J.B.; Chemaly, S.M.; Currin, A.E.; Lee, A.R.; Thompson, R.L. y Van der

Westhuizen, D.D. (1976). A comparative study of enzymes of urea and uric acidmetabolism in different species of amphibia and the adaptation to the environment ofthe tree frogChitomantismmm Peters.92mm Bimhem.Bhuigl. 5.4:540-555.

- Balinsky, J. B. (1981) Adaptation of nitrogen metabolism to hyperosmotic environmentin Amphibia.1. en. M. 215: 335- 350.-Bentley,PJ.(l97l)_duEnn'nmmm. ¿mmmojmregulation 9_fwgtgrand san i_nmmm. Springer Verlag, Berlin. 300 pp.

- Boemke, W.E. (1973) Adaptation of Amphibian arginase - I. Response to dehydratation.gonna. Bimhem.Bum. fi B : 647-655.

- Bracken, W.M. y Sharma, R.P. (1985) Cytotoxicity related changes in biochemical cellfunctionfollowing"mLim cadmiumtreatment.Mg! 2: 189-200.

- Bretos, M.; Martínez, C. y Cabello, J . (1967) Actividad arginásica y variacionescuantitativas de las proteínas y del peso durante la embriogénesis del sapo Bufospinulosus. Arch. Biol. Mgï. E5131. 4_2:244-251.

- Brown,G.W. (1964) The metabolismof Amphibia.En Moore,J.A. ( Ed.), Muof me Amphibig. New York, Academic Press, pp. 1-98.

- Burggren, W.W. y Just, JJ. (1992) Developmental changes in physiological systems. EnFeder,M.E.y Burggren,W.W.( Eds.)Environmenmphysiology91m;University of Chicago Press, Chicago. pp. 467-530.

- Byrne, J. y White, R. (1975) Cyclic changes in liver and muscle glycogen tissue lipid andblood glucose in a naturally occurring population of Rana catesbeiana 991m2.Bimhem.2111533. 5_QA: 709-715.

Bibliografia

- Campbell, J.W. (1991) Excretory nitrogen metabolism. En: Prosser, C.L. ( Ed.),Mmmm and mmm; animalnhxsiolgax,Wiley- Liss, NewYork.pp. 277324.

- Campbell, J.W.; Vorhaben, J. y Smith Jr., D. (1987) Uricoteley: its nature and originduring evolution of tetrapod vertebrates. 1. exp. Zml. 2132349663.

- Carlisky, N. J.; Botbol, V.; García Argiz, C.A.; Ban-io, A. y Lew, V.L. (1968)Properties and subcellular distribution of omithine cycle enzymes in amphibian lddney.Qcmn- Bimhcm. BhïSlQl- 25: 835-848.

- Carlisky, NJ. (1970) Urea excretion and arginase in Anuran kidney. En: SchmidtNielsen, B (Ed.), nm and me 191m, ExcerptaMedicaFoundation,Amsterdam.pp.263-271. .

- Castañé, P. M.; Salibián, A.; Zylbersztein, C. y Herkovits, J. (1987) Ontogenic screeningof aldosterone in the South American toad Bufo arenarum. Mim. Bhysigl.Sá: 697-701.

- Cohen, P.P. (1966) Biochemical aspects of metamorphosis transition from amoniotelismto ureotelism.11m 1,51., m: 119-154.

- Degani, G. y Nevo, E. (1986) Osmotic stress and osmoregulation of tadpoles andjuvenilesof Pelobatessyriacus.Comp,Bm Busng 33 A: 365-370.

- Del Conte, E. y Sirlin, J. (1951) Serie tipo delos pn'meros estadios embrionarios en Bufoarenamm. Acta Zml. Lillgana 12: 495-499.

- Demichelis, 8.0- (1993) Impath del admira SQDLQel fimsimalismq del ciclo de la uma.Biblioteca Central, Universidad Nacional de Luján, número de inventario 13.7737: 63PP

- Demichelis, S.O.; Rovedatti, M.G.; Castañé, P.M. y Salibián, A. (1992) Acumulaciónde cadmio en hígado de Bufoarenarum. ¿IA Mana L6: 104.

