1130-0108/2003/95/11/765-770REVISTA EspAÑOLA DE ENA:RMEDADES DIGESTIVASCopyright @ 2003 ARAN EDICIONES, S. L.

j .REV Esp ENFERM DIG (Madrid)rol. 95. N.o 11, pp. 765-770, 2003

Efecto de la resección hepática sobre el desarrollo de metástasisen el hígado

l. García-Alonso, T. Palomares, A. Alonso1, V. Portugal, B. Castro1, J. Caramés y J. Méndez

Laboratorio de Cirugía Experimental. IDepartamento de Biología Celular y Ciencias Morfológicas. Facultad deMedicina y Odontología. UPVIEHU. Vizcaya

RESUMEN García-Alonso 1, Palomares T, Alonso A, Portugal V, Castro B,Caramés J, Méndez J. Effect of hepatic resection on developmentof liver metastasis. Rev Esp Enferm Dig 2003; 95: 765-770.Los estadios iniciales de la enfermedad metastática requie-

ren de la estimulación de factores de crecimiento del propiohuésped. Dichos factores pueden encontrarse aumentados enciertas situaciones clínicas, como la resección parcial del hígadometastatizado. Dada la importancia de los factores hepatotrófi-cos en la regeneración hepática, en el presente estudio se hainvestigado el efecto de la hepatectomía parcial sobre el desa-rrollo de las micrometástasis residuales y de la enfermedad neo-plásica global. Se ha utilizado un modelo murino en el que trasla inducción subcutánea de un tumor de rabdomiosarcoma enratas WAG, estas fueron sometidas a resección del tumor pri-mario, hepatectomía del 40% o a ambos actos quirúrgicos. Lainfluencia de dichos procedimientos sobre la enfermedad tumo-ral fue analizada en los días 25 y 35 post-inoculación tumoral,evaluando además la tasa regenerativa hepática. La tumorecto-mía y la hepatectomía, practicadas de forma aislada, produje-ron un aumento de las adenopatías regionales, sin modificar laevolución de las metástasis hepáticas. Sin embargo, el trata-miento combinado de tumorectomía y hepatectomía produjoun aumento del proceso metastático. Así, además de producir-se una mayor extensión global de la enfermedad (pulmonar,mediastínica y retroperitoneal), se incrementó un 300% el nú-mero de metástasis hepáticas. Este aumento de la carga metas-tática hepática coincidió con un incremento de la respuesta re-generativa hepatocitaria que casi duplicó al del grupo conhepatectomía sola. En conclusión, la hepatectomía sola o encombinación con la resección del tumor primario puede origi-nar una intensificación de la enfermedad tumoral, de extensiónlocal y metastática.

INTRODUCCIÓN

Desde que hace más de medio siglo, Higgins y cols.(1) demostraran la capacidad regenerativa del hígadohasta la recuperación de la masa inicial del órgano tras larealización de una hepatectomía parcial, la generaliza-ción de la resección hepática como alternativa terapéuticade la enfermedad metastática localizada, ha abierto unimportante tema de investigación en cirugía experimen-tal. El interés de este campo de investigación se ha vistoincrementado tras el aislamiettto en los últimos años delas sustancias implicadas en dicho proceso de regenera-ción hepática (2-3). Si bien existe un factor de crecimien-to específico hepatocitario (factor de crecimiento de he-patocitos, HGF), se han ido paulatinamente descubriendouna plétora de factores de crecimiento (GF) que, igual-mente, regulan la proliferaci6n hepatocitaria, como elfactor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de cre-cimiento endotelio vascular (VEGF), el factor de creci-miento transformante alfa y el beta (TGF) y el factor decrecimiento fibroblasto básico (FGFb), entre otros (4,5).

Si bien la cirugía puede ser¡ conSiderada una de las te-

rapias más efectivas para el tr tamiento de las metástasis

hepáticas, la recurrencia de la enfermedad tumoral es unfenómeno común. Dicha reci iva se produce, habitual-mente, tras el crecimiento de 1 s micrometástasis presen-tes en el hígado remanente (6). En este desarrollo metas-tático se encuentran imp~icados, al menos, dosimportantes procesos biológicos dependientes, asimismo,de la presencia de GF: la proliferación celular y la angio-génesis. Gracias a la existenpia en la superficie de lamembrana plasmática de receptores específicos para GF

Palabras clave: Hepatectomía parcial. Tumorectomía. Me-tástasis hepáticas. Regeneración hepática.

Recibido: 09-04-03.Aceptado: 25-06-03.

Correspondencia: Ignacio García-Alonso Montoya. Opto. de Cirugía y Ra-diología y MF. Fac. de Medicina y Odontología. BO Sarriena s/n. 48940Leioa, Vizcaya. Telf.: 946 012 816. Fax.: 946 012 781. e-mail: ocpga-

moi@lg.ehu.es.

El presente trabajo ha sido financiado por el Proyecto del F./.S. /44.327-0364/99

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secretados por las células neoplásicas (GF autocrinos) opor las propias del órgano huésped (GF paracrinos), lascélulas tumorales reciben la señal mitogénica necesariaque les permite dividirse de forma activa, dando lugar aun aumento de la masa tumoral (7-9). Sin embargo, ellono sería posible sin el adecuado soporte conectivo-vascu-lar que sustente este incremento proliferativo. Dicho so-porte, puede ser inducido por células tumorales o por laspropias células del órgano invadido, mediante la secre-ción al medio de GF neoangiogénicos (VEGF) y GF esti-muladores de la proliferación de los fibroblastos (FGFb),entre otros (10).

