EFECTO DE LA TEMPERATURA EN PRELARVAS DE L guttatus

Efecto de diferentes dosis de GCH y OVAPRIM en el desove y efecto de la temperatura en

prelarvas del pargo manchado Lutjanus guttatus bajo condiciones de cautiverio

Elkin Javier Rodríguez Gómez

Universidad Jorge Tadeo Lozano

Facultad de Biología Marina

Santa Marta, Colombia

2005

1







2005

2




Tesis de grado para optar al titulo de

Biólogo Marino

Director de tesis:

M.Sc. Jorge Boza Abarca

Coordinador Laboratorio de Peces Marinos

Estación de Biología Marina

Universidad Nacional

Puntarenas, Costa Rica




2005

3

Nota de aceptación

_________________________________

_________________________________

_________________________________

_________________________________ Presidente del jurado

__________________________________

Jurado

__________________________________ Jurado

Bogotá ___________________

4

A mis padres

y mi hermana

con todo mí

amor.

5

CONTENIDO

pag.

INTRODUCCIÓN 1. MANEJO DE REPRODUCTORES, INDUCCIÓN Y DESOVE 11 1.1 OBTENCION DE LOS REPRODUCTORES 13 1.2 INDUCCIÓN 14 1.3 RECOLECCIÓN Y CONTEO DE LOS HUEVOS 15 2. EFECTO DE GCH y OVAPRIM Y OPTIMIZACIÓN DE LA DOSIS DE GCH EN L. guttatus 17 2.1 SELECCION DE HORMONA 19 2.1.1 Procedimiento 19 2.1.2 Resultados. 21 2.2 OPTIMIZACIÓN DE LA DOSIS DE GCH EN L. guttatus 26 2.2.1 Procedimiento 26 2.2.2 Resultados 27 2.3 DISCUSIÓN 33 3. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN PRELARVAS DE L. guttatus 37 3.1 PROCEDIMIENTO 39

6

3.2 RESULTADOS 42 3.3 DISCUSIÓN 50 4. CONCLUSIONES 54 BIBLIOGRAFÍA 56

ANEXOS 60

7

LISTA DE TABLAS

pag.

Tabla 1. Diferentes tipos y dosis de hormonas usadas en trabajos realizados

en especies de la familia Lutjanidae.

18

Tabla 2. Dosis utilizada en cada uno de los tratamientos del experimento de

selección de hormona.

19

Tabla 3. Peso, desoves, tiempo desde la inducción hasta el desove y

porcentaje de fertilización para las hembras de L. guttatus usadas en el

experimento de selección de hormona. 21

Tabla 4. Diámetros de los oocitos a las 0, 24 y 48 horas e incremento del

diámetro para hembras de L. guttatus, en cada uno de los tratamientos

en el experimento de selección de hormona. 23

Tabla 5. Tratamientos y diferentes dosis de GCH usadas en el experimento

de optimización. 26

Tabla 6. Peso, desoves, tiempo desde la inducción hasta el desove y

porcentaje de fertilización para las hembras L. guttatus usadas el

experimento de optimización de GCH. 28

8

Tabla 7. Diámetros de los oocitos a las 0, 24 y 48 horas e incremento del

diámetro a las 0, 24 y 48 horas para hembras de L. guttatus, en cada

uno de los tratamientos en el experimento de optimización. 29

Tabla 8. Diferentes parámetros fisicoquímicos monitoreados durante el

experimento de temperatura en prelarvas de L guttatus.

43

Tabla 9. Estimación de la longitud el y volumen del vítelo en prelarvas de

L. guttatus 44

9

LISTA DE FIGURAS

pag.