- Devillers,J. y Exbrayat,J.M. (1992)mm 9_fchemical;tg Amphibians,Volumenl, Gordon and Breach Science Publishers S.A., Amsterdam. 351 pp.

- Domm, A. y Janssens, P.A. (1971) Nitrogen metabolism dun'ng development in thecorroboree frog Pseudophynecorroboree Moore. ngp. Bigghem. Physigl. 18 A: 163173.

- Draper, N.R. y Smith, H. (1981) Appljgi Legmsiog analysis. John Wiley and Sons, NewYork. 709 pp.

- Duellman,W.E. y Trueb,L. (1986)Biology91' McGrawHill.670pp.- Echeverría, D.D. y Fiorito de López, L.E. (1981) Estadios de la metamorfosis en Bufo

arenarum (Anura). Mi 4_Q:15-23.- Espina, S.; Salibián, A. y Rojas, S. (1980) Nitrogen excretion in the South American

aquatic leptodactylid Caudiverbera caudiverbera. Comp. Bimhem. Physigl. EA: 163173.

- Fawcett, J .K. y Scott, J .E. (1960) A rapid and precise method for the determination ofurea. .I. cli_n.Bath. l}: 156-159.

- Ferrari, L. ; Lombardo, R. y Salibián, A. (1988) Modificaciones en el equilibrio hfdn'code larvas de Bufo arenamm expuestas a soluciones de D-manitol. Resúmenes del X11r (N°1152):96

- Fujiwara, S.; Ohashi, H. y Noguchi, T. (1987) Comparison of intraperoxisomallocalization and properties of amphibian (Rana catesbeiana) uricase with those of otheranimal uricases. Comp Em. Ehysiol.89_B:23-26.

ii

Bibliografia

- Funkhouser D. y Goldstein L. (1973) Urea response to pure osmotic stress in the aquatictoad Xenopus laevis. Am. .L Bhysjgl. 2g: 524-529.

- Gosner, K.L. (1960) A Simplified table for staging anuran embryos and larvae with noteson identification.11mm 16: 183-190.

- Grably, S. y Piery, Y. (1981) Weight and tissue changes in long term starved frogs Ranaesculenta 99m2. Bimhgm. Ehysjgl. 62 A: 683-688.

- Hansen, J.C.; Gron, P.; Jespersen, B.A.; Voigt, J.; Simonsen, 1.; Dalgaard, J.B. yHansen, E. (1989) Cadmium exposure in Denmark. Based on analyses of liver andkidney tissues. Dan. Med. Bull. 35: 499-502.

- Hellstrom-Lindahl, E. y Oskarsson, A. (1989) Response of rat hepatocyte cultures tocadmiumchlon'deand cadmium- diethyldithiocarbamate.m1 ¿6: 9-21.

-Henry, R.J.;Sobel, Ch. yKim, J. (l957)Amodified 4 ‘ ,L ,L L a ‘ ‘ methodfor the determination of uric acid and comparisons with the spectrofotometn'c uricasemethod. Am. ,I. gún. Bam. 25: 152-160.

- Herkovits, J.; Castañé, P.M. y Salibián, A. (1983) Peso seco, peso húmedo y proteínasdurante el desarrollo de embriones de Bufo arenarum provenientes de ovocitos grandesy paqueños y su relación con el peso materno. Maligna 4_3(6/2): 815-816.

- Hill, R.W. y Wyse, G.A. (1989). Animal Bhysjglggy. Harper Collins Publishers, NewYork. pp 198-209.

- Hirch Kolb, H.; Kolb, H.J. y Greenberg, D.M. (1971) Nuclear magnetic resonancestudies of manganese bindings of rat liver arginase. 1. ngl. Quem. 216: 395-401.

