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EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO Y LA ADICIÓN DE SALES

DE CALCIO Y/O MAGNESIO EN LA PRODUCCIÒN DE

NARINGINASA POR MEDIO DE Aspergillus niger RESUMEN El presente trabajo aporta información del efecto de la naringina, melaza o

ramnosa, como fuentes de carbono, y las sales de Ca2+ y/o Mg2+ en la producción

de naringinasa por medio de Aspegillus niger ATCC1015, el cual es un

microorganismo productor de ácido cítrico y no produce toxinas.

Primero se evaluó por cromatografía en capa fina la capacidad productora de

naringinasa por la cepa empleada, lo cual permitió conocer que el microorganismo

empleado tuviera presuntivamente la capacidad de producir naringinasa. Para

conocer el efecto de las diferentes fuentes de carbono de interés, se empleó un

caldo nutritivo base, adicionado con naringina, ramnosa o melaza, y/o sales de

calcio y magnesio. Las fermentaciones se llevaron a cabo bajo las mismas

condiciones de temperatura y agitación. Cada 24 horas durante los siete días de la

fermentación se cuantificó el peso del micelio, la producción de proteína y la

actividad enzimática de la naringinasa producida, además se determinó mediante

diferentes modelos gráficos las contantes de Vmáx y Km para la naringinasa que

mostró mayor actividad enzimática. Las constates de Vmáx y Km de la naringinasa

obtenida fueron comparadas contra las de la naringinasa comercial de Penicillium

decumbens, la cual también se determinó en este trabajo. A partir de las

investigaciones realizadas en la presente investigación se encontró que la melaza

y la adición de carbonato de calcio favorecieron significativamente el crecimiento

del microorganismo, pero no la producción de proteína y la actividad enzimática.

También se encontró que para favorecer la producción proteica se debe emplear

como fuente de carbono a la naringina y se debe adicionar la mezcla de las sales

de calcio y magnesio. Por otra parte, la fuente de carbono que permitió obtener

una mayor actividad enzimática fue la ramnosa sin adición de sales. Finalmente,

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se encontró que la naringinasa producida bajo las condiciones de este trabajo

presenta la misma actividad específica que la naringinasa comercial, lo cual la

convierte en una enzima que puede competir con la enzima que se encuentra en

el mercado.

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INTRODUCCIÓN

La implementación de enzimas, con aplicación en la industria de los alimentos, ha

aumentado en años recientes. Un ejemplo de esto son las glucanasas, utilizadas

en la panificación, la extracción y clarificación de jugos (Villena y Gutiérrez, 2003)

o las enzimas quimosina y pepsina, que forman el cuajo para la fabricación de

quesos, solo por mencionar algunas (Montes y Magaña, 2002; Manzanares y col,

1997).

La aplicación de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas de

índole económica o tecnológica. La gran especificidad de acción que tienen las

enzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Además, las

enzimas pueden inactivarse fácilmente cuando se considere que ya han realizado

su misión, quedando entonces asimiladas el resto de las proteínas presentes en el

alimento (Montes y Magaña, 2002).

La naringinasa es una enzima que está siendo utilizada en la industria de los

alimentos con una aplicación importante en el proceso de desamargor en los jugos

de uva y otras frutas cítricas. La naringinasa es un complejo enzimático que

presenta actividad α-L-ramnosidasa (EC.3.2.1.40) y β-D- glucosidasa

(EC.3.2.1.21) capaz de hidrolizar a la naringina, el cual es el mayor y principal

componente del amargor en jugos de uva y varias frutas cítricas (Thomas y col,

1958; Griffith, 1969; Dunlap y col, 1962; Ono y col, 1978). La naringina es

abundante en frutas inmaduras y su concentración decrece en frutas maduras. Su

presencia ha sido la mayor limitación en la aceptación comercial de los jugos de

frutas. La hidrólisis de la naringina produce naringenina la cual es insípida, lo cual

ayuda a la mejor aceptación de los jugos por la disminución de su amargor (Yusof

y col, 1990).

La información sobre la α-L-ramnosidasa de la naringinasa es limitada y su

producción ha sido asociada con plantas (Hall, 1938; Thomas y col, 1958, Ting,

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1958; Kaji y Ichimi, 1973), gastrópodos marinos (Kurosawa y col, 1973), y

microorganismos (Manzanares y col, 199, Young y col, 1989; Shanmugam y

Yadav, 1995). Por razones de viabilidad, solo los procesos basados en

naringinasas microbianas son viables (Munish y Uttam, 2000). Tal es el caso de

Aspergillus niger quien es considerado como el mejor productor de naringinasa

extracelular (Kishi, 1955) y Aspergillus terreus quien es bien conocido como un

hongo productor eficiente de enzimas extracelulares de interés para la industria de

alimentos (Gallego y col, 1996).

Existe poca información disponible en cuanto a la producción de la naringinasa y

mucha información está guardada como secreto industrial o está patentada (Ito y

Takiguchi, 1970; Fukumoto y Okada, 1973; Wulbrandt y col, 1995). Algunos

reportes científicos ofrecen una información muy ambigua acerca de las

condiciones de producción de la naringinasa. Se ha reportado que la producción

de naringinasa mediante hongos filamentosos esta favorecida por los iones

metálicos como Ca2+ y Mg2+. Sin embargo, se ha encontrado que dichos iones no

son indispensables (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001). También se ha

reportado que la enzima es reprimida por la presencia de glucosa (Bram y

Salomons, 1965) lactato, citrato, sacarosa, fructosa y almidón (Munish y Uttam,

2000). Por otra parte se ha encontrado que la producción de la enzima disminuye

abajo de pH 4 y es estimulada en presencia de los sustratos naringina, ramnosa,

melaza (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001) y licor de maíz (Munish y Uttam,

2000).

La naringinasa de origen microbiano que existen actualmente en el mercado

presenta una eficacia muy deficiente de la hidrólisis de la naringina, por lo que es

necesario llevar a cabo estudios para conocer las condiciones de producción y

encontrar una enzima naringinasa que presente una mejor capacidad de hidrólisis.

Por ello en este estudio se utilizarán diferentes fuentes de carbono y iones

metálicos para conocer su efecto en la producción de la enzima naringinasa y en

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su capacidad de hidrólisis. Asimismo, se llevará a cabo una comparación de la

actividad de la naringinasa producida por Aspergillus niger (ATCC 1015), la cual

es una cepa principalmente productora de ácido cítrico, y la naringinasa comercial

pura (producida por Penicillum decumbens) para conocer si la enzima producida

por A. niger presenta mayor capacidad de hidrólisis que la enzima comercial.

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MATERIALES Y MÉTODOS En el siguiente diagrama de flujo (Fig. 1) se observa de manera detallada el

desarrollo experimental que se llevó a cabo.

Figura 1. Diagrama de proceso para la producción de naringinasa, proteína y

determinación de la actividad enzimática de naringinasa producida por A. niger

ATCC1015 utilizando diferentes fuentes de carbono.

Preparación del inóculo

Fermentación Crecimiento del microorganismo en diferentes sustratos

Ramnosa Naringina Melaza

Identificación de la enzima

Proteína

Método Bradford Determinación de la

Vmáx, Km

Prueba preliminar de la capacidad productora de naringinasa por la cepa

CaCO3 y/o MgCO3

Actividad

enzimática

Aspergillus niger ATCC 1015

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Materias primas.

1. Naringinasa de Penicillium decumbens (Sigma)

2. Naringina (Sigma)

3. Ramnosa (BDDIFCO)

4. Melaza (Ingenio San Miguelito, Córdoba, Ver.)

5. Glucosa (Sigma)

6. Medio de cultivo Agar Saboraud (BDDIFCO)

7. Extracto de malta (BDDIFCO)

• Microorganismo

Aspergillus niger ATCC 1015 obtenido de Colección Nacional de Cepas

Microbianas y Cultivos Celulares del Centro de Investigación y de Estudios

Avanzados (CINVESTAV) y mantenidas a 5ºC en agar papa dextrosa. Este

microorganismo esta reportado como productor de ácido cítrico y antígenos

(CDBB: 177).