En esta comunicación bidireccional entre las célulastumorales y las células del hígado (11), se encuentran im-plicados GF relacionados con el proceso de regeneraciónhepática, como son los anteriormente citados HGF,FGFb, EGF, VEGF, etc. (12-14). De este modo, los facto-res de crecimiento liberados durante la hepatectomía par-cial estimularían tanto la proliferación hepatocitariacomo el desarrollo de las células tumorales. Ante estapremisa, parece necesario, por tanto, conocer el efectoque el acto quirúrgico, para el control de metástasis loca-lizada, pueda ejercer sobre la posterior evolución tumo-ralo

animales de cada grupo fueron sacrificados en dos mo-mentos evolutivos diferentes (días 25 ó 35 post-inocu-lación tumoral, respectivamente), mediante secciónmedular alta bajo anestesia con éter. Se registró la exis-tencia y/o número de metástasis en diferentes localiza-ciones (inguinal, axilar, retroperitoneal, intraperitoneal,mediastínica, pulmonar y hepática), así como el pesodel animal, del hígado y -en su caso- del tumor prima-rio. Por otro lado, se realizó un análisis de la capacidadregenerativa hepática mediante microespectrofotome-tría sobre cortes histológicos del lóbulo paramediano,extraído de los animales sacrificados en el día 25 post-inoculación, y teñidos con colorante de Schiff (reac-ción de Feulgen).

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el testexacto de Fisher para la comparación de la frecuencia deaparición de metástasis ganglionares, y aplicando el testde la t de Student para el resto de los parámetros cuantita-tivos.

RESULTADOS

En base a lo anteriormente expuesto, en el presentetrabajo se ha investigado la influencia que la resecciónparcial del hígado metastatizado tiene sobre el desarrollode las micrometástasis residuales y la evolución de la en-fermedad neoplásica en su conjunto, de cara a disponerde un buen modelo en el que ensayar medidas terapéuti-cas que contrarresten dicha influencia.

Efecto de la tumorectomÍa sobre la evolución de laenfermedad metastática

La resección del tumor primario fue seguido de unaumento significativo de la frecuencia de metástasisganglionares axilares e inguinales. Como puede obser-varse en la tabla 1, mientras en el grupo control no seapreciaron metástasis ganglionares en el día 25 de evo-lución, el 70% de los animales a los que fue practicadala tumorectomía presentó adenopatías axilares ipsilate-rales (p <0,005). En el día 35 de evolución, dicho por-centaje se incrementó hasta el 100% y, asimismo, el90% de estos animales tenían también adenopatías in-guinales ipsilaterales, en comparación al 10% de losanimales del grupo control (p <0,005). En cambio, nose observaron diferencias significativas en la frecuen-cia de metástasis ganglionares contralaterales, intra yretroperitoneales, mediastínicas y pulmonares (Tabla1). De igual modo, tampoco se produjeron diferenciassignificativas entre el grupo control y el grupo en elque se practicó la tumorectomía, ni en el número de fo-cos metastáticos hepáticos (5,2 vs 5,1 focos macroscó-picos; Tabla 11), ni en la distribución de los mismos en-tre los diferentes lóbulos del hígado (Tabla 111).

En lo que respecta al porcentaje de hepatocitos en re-generación, y tomando como referencia los valores nor-males de regeneración basal hepática (2,5% :t 1,6), latumorectomía no modificó de forma significativa dichoporcentaje (1,7% :t 1,9; Tabla IV). Por otro lado, encomparación al grupo control, la resección del tumorprimario tampoco alteró de forma significativa el por-centaje del peso hepático relativo al peso global delanimal (Tabla V).

MATERIAL Y MÉTODOS

Se han utilizado ratas WAG, machos de 8 semanas(150 :t 20 g), estabuladas con un ciclo de luz/oscuridadde 12 h, con comida y bebida "ad libitum", y siguiendoen todo momento la "Guía nacional española para elcuidado del animal en experimentación y otros finescientíficos" (Real Decreto 223/88). Como modelo tumo-ral se utilizó la línea celular de rabdomiosarcoma (singé-nica para la ratas WAG) S4MH, con alta afinidad para eldesarrollo de metástasis hepáticas. Las células (2,5 x lOscélulas, resuspendidas en 250 ~l de PBS) fueron inocula-das por vía subcutánea en el flanco derecho de los anima-les.

Tras la inoculación tumoral, los animales se distribu-yeron de forma aleatoria en cuatro grupos de 20 anima-les: control, tumorectomía (con extirpación completade la lesión tumoral primaria el día 23 post-inoculacióntumoral), hepatectomía parcial del 40% (exéresis dellóbulo lateral izquierdo el día 23 post-inoculación tu-moral), y grupo sometido a ambos procesos (tumorec-tomía y hepatectomía). Para facilitar la recuperación delos animales, al finalizar el acto quirúrgico se adminis-traron 5 mI de suero glucosado 5% i.p. La mitad de los

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Vol. 95. N.o 11.2003 EFEcro DE LA RESECCIÓN HEPÁTICA SOBRE EL DESARROLLO DE METÁSTASIS EN EL HÍGADO 767

Tabla l. Evolución de las metástasis

Localización

metastática

Control

Día 25 Día 35

Tumorectomía

Día 25 Día 35

Hepatectomía

Día 25 Día 35

Tu morectom ía+ H epatectom ía

Día 25 Día 35

oo

10

10

oo

90*

20oo

90*

50

oo

90*

20

Inguinal

ipsilateral

contralateral

Axilar

ipsilateral

contra lateral

Retroperitoneal

Intraperitoneal

Mediastrnicas

Pul mona res

oo

50

O

O

30

10

10

100

50

30

90

70*

O

60

O

O

10

100**

20

100

60

40

100

70*

O

70

O

O

30

100**

40

100

60

10

100

90**

O

90

O

O

40

90*

40

100

90

50

100

Las cifras expresan el porcentaje de animales en los que se encontraron metástasis macroscópicas en esa localización. Las comparaciones entre cada serie y el grupo controlse han realizado con el Test de Fisher: .p<O,OO5; ..p<O,OOO5.