- Hochachka,P.W.ySomero,G.N.(1984)Mmm m. PrincetonUniv.Press,Princeton, New Jersey, 537 pp.

- Hourdry, J (1993) Passage to the terrestrial life in amphibians: events accompanying thisecologica] transition. Zml. nggggg _l_Q:715-731.

- IUBMB(1992)Engine mm, AcademicPress, SanDiego,California.862pp.- Jacobson, K.B. y Turner, J.E. (1980) The interaction of cadmium and certain other metals

ions with proteins and nucleic acids. ' L6:- Jones, R.M. (1982) Urea synthesis and osmotic stress in the terrestrial anurans Bufo

woodhouseiand Hyla cadaverina. 99m2. Mm. Physigl. 1L A: 293-297.- Jungreis, A.M. (1976) Partition of excretory nitrogen in amphibia. ngp. Milan.

Physigl. 3A: 133-141.- Jungreis, A.M. y Hooper, A.B. (l970)a. The effects of long- term starvation and

acclimation temperature on glucose regulation and nitrogen anabolism in the frog Ranapipiens.I Winteranimals.ngp. Mm. Physigl.2: 417-432.

- Jungreis, A.M. y Hooper, A.B. (1970) b. The effects of long- term starvation andacclimation temperature on glucose regulation and nitrogen anabolism in the frog Ranapipiens. II Summer animals. Comp. Bigghem. Physical. 31: 433-444.

- Kershaw, W.C. y Klaassen, C.D. (1991) Cadmium-induced elevation of hepaticisometalothioneinconcentrationsin inbredstrainsof mice.Quem,Biol,mmm 18:269-282.

- King,P.A. y Goldstein, L. (1985) Renal excretion of nitrogenous compounds inVertebrates.32ml mm. fi: 261-278.

- Knox, W.E. y Greengard, O. (1964) The regulation of some enzymes of nitrogenmetabolism- An introduction to enzyme physiology. M1. En. Egg. 3: 247-313.

- Lehninger,A.L. (1981)mmm Ed. Omega, Barcelona. 1117pp.

iii

Bibliografia

- Loveridge, J.P. (1970) Observations on nitrogenous excrefion and water relations ofChiromantis xerampelina (Amphibia, Anura). Amgldja fi: 1-6.

- Lowry, O.H.; Rosebrough, N.J.; Farr, A.L. y Randall, R.J.(l951) Protein measurementwith the Folin phenol reagent. 1. bigl. Chen]. 123: 265-275.

- Maggini, S.; Stoecklin Tschan, F.B.; Morikofer Zwez, S. y Walter, P. (1992) Newkinetic parameters for rat liver ar inase measured at near-physiological steady-stateconcentrations of arginine and Mn +. Ejmhgm. ,I. 233: 653-660.

- Martin, M.C. de; Núñez, A.M. y Tomatis, M.E. (1985) Metamorfosis en anfibios. I.Desarrollo metamórfico en larvas de Brgfoarenaan Hensel (Amphibia: Anura).Histmia Natural ¿(32): 289-382

- Mayer, F.L.; Versteeg, D.J.; McKee, M.J.; Folmar, L.C.; Graney, R.L.; McCume,D.C. y Rattner, B.A. (1992) Physiological and nonspecific biomarkers. En: Huggett,R.J.; Kimerle, R.A.; Mehrle Jr., P.M. y Bergman, H.L. (Eds.), Bigmarkers, LewisPublishers, Chelsea. pp. 5-85.

- Mc Nabb R.A. y Mc Nabb, P.M.A. (1980) Physiological Chemistry of uric acidsolubility, colloid and iron-bindingproperties. 991m2 Him. Bhysigl. 61 A: 27-34.

- Merkle, S. y Hanke, W. (1988) Long term starvation in Xenopus laevis Daudin I. Effectson general metabolism.goma. Mm. 1115101.82 B: 719-730.