Material de laboratorio y reactivos. Ácido ortofosfórico (Baker), acido 3,5-dns (Baker), agujas de jeringa (plastipack),

agua destilada-desionizada, agar maltosa de sabouraud (BDDIFCO), albúmina

sérica bobina (bsa), azul de comassie-g (Baker), cajas petri, cloroformo.

Equipo. Balanza analítica (Ohaus, Explorer® Po), baño metabólico (Shaker, G25), baño

maría (BM), centrifuga ALC4239R, espectrofotómetro visible-UV (Termo

Spectronic, Genesys 20), fotocolorímetro (Klett- Summerson), horno (American),

autoclave, parrilla de calentamiento (Termolyne, HP-A1915B), vortex (Daigger,

Vortex Genie 2).

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Métodos. Evaluación preliminar de la capacidad productora de naringinasa de la cepa

Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina.

Para conocer si la cepa empleada tenía la capacidad de producir naringinasa, se

utilizaron muestras de jugo de dos lotes de naranjas verdes, un lote sin inocular y

otro inoculado por picadura con Aspergillus niger ATCC 1015, con la finalidad de

evaluar la presencia de naringina en el jugo y la hidrolisis de esta por medio de la

enzima producida por el microorganismo inoculado.

Las muestras de jugo de cada lote fueron tomadas cada 24h y en el caso del lote

de naranjas inoculadas las muestras fueron tomadas del punto de inoculación

debido a que el microorganismo no alcanza a colonizar toda la naranja en 24h. El

lote sin inocular sirvió como control para determinar que, la hidrólisis de la

naringina no fuera efecto de la maduración de la naranja.

Para dar seguimiento a la presencia o ausencia de naringina se utilizó la técnica

de cromatografía en capa fina, para lo cual se cortaron placas cromatográficas de

5 x 2 cm de largo y ancho respectivamente, a las que, se les aplicó una gota de la

muestra problema (naringina pura o jugo de naranja) a una distancia de 0.5 cm del

inicio de la placa cromatográfica (punto de aplicación). Cada placa cromatográfica

con la muestra previamente aplicada, se introdujo en una cámara de vidrio que

contenía 2 mL de disolvente aproximadamente. La muestra aplicada en la placa

ascendió por capilaridad utilizando diferentes disolventes.

Después de que la muestra ascendió por capilaridad y el disolvente recorrió una

distancia de hasta 0.5 cm antes del final de la placa cromatográfica, se sacó la

placa de la cámara de vidrio y se dejó evaporar al ambiente el disolvente que ésta

había absorbido.

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Para observar la distancia recorrida por las muestras a lo largo de la placa, se

utilizó una lámpara de luz ultravioleta de longitud corta (253 nm) y una de longitud

larga (350 nm), las manchas observadas fueron marcadas con lápiz.

Posteriormente se le aplicó con ayuda de un algodón y unas pinzas sulfato sérico

amoniacal que sirvió como revelador cuando se sometió la placa con el sulfato

sérico amoniacal a calentamiento mediante de una parrilla por 1 min

aproximadamente. El experimento se realizó por triplicado.

Determinación del mejor disolvente que permite la ascendencia por capilaridad de

la naringina pura y la naringina presente en el jugo de naranja en cromatografía en

capa fina.

En primer lugar se empleó una muestra de naringina pura (N) que se empleó

como patrón de comparación en una concentración de 50 mg/1000ml, para poder

hacer los experimentos que permitieran conocer si la cepa empleada tenía

capacidad de producir naringinasa. Por ello se evaluaron las mezclas de

disolventes presentes el Cuadro 1.

La elección del disolvente que permitió la mejor elución de la naringina en

cromatografía en capa fina se realizó en base a los Rf (factor de elución de un

compuesto en una placa cromatográfica) calculados para cada placa

cromatográfica, es decir para cada muestra de naringina eluída utilizando

diferentes disolventes.

El Rf expresa la posición de un compuesto sobre la placa cromatográfica como

una fracción decimal; el máximo Rf es 1 y a mayor Rf mejor factor de elución. El Rf

fue calculado dividiendo la distancia que recorrió la muestra en la placa

cromatográfica entre la distancia que recorrió el disolvente.

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Cuadro 1. Disolventes utilizados para determinar el factor de elución de una

muestra de naringina pura en cromatografía en capa fina.

Disolvente / Concentración %

hexano / 100

acetato / 100

hexano: acetato de etilo / 80:20

acetato de etilo: hexano / 80:20

metanol: acetato de etilo / 80:20

metanol / 100.

acetona / 100

metanol: acetona / 95:5

metanol: acetona / 90:10

metanol: acetona / 80:20

Además se utilizaron diferentes disolvente o mezcla de disolventes para conocer

la elución de la naringina presente en el jugo de naranja (n) en una placa

cromatográfica las cuales se muestran en el Cuadro 2.

Cuadro 2. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor de elución

de la naringina presente en el jugo de naranja.

Disolvente / Concentración %

metanol / 100

acetona / 100

metanol: acetona / 95:5

metanol: acetona / 90:10

metanol: acetona / 80:20

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Se buscó el mejor sistema de elución tanto para la naringina pura (N) como para la

naringina presente en el jugo de naranja (n). Para ello se evaluaron las mezclas de

disolventes presentes en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor de elución

de la naringina pura y de la naringina presente en el jugo de naranja en una misma

placa cromatográfica.

Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado.

La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del Cinvestav) se

adquirió en tubos de ensaye en agar papa dextrosa, por lo que fue resembrada

para obtener una cantidad suficiente para que pudiera emplearse en las

fermentaciones a realizar (Díaz y col, 1998).

Preparación del inóculo de A. niger por medio de turbidimetria.

Para la obtención del inóculo a emplear en cada fermentación se preparó para

cada ensayo y en el momento del inicio de la fermentación una solución que

contenía 900 x 106 esporas/ mL por medio de turbidimetria utilizando una escala

de MacFarland previamente preparada como se muestra en el Cuadro 4 (Díaz y

col, 1998).

Disolvente / Concentración %

metanol / 100

metanol: acetona / 80:20

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Cuadro 4. Escala Macfarland empleada para calcular el inoculo empleado en cada

fermentación.

El renglón sombreado indica la cantidad de inóculo empleado.

Fermentaciones para la producción de naringinasa por medio de A. niger

utilizando como base un caldo nutritivo.

Se utilizó Aspergillus niger ATCC 1015 en una concentración 900 x 106

esporas/mL. Se preparó un caldo nutritivo con la composición que se observa en

el Cuadro 5 (Munish y col, 2005; Bram y Solomons, 1965).

Cuadro 5. Composición del caldo nutritivo empleado en cada fermentación y al

cual se le adicionó la fuente de carbono y/o las sales de calcio y magnesio.

Clave del tubo BaCl 1% mL

H2SO4 1% mL

No. aproximado de microorganismos x

106/mL

1 0.1 9.9 300

2 0.2 9.8 600

3 0.3 9.7 900

4 0.4 9.6 1200

5 0.5 9.5 1500

6 0.6 9.4 1800

7 0.7 9.3 2100

8 0.8 9.2 2400

9 0.9 9.1 2700

10 1.0 9.0 3000

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Las muestras que se prepararon con caldo nutritivo para conocer el efecto de la

fuente de carbono y de las sales CaCO3 y MgCO3 se muestran en el Cuadro 6.

Cada fermentación se realizó por duplicado en matraces de 1L los cuales fueron

incubados por un periodo de 8 días a 30°C, con agitación de 54 ciclos por min.

Cuadro 6. Caldos nutritivos evaluados en el crecimiento del microorganismo y

producción de naringinasa por A. niger.

Caldo nutritivo

sustancia proporción

NaNO3 2.0 g/l

KH2PO4 1.0 g/l

KCl 0.5 g/l

MgSO4·7H2O 0.5 g/l

FeCl3 0.1 g/l

Extracto de malta 1% p/v

Fuente de carbono

Proporción fuente de

carbono %

CaCO3 proporción

0.01 mM

MgCO3 proporción

0.01mM naringina 0.5 --- --- naringina 0.5 0.01 --- naringina 0.5 --- 0.01 naringina 0.5 0.01 0.01 melaza 0.5 --- --- melaza 0.5 0.01 --- melaza 0.5 --- 0.01 melaza 0.5 0.01 0.01

ramnosa 0.5 --- --- ramnosa 0.5 0.01 --- ramnosa 0.5 --- 0.01 ramnosa 0.5 0.01 0.01

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Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono.