Tabla 11. Número de metastasis hepáticas macroscópicas

A: todos los lóbulos hepáticos

DS Mediana

B: excluido el lóbulo lateral izquierdo

Media DS MedianaMedia Rango Rango5,17

4,26

1,57

6,38

5

5

1,58

2,873

1,5

8,62*

2,32

2,55

1,57

6,38

3

3

1,58

Control

Tumorectomía

Hepatectomía

Tum. + Hep.

En la tabla B se eliminan las metástasis correspondientes al lóbulo lateral izquierdo para facilitar la comparación con las series en las que se practicó hepatectomía parcial.'Indica p<O,OS respecto al grupo control.

Tabla 111. Distribución de las metástasis hepáticas macroscópicas en los diferentes lóbulos

Hfgados completos Control

% metástasis

Tumorectomía

HepatectomfaHepatectomra

% metástasis

Turn. + Hep

En negrita se recoge el porcentaje de masa que corresponde a cada lóbulo hepático. Para cada grupo experimental se detalla el porcentaje de metástasis macroscópicas quese asentaron en cada lóbulo, as! como el número medio de metástasis macroscópicas Gunto al error estándar).

Efecto de la hepatectomía parcial sobre la evoluciónde la enfermedad tumoral

al del grupo tumorectomizado, tanto en el momento evo-lutivo de aparición de las metástasis inguinales y/o axila-res, como en el porcentaje de animales con presencia dedichas metástasis. Así, en el día 25 de evolución, el 70%de los animales hepatectomizados presentó adenopatíasaxilares ipsilaterales (p <0,005), siendo dicho porcentajedel 100% en el día 35 de evolución, momento en el cual

Al igual que lo observado en el grupo de animales tu-morectomizados, la hepatectomía dio lugar a un incre-mento de la frecuencia de las metástasis ganglionares in-guinales y axilares. Aún más, dicho aumento fue paralelo

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Tabla IV. Porcenjate de hepatocitos en regeneración en ani-males portadores de tumor y en controles no inoculados

Portadores de tumor No inoculados

6,

2,

O,

O,

2,

O,

O,

2,

O,

1,

1,

49,46

47,17

25,02

34,76

28,90

54,75

12,70

31,95

12,53

33,03++

15,25

2,83

4,8

0,7

1,17

2,95

Media

DS

2,49

1,63

Las diferencias son significativas (*) respecto al controlo (++) respecto al grupohepatectomizado, con una p <0,05.

el 90% de los animales tenían también adenopatías ingui-nales ipsilaterales (p <0,005). Por otro lado, también seprodujo un aumento de la frecuencia de metástasis gan-glionares axilares e inguinales contralaterales (40 y 50%,repectivamente), no alcanzando sin embargo este incre-mento significación estadística (p=0,15; p=0,07). Si-guiendo con el paralelismo existente con el grupo tumo-rectomizado, y en lo que se refiere a la frecuencia demetástasis en el resto de las localizaciones anatómicasevaluadas, en el grupo hepatectomizado tampoco se pro-dujo modificación significativa respecto al grupo control.

En el caso particular del número de focos metastáti-cos en el hígado, en comparación al grupo control y unavez excluido el lóbulo lateral izquierdo en el recuentode los mismos (Tabla IIB), se pudo observar que sibien en el grupo hepatectomizado existió una disminu-ción en el número de metástasis hepáticas, esta no llegóa ser significativa respecto al grupo control (1,5 :!: 1,6 vs2,9 :!: 2,3; P = 0,08). Sin embargo, tal y como se puedeapreciar en la tabla III, la distribución de las metástasisentre los diferentes lóbulos hepáticos no se realizó enfunción del porcentaje de masa hepática correspon-diente a cada uno de los mismos, existiendo un mayortropismo por el lóbulo caudado en los animales hepa-tectomizados respecto al grupo control (47 vs 14%,respectivamente; p <0,05).

En lo que respecta a la respuesta regenerativa hepáti-ca, tal y como cabría esperar, la hepatectomía parcialdel 40% produjo un aumento significativo del porcenta-je de hepatocitos en regeneración respecto al control(18,7%:!: 5,5 vs 2,5%::!: 1,6) (Tabla IV). Por el contrario,la hepatectomía no modificó los parámetros ponderalesdel hígado ni del tumor primario (Tabla V).

de animales exclusivamente tumorectomizados o hepa-tectomizados (Tabla 1), se produjo un aumento de la fre-cuencia de las metástasis ganglionares inguinales y axila-res ipsilaterales. Aún más, con respecto a estas últimas,en el día 25 de evolución el porcentaje fue incluso mayorque en las otras dos series experimentales (90 vs 70%).Este aumento pudo también apreciarse en lo que se refie-re a las metástasis retroperitoneales y pulmonares en eldía 25 de evolución, y a las intraperitoneales y mediastí-nicas en el día 35 de evolución, si bien en estos casos nollegó a alcanzar significación estadística respecto al con-trol.

Sin embargo, fue el hígado el órgano donde pudo ob-servarse en mayor medida la intensificación del desarro-llo metastático debida a la combinación tumorectomía-hepatectomía (Tabla IIA). Las diferencias son aún ma-yores al comparar el número de metástasis tras excluir, entodas las series, las metástasis del lóbulo lateral izquierdo(lóbulo hepatectomizado). Así, respecto al grupo control,en la serie de animales tumorectomizados y hepatectomi-zados el número de metástasis se incrementó un 300%

Efecto del tratamiento combinado sobre la evoluciónde la enfermedad metastática

El tratamiento combinado, tumorectomía y hepatecto-mía parcial, produjo una intensificación del proceso me-tastático respecto a los grupos en los que se practicó sólola tumorectomía o la hepatectomía. En lo referente a lasmetástasis ganglionares, y tal como ocurría en los grupos

Tabla V. Parámetros de evolución clínica

Día 35Día 25

Absoluto Relativo Absoluto RelativoAbsoluto Relativo Absoluto Relativo

25,S :t 5,2 14,3:t 2,515,5 :t 1,8 8,9 :t 0,9

8,5:t 1,3

17,9:t 7,6 10,8:t 4,1

7,9 :t 2.2

Control

Tumorectomía

Hepatectomía

Tum. + Hep.