- Merkle, S. (1990) Effects of starvation in Xenopus. En: Hanke, W. ( Ed.) Biology and11.1531ng 9_fmobbing}, Fischer Verlag, New York. pp. 311-320.

- Mora,J.; Tabbar, R.; Martuscelli, J. y Soberon, G. (1965) Characten'stics of arginasefrom ureotelic and non- ureotelicanimals. Him. .I. 26: 588-594.

- Minotti, P.G.; Herkovits, J. y Salibián, A. (1983) Desarrollo de embriones de Bufoarenarum en agua destilada: tolerancia y alteraciones en el tejido ectodérmico.MR'mnHQQuar- 24.

- Morris, S.M.; Moncman, C.L.; Rand, K.; Dizikes, G.J.; Cederbaum, S.D. y O’Brian,W.E. (1987). Regulation of mRNA levels for five urea cycle enzymes in rat liver bydiet, cyclicAMPand glucocorticoids.m. Eminem. Bm. 216 (l): 343-353.

- Muiño, C.V.; Ferrari, L. y Salibián, A. (1990). Protective action of ions against cadmiumtoxicityto youngBufoarenarum tadpoles.M. Envirgn. mg. ijgximl. 4_5:313319.

- Müller, L.; y Ohonesorge, F.K. (1984) Cadmium-induced alteration of the energy levelin isolated hepatocytes. ' 31: 29 06.

- Müller, L. (1986) Consequences of cadmium toxicity in rat hepatocytes: mitochondrialdysfunctionand lipiddperoxidation.Mm 4_Q:285-295.

- Nener, J .C. (1988) Variable and constrained features of the omithine - urea cycle. gm.1. M. fi: 1069-1077.

- Noguchi, T. (1969) Regulatory mechanism of hepatic arginase activity of anuran tadpolesduring metamorfosis.L Eng,5g, univ, 19319 531 L! LM) ua): 555-577.

- Nomiyama, K. (1986) The chronic toxicity of cadmium: influence of environmental andother variables. En: Foulkes, E.C. ( Ed.), Cadmium, Springer - Verlag, Berlin. pp.101-133.

- Nríagu, J-O- y Sprague, J-B. (1987) Qadmirun i_nrthe admira Mmmm, J. Wiley andSons, New York. 272 pp.

- Padhye, A.D. y Ghate, H.V. (1992) Sodium chloride and potassium chloride toleranoeof different stages of the frog, Microhyla omata. 5mm. 1. _2_:18-23.

iv

Bibliografia

- Page A.L.; El Amamy, M.M. y Chang, A.C. (1986) Cadmium in the environment andits entry into terrestrial food chain crops. En: Foulkes, E.C. ( Ed), Qadmium,Springer - Verlag, Berlin. pp. 33-74.

- Peiser, L. y Balinsky, J.B. (1982) Kinetic properfies of arginase from Xenopus laevis.. him. Physical.13 B: 215-220.

- Perez Coll, C.S.; Herkovits, J. y Salibián, A. (1985). Efectos del cadmio sobre eldesarrollo de un anfibio. Arch. Biol Mai. En. 18: 33-39.

- Salibián, A. y Fichera, L.E. (1984) Excreción nitrogenada urinaria de Bufo arenamm.Ele. Animal11011.5.Paula8: 109-118.

- Schlaghecke, R. y Blum, V. (1978) Seasonal variations in liver metabolism of the greenfrogRanaesculenta.flama 35: 456-457.

- Schmid, W.D. (1968) Natural variations in nitrogen excretion of amphibians fromdifferent habitats. M93! 12: 180-185.

-Schoffeniels, E. (1991) Le systeme de la biochimie comparée. Arch, im, Ehysigl, Bimhim,et a: mmm. 22: 14s.

- Shoemaker, V.H. (1987) Osmoregulation in Amphibians. En: Dejours,P.; Bolis, L.;Taylor,CR. y Weibel(Elsa, ° mmm; ur: in me: ¿mi9.oland,Fidia Research Series, IX-Liviana Press, Padova. pp 109-117.