Se tomó una alícuota de 20 mL cada día que duró la fermentación, esta fue filtrada

en papel filtro de poro de 1mm y se secó a 80ºC por 10 min aproximadamente, así

se cuantificó el peso del micelio por diferencia (Bucio Villalobos y col, 2007).

MÉTODOS ANALÍTICOS. Determinación de proteína en el medio de cultivo.

Para la determinación de la proteína en el medio de cultivo se utilizó el método de

Bradford, el cual es un método rápido y sensible para la cuantificación de micro

cantidades de proteína utilizando el principio de formación de color por unión a la

proteína (Bradford, 1976; Kirk y col, 2004).

El método de Bradford involucra la unión no covalente de la proteína al reactivo

Azul brillante de Coomasie G-250 ya que este interacciona con los grupos básicos

y aromáticos de las proteínas. Este colorante absorbe a una longitud de onda de

365 sin embargo la unión de la proteína al colorante causa un cambio en el

máximo de absorción del colorante de 365 a 595nm absorbancia a la que se

realiza la determinación (Bradford, 1976).

- Preparación del reactivo de Bradford.

Se disuelven 100 mg de azul de Comassie en 50 mL de etanol al 96 %, después

se añaden 100 mL de ácido fosfórico 85 %.Se diluye con 1000 mL de H2O

destilada y se deja reposar 24 h en oscuridad, se filtra dos veces con papel filtro y

se conserva en una botella oscura.

-Patrón de albúmina sérica bobina (ASB).

Se realiza una curva de ASB de acuerdo con el Cuadro 7. Agitando

perfectamente y después de incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.

Cada ensayo se lee a 595 nm usando como blanco el tubo 6 de la serie y se

determinan por triplicado. Esta curva solo es estable por 30 min y se deberá agitar

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perfectamente antes de leer. Para determinar el contenido de la proteína en

cuestión se realiza el mismo procedimiento sustituyendo la ASB por la proteína

problema e interpolando los resultados obtenidos para la proteína problema en la

curva estándar. Durante la determinación se desarrolla una coloración azulada

que se incrementa conforme se incrementa la concentración de proteínas.

Cuadro 7. Curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación de

proteína en el medio de cultivo por el método de Bradford.

Tubo Solución Proteína (ASB, 250 μg/mL)

Agua destilada (mL)

Reactivo de Bradford (mL)

1 0.1 2.9 3 2 0.2 2.8 3 3 0.3 2.7 3 4 0.4 2.6 3 5 0.5 2.5 3 6 0.0 3 3

La curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación de proteína en el

medio de cultivo por el método de Bradford.se reporta en el Anexo número 1 del

presente trabajo y presentó una ecuación de la recta de Y=5.78x + 0.1408;

R2=0.9579.

Determinación de la actividad enzimática de la naringinasa comercial de

Penicillium decumbens.

Para llevar a cabo la determinación de la naringinasa producida por el

microorganismo empleado fue importante conocer el comportamiento de esta in

vitro por tanto se realizaron las siguientes determinaciones utilizando naringinasa

de Penicillium decumbens (Sigma).

Estudio del efecto de la concentración de naringinasa de Penicillium decumbens

en la hidrólisis de naringina.

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Se preparó una solución de naringina 0.005 mM en regulador de citratos 0.05 M

pH 4.5 de la cual siempre se adicionó 1.9 mL a cada tubo de ensayo, además de

diferentes soluciones de naringinasa de concentración final de 10, 30, 50, 75, 100,

125 y 150 μg/mL; las cuales fueron elaboradas a partir de una solución

concentrada de 1500 μg/ mL, siendo siempre la alícuota que se adicionó al

sustrato de 0.1 mL. Así el volumen total de cada tubo de ensayo fue de 2 mL.

Cada ensayo se incubo durante 15 minutos, tiempo en el cual se llevaría a cabo la

hidrólisis de naringina por la naringinasa y se obtendría glucosa como producto

final y esta es directamente proporcional a la cantidad de naringenina producida

por dicha hidrólisis. Terminado el tiempo de reacción, la reacción se detiene con la

adición de 4 mL de DNS y se calienta durante 5 minutos a ebullición para revelar

cada tubo, los cuales una vez fríos fueron leídos a 540nm con filtro verde. (Ting,

1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los

resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2 apartado 2a.1 del presente

trabajo.

Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina por la

naringinasa de Penicillium decumbens.

Del estudio anterior se seleccionó una concentración de naringinasa a la cual se

observara claramente la hidrólisis de la naringina la cual fue 50 μg/ mL, dicha

concentración se mantuvo constante durante todo el experimento donde se

evaluaron diferentes tiempos de hidrolisis los cuales fueron 5,10, 20, 30, 40, 50, 60

minutos adicionando a cada tubo de ensayo 1.9 mL de naringina 0.005M y 0.1 mL

de naringinasa. Terminado el tiempo de reacción, la reacción se detuvo con la

adición de 4 mL de DNS y se calentó durante 5 minutos para revelar cada tubo,

los cuales una vez fríos fueron leídos en el fotocolorímetro con filtro verde. (Ting,

1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los

resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2, apartado 2a.2 del presente

trabajo.

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-Curva tipo de naringina.

Para el montaje de la curva tipo de naringina una vez conocidos tanto la

concentración de naringinasa a emplear (50 μg/ mL) y el tiempo de hidrólisis más

adecuado para observar tal efecto (10 min), se preparó una solución de

naringinasa en concentración de 50 μg/ mL en regulador de citratos 0.005 mM pH

4.5 de la cual se adición 0.5mL, la concentración de naringina empleada fue de

0.005M y se emplearon los siguientes volúmenes: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1,

1.2, 1.4, 1.6 y 1.8 mL para alcanzar un volumen final de cada ensayo de 2.5 mL. El

tiempo de incubación fue de 10 minutos, posteriormente la reacción fue detenida

agregando 4 mL de DNS y los tubos fueron puestos a ebullición durante 5

minutos, una vez fríos se llevo a cabo la lectura a 450nm con filtro verde. (Ting,

1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los

resultados de este estudio se reporta en el Anexo 3, Figura 4A del presente

trabajo.

-Determinación de las constantes de Vmáx y Km para la naringinasa de

P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk,

Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson.

Con base en base los resultados obtenidos de la curva de naringinasa y haciendo

una curva patrón de glucosa se calcularon las concentraciones reales en μg/ ml

que representa cada volumen empleado en la curva tipo de naringina 0.005M.

Dichos resultados fueron empleados para trazar las curvas de Michaelis- Mentes

(Anexo 5, Figura 6A), Lineweaber-Burk (Anexo 5, Figura 7A), Eadie-Hofsteen

(Anexo 5, Figura 8A) y Agustinson (Anexo 5, Figura 9A), y se determino la Vmáx y

Km para cada uno, a demás se determinaron dichas constantes por el método

estadístico de Wilkinson (1960). La Vmáx esta expresada en U/mg proteína donde

una U = cantidad de enzima para liberar 1μmol de glucosa/ min.

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Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por A. niger en

muestras de la fermentación de cada formulación.

Para llevar a cabo la determinación de la actividad enzimática de la naringinasa

producida por el microorganismo empleado. Se tomó 0.5 mL de cada muestra de

la fermentación de cada formulación, se le adicionó 1.5 mL de una solución de

naringina (Sigma) 5.26 mM en regulador de citratos 0.05M pH 6, como sustrato, y

se incubó a 35°C por 24 h, la reacción fue detenida adicionando 4 mL de ácido

3,5-dinitrosalicilico y con ebullición en baño María durante 5 minutos,

posteriormente se leyó a 450 nm en un fotocolorímetro con filtro verde. Todos los

ensayos se realizaron por triplicado. Como blanco se utilizó 1.5 mL de una

solución de naringina 5.26mM. Para el tratamiento de los resultados se utilizó una

curva tipo de glucosa con una ecuación de la curva de Y=0.6456x -2.2889;

R2=0.987, reportada en el Anexo 4, Figura 5A del presente trabajo.

Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por A. niger del

caldo nutritivo que presentó mayor actividad enzimática en el estudio anterior.

A partir de los resultados obtenidos en el estudio anterior se seleccionó el caldo

nutritivo seleccionado que presentó mayor actividad enzimática.

El caldo nutritivo elegido, fue tratado para concentrar la proteína y separarla del

medio de cultivo por lo que se le adicionó 65 g de sulfato de amonio por cada 100

mL de medio de cultivo para precipitar la proteína en baño de hielo logrando una

saturación de 99% de acuerdo con Dawson (1968). La solución fue centrifugada a

17100 rpm (107442.46875277 radianes /min) 4°C por 30 min; el pellet fue re-

suspendido en 15 mL de regulador de citratos 0.05M pH 6 y se le determinó el

contenido proteico por medio del método de Bradford.

Para la determinación de la actividad enzimática del concentrado proteico obtenido

se emplearon 1.5 mL de una solución de naringina de diferente molaridad (0.02,

0.008, 0.00526, 0.0026, 0.0013, 0.001, 0.0006 M) en regulador de citratos 0.05 M

pH 6 a la que se le adicionaron 0.5 mL del concentrado proteico y se incubaron a

19

35°C por 24 h en baño María, una vez transcurrido el tiempo de incubación la

reacción fue detenida adicionando 4 mL de ácido 3,5-dinitrosalicilico y con

ebullición en baño María durante 5 minutos, posteriormente la lectura se realizó en

un fotocolorímetro con filtro verde. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Para el tratamiento de los resultados se utilizó una curva tipo de glucosa con una

ecuación de la curva de Y=0.6456x -2.2889; R2=0.987, reportada en el Anexo 4,

Figura 5A del presente trabajo. Los resultados obtenidos permitieron calcular los

gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaer-Burk, Eadie-Hoffsten y Agustinson. A

demás se determinó la Vmáx y Km para cada uno. El valor de Vmáx y Km para

Wilkinson se calculó de acuerdo al modelo estadístico de Wilkinson (1960).

Análisis estadístico

Los resultados de peso del micelio, proteína y actividad enzimática fueron

analizados estadísticamente por medio del programa MINITAB13, a través de un

análisis de varianza (ANOVA) con un p ≤ 0.05 utilizando un diseño factorial

general completo de 3x4x5 (fuente de carbono, sales y días) con tres repeticiones.

20

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Evaluación de la capacidad productora de naringinasa de la cepa Aspergillus niger

ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina.

Se encontró que la naringina pura (N) y la naringina presente en la naranja (n),

ascendieron por capilaridad en metanol 100% alcanzando un Rf= 0.86, pero su

ascendencia por capilaridad mejoró con metanol: acetona en 80:20 presentando

un Rf= 1 el cual fue calculado con respecto a la muestra de referencia lo que nos

sugiere que el mejor sistema para permitir la ascendencia por capilaridad en

cromatografía en capa fina de las muestras de naringina pura y naringina de la

naranja es el de metanol: acetona en 80:20. Por tanto para la siguiente etapa

experimental se trabajo con este sistema de disolventes.

Evaluación de la degradación de la naringina por la naringinasa producida por

Aspergillus niger ATCC 1015 una vez inoculado en naranjas.

Pequeñas muestras de jugo de las naranjas utilizadas en el experimento (n) se

compararon en una placa cromatográfica contra una muestra de naringina pura

(N) tanto de las naranjas inoculadas por picadura con Aspergillus niger ATCC

1015 como las no inoculadas (controles). Después de revelar las placas se

confirmó la presencia de la naringina en el lote de naranjas sin inocular y de igual

manera se confirmo la presencia de la naringina en el lote de naranjas acabadas

de inocular.

A las 48 y 72 horas se observó la presencia de naringina en las naranjas no

inoculadas junto con la presencia de otros compuestos, lo que podría sugerir el

inicio de la degradación de la naringina presente en la naranja probablemente por

efecto de la maduración. A 120 hrs los controles mostraron la presencia de

naringina junto con la presencia de otros compuestos que solo absorven en

longitud de onda larga en el UV. En las muestras de las naranjas inyectadas con

21

el hongo no se observa la presencia de naringina probablemente debido a una

hidrólisis inducida por el microorganismo inoculado.

preparación del inóculo de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado.

La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del CINVESTAV; fue

resembrada en agar Sabouraud el cual fue preparado, esterilizado y vaciado

previamente en cajas petri, las cuales fueron resembradas por picadura. Dichas

cajas se mantuvieron a temperatura ambiente y cubiertas con papel aluminio por

una semana para obtener un óptimo crecimiento del microorganismo. El hongo

comenzó a crecer desde el primer día y alcanzo su óptimo a los 7 días de haberse

sembrado. Este procedimiento se realizó mensualmente a manera de conservar la

cepa. El caldo nutritivo, como fue descrito en materiales y métodos, fue adicionado

con diferentes fuentes de carbono (0.5% p/v) y con sales de calcio y magnesio al 1

M y 0.1mM. Sin embargo, en estas muestras no se observó el crecimiento del

hongo (peso del micelio).

Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono.

Se observó crecimiento del microorganismo cuando se empleó como fuente de

carbono naringina, ramnosa o melaza (0.5% p/v) en el caldo nutritivo. Cuando se

adición las sales de calcio y/o magnesio en concentración de 0.01mM se observó

crecimiento del microorganismo al contrario de cuando se utilizó una

concentración de 1 y 0.1mM. Por ello se empleó en todos los caldos nutritivos que

se trabajaron en este estudio una concentración de 0.01 mM para las sales.

Es importante resaltar que cuando no se adicionó sal alguna al medio de cultivo,

no se encontró diferencia significativa para las tres diferentes fuentes de carbono

empleadas. Lo cual concuerda con Bramn y Solomons (1965) que sugieren que no

es necesaria la adición de factores de crecimiento para Aspergillus niger NRRL

72-4 en la producción de naringinasa. Sin embargo, la presencia de CaCO3 y

MgCO3 individualmente favoreció significativamente (p≤0.05) el crecimiento de

22

A. niger solo cuando se utilizó melaza como fuente de carbono, siendo el máximo

de crecimiento 0.905 g/mL y 0.775 g/mL para CaCO3 y MgCO3 respectivamente

(Figura 2). Bramn y Solomons (1965) sugieren que el CaCO3 tiene un efecto

positivo en el crecimiento del hongo durante la producción de la naringinasa

debido a que cuando se realiza dicha producción en matraces agitados, y no en

fermentadores, en donde se pueden controlan todos los factores, se forma una

atmosfera limitada en oxigeno que afecta el crecimiento del hongo y esta limitación

puede modificarse a través de la adición de CaCO3. Esto podría aplicarse también

para el MgCO3, ya que lo que aporta el carbonato de calcio es oxigeno para

contrarrestar la deficiencia de este en el medio, sin embargo, para magnesio no

está comprobado. No obstante la adición de la mezcla de ambas sales no mostró

diferencia significativa para alguna fuente de carbono empleada.

23

Figura 2. Crecimiento del micelio de A. niger ATCC1015 en melaza con adición de

CacO3 (▲) y melaza con adición de MgCO3 (■).

Determinación de proteína en el medio de cultivo

La determinación de la proteína durante el crecimiento del microorganismo (no

toda la proteína producida es enzima naringinasa) se realizó por triplicado para

todas las muestras tomadas cada 24 horas durante el transcurso de la

fermentación y se utilizó como blanco la fuente de proteína inicial (1% p/v).

Para la producción de proteína se encontró que existe diferencia significativa

(p≤0.05) dependiendo de la fuente de carbono que se utilice, siendo la naringina la

fuente de carbono que favorece más la producción proteica, lo cual se observa en

la Figura 3, Curva A.

También se encontró diferencia significativa en la producción de proteína

dependiendo de la presencia o ausencia de sales de Ca2+ y/o Mg2+. En la Figura 3,

Curva B se observa que la adición de las sales favorece positivamente la

producción de proteína, teniendo un mayor efecto positivo el MgCO3 que el

CaCO3, sin embargo, se observa que el efecto positivo se incrementa cuando se

adiciona la mezcla de sales de Ca2+ y Mg2+ y cuando se utiliza naringina como

fuente de carbono (Figura 34, Curva A). Probablemente el efecto de la mezcla de

las sales es mayor porque al adicionarlas juntas suman su efecto actuando de

manera sinergica sobre la producción proteica.