27,4:i:6,414,2:i:2,74,4:t 0,8

Las cifras expresan el peso absoluto en gramos del hígado y del tumor primario y el porcentaje que suponen respecto al peso del animal (medias:!: DS). Las diferencias ob-

servadas no alcanzan significación estadística.

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25

37

73

00

14

75

72

74

00

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EFECTO DE LA RESECCIÓN HEPÁtICA SOBRE EL DESARROLLO DE METÁSTASIS EN EL HÍGADOVol. 95. N.o 11.2003 769

(p <0,05; Tabla IIB). Por otro lado, respecto a los anima-les exclusivamente hepatectomizados, se produjo unamodificación en la distribución lobular de las metástasis,pasando a ser el lateral derecho el lóbulo con mayor por-centaje de metástasis (44%) en vez del lóbulo caudado(20%; Tabla 111). De forma paralela al incremento de lacarga metastática hepática, en este grupo de animales seprodujo también un aumento muy significativo de la res-puesta regenerativa hepatocitaria, que llega casi a dupli-car a la del grupo exclusivamente hepatectomizado (33vs 19%; P <0,05). Por último, el peso hepático relativodel grupo que recibió el tratamiento quirúrgico combina-do no se vio modificado en ninguno de los dos momentosevolutivos analizados, respecto al grupo control.

DISCUSIÓN

como cirugía curativa), se debe tener en cuenta que resul-ta un momento idóneo para cubrir el objetivo de este tra-bajo: el estudio del proceso metastático y la repercusiónde la intervención quirúrgica en dicho proceso.

Hemos podido observar que cualquiera de los dos ac-tos quirúrgicos, tumorectomía o hepatectomía, realizadosde forma aislada provocan un incremento de las metásta-sis ganglionares, sin modificar el número de metástasisen el pulmón o en el hígado. Sin embargo, con la combi-nación terapéutica tumorectomía + hepatectomía, es esteúltimo órgano el que se ve más ampliamente afectado, in-crementándose significativamente el número de metásta-sis. Este efecto pudiera estar relacionado con la demos-trada afinidad de las células S4MH por metastatizar en elhígado, órgano diana en el cual pueden encontrar el mi-croambiente adecuado para su desarrollo, favorecido ade-más por la liberación de los factores de crecimiento trasla hepatectomía. Otros autores han demostrado tambiénel estímulo tumoral tras la hepatectomía parcial, sugirien-do una cierta selectividad por el desarrollo de las célulastumorales presentes en el hígado debido a la liberación,tras la resección hepática, de factores de crecimientocomo el TGFa. TGFJ3, FGFb o el HGF, que no estimula-rían las células presentes, por ~jemplo, a nivel pulmonar(12). Entre estos factores, el HGF es el que ha sido másampliamente implicado en la telación entre la regenera-ción hepática y el proceso metastático. De hecho, el HGFha demostrado ser un factor mitogénico para diferentestipos de poblaciones tumorales que expresan receptoresen la superficie de la membrana plasmática para dichofactor (HGF-R) (13,19), estimulando su proliferación através, entre otrosmecanism°!1' de la activación de la víafosfatidilinositol 3-kinasa (PI3Lkinasa) (20).

Por otro lado, autores como Jiang y cols. han señaladoque ciertas células tumorales, además de expresar HGF-R,son capaces de secretar de forma autocrina HGF (14). Aúnmás, se ha sugerido también que tras una resección turno-ral puede producirse, incluso, una sobre-expresión delHGF-R en las células tumorales remanentes (21). De estemodo, una tumorectomía concomitante a la hepatectomía,como la realizadas en nuestro estudio, daría lugar a la coe-xistencia simultánea de un aumento de expresión de HGF-R en las células tumorales y de un aumento de HGF solu-ble, estimulando así de forma importante el desarrollometastático. De hecho, en nuestro estudio observamos que,en el grupo en el que fueron practicados ambos procedi-mientos quirúrgicos, el número de metástasis se incremen-tó cerca de tres veces respecto a cualquiera de las otras se-ries experimentales. Sin embargo, en el caso de latumorectomía o la hepatectomía aplicadas de forma aisla-da, el efecto autocrino o paracrino de los factores de creci-miento derivados de las células normales -fibroblastos, cé-lulas endoteliales, macrófagos o los hepatocitos-, podríasuponer también un estímulo suficiente para propiciar uncrecimiento locorregional tumoral más rápido, como es eldesarrollo de metástasis ganglionares, lo cual ha sido suge-rido también por otros autores (6,7).

El presente trabajo demuestra el efecto estimulador deldesarrollo metastático secundario al acto quirúrgico parael tratamiento de la enfermedad tumoral a través de unatumorectomía y/o hepatectomía. Ambos tipos de inter-venciones quirúrgicas, la resección del tumor primario yla resección de metástasis hepáticas localizadas, se hanmostrado eficaces a nivel clínico como tratamiento cura-tivo o paliativo de la enfermedad neoplásica (15-17). Sinembargo, durante ambas manipulaciones quirúrgicas seproduce la liberación plasmática de diferentes factoressolubles, los cuales pueden estar implicados, además deen los procesos inflamatorios y regenerativostisulares, enla evolución de la enfermedad tumoral residual o subclí-nica. En la actualidad, es bien conocida la dependenciade las células tumorales a dichos factores solubles delhuésped para su crecimiento y, en particular, para el desa-rrollo de metástasis, en lo que se ha denominado meca-nismo de crecimiento paracrino de la enfermedad metas-tática (7-9).