- Shoemaker, V.H.; Balding, D.; Ruibal, R. y McClanahan, Jr. L. (1972) Uricotelism andlow evaporative water loss in a South American frog. ¿densa 11:: 1018-1020.

- Shoemaker, V.H. y McClanahan, L.L. Jr (1975) Evaporative water loss, nitrogenexcretion and osmoregulation in Phyllomedusinefrogs. 1. mp. Physigl. M: 331345.

- Shoemaker, V.H. y McClanahan, L. (1973) Nitrogen excretion in the larvae of a landnesting frog (Leptodactylusbufonius).Comp. mm. Ehyjiol. fi A: 1149-1156.

- Shoemaker, V.H. y McClanahan, L.L. (1982) Enzymatic correlates and ontogeny ofuricotelism in tree frog of the Genus Phyllomedusa. .I. exp. Zml. 229: 163-169.

- Shoemaker, V.H.; Hillman, S.S.; Hillyard, S.D,; Jackson, D.C.; McClanahan, L.L.;Withers, P.C. y Wygoda, M.L. (1992) Exchange of water ions and respiratory gasesin terrestn'alamphibians.En: Feder, M.E. y Burggren,W.W. (Eds.),Mmmphyjigjggy of the Amnhibiam, University of Chicago Press, Chicago. pp. 123-150.

- Stegeman, J.J.; Brouwer, M.; Di Giulio, R.T.; Fórlin, L.; Fowler, B.A.; Sanders, B.M.y Van Veld, P.A. (1992). Molecular responses to environmental contamination:enzyme and protein systems as indicators of chemical exposure and effect. En:Huggett, R.J.; Kimerle, R.A.; Mehrle Jr., P.M. y Bergman, H.L. (Eds.), Bigmgkers,Lewis Publishers, Chelsea. pp. 235-335.

- Sunaga, H.; Yamane, Y.; Aoki, Y. y Suzuki, K.T. (1991) Different distribution ofcadmium in the liver supematant between in vi_vgand m litro. ge; {29mm Qhem,Bath;üamawL JA (2): 215-222

- Takiguchi, M.; Haraguchi, Y. y Mori, M. (1988) Human liver-type arginasegene:strucutureof thegeneandanalysisof thepromoterregion.NucleigAcidml_6(l8): 8789-8802.

- U.S. Departmentof Health and Human Service (1993) maca; profile fo;(¿asimism- 171 pp.

- Venkatakrishnan, G. y Reddy, S.R.R. (1983) A comparative polyacrylamide gelelectrophoretic study of arginase in vertebrate tissues. Enzyme 22: 145-152.

V

Bibliografia

- Wallace, H. (1991) The development of Triturw cristatus under osmotic stress. 110333Arch. MEM. 299:53-60.

- WHO (World Health Organization) (1992) Enximnmsntal Hsalth Emilia 1.15QadmiumEnximmmal mts, Geneva.156PP

- Withers, P.C.; Hillman, S.S.; Drewers, R.C. y Sokol, O.M. (1982) Water loss andnitrogen excretion in sharp-nosed reed frogs (Hyperolius nasutus: anura, Hyperoliidae).1. en. Big]. 91: 335-343.

- Withers, P.C. (1992) 951mm Animal Ehuiglggy. Saunders College Publishing(Florida), 949 pp.

- WorthingtonBiochemicalCorporation(1972)ngingtgn enzymemal New Jersey,pp 37-38.

- Zamorano, B.; Cortés, A. y Salibián, A. (1988) Ammonia and urea excretion in urine oflarval Caudiverbera caudiverbera (L.) (Anura, Amphibia). 9.0.0112.mm. Physigl.215 (l): 153-155.

- Zar,LH.(1984) Msi; PrenticeHall,NewJersey.718pp.