Figura 1: Adulto sexualmente maduro de L. guttatus 13

Figura 2. Vista aérea de la parte media del Golfo de Nicoya, mostrando

el recorrido realizado para el traslado de los reproductores. 14

Figura 3. Esquema del sistema de recolección de huevos usado durante el

desarrollo de los experimentos. 15

Figura 4: Diámetros promedio de los oocitos tomados de las hembras tratadas

con diluyente, GCH, OVAPRIM 0.7 y OVAPRIM 1.0, al iniciar el

experimento, 24 y 48 horas después de la primera inyección. 22

Figura 5: Porcentaje de los estados de maduración de los oocitos de las muestras

tomadas para los tratamientos de diluyente, GCH, OVAPRIM 0.7 y

OVAPRIM 1.0 al iniciar el experimento, 24 y 48 horas después de la primera

inyección. 24

Figura 6: Distribución de frecuencias de los diámetros de los oocitos en

los tratamientos de diluyente, GCH, OVAPRIM 0.7 y OVAPRIM 1.0 al

inicio, 24 y 48 horas luego de la primera inyección. 25

Figura 7: Diámetros promedio de los oocitos en cada tratamiento, al iniciar,

24 y 48 horas después de comenzar el experimento de optimización de la dosis

de GCH. 29

10

Figura 8: Porcentaje de los estados de maduración de los oocitos las muestras

tomadas para los tratamientos A, B, C y D, al iniciar el experimento , 24 y 48

horas después de comenzar el experimento de optimización de la dosis de GCH. 31

Figura 9: Distribución de frecuencias de los diámetros de los oocitos en

los tratamientos A , B , C y D al inicio, 24 y 48 horas después de comenzar el

experimento de optimización de la dosis de GCH. 32

Figura 10: Montaje utilizado para evaluar el efecto de la temperatura en las

prelarvas de L. guttatus 40

Figura 11: Medidas morfológicas estimadas en la prelarva de L. guttatus . 41

Figura 12. Cambios en la longitud total de las prelarvas y el volumen del vitelo

durante las primeras 60 horas luego de la eclosión. 45

Figura 13. Porcentajes de sobrevivencia en prelarvas de L. guttatus 60 horas

después del comienzo del experimento. 46

Figura 14. Fotografías de prelarvas de L. guttatus a 22 ºC, 25 ºC y 28 ºC 47

tomadas 12, 48 y 60 horas luego de la eclosión.

Figura 15: Prelarva de L. guttatus mantenida a 28 ºC luego de haber sido capturada 48

para su observación.

Figura 16: Regresión lineal entre la longitud total y el volumen del vitelo de la

prelarva para los tratamientos de 22 ºC, 25 ºC y 28 ºC. 49

11

AGRADECIMIENTOS

Extiendo un especial agradecimiento a:

M.Sc. Jorge Boza Abarca, Coordinador Laboratorio de Peces Marinos de la Estación de

Biología Marina -Universidad Nacional, por su constante orientación y motivación.

Bióloga Marina Patricia Rincón por su incondicional ayuda en el desarrollo de este

proyecto.

12

INTRODUCCIÓN

La actividad pesquera ha disminuido su tasa de crecimiento en el transcurso de los últimos

años, debido tanto a fenómenos atmosféricos, como a que las diferentes poblaciones de

interés comercial están llegando a su límite máximo de explotación, reduciéndose así sus

capturas. Las especies de importancia comercial a escala mundial con mayores

disminuciones fueron la Anchoveta (Engraulis sp, 78 % menos), el jurel chileno

(Trachurus murphyi, 44 % menos), El capelan (Mallotus villosus, 38 % menos), la pota

japonesa (Todarores pacificus, 37 % menos), La pota argentina (Illex argentinus, 33 %

menos), El jurel del Atlántico (Trachurus sp, 22 % menos) y el Estornino (Scomber

japonicus, 21 % menos). Aunque el crecimiento de las pesquerías en la última década ha

sido ínfimo, sigue mostrando los mayores niveles de producción, alcanzando para 1999

92.3 millones de toneladas, contra 32.9 millones de toneladas provenientes de la

acuicultura (FAO, 2000).

La acuicultura ha elevado su producción, generando gran cantidad de empleos, alimentos y

proteína de primera calidad, lo que se refleja en una rápida expansión de este sector, ya que

desde 1984 la tasa media de crecimiento de la acuicultura ha sido del 10 %, cifra que

sobrepasa ampliamente el 1.6 % de crecimiento de las pesquerías (Rana and Immink,

2000). Así mismo, la mayor parte de la acuicultura se ha desarrollado en agua continental,

alcanzando el 58.7 % de la producción total, siendo los mayores productores los países

asiáticos y en las especies de la familia Ciprinidae. La acuicultura en aguas salobres ocupa

un 35 % de la producción mundial, siendo el langostino tigre la especie más

comercializada, mientras el ambiente menos representativo es el marino con un 6. 3 % de

la producción acuícola total (FAO, 2000).