24

Figura 3. Curvas de comportamiento de la proteína en relación a la fuente de

carbono (A) y sales de Ca2+ y/o Mg2+ (B), por Aspergillus niger ATCC1015.

Tiempo de la fermentación en días(C). N= naringina; R= ramnosa; M=melaza; 0=

sin sales; Ca= CaCO3; Mg=MgCO3; m= mezcla de sales. La línea punteada

representa la media de los datos.

25

Figura 4. Curvas de producción de proteína mostrando las relaciones: fuente de

carbono-sales (A) y fuente de carbono-días (B), para naringina, melaza y ramnosa

y (C) la relación sales-días para naringina. N= naringina; R= ramnosa; M=melaza;

0= sin sales; Ca= CaCO3; Mg= MgCO3; m= mezcla de sales.

Al analizar individualmente las diferentes formulaciones en función de la fuente de

carbono utilizada se encontró para el caso de naringina que existe diferencia

significativa (p≤0.05) en ausencia y presencia de las sales de Ca2+ y/o Mg2+.

Siendo el máximo de producción de proteína (Cuadro 9) para naringina sin adición

26

de sales de 6192 µg / mL; para naringina + Ca2+ de 11849 µg / mL; para naringina

+ Mg2+ de 15154 µg / mL y para naringina + Ca2+ y Mg2+ de 32553 µg / mL. A

partir de dichos máximos de producción de proteína se observa que la adición de

la mezcla de las sales incrementa significativamente la producción de proteína en

comparación cuando no se adicionan sales o cuando se adicionan Ca2+ o Mg2+

individualmente.

Cuadro 9.Máximos de producción de proteína en la producción de naringinasa por

medio de A. niger.

Sin embargo, no existe diferencia significativa en la producción de proteína al

adicionar Ca2+ y Mg2+ de manera independiente. Es posible que la adición de la

Ensayo

Producción de proteína (µg / mL)

naringina sin sales

naringina +Ca2+ y Mg2+

naringina + Ca2+

naringina + Mg2+

6192

32553

11849

15154

melaza sin sales

melaza +Ca2+ y Mg2+

melaza + Ca2+

melaza + Mg2+

2339

5033

4987

7368

ramnosa sin sales

ramnosa+Ca2+ y Mg2+

ramnosa + Ca2+

ramnosa + Mg2+

2006

3139

2845

19445

27

mezcla de las sales tenga un efecto sinergista positivo en la producción de

proteína cuando se utiliza naringina como fuente de carbono.

Cuando se utilizó melaza como fuente de carbono se encontró diferencia

significativa en la producción de proteína en ausencia y presencia de las sales de

Ca2+ y/o Mg2+. Siendo el máximo de producción de proteína (Cuadro 9) para

melaza sin adición de sales de 2339 µg /mL; para melaza + Ca2+ de 4987 µg / mL;

para melaza + Mg2+ de 7368 µg / mL y para melaza + Ca2+ y Mg2+ de 5033 µg /

mL. Es importante mencionar que, a pesar de que la producción de proteína al

adicionar Mg2+ al caldo nutritivo es mayor, esta no es significativamente diferente

en relación a la proteína producida cuando no se hizo adición de sales o cuando

se adicionó solo Ca2+, sin embargo, sí es significativamente mayor en relación a la

producida cuando se adicionó la mezcla de sales.

Finalmente cuando se utilizó ramnosa como fuente de carbono también se

encontró diferencia significativa en ausencia y presencia de las sales de Ca2+ y/o

Mg2+ en la producción de proteína (Cuadro 9). Siendo el máximo de producción de

proteína para ramnosa sin adición de sales de 2006 µg /mL; para ramnosa + Ca2+

de 3139 µg / mL; para ramnosa + Mg2+ de 2845 µg / mL y para ramnosa + Ca2+ y

Mg2+ de 19445 µg / mL. A partir de los máximos obtenidos se observa que la

adición de la mezcla de sales de Ca2+ y Mg2+ al caldo nutritivo permite una mayor

producción de proteína con respecto a cuando no se adicionaron dichas sales, es

decir, la adición de la mezcla de sales tiene un efecto positivo en la producción de

proteína. Por otra parte la adición de Ca2+ al caldo nutritivo favoreció de igual

manera la producción de proteína en relación a cuando no se adicionó, pero esta

producción no fue significativamente diferente a la obtenida cuando se adicionó

Mg2+ o cuando se adicionó la mezcla de Ca2+ y Mg2+. Cabe señalar que la adición

de Mg2+ no tuvo un efecto significativo en la producción de proteína en relación a

los otros caldos nutritivos.

Al hacer una comparación entre las tres fuentes de carbono (naringina, melaza y

ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontró que al no adicionar sales

28

existe diferencia significativa en la producción de proteína entre la proteína

(Cuadro 10) producida al adicionar naringina y al adicionar ramnosa (2006 µg/mL)

como fuente de carbono, siendo mayor la producción de proteína cuando se utiliza

naringina (6192 µg/mL), sin embargo, no existe diferencia significativa entre las

dos fuentes de carbono mencionadas anteriormente con respecto a melaza

cuando se utiliza como fuente de carbono.

Los caldos adicionados con Ca2+ que mostraron ser significativamente diferentes

en la producción de proteína, fueron en los que se utilizó naringina y melaza como

fuente de carbono (Cuadro 10), siendo mayor la producción de proteína para el

caso de naringina (11849 µg/mL) en relación con la melaza (4987 µg/mL). El caldo

nutritivo en el que se empleo ramnosa como fuente de carbono no mostró ser

significativamente diferente a los anteriormente mencionados.

Cuadro 10. Comparativo

de los máximos de

producción de proteína significativos (p≤0.05) en la producción de naringinasa

mediante diferentes fuentes de carbono por medio de A. niger.

Ensayo

Producción de proteína (µg / mL)

naringina sin sales ramnosa sin sales

6192 2006

naringina + Ca2+ melaza + Ca2+

11849 4987

naringina + Mg2+ ramnosa + Mg2+

15154 2845

naringina + Mg2+ melaza + Mg2+

15154 7368

naringina + Ca2+ y Mg2+ melaza + Ca2+ y Mg2+

32553 5033

naringina + Ca2+ y Mg2+ ramnosa + Ca2+ y Mg2+

32553 19445

29

En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg2+ se encontró diferencia

significativa en la producción de proteína (Cuadro 10), entre el que se utilizo como

fuente de carbono la naringina (15154 µg/mL) y en el que se utilizo ramnosa (2845

µg/mL), también se encontró diferencia significativa en la producción de proteína

entre naringina y melaza (7368 µg/mL). Sin embargo, la producción de proteína

entre melaza y ramnosa no fue significativamente diferente.

En el caso de los caldos adicionados con la mezcla de las sales de Ca2+ y Mg2+,

también se encontró diferencia significativa en la producción de proteína (Cuadro

10), entre naringina (32553 µg/mL) y melaza (5033 µg/mL) utilizada como fuente

de carbono, de igual manera entre naringina y ramnosa (19445 µg/mL).

Por otra parte el tiempo (días) mostró tener efecto en la producción de proteína

dependiendo de la fuente de carbono que se empleo, lo cual se observa en la

Figura 4B donde claramente se aprecia que los ensayos realizados con naringina

como fuente de carbono presentan mayor producción de proteína ya que a pesar

de que presenta variaciones a lo largo de la fermentación, siempre se mantiene

por arriba de la producción de proteína producida con melaza y con ramnosa. Por

otra parte la Figura 4C, muestra la producción de proteína a lo largo del tiempo de

fermentación utilizando naringina como fuente de carbono en relación a la

ausencia y/o presencia de las sales de Ca2+ y Mg2+ donde se observa que es con

la mezcla donde se ve favorecida significativamente la producción de proteína a

pesar de la variación de esta a lo largo de los días debido al metabolismo del

hongo.

Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa de A. niger en muestras de

cada fermentación.