“7W mp;///,/

I

/

vi

Bibliografia

MMMN° y Título abreviado Página

l: Actividad de la uricasa en hígado de algunos anuros . . . . . . . . . . . . . . . 22

2: Cuadro comparativo de los estadios de desarrollo Bufo arenarum según distintosautores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3: Productos de excreción nitogenada urinaria en anuros de diferente habitat . . 37

4: Productos de excreción nitrogenada urinaria en anuros de diferente habitat.Porcentajes de los datos de la Tabla N° 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

5: Relación entre N-urinario y plasmático en anuros sudamericanos de diferentehabitat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

6: Coeficientes de correlación entre el peso corporal y los productos de excreciónnitrogenada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

7: Actividad de la arginasa hepática en adultos de distintas especies de Bufo . . 44

8: Actividad de la arginasa y proteínas totales hepáticas en adultos de Bufoarenamm sometidos a diferentes regímenes alimentarios . . . . . . . . . . . . 46

9: Concentración de los productos nitrogenados urinarios y de la ureaplasmática en adultos de Bufo arenarum sometidos a diferentesregímenes alimentarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

10: Parámetros de la regresión exponencial de la arginasa y de la regresión linealdel contenido de proteínas en embriones de Bufo arenarum . . . . . . . . . . S4

ll: Embriones de Bufo arenarum desarrollados en condiciones de diferenteosmolaridad: parámetros de la regresión lineal simple de la actividadespecífica de la arginasa respecto del tiempo post fecundación yestadístico del análisis de la covarianza para la comparaciónde pendientes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

12: Parámetros de la regresión lineal simple y estadístico F del ANOVAde la cantidad de proteínas vs. el tiempo post fecundación . . . . . . . . . . . 63

Bibliografia

13: Actividad de la arginasa hepática en larvas de Bufo arenamm (Estadio 29) . 64

14: Actividad de la uricasa hepática en larvas de estadío 29, juveniles de estadio35 y adultos de Bufo arenarum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

15: Actividad de la uricasa hepática en larvas de Bufo arenarum de estadio 29mantenidas en soluciones de diferente osmolaridad

16: Actividad de la un'casa en hígado de adultos de Bigfoarenarum y Leptodactylusocellatus

17: Porcentaje de la cantidad total de urea formada a partir del ciclo de laurea y de la degradación de las purinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

18: Pesos corporales de Bufo arenamm inyectados con cadmio al inicio de laadaptación a las condiciones de temperatura, fotoperiodo e inyección (inicial)y en el momento de la toma de las muestras (final) . . . . . . . . . . . . . . . 74

19: Peso de los higados y porcentaje del peso del higado respecto delpeso corporal de Bufo arenarum adultos inyectados con cadmio 74

viii

HSDIQEDEEIGHRAS

N° y Título abreviado Página

l: Esquema de los caminos metabólicos que conducen a los principales productosde excreción nitrogenada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2: Ciclo de la urea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3: Cambios relativos en las actividades enzimáticas del ciclo de la urea hepático detres especies de anuros adultos aclimatados a altas salinidades . . . . . . . . . . 25

4: Diseño experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

5: Actividad especifica de la arginasa (nm urea.min". mg"lproteina) y cantidad deproteínas totales (mg/embrión) en embriones de quo arenamm . . . . . . . . . 53

6: Actividad específica media de la arginasa en embriones de Bufo arenarumdesarrollados en medios de diferente osmolaridad . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

7: Recta de regresión de la actividad especifica de la arginasa de embriones de Bufoarenarum desarrollados en solución de Holtfreter diluída respecto de las horaspost fecundación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

8: Recta de regresión de la actividad específica de la arginasa de embriones deBufo arenarum desarrollados en solución de Holtfreter concentrada . . . . . .