13

Aunque la producción acuícola marina este representada en tan baja proporción, los altos

precios en sus productos han provocado que el cultivo de peces marinos aumente su

producción en los últimos años (Rana and Immink, 2000). Algunos peces marinos de

importancia en la maricultura son él sea bream (Pagrus pagrus), mandarin fish

(Synchiropus splendidus), y Sea Bass (Epinephelus sp), que para 1996 sumaban una

producción de 629,078 toneladas, aproximadamente el 3.77 % del total de la producción

acuícola en peces (New, 1999).

De los países latinoamericanos, Chile se encuentra como el mayor productor con

323,115 toneladas por año, de las cuales el 61.6 % corresponde al cultivo de salmónidos.

Luego de Chile se encuentra Ecuador que basa su producción en el cultivo extensivo del

camarón (99 %), seguido por México, Brasil y Colombia (New, 1999). La piscicultura

marina en Latinoamérica es muy reducida, destacándose República Dominicana y Chile,

siendo este último, un importante productor de lenguado.

Costa Rica es el noveno productor acuícola a nivel Latinoamericano. Sus cultivos más

importantes son la tilapia y el camarón con un 70.6 % y 26.4 % de la producción acuícola

nacional que sumó para 1999 un total de 9,324 toneladas métricas (Incopesca, 1999).

En Costa Rica, de sus dos costas, la mas explotada es la costa Pacífica, que por su alta

productividad y amplia plataforma continental concentra el 98 % de la captura, siendo el

núcleo pesquero más importante el Golfo de Nicoya, donde se capturan el 50 % de los

peces marinos y mariscos a nivel Nacional (FID/CP/COS, 1996). Dentro del Golfo de

Nicoya las especies que sostienen la pesca artesanal son principalmente dos: En la parte

media e interna del golfo la corvina aguada (Cynoscion squamipinnis) y en la parte

externa el pargo mancha (Lutjanus guttatus), siendo este último una de las especies más

importantes en el litoral pacífico. Para L. guttatus se reportó un total de 62 toneladas por su

captura en 1996, pero esta se vió disminuida en un 10 % en comparación con 1994, al

igual que sus tallas medias de captura (38 cm y 43 cm, respectivamente), lo que indica que

14

el esfuerzo pesquero sobre esta población es excesivo y que se requiere de un manejo

apropiado para hacer sostenible su explotación y protección (Vargas, 1999).

L. guttatus habita fondos duros alrededor de áreas de arrecife. Son generalmente

solitarios, aunque ocasionalmente pueden formar grandes escuelas. Los juveniles habitan

en estuarios y bocas de los ríos. Son carnívoros, se alimentan de invertebrados y otros

peces (Fisher et al.,1995). Por su alto valor comercial, facilidad de manipulación,

aceptabilidad de alimento artificial y reproducción en cautiverio, L. guttatus es

potencialmente viable para la producción en medios de cultivo (Olivares y Boza, 1999).

Hasta el momento en cautiverio se ha logrado la inducción al desove, la reproducción y el

levante de la especie, pero con muy bajas tasas de sobrevivencia. (Valverde y Boza, 1999;

Olivares y Boza, 1999). Estas bajas tasas pueden ser atribuidas a la calidad de los productos

sexuales, factores ambientales y nutricionales que afectan el crecimiento larval y la

sobrevivencia (Keembiyehetty and Wilson, 1998; Tucker, 1998; Silva, 1999; Bargarinao,

1986. En: Koven et al.1999).

En un inicio la inducción al desove en pargo manchado se realizó mediante el uso de SPC

(Suspensión de pituitaria de carpa) (Valverde y Boza, 1999). Aunque los resultados fueron

satisfactorios se dejó de utilizar por dos razones: no saber exactamente el contenido de

GtH en el macerado y por la existencia de otras hormonas sintéticas que llevan al mismo

propósito conociendo la cantidad suministrada. Por esta razón, se comenzó a utilizar el

análogo sintético GCH (Gonadotropina corinonica humana). Como en la literatura se

encuentran diferentes tipos de hormonas usadas y las concentraciones varían desde unas

pocas unidades internacionales hasta miles y con el fin de mejorar los resultados hasta

ahora obtenidos, se planteó el determinar el efecto de las hormonas GCH y OVAPRIM.