La determinación de la actividad enzimática se realizó durante el crecimiento del

hongo en el caldo nutritivo en diferentes condiciones por triplicado a lo largo de 7

30

días de fermentación. Se utilizó como blanco una solución de naringina 5.26M pH

6 en buffer de citratos.

En la Figura 2A se observa el efecto de las tres diferentes fuentes de carbono en

la actividad enzimática. A través del análisis estadístico se encontró que existe

diferencia significativa entre ellas (p≤0.05) siendo la ramnosa la fuente de carbono

que favorece más la producción de naringinasa. Por otra parte en la figura 5B se

observa que la adición de sales no influye significativamente en la actividad

enzimática de esta enzima.

Figura 5. Curvas de Actividad enzimática expresada en microgramos de glucosa

producida después de 24hrs de hidrolisis, en relación a las diferentes fuentes de

carbono 0.5%, sales de Ca2+ y/o Mg2+ 0.01mM y días. La línea punteada

representa la media de los datos. N= naringina; R= ramnosa M=melaza; 0= sin

sales; m= mezcla de sales.

La producción enzimática obtenida en el presente trabajo puede explicarse a

través de la teoría económica de los microorganismos (Koch, 1985) que establece

31

que la producción de una enzima inducida, solo es favorecida cuando la

producción de esta permite al microorganismo obtener más nutrientes para su

crecimiento y multiplicación. Además este efecto puede incrementar si no existen

sustratos fácilmente asimilables, los microorganismos no regularan fuertemente la

producción enzimática de las enzimas constitutivas, o los costos enzimáticos son

suficientemente bajos para permitir una continua producción, y de acuerdo con

Stevens y col, (2005), las enzimas extracelulares como en este caso la

naringinasa son el principal medio por el cual los microorganismos degradan

compuestos orgánicos complejos en moléculas pequeñas que pueden ser

asimilables.

Por otra parte en la Figura 5C se observa que la producción de naringinasa varía

de acuerdo con el metabolismo del hongo durante los días que duró la

fermentación, siendo esta mayor el primer día después del inicio de la

fermentación y claramente se observa una disminución de esta los últimos días de

la fermentación, quizá debido a una represión por catabolito (glucosa) (Munish y

col 2005, Bram y Solomons, 1965).También el comportamiento ascendente y

descendente de la actividad enzimática a lo largo del tiempo de fermentación

puede explicarse a través de lo citado por Chróst (1991) que establece que una

vez que la concentración de productos incrementa lo suficiente, la síntesis

enzimática se ve reprimida y la producción regresa a un nivel basal.

Comparando la actividad enzimática que se observa a través de los días (Fig. 5C)

con la variación de la proteína presente en el medio de cultivo con respecto al

tiempo (Fig. 3C) se observa que la cantidad la actividad enzimática no es

proporcional a la producción de proteína ya que la actividad enzimática mayor se

observa en el primer día después del inicio de la fermentación (Figura 6B)

después de lo cual desciende y es hasta el sexto día cuando vuelve a subir pero

no alcanza el máximo alcanzado el primer día, lo que es contrario para la

producción de proteína donde se observa (Figura 3B) que esta aumenta y

disminuye repetitivamente, es decir no muestra la misma tendencia que en el caso

32

de la actividad enzimática . De acuerdo con Koch, 1985; Pelletier y Sygush, 1990;

Chróst, 1991; Sinsabaugh y Moorhead, 1994, debido a la producción de nitrógeno

y energía, los microorganismos solo deben producir enzimas a expensas del

crecimiento y metabolismo, es decir; cuando la disponibilidad de nutrientes es

escasa, la producción de enzimas aumenta, ya que de esta manera los

microorganismos pueden movilizar los nutrimentos de las fuentes complejas

(Harder y Dijkhuizen, 1983).

En este trabajo no se cuantificó la cantidad de enzima producida sino la actividad

enzimática de la enzima producida, en este sentido, la actividad enzimática de la

naringinasa producida no, fue proporcional a la producción de proteína.

Por otra parte también se encontró que las relaciones de Fuente de carbono-Sales

(Figura 6A), Fuente de Carbono- Días (Figura 39B), Sales-Días (Figura 6C), tienen

un efecto significativo en la actividad enzimática determinada.

33

Figura 6. Curvas de actividad enzimática mostrando las relaciones fuente de

carbono-sales, fuente de carbono-días y sales-días. N= naringina; R= ramnosa

M=melaza; 0= sin sales; m= mezcla de sales. La línea punteada representa la

media de los datos.

Al analizar los diferentes caldos nutritivos en los que se empleó naringina como

fuente de carbono se encontró que no existe diferencia significativa entre ellos en

cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin embargo, el máximo

de actividad enzimática encontrado para naringina sin sales fue de 2605 μg de

glucosa/mL; para naringina + Ca2+ fue de 5536 μg de glucosa / mL; para naringina

+ Mg2+ fue de 3122 μg de glucosa/mL y para naringina + Ca2+ y Mg2+ fue de 3122

34

μg de glucosa/mL. Las unidades de actividad enzimática son expresadas en este

trabajo en microgramos de glucosa debido a que a partir del método utilizado se

cuantifica la cantidad de glucosa producida por la hidrólisis de la naringinasa

presente en el medio de cultivo sobre una muestra de naringina pura de

concentración conocida.

Cuadro 11.Máximos encontrados de actividad enzimática en la producción de

naringinasa por medio de A. niger (No diferencia significativa).

En el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo melaza como

fuente de carbono se encontró que no existe diferencia significativa entre ellos en

cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin embargo, el máximo

de actividad enzimática encontrado para melaza sin sales fue de 2605 μg de

Ensayo

Actividad enzimática (U/µg)

Naringina sin sales

Naringina +Ca2+ y Mg2+

Naringina + Ca2+

Naringina + Mg2+

2605

3122

5536

3122

Melaza sin sales

Melaza +Ca2+ y Mg2+

Melaza + Ca2+

Melaza + Mg2+

2605

2432

2743

3225

Ramnosa sin sales

Ramnosa+Ca2+ y Mg2+

Ramnosa + Ca2+

Ramnosa + Mg2+

6139

4932

1638

2777

35

glucosa / mL; para melaza + Ca2+ fue de 2743 μg de glucosa / mL; para melaza +

Mg2+ fue de 3225 μg de glucosa / mL y para melaza + Ca2+ y Mg2+ fue de 2432 μg

de glucosa/mL.

Finalmente, para el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo

ramnosa como fuente de carbono tampoco se encontró diferencia significativa

entre ellos en cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin

embargo, el máximo de actividad enzimática encontrado para ramnosa sin sales

fue de 6139 μg de glucosa / mL; para ramnosa + Ca2+ fue de 1638 μg de glucosa /

mL; para ramnosa + Mg2+ fue de 2777 μg de glucosa / mL y para ramnosa + Ca2+

y Mg2+ fue de 4932 μg de glucosa / mL.

Por otra parte, al hacer una comparación entre las tres fuentes de carbono

(naringina, melaza y ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontró que al no

adicionar sales sí existe diferencia significativa entre en la actividad enzimática

determinada en el caldo nutritivo adicionado con naringina y el adicionado con

ramnosa, encontrándose un máximo de actividad enzimática para naringina de

2605 µg de glucosa /mL y de 6139 µg de glucosa /mL para ramnosa (Cuadro 12).

Cuadro 12. Comparativo de los máximos de actividad enzimática significativos

(p≤0.05) de la naringinasa producida utilizando diferentes fuentes de carbono por

medio de A. niger.

Ensayo

Actividad enzimática (U/µg)

Naringina sin sales

Ramnosa sin sales

2605

6139

Melaza sin sales

Ramnosa sin sales

2605

6139

Naringina + Ca2+

Melaza + Ca2+

5536

2743

36

También se encontró diferencia significativa entre la actividad enzimática

determinada en el caldo nutritivo adicionado con melaza y el adicionado con

ramnosa, encontrándose un máximo de actividad enzimática para melaza de 2605

µg de glucosa /mL, lo que claramente significa que el caldo de cultivo en el que se

emplea ramnosa como fuente de carbono permite obtener una mayor actividad

enzimática comparada con la de las otras dos fuentes de carbono (Cuadro 12).