El efecto protumoral secundario a la tumorectomía yhepatectomía ha podido ser demostrado gracias a la utili-zación de un modelo experimental que presenta la venta-ja de incluir todas las etapas del proceso metastático (18).En el presente estudio, se ha elegido como momento ade-cuado para la realización de los dos tipos de procedi-mientos quirúrgicos el día 23 post-inoculación de las cé-lulas tumorales, ya que en dicho modelo observamos queen el día 25 comienzan a apreciarse los primeros focosmetastáticos en el hígado, coincidiendo, además, con elperiodo de máxima regeneración hepatocitaria tras efec-tuar una hepatectomía parcial del 40%. Así mismo, el día35 se definió como el de máxima carga metastática, yaque en dicho momento evolutivo todos los animales handesarrollado metástasis en el hígado y la supervivencia estodavía del 90%. Si bien resulta obvio reconocer que eldía 23 es un momento demasiado tardío en experimenta-ción animal para la realización de maniobras terapéuticasencaminadas a aumentar la supervivencia de los animales(en el sentido de entender la tumorectomía practicada

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Otro resultado destacable del presente trabajo ha sidola distribución anatómica de las metástasis hepáticas, pu-diendo observar una localización preferente en uno de loslóbulos hepáticos. Este resultado apoyaría la opinión deaquellos autores que abogan por una resección de las mé-tastasis hepáticas lo más limitada posible. Sin embargo,en base a todo lo anteriormente expuesto y a los trabajospreviamente publicados, en los que se sugiere que una re-sección hepática mínima da lugar a una fuerte estimula-ción del crecimiento de las células tumorales residuales,mientras una hepatectomía mayor (60%) puede, por elcontrario, suprimirla (22,23), hace de aquella, al menos,una opinión discutible.

En conclusión, si bien la escisión quirúrgica puede re-presentar la única alternativa curativa para tumores pri-marios y metástasis hepáticas, es preciso tomar en consi-deración el efecto estimulador que dicha intervenciónpuede producir, de forma indirecta, sobre la enfermedadmetastática microscópica. Esto hace, por lo tanto, funda-mental el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos queprevengan o anulen dicho efecto protumoral en el trata-miento quirúrgico de la enfermedad neoplásica.

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REv EspENFERM DIO 2003; 95(11): 765-770

1130-0108/2003/95/11/771-776REVISTA EsPAÑOLA DE ENFERMEDADES DIGESllVASCopyright @ 2003 ARAN EDICIONES, S. L.

REV EsP ENFERM DIG (Madrid)Vol. 95. N.o 11, pp. 771-776, 2003

García-Alonso, T. Palomares, A. Alonsol V. Portugal, B. Castro!, J. Caramés and J. Méndez

Laboratory of Experimental Surgery. 1 Department of Celular Biology and Morphological Sciences. Department of

Medicine and Odontology. UPVIEHU. Vizcaya, Spain

ABSTRACT GJrcía-Alonso 1, Palomares T, Alonso A, Portugal V, Castro B,Caramés J, Méndez J. Effect of hepatic resection on deuelopmentof liuer metastasis. Reu Esp Enferm Dig 2003; 95: 771-776.In the early stages of metastasis, development of the disease is

dependent on growth factors produced by fue host. There are cli-nical situations associated with an increase in these factors, suchas partial resection of metastasized liver. Given the important Toleof hepatotrophic factors in liver regeneration, we have studied theeffect of partial hepatectomy on the development of residual mi-crometastases in fue liver, and on the neoplastic process as awhole. We used a murine model in which a rabdomiosarcoma wasestablished by subcutaneous inoculation of syngeneic tumor cellsin male Wag rats. Subsequently, the primary tumor was resectedand/or a 40% hepatectomy was performed. The effect of thesetwo surgical procedures on the tumor process was analyzed onfue 25th and 35th days post-inoculation, and the percentage ofregenerating hepatocytes was assessed. Both the tumorectomyand liver resection, when not combined, produced an increase inregional adenopathies without modifying the evolution of metasta-sis in the liver. However, when tumor excision and partial hepa-tectomy were performed simultaneously, fueTe was a net increasein the metastatic process. In addition to a rapid spread of the di-sease (Iung, mediastinum, retroperitoneum), the number of livermetastases increased by 300%. This development coincided witha steep rise in fue percentage of regenerating hepatocytes, whichnearly doubled that of fue group subjected only to liver resection.We conclude that liver resection, alone or combined with excisionof the primary tumor, may enhance tumor progression, both 10-cally and at fue metastasic level.

INTRODUCTION

Ever sinée Higgins et al. (1) demonstrated over half acentury ago the capacity of the liver to regenerate alterpartial hepatectomy and to quickly regain its initial mass,liver resection has been increasingly used as an alterna-tive for managing localized metastatic disease and hasopened up an important area for study in experimentalsurgery. lnterest in this field of research has been furtherprompted by the recent isolation of substances responsi-ble for liver regeneration (2,3). As might be expected,there is a specific hepatocyte growth factor (HGF), butthere is also a range of other growth factors (GF) thatare also involved in regulating hepatocyte proliferation,such as epidermal growth factor (EGF), vascular endo-thelial growth factor (VEGF), transforming growth fac-tor alpha and befa (TGF-alpha, TGF-beta), and basicfi-broblast growthfactor (FGFb), among others (4,5).