Además, se probó si otras concentraciones de GCH (Según las dosis iniciadora y

definitoria) podrían mejorar los resultados hasta ahora obtenidos.

15

La temperatura influye en la tasa metabólica (mantenimiento y metabolismo de

crecimiento) en embriones y larvas de peces (Kinne, 1963, En: Bermudes y Ritar, 1999),

debido a que es uno de los factores que más varían durante los diferentes períodos de

tiempo en tanques de cultivo, exponiendo a las larvas a condiciones extremas de

temperatura (Keembiyehetty and Wilson, 1998). Esta exposición puede ocasionar desde

una absorción muy rápida del vitelo, que trae consigo deficiencias en las reservas

energéticas de la larva, hasta una demora en el desarrollo, lo que conlleva a un aumento en

la probabilidad de contraer enfermedades por parte de la larva (Tucker, 1998). Con el fin de

definir un rango de temperatura que beneficie la sobrevivencia larval en sus primeros días,

se realizó un experimento variando la temperatura del agua, mientras, las demás variables

se mantenían constantes, y se observó las diferencias en sobrevivencia entre las diferentes

temperaturas.

Esta investigación fue desarrollada en la Estación de Biología Marina (Escuela de Ciencias

Biológicas), en el área de maricultura bajo la tutoría y responsabilidad del profesor M. Sc.

Jorge Boza Abarca, cuya investigación es financiada por el Programa UNA-LUW,

convenio entre la Universidad Nacional y la Universidad Agrícola de Wageningen,

Holanda.

16

1. MANEJO DE REPRODUCTORES, INDUCCIÓN Y DESOVE

Los reproductores que son utilizados en experimentos de inducción al desove y larvicultura

pueden tener dos orígenes: capturados del medio natural, ya sea adultos o juveniles, o

criados desde larvas, para su posterior utilización. Cuando son capturados adultos,

dependiendo de la profundidad a la cual se encuentren, es necesario insertar una aguja en la

cavidad abdominal del pez para eliminar el exceso de gases de la vejiga natatoria. En el

caso que sean juveniles, ya sea salvajes o provenientes de un cultivo, los peces son

mantenidos en jaulas flotantes hasta que alcancen la talla mínima de madurez (Tucker,

1998). Dentro de los trabajos de maricultura desarrollados en la familia Lutjanidae, han

sido utilizados como reproductores a juveniles recolectados en zonas de manglar y luego

levantados en tanques de concreto (Emata et al., 1999; Watanabe et al., 1998), de tierra

(Singhagraiwan and Doi, 1993), mixtos (Rosas et al., 1998) o en jaulas flotantes

(Chaitanawisuti and Piyatiratitivorakul, 1994; Olivares y Boza, 1999). También han sido

utilizados peces adultos capturados con anzuelo (Davis and West, 1993; Valverde y Boza,

1999; Boza et al., 2005).

El adecuado control de la maduración sexual y el desove es un punto de interés primario

para la reproducción de peces. Inicialmente, se estudió cuáles factores estimulaban a las

diferentes especies a madurar sus productos sexuales y el disparador que provocaba el

desove. Como resultado, se encontró que la temperatura del agua, el fotoperíodo y las

estaciones controlaban los ritmos biológicos que influyen en la maduración sexual. De esta

manera, se comenzó a inducir a los peces a reproducirse, imitando las condiciones

ambientales de las que dependía este proceso, pero, debido a que algunas especies solo

lograban madurar sus gónadas, más no desovar, y a la necesidad de aumentar el número de

larvas obtenidas en laboratorio, se comenzó a estudiar la fisiología del desarrollo gonadal,

encontrando las hormonas responsables de la maduración e inductoras del desove. Desde

17

hace 60 años se han utilizado diferentes preparaciones hormonales, con las cuales se ha

logrado optimizar la reproducción en cautiverio de peces (Bromage and Roberts, 1995).