Cabe señalar que no se encontró diferencia significativa entre la actividad

enzimática de la naringinasa determinada en el caldo nutritivo adicionado con

Naringina y el adicionado con melaza.

Los caldos adicionados con Ca2+ que mostraron ser significativamente diferentes

en la actividad enzimática fueron en los que se utilizó naringina y melaza como

fuente de carbono (Cuadro 12), siendo mayor la producción de proteína para el

caso de Naringina (5536 µg de glucosa /mL) en relación con la melaza para la que

se encontró una actividad enzimática de 2743 µg de glucosa /mL. El caldo de

nutritivo en el que se empleo Ramnosa como fuente de carbono no mostró ser

significativamente diferente a los anteriormente mencionados.

En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg2+ no se encontró diferencia

significativa en la actividad enzimática, entre el alguna de las fuentes de carbono

empleadas en este trabajo. En los caldos adicionados con la mezcla de las sales

de Ca2+ y Mg2+, tampoco se encontró diferencia significativa en la actividad

enzimática determinada entre los caldos de cultivo adicionados con las diferentes

fuentes de carbono.

De acuerdo a los resultados anteriores se seleccionó el caldo nutritivo que

presentó mayor actividad enzimática. De tal manera que la elección se realizó ente

la actividad enzimática para los caldos nutritivos en los que no se adicionó sales y

cuando se adicionó Ca2+, para las fermentaciones llevadas a cabo sin adición de

sales, el caldo nutritivo adicionado con ramnosa fue quién mostro mayor actividad

enzimática (6139 µg de glucosa /mL) y para las llevadas a cabo con adición de

37

Ca2+ la actividad enzimática mayor encontrada fue cuando se utilizó Naringina

(5536 µg de glucosa /mL) como fuente de carbono. Por lo que la fracción de

ramnosa sin sales fue la elegida para realizar la siguiente parte del experimento.

Estudio de la actividad enzimática del caldo nutritivo seleccionado.

La fracción seleccionada para la concentración de la proteína y la determinación

de las constantes fue la de la ramnosa sin adición de sales del primer día después

del inicio de la fermentación. El uso de la ramnosa como fuente de carbono

permite obtener una naringinasa con mayor actividad comparada con la producida

utilizando como fuente de carbono naringina o melaza. Quizá este

comportamiento pude explicarse por lo sugerido por Munish y colaboradores en el

2005, quienes señalan que los medios utilizados para producir naringinasa por A.

niger, adicionados con ramnosa, producen elevadas cantidades de enzima quizá

ya que estos medios tienen un bajo contenido de carbohidratos. Sin embargo,

Elinbaum y col. 2002 sugieren que en el caso de una fermentación sólida la

naringina es mejor inductor que la ramnosa para la producción de la naringinasa

utilizando A. terreus, además también sugieren que una fermentación solida

provee mejores resultados para la producción de naringinasa que una

fermentación liquida.

Haciendo una comparación de la producción proteica a lo largo del tiempo de

fermentación en relación a la actividad enzimática se observa que no son

proporcionales y por tanto una mayor producción proteica no conlleva a una mayor

actividad enzimática aunque la naturaleza de la enzima sea proteica, ya que una

actividad enzimática elevada puede estar dada tanto por haber alto contenido de

proteína en el medio de cultivo o por que la enzima es altamente activa. También

es importante resaltar que la actividad enzimática puede ser reprimida debido a

una inhibición por glucosa (producto de la hidrólisis de la naringina por la

naringinasa) ya que de acuerdo con lo reportado por Munish y colaboradores en el

38

2005; Gallego y col en el 2001; Bram y Solomons en 1965 y Clarke y Brammer en

1964, la glucosa reprime la producción de naringinasa.

Como se mencionó con anterioridad, el caldo nutritivo donde se encontró mayor

actividad enzimática fue el adicionado con ramnosa como fuentes de carbono y sin

adición de sales durante las primeras 24 horas de la fermentación. Sin embargo,

debido a que se contaba con una pequeña cantidad de muestra se decidió juntar

todas las muestras tomadas cada día durante el periodo de la fermentación y se

procedió a una concentración de proteína. El contenido de proteína determinado

después del proceso de concentración al que se sometió la muestra fue de 66851

μg/mL de proteína.

La determinación de la actividad enzimática de las fracciones de ramnosa (del

conjunto de muestras obtenidas cada día) sin adición de sales se probó sobre la

hidrólisis de naringina y se obtuvo una actividad enzimática de 0.010U/mg

(U=1µmol de glucosa liberada / min) la cual se reporta en el Cuadro 13. Tal vez

este valor tan pequeño encontrado se debe a que al juntar todas las fracciones

disminuyó la actividad enzimática inicial la cual fue de 0.947 U / min.

La actividad encontrada para la naringinasa presente en el concentrado de

proteína es mayor comparada con la informada por Bram y Solomons 1965 para la

naringinasa de A. niger NRRL 72-4 (Cuadro 13, No 5) y es menor comparada con

la informada por diferentes autores, los valores se presentes en el Cuadro 13, sin

embargo, es importante resaltar que la mayoría de ellos determinaron la actividad

enzimática utilizando sustratos inespecíficos como el p-nitrofenol o el dietilen glicol

alcalino, que esta actividad fue determinada utilizando diferentes condicione, y que

la producción de la enzima se realizó utilizando diferentes condiciones de

fermentación como en el caso de Gülten y col, 2006 (Cuadro13, No 2).

Por otra parte tal vez la producción de naringinasa por el hongo en estudio podría

mejorarse si se hace una adición de la fuente de carbono en diferentes etapas de

39

la fermentación de acuerdo con lo que sugiere Bram y Solomons (1965), sin

embargo, como ellos mismos establecen la adición continua de la fuente de

carbono a lo largo de la fermentación es un método más difícil y que requiere de

mayor control y de un fermentador.

Cuadro 13. Actividad enzimática de la naringinasa producida por diferentes

microorganismos y determinada mediantes diferentes sustratos.

Sustrato Actividad

narignina (1) 0.010 U/mg

naringina (2) 469 U/mg

p-nitrofenol (3) 91 U/mg

p-nitrofenol (4) 1.7 U/mL

dietilen glicol alcalino (5) 90-94 U/mL

dietilen glicol alcalino (6) 3.99x 10-4 IU/mL

p-nitrofenol (7) 0.059 U

(1) Naringinasa de A. niger ATCC1015 producida en el presente trabajo. Medio de

cultivo adicionado con ramnosa como fuente de carbono. Regulador de citratos

0.05M, pH=6, 35°C, [naringina]=0.00526mM. U=1µmol de glucosa liberada / min.

(2) Naringinasa de P. decumbens, Gülten y col, 2006. Fermentación solida.

Regulador de acetato de amonio 0.1M, pH= 4, 40°C, U= 1 µmol de glucosa

liberado/ min.

(3) α-L-ramnosidasa de A. terreus, Gallego y col, 2001. Medio de cultivo

adicionado con ramnosa. Rregulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, 50°C. U=

cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min.

(4) α-L-ramnosidasa de A. terreus, Elinbaum y col, 2002. Medio de cultivo

adicionado con carbono de bagazo de caña de azúcar. Regulador de ácido.

40

succínico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, 30°C. U=cantidad de enzima

necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min.

(5) Naringinasas de A. niger NRRL 72-4, Bram y Solomons 1965. Regulador de

citratos sin molaridad especifica reportada, pH=4, 45°C. U=cantidad de enzima

necesaria para hidrolizar 1μmol naringina/min. Método de Davis 1947.

(6) Naringinasa de A. niger MTCC 1344, Munish y col en el 2005. Medio de cultivo

adicionado con ramnosa. Regulador de acetato de sodio 0.1M, pH= 4, 30°C.

IU=cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol naringina/min. Método de

Davis 1947.

(7) α-ramnosidasa de la naringinasa de A. niger. Manzanares y col, 1997. Medio

de cultivo adicionado con naringina. Regulador MacIIvaine, pH=4.5, 30°C.

U= μmol de ramnosa/min.