While surgery may be considered one of the mast ef-fective therapiesfor treating liver metastasis, recurrenceof the disease is a common phenomenon. Relapse nor-mally occurs when the residual micrometastases presentin the resected liver start to grow (6). There are at leasttwo majar biological processes involved in this metasta-tic development, both ofwhich are also dependent on thepresence of GF, namely cell proliferation and angiogene-siso Thanks to the existence on the plasma membrane sur-face of specific receptors for GF secreted by the neoplas-tic cells (autocrine GF) or by the cells of the host organ(paracrine GF), tumor cells receive the mitogenic signalthey need to divide and proliferate, thus giving rise to anincrease in the tumor mass (7-9). Howevet; this would not

Key words: Partía! hepatectomy. Tumorectomy. Uver metas-tasís. Uver regeneration.

Received: 09-04-03.Accepted: 25-06-03.

Correspondence: Ignacio García-Alonso Montoya. Laboratory oí Experi-mental Surgery. UPV/EHU. Bo Sarriena s/n. 48940 Leioa. Vizcaya, Spain.Phone: 946 012 816. Fax.: 946 012 781. e-mail: ocpgamoi@lg.ehu.es.

This study was funded by FIS Project no. 144.327-0364/99

772 l. GARCÍA-ALONSO ET AL. REy Esp ENFERM OIG (Madrid)

Statistical analysis was performed using Fisher's exacttest to compare the frequency of appearance of glandularmetastases, and applying Students t-test for other quanti-tative parameters.

RESULTS

Effect of tumorectomy on the course of metastaticdisease

be possible without an adequate connective-vascular net-work supporting the accelerated proliferation. Such sup-port can be induced either by the tumor cells or by thecells of the invaded organ, through secretion of neoan-giogenic, or vascular endothelial, growthfactors (VEGF)and fibroblast proliferation-stimulating GF (FGFb,among others (10).

In this two-way communication between tumor cellsand liver cells (11), the GF responsible for hepatic rege-neration, such as HGF, FGFb, EGF, VEGF, etc. are in-volved (12-14). This means that the growthfactors secre-red during partial hepatectomy prompt not onlyhepatocyte proliferation, but the growth of tumor cells aswell. Given this premise, we need to investigate the effectthat surgical management of localized metastasis mayhave on subsequent tumor growth.

Accordingly, we have studied the impact ofpartial re-section of metastasized liver on the development of resi-dual micrometastases and on the evolution of neoplasticdisease as a whole, in order to attain an adequate modelfor testing therapeutic measures to counteract the in-fluence of surgery.

MATERIAL AND METHODS

Resection of the primary tumor was followed by a sig-nificant in crease in the frequency of metastasis in axillaryand inguinal glands. As shown in table 1, while no glan-dular metastases were detected in the control group onday 25 post-inoculation, 70% of the animals that under-went tumorectomy exhibited ipsilateral axillary adeno-pathies (p <0.005). On day 35 post-inoculation, this per-centage had increased to 100%. Moreovel; 90% oftheseanimals also had ipsilateral inguinal adenopathies, com-pared to 10% of the animals in the control group (p<0.005). On the other hand, howevel; no significant dif-ferences were found in the frequency of metastases incontralateral glands, intra- and retroperitoneum, me-diastinum and lung (Table 1). Similarly, no significant dif-ferences were found between the control group and thegroup that underwent tumorectomy, either in the numberofmetastatic colonies in the liver (5.2 vs 5.1 macroscopicsites; Table 11), or in their distribution in the difierent he-patic lobes (Table Il/).

With regard to the percentage of regenerating hepa-tocytes, and taking as our reference normal baseline he-patic regeneration values (2.5% :!: 1.6), tumorectomy didnot significantly alter this figure (1.7% :!: 1.9; Table IV).Finally, compared to the control group, resection of theprimary tumor also caused no significant change in liverweight as a percentage of total animal weight (Table V).

We usedmale, 8-week old WAG rats (150 :1:20 g), sta-bilized with a 12-h lightldarkness cycle and given foodand drink "ad libitum". Spain's National Guidelines forthe cace of laboratory animals (Royal Decree Law no.223188) were followed at all times. As a tumor model weused the rhabdomyosarcoma cell line (syngeneic forWAG rats) S4MH, with high affinity for the developmentof liver metastasis. The cells (2.5 x 1OS cells, resuspendedin 250 .Lil of PBS) were administered by subcutaneousinoculation in the animals' right flank.

Following inoculation, the rats were randomly distri-buted into four groups of 20 animals: control, tumorec-tomy (with complete extirpation of the primary malignantlesion on day 23 post-inoculation), partial (40%) hepa-tectomy (excision of left laterallobe on day 23 post-ino-culation) and a group subjected to both procedures (tu-morectomy and partial hepatectomy). To facilitate therecovery of animals following surgery, 5 ml of 5% serumglucosed i.p. was administered Half of the animals ofeach group were sacrificed at two different times in thecourse of the experiment (day 25 or 35 post-inoculation,respectively), by severing the upper spinal cord under etheranesthesia. The existence and/or the number of metasta-ses in different locations (groin, axilla, retroperitoneum,intraperitoneum, mediastinum, lung and liver) was recor-ded, as was the weight of the animal, of the liver andowhere applicable, of the primary turno/: Finally, the rege-nerative capacity of the liver was studied by microspec-trophotometry on histological sections ofthe paramedianlobe extracted from animals sacrificed on day 25 post-ino-culation and prepared with Schiff stain (F eulgen reaction).