La hormona que controla la maduración sexual es la gonadotropina (GtH), la cual se

produce en la hipófisis (Pituitaria). Para provocar su liberación es necesario que las

hormonas llamadas liberadora de la gonadotropina (GnRH) y la dopamina, una hormona

liberadora-inhibitoria, sean producidas en el hipotálamo. Así, en algunos peces como

ciprínidos y el pez gato (catfish) los investigadores utilizan métodos de inducción

aplicando una mezcla de GnRH con un antagónico de la dopamina como el domperidon o

pimozide ( Peter et al. 1988., En: Bromage and Roberts, 1995).

Una vez que se ha obtenido el desove, se debe realizar la colecta de los huevos. Este

proceso es de gran importancia ya que dependiendo de cuando se realice, se aumenta o

reduce el porcentaje de eclosión y de prelarvas sanas. Durante el desarrollo embrionario de

los peces se reconocen diferentes etapas, cada una de las cuales presenta una mayor o

menor resistencia a la manipulación. En los primeros clivajes, donde aún no hay una

diferenciación celular, el huevo tiene la capacidad de sustituir cualquier célula que salga

dañada durante la manipulación, sin perjudicar el desarrollo normal de cualquier estructura

u órgano. Al completar la neurulación, y de ahí en adelante, los huevos son muy resistentes

al manejo, sobre todo cuando llegan a la forma C, donde es apreciable un embrión con

todas las características de la prelarva, pero rodeando el vitelo (Caberoy and Quinitio,

1998).

Debido a que el intervalo de tiempo entre el estado de C y la eclosión del huevo es muy

pequeño la recolección se realizó unas horas antes (En el momento en que el corazón del

embrión comienza a latir) ya que es muy probable que comience la eclosión antes de

terminar de concentrar todos los huevos, perdiendo de esta manera información importante

como el porcentaje de fertilización y el número total de huevos, además de dañar a las

prelarvas ya que éstas son mas sensibles al perder la protección del corion (Hilomen-

García, 1998; Tucker, 1998).

18

1.1 OBTENCIÓN DE LOS REPRODUCTORES

Para el desarrollo del presente trabajo se usaron L. guttatus salvajes juveniles colectados

con trampas por pescadores artesanales, en zonas de manglar del Golfo de Nicoya. Estos

peces se mantuvieron en jaulas flotantes con una dieta de alimento para trucha (38% de

proteína), y se utilizaron una vez que alcanzaron su madurez sexual (alrededor de 500

gramos), aproximadamente 12 meses después de la captura (Figura 1).

Figura 1: Adulto sexualmente maduro de L. guttatus

Para cada experimento, los reproductores de pargo manchado se trasladaron desde Punta

Cuchillo (Figura 2 B), ubicada en el margen occidental del Golfo de Nicoya, al laboratorio

de la Estación de Biología Marina (figura 2 A), por vía marítima y terrestre durante un

período aproximado de una hora, tiempo durante el cual los peces se mantuvieron en un

contenedor de 75 litros con aireación constante y sin luz para reducir el efecto de estrés.

Cada reproductor se anestesió (MS-222, me lfato, diluido en agua de mar), se sexó

en adelante), edad (un año en

cautiverio), calidad de huevos en las hembras (se usa una cánula de 0.5 mm de diámetro

tasu

(presión abdominal en donde la presencia de fluido ovárico o semen indica el sexo del

ndividuo) y seleccionó de acuerdo a su peso (500 gr. i

19

para extraer una muestra de huevos) y la cantidad de semen en los machos (abundancia de

semen como respuesta a la presión abdominal) (Álvarez-Lajonchere y O. Hernández,1994).

Figura 2: Vista aérea de la parte media del Golfo de Nicoya, mostrando el recorrido realiza traslado de los reproductores La línea muestra el recorrido realizado con los reproductores desde Punta Cuchillo (B), hasta la Estación de Biología Marina (A) en Puntarenas.