Para determinar la constante de velocidad (Vmáx) y la constante de Michaelis-

Menten (Km) se utilizaron los modelos gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-

Burk, Eadie-Hofsteen y Agustinson y el método gráfico de Wilkinson 1960. La

Figura 7 muestra las curvas para los modelos gráfico.

A B

C D

41

Figura 7. (A)Curva de Michaelis –Menten para Naringinasa donde Y=

6.683x+0.068; R2=0.908; (B) Curva de Lineweaber-Burk para Naringinasa; (C) Curva de Agustinson para Naringinasa; (D) Curva de Eadie-Hofsteen para la

naringinasa de A. niger ATCC1015.

Los valores correspondientes a Vmáx y Km para la naringinasa de A. niger a partir

de cada modelo gráfico y el calculado por el método estadístico de Wilkinson se

muestran en el cuadro 15.

Cuadro 15. Parámetros de Vmax y Km para las curvas de Michaelis-Menten,

Lineweaber-Burk, Eadi-Hoffsten, Agustinson y Wilkinson para la naringinasa de A.

niger ATCC1015.

En el Cuadro 16 se presentan los valores para la Vmáx y Km determinadas para

A. niger y P. decumbens, así como los valores reportados por diferentes autores

para la naringinasa.

Curva Vmax ( U/mg min)

Km (mM)

Michaelis-Menten 0.0158 0.0954

Lineweaverburk 13.24 1.6

Eadie-Hoffsten 18.46 7.21

Agustinson 14.64 2.1

Wilkinson* 17.63 3.3

42

Cuadro 16. Constantes de Vmáx y Km para la naringinasa producida por

diferentes microorganismos.

Sustrato Vmáx Km

narignina (1) 17.63U/mg·min 3.3mM

naringina (2) 2.92 8.4

naringina (3) 0.45µmol/mg·min 0.1.22mM

p-nitrofenol (4) 20.6 U/mg 2.9 mM

p-nitrofenol (5) 10.7 U /mg 1.52 mM

p-nitrofenol (6) 84U/mg 0.17mM

(1) Naringinasa de A. niger. Medio de cultivo adicionado con ramnosa como fuente

de carbono. Regulador de citratos 0.05M, pH=6, 35°C, [naringina]=0.00526mM.

U=1µmol de glucosa liberada / min (Método de Wilkinson).

(2) Naringinasa de P. decumbens (Sigma). Regulador de citratos 0.05M, pH=4.5,

35°C, [naringina]=0.00526mM. U=1µmol de glucosa liberada / min (Método de

Wilkinson).

(3) Naringinasa de Penicillium. Decumbens. Gülten y col, 2006. Fermentación

solida. Regulador de acetato de amonio 0.1 M, pH= 4, 40°C. U= 1 µmol de glucosa

liberado/ min. (Lineweaberburk).

(4) α-ramnosidasa de la naringinasa de A. niger .Manzanares y col, 1997.

Regulador MacIIvaine pH=4.5, 30°C.U= μmol de ramnosa liberados / min

(5) α-L-ramnosidasa de Penicillium sp Romero y col, 1985. Regulador de ácido.

succínico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, 30°C. U=cantidad de enzima

necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min.

43

(6) α-L-ramnosidasa de A. terreus, Gallego y col, 2001. Medio de cultivo

adicionado con ramnosa. Rregulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, 50°C. U=

cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min. (Michaelis)

En este trabajo se encontró que los valores de Vmáx y Km para la naringinasa de

A. niger ATCC1015 (Cuadro16, No.1) coinciden con los encontrados para la

naringinasa de P. decumbens (Cuadro16, No.2), lo que significa que a pesar de

haber una aparente producción proteica baja para la naringinasa producida por A.

niger, las constantes resultaron ser del mismo orden que las encontradas para la

naringinaa de P. decmbens por lo cual los resultados obtenidos son

comparativamente buenos.

El valor de Vmáx reportados por Gallego y colaboradores en el 2001 (Cuadro 16,

No 6) para la α-L-ramnosidasa de A. terreus es menor comparada con el obtenido

en el presente trabajo (Cuadro 16, No. 1) sin embargo, la enzima obtenida

presenta una menor afinidad por el sustrato naringina ya que obtuvo una Km

mayor (Cuadro 16, No.1) quizá porque esta enzima no solo presenta la actividad

de α-L-ramnosidasa sino también la de β-glucosidasa.

Por otra parte el valor informado para la α-L-ramnosidasa de A. niger por

Manzanares y colaboradores en 1997 y el informado por Romero y colaboradores

en 1985 es menores que el encontrado en el presente trabajo mediante el método

de Wilkinson ya que este engloba de manera estadística a todos los demás.

El valor de Vmáx para la α-L-ramnosidasa de A. niger informado por Manzanares y

col. 1997 (Cuadro 16, No.4) es mayor a lo encontrado en el presente trabajo lo

que significa que la actividad enzimática de la enzima encontrada es menor

teniendo ambas actividades (α-L-ramnosidasa y β-D-glucosidasa).

Gülten y col. en el 2006 determinaron las constantes de actividad enzimática de la

naringinasa de P. decumbens a través del método de Linewaver-Burk,

44

encontrando una Km menor a la encontrada, lo que significa que dicha naringinasa

tiene más afinidad por el sustrato que la que tiene la naringinasa producida

(Cuadro 64, No.3).

Sin embargo todos los autores anteriormente mencionados determinaron la las

constantes de Vmáx y Km utilizando un sustrtos inespecíficos como el p-nitrofenol,

obteniendo los valores presentes en el Cuadro 16.

CONCLUSIONES

El presente trabajo nos permitió encontrar una cepa capaz de producir una enzima

con las características encontrada en una enzima comercial, por lo que usando

fuentes de carbono económicas se puede encontrar un nicho que a nivel comercial

puede ser más rentable.

La prueba presuntiva en cromatografía en capa fina mostró presuntivamente que

la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015 es capaza de producir naringinasa.

Las diferentes fuentes de carbono y la concentración en la que se emplearon

produjeron naringinasa a partir de A. niger ATCC 1015 como respuesta por parte

del microorganismo a la presencia de compuestos orgánicos que pueden ser

asimilables a través de estas enzimas.

Cuando se adicionaron las sales de calcio y magnesio se encontró que un factor

determinante para el crecimiento del microorganismo es la concentración en la

que éstas se adicionan.

La fuente de carbono que favorece más el crecimiento del microorganismo es la

melaza y este crecimiento incrementa cuando se adiciona carbonato de calcio.

La mayor producción proteica se obtuvo cuando se empleó naringina como fuente

de carbono y ésta fue favorecida positivamente al adicionar la mezcla de sales.

45

La mayor actividad enzimática encontrada fue la de la enzima producida utilizando

el caldo nutritivo adicionado con ramnosa como fuente de carbono sin adición de

sales.

Por lo tanto las condiciones que favorecieron el crecimiento del hongo y la

producción de la proteína no fueron las ideales para favorecer la mayor actividad

enzimática de la naringinasa producida. De acuerdo a lo encontrado las

condiciones más adversas utilizadas en este estudio para el crecimiento del hongo

favorecieron la producción de enzima con mayor capacidad de hidrólisis de la

naringina. Lo que significa que no existe relación alguna entre el crecimiento del

hongo y la actividad enzimática de la enzima producida. A demás tampoco existe

relación alguna entre la producción proteica con respecto una mayor actividad

enzimática ni entre el crecimiento del microorganismo con respecto a la

producción proteica. Sin embargo en este trabajo si existió una relación entre la

actividad enzimática y la adquisición de nutrientes por parte del microorganismo.

Debido a que la naturaleza de A. niger es producir acido cítrico, la tendencia

natural del medio de cultivo tiende a ser acida, quizás controlando estas

condiciones puede mejorarse la producción enzimática y la actividad de esta y

esto puede lograrse haciendo un escalamiento de dicha producción a

fermentadores controlados ya que con una aeración controlada y vigorosa puede

inhibirse la producción de acido cítrico por este hongo y favorezca la producción

de naringina. Además el proceso podría ser optimizado ya que existen

investigaciones que suguieren que la adición de fuentes de carbono en diferentes

etapas podría proveer mejores resultados en cuanto a la actividad enzimática de la

naringinasa que se produce utilizando A. niger.

46

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