Effect of partial hepatectomy on the course ofmetastatic disease

As was observed in the group of animals that had theirprimary tumor removed, partial hepatectomy gave rise toan increased rafe of metastasis in inguinal and axillaryglands. Moreover; this increase paralleled the rafe chan-ges detected in the tumorectomized group, regarding boththe time of appearance of the inguinal and/or axillarymetastases, and the percentage of animals exhibiting theselesions. On day 25 post-inoculation, 70% of the hepatec-tomized animals exhibited ipsilateral axillary adenopathies(p <0.005), afigure which had risen to 100% by day 35post-inoculation, when 90% of the animals also had ipsi-lateral inguinal adenopathies (p <0.005). Moreover;there was also a rise in the frequency of contralateralaxillary and inguinal gland metastases (40 and 50%, res-pectively), although this increase was not statistically

REy EspENFERM DIG 2003: 9501): 771-776

VoL 95. N,o 11.2003 EFFECf OF HEPA TIC RESECfION ON DEVELOPMENT OF LIVER MET AST ASIS 773

Table l. Evolution of metastasis

Metastatic

location

Control

Day 25 Day 35

Tumorectomy

Day 25 Day 35

Hepatectomy

Day 25 Day 35

Tu m o rectomy + H epatectomy

Day 25 Day 35

oo

10

10

oo

90*

20

oo

90*

50

oo

90*

20

Inguinal

ipsilateralcontra lateral

Axillary .

ipsilateral

contra lateral

Retroperitoneal

Intraperitoneal

Mediastinal

Pulmonary

oo

50

O

O

30

10

10

100

50

30

90

70*

O

60

O

O

10

100**

20

100

60

40

100

70*

O

70

O

O

30

100**

40

100

60

10

100

90**

O

90

O

O

40

90*

40

100

90

100

Figures express the percentage of animals in which macroscopic metastases were found in this location. Comparisons between each series and the control group weremade using the Fisher test: .p <0.005; ..p <0.0005.

Table 11. Number of macroscopic hepatic metastases

Control

Tumorectomfa

Hepatectomfa

Tum. + Hep.

5.17

4.26

1.57

6.38

5

5

1.5

8

2.32

2.55

1.57

6.38

3

3

1.58

In table B metastases found in the left laterallobe were eliminated to facilitate comparison with the series in which partial hepatectomy was performed. *Indicates p <0.05compared to control group.

Table 111. Distribution of macroscopic metastasis per liver lobe

Median Leftlateral Right lateral Caudate

30%Distribution acc. to liver mass %

Complete liver Control

% metastasis

Tumorectomy

33% 17%Distribution acc. to liver mass % 50%

47%

O.7~O.21

21%

2.25~O.88

Hepatectomy Hepatectomy

% metastasis

Turn. + Hep.

Figures in bold show the percentage of mass corresponding to each hepatic lobe. For each experimental group, the table shows the percentage of macroscopic metastasiscolonizing each lobe, as well as the average number of macroscopic metastases (plus standard error).

lobe was excluded from the count (Table IIB), the numberof liver metastases was lower in the hepatectomized ani-mals, but that the difference compared to the controlgroup was not significant (1.5 :f: 1.6 vs 2.9 :f:2.3; P = 0.08).Howevel; as can be seen from rabie lIl, the distribution ofmetastases among the different hepatic tabes did not de-pend on the percentage of liver mass in each, there being

significant (p=O.15; p=O.O7). Afurther parallel with thetumorectomized group concerns the frequency of metas-tases in the remaining anatomicallocations evaluated. Inthe hepatectomized group, there was no significant chan-ge compared to the control group.

Regarding the number of metastatic colonies in the li-ver compared to controls, we found that if the left lateral

REY Esp ENFERM OIG 2003; 95(11); 771-776

774 GARCÍA-ALONSO ET AL. REy Esp ENFERM DIG (Madrid)

a greater tropismfor the caudate lobe in the hepatectomi-zed animals compared to the control group (47 vs 14%,respectively,. p <0.05).

With regard to hepatic regenerative response, as wasto be expected, 40% partial hepatectomy produced asignificant rise in the percentage of regenerating hepa-tocytes compared to the control group (18.7 :t 5.5 vs2.5% :t 1.6,. Table IV). Howeve¡; hepatectomy did notmodify liver weight or primary tumor weight parame-ters (Table V).

Table IV. percentage of regenerating hepatocytes in tumor-bearing animals and in non-inoculated controls

Hepatectomy17.24

21.87

25.24

16.19

16.23

8.57

18.82

25.45

Average 18.70*

SO 5.55

49.'

47.

25.(

34.:

28.~

54.~

12. ~

31.!

12.!

33.0~

15.:

2.83

4.80.7

1.17

2.95

Effect of combined treatment on the course ofmetastatic disease

2.491.63

The differences are significant (*) compared to controls or (++) compared to thehepatectomized group. p <0.05.

date lobe (20%; Table /l/J. Parallel to the increase in me-tastatic load in the livet; this group of animals also exhi-bited a very significant rise in the percentage of regene-rating hepatocytes, which almost doubled the rafedetected in the exclusively hepatectomized group (33 vs19%; p <0.05). Finally, compared to the control group,there were no differences in the relative hepatic weight ofthe group subjected to the combined surgical treatmenton either ofthe two post-inoculation days analyzed.

The combined tumorectomy + partial hepatectomy treat-ment produced an intensification of the metastatic pro-cess compared to the groups that underwent tumorectomyor hepatectomy alone. Regarding glandular metastases,as occurred in the groups of animals subjected only toeither tumorectomy or hepatectomy (Table 1), there wasan increase in the frequency of ipsilateral inguinal anda.xillary gland metastases. Moreovel; with regard to thelattel; on day 25 post-inoculation the percentage waseven higher than in the other two experimental series (90vs 70%). A similar in crease was also detected in retrope-ritoneal and pulmonary metastases on day 25 post-inocu-lation, and in intraperitoneal and mediastinal metastaseson day 35 post-inoculation, although in these cases thedifference compared to controls was not statistically sig-nificant.