9: Recta de regresión de la actividad específica de la arginasa de embriones deBufo arenarum desarrollados en agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

10: Contenido de proteinas del homogenato de embriones de Bufo arenarumdesarrollados en medios de diferente osmolaridad . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

ll: Fotografía del hígado de Bufo arenamm inyectado con cadmio 75

INDICE ALFABETICO DE AUTORES CITADOS

Autor/es Página

Alcocer y col., 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23Aminlari y Vaseghi, 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64Aold y 001., 1988 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Balinsky, 1972 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18, 19Balinsky y Baldwin, 1961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Balinsky y 001., 1976 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18, 79Balinsky, 1970 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21, 23,50Balinsky, 1978 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64Balinsky, 1981 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24, 65Bentley, 1971 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41Boemke, 1973 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Bracken y Sharma, 1985 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Bretos y col, 1967 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22Brown, 1964 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Burggren y Just, 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25, 26, 7lByrne y White, 1975 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Campbell y col., 1987 . . . . . . . . .\ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l9, 49Campbell, 1991 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l7Carlisky, 1970 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42Carlisky y col., 1968 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20Castañé y col., 1987 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65Cohen, 1966 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

Degani y Nevo, 1986 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24Del Conte y Sirlin, 1951 . . . . . . . . . 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30, 31Demichelis, 1993 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Demichelis y 001., 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72Devillers y Exbrayat, 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27, 73Domm y Jansens, 1971 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65Draper y Smith, 1981 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35Duellman y Trueb, 1986; . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l7Echeverría y Fiorito de López, 1981 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30, 31Espina y col., 1980 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17, 41Fawcett y Scott, 1960 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33Ferrari y col., 1988 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Fujiwara, 1987 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Funkhouser y Goldstein, 1973 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Gosner, 1960 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

Grany y Piery, 1981 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

X

Bibliografia

Hansen, y col., 1989 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Hellstom Lindahl y Oskarsson, 1989 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Henry y col., 1957 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33Herkovits y 001., 1983 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SlHill y Wyse, 1989 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Hirsch Kolb y 001., 1971 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76Hochachka y Somero, 1984 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l7Hourdry, 1993 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23Jacobson y Turner, 1980 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Jones, 1982 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

Jungreis y Hooper, 1970 a y b . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44, 49Jungreis, 1976 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16, 44Kershaw y Klaassen, 1991 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72King y Goldstein, 1985 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17Knox y Greengard, 1964 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64Lehninger, 1981 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20Loveridge, 1970 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l7

Lowry y col., 1951 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34Maggini y col., 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77Martin y col., 1985 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Mayer y col., 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23McNabb y McNabb, 1980 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17Merkle y Hanke, 1988 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49Merkle, 1990 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48, 49

Minotti y 001., 1983 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26, 65Mora y col, 1965 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Morris y col., 1987 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48Muiño y col., 1990 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Müller y Ohnesorge, 1984 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Müller, 1986 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

Nener, 1988 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

Noguchi, 1969 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

Nomiyama, 1986 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Nn’agu y Sprague, 1987 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Padhye y Ghate, 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Page y col.,1986 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Peiser y Balinsky, 1982 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Perez Coll y col., 1985 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Salibián y Fichera, 1984 . . . . . . . . . . . . . . 17, 18, 22, 36, 39, 41, 43, 44, 49Schlaghecke y Blum, 1978 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49Schmid,l968 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Schmidt, 1968 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Schoffeniels, 1991 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Shoemaker y col., 1972 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l7Shoemaker y 001., 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25, 26Shoemaker y McClanahan, 1975 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17, 41

Bibliografia

Shoemaker y McClanahan, 1973 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Shoemaker y McClanahan, 1982 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21, 24, 34, 35, 50Shoemaker, 1987 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

Stegeman y col., 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72Sunaga y 001., 1991 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . 72Takiguchi y col., 1988 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64U.S.Health Human Service, 1993 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Venkatakrishnan y Reddy, 1983 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Wallace, 1991 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

WHO, 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27, 73

Withers y 001., 1982 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17, 41Withers, 1992 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Worthington Enzyme Manual, 1972 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35Zamorano y 001., 1988 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Zar, 1984 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .‘ 35

Ecofisiología de anuros: aspectos del catabolismo del nitrógeno … · Facultad de Ciencias...

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