Howevel; the liver was the organ where metastatic de-velopment was observed to be most intense following thecombined tumorectomy + hepatectomy treatment (TableIIA). The differences are even greater if we exclude fromthe count metastases in the hepatectomized left laterallobe: compared to the control group, in the series thatwas tumorectomized and hepatectomized, the number ofmetastases grew by 300% (p<0.05; Table IIB). Moreovel;compared to the exclusively hepatectomized group, therewas a change in the lobular distribution of the metasta-ses, with the right laterallobe exhibiting the largest per-centage of metastatic colonies (44%) instead of the cau-

DISCUSSION

This study demonstrates the stimulatory effect of surgi-cal treatment (i.e. tumorectomy andlor partial hepatec-tomy) on metastatic proliferation in cancel: Both resec-tion of the primary tumor and resection of localized livermetastases have been shown to be clinically effective ascurative or palliative treatments in managing neoplasticdisease (15-17). Howevel; during both types ofsurgery,

Table V. Clinical evolution parameters

Primary tumor weightPrimary tumor weight Liver weightLiver weight

The figures express the absolute weight in grams of the liver and the primary tumor, and the percentage they account for of total body weight (average :1: SD). The diffe-

rences observed were not statistically significant.

REy EspENFERM DIG 2003; 95(11): 771-776

Vol. 95. N.o 11.2003 EFFECT OF HEPATIC RESECTION ON DEVELOPMENT OF LIVER METASTASIS 775

ble of autocrine secretion of H~F (14). Moreovel; it hasalso been suggested that tumori resection may even be fo-llowed by an overexpression ofHGF-R in any residualtumor cells (21). Thus tumorectomy with concomitant he-patectomy, such as the treatment performed in our study,would give rise to the simultaneous co-existence of an in-crease in HGF-R expression in tumor cells and an increasein soluble HGF, thereby greatly stimulating metastaticgrowth. This was confirmed in our study, where we ob-served that, in the group that underwent both surgicalprocedures, the number of metastases increased nearlythree-fold compared to the other experimental series.Howevel; in the case of tumorectomy or hepatectomy per-formed in isolation, the autocrine or paracrine effect ofnormal cell-derived growthfactors -fibroblasts, endothe-lial cells, macrophages or hepatocytes- could also pro-vide sufficient stimulus to prompt quickened local-regio-nal tumor growth, such as the development of glandularmetastases, which has also been suggested by otherauthors (6,7).

Another noteworthy result of the present study was theanatomical distribution of the liver metastases, wherepreferentiallocation in one of the hepatic lobes was ob-served. This finding would seem to support the opinion ofauthors who claim that resection of hepatic metastasisshould be used as sparingly as possible. Howevel; in viewof the results outlined above and of work published pre-viously where it is suggested that minimal hepatic resec-tion leads to pronounced stimulation of residual tumorcell growth, whereas larger hepatectomy (60%) may ac-tually suppress it (22-23), it would seem legitimate toquestion the claim that hepatic resection should be limi-ledo

In conclusion, while surgical removal may representthe only curative alternative for primary tumors and he-patic metastases, it is necessary to take into account theindirect stimulatory effect that surgery may have on mi-croscopic metastatic disease. Therefore, it is essential todevelop new therapeutic approaches that will prevent orannul this tumor-stimulating effect in the surgical treat-ment of neoplastic disease.

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The tumor-stimulating effect secondary to tumorec-tomy and hepatectomy was demonstrated thanks to theuse of an experimental model having the advantage of ex-hibiting all the stages in the metastatic process (18). Inthis study, dar 23 post-inoculation of tumor cells waschosen as the best time for peiforming the two types ofsurgical procedure, since according to our observations,in this model metastatic colonies can first be detected inthe liver on dar 25, a date which further coincides withthe time of maximum hepatocyte regeneration following40% partial hepatectomy. Day 35 was defined as the dateof maximum metastatic load, since this marks the point inthe experiment when all the animals have developed me-tastasis in the liver and there is still 90% survival. Whiledar 23 is obviously too late in animal experimentation toundertake therapeutic measures designed to enhancesubject survival (e.g. tumorectomy peiformed as curativesurgery), it is nonetheless the best time for meeting theobjectives of this work: to study the metastatic processand how it is affected by surgical intervention.

The study shows that when either of the surgical pro-cedures (tumorectomy or hepatectomy) is peiformed indi-vidually, the outcome is an increase in glandular metas-tases, with no significant change in the number ofmetastases in lung or livel: Howevel; when the two proce-dures are peiformed together as a combined treatment,the liver is the organ most clearly affected, with a signifi-cant increase in the number of metastases. This effe~tcould be related to the demonstrated affinity of 84MBcells for metastasizing in the livel; a target organ thatprovides a good microenvironment for their development,which is further fostered by the release of growth factorsfollowing hepatectomy. Other authors have also shownthat partial hepatectomy triggers tumor growth, sugges-ting a certain selectivity for the development of tumorcells present in the liver due to the release, following he-patic resection, of growth factors such as TGFa, TGFj3,FGFb and HGF, which do not appear to stimulate thecells present, for example, at the pulmonary level (12). Ofthese factors, HGF is the one most clearly involved in therelation between liver regeneration and the metastaticprocess. 1ndeed, HGF has been shown to be a mitogenicfactor for different types of tumor populations that ex-press plasma membrane suiface receptors for this factor(HGF-R) (13,19), stimulating their proliferation throughmechanisms including activation of the phosphatidylino-sitol3-kinase pathway (P/3-kinase) (20).

Authors such as Jiang et al. have reported that certaintumor cells, in addition to expressing HGF-R, are capa-

REY Esp ENFERM DIG 2003; 95(11): 771-776

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