Punta Cuchillo

Puntarenas

Isla San Lucas

Costa Rica G. Nicoya

1.2 INDUCCIÖN

Los reproductores de L. guttatus fueron sedados para facilitar la manipulación durante el

ismo tiempo que la segunda inyección

bras.

proceso de inducción. Las hembras se pesaron (± 1 gramo) e inyectaron por detrás de la

base de la aleta dorsal con el tipo y cantidad de hormona correspondiente al experimento en

curso y en dos dosis, con intervalos de 24 horas entre cada una. A los machos se les

administró una dosis única de 250 U.I. de GCH, al m

de las hem

20

Durante y después del proceso de inducción, los reproductores se mantuvieron en tanques

.3 RECOLECCIÓN Y CONTEO DE LOS HUEVOS

cilíndricos de fondo plano de 2.5 toneladas, en proporción de dos machos por hembra con

aireación y con recambio solo hasta el momento de aplicar la segunda dosis de hormona

para evitar la perdida de los huevos por el rebalse.

1

l tanque de E desove se encontraba unido al sistema de recolección (tanque de 250 litros)

or medio de una salida lateral a la altura del máximo nivel de agua, por medio de un tubo,

el agua caía en un colector de huevos, provisto de ventanas laterales y fondo en malla de

300 µm (Figura 3).

p

Figura 3: Esquema del sistema de recolección de huevos usado durante el desarrollo de los experimentos.

r

Huevos

Agua de mar Salida lateral

s

Al mar

Una vez c

contenedor

objetivo de

estén en la

fueron con

viables, lo

Colecto

onfirmado el desove, se inició

ealizó homogeneizando el tota

(1000- 2000 ml), tomando cinco m

el recam

colectar los huevos. La característica

s aguas superficiales del tanque y sean d

centrados en un volumen conocido de

cual se r

21

Reproductore

q d con el

l de huevos en la columna de agua de un

uestras de 1 ml con pipetas pasteur y

bio de agua del tan ue de esove

boyante de los huevos permite que estos

epositados en el colector. Una vez allí, lo

agua para estimar el número de huevos

contabilizando la cantidad de huevos viables y no viables. Los huevos viables se

caracterizan por ser transparentes con un embrión bien definido y la presencia de la gota de

aceite, mientras los huevos no viables están caracterizados por presentar un color

blanquecino. Estos últimos también fueron contados para así determinar el porcentaje de

fertilización de la siguiente manera:

% Fertilización = # huevos viables ×100 # total de huevos

Luego de contados, los huevos fueron lavados con agua de mar tratada y filtrada a 1 µm.

Luego se depositaron en un tanque de eclosión sin recambio y aireación moderada. Después

de la eclosión se sifoneó el fondo del tanque ucho cuidado con el fin de eliminar los

restos de corion.

con m

22

2. EFECTO DE GCH Y OVAPRIM Y OPTIMIZACIÓN DE LA DOSIS DE GCH

EN L. guttatus

Los trabajos de maricultura se han enfocado hacia el desarrollo de nuevas y mejores

técnicas de inducción a la maduración final y al desove teniendo como base el

conocimiento del mecanismo hormonal de maduración sexual. Debido a la necesidad de

aumentar la disponibilidad de larvas para la producción de peces marinos en cautiverio, en

las últimas décadas se han usado hormonas de origen natural extraídas de otros animales,

demás, de la creación de análogos sintéticos de las hormonas que naturalmente trabajan

actos de pituitaria, los cuales

enen resultados positivos, aunque es difícil su obtención y la concentración de la hormona

que en otras solo un porcentaje de las hembras responde a

inducción. Además, produce sobrehidratación de los huevos cuando la dosis es

liberad la gonad HRHa / G con excelentes resul n especies

s d jores r on los s. Algunos

tratamientos de inducción combin la dop domperidon

(Bromage nd Roberts

Dent ilia Lu idae se abajos de sando

diferentes hormonas y . La tab es d que han sido

sadas con el fin de inducir la maduración final y el desove.

a

sobre las especies (New, 1999).

Un método de inducción muy común es la inyección de extr

ti

es desconocida (Tucker, 1998). Una de las hormonas más utilizadas para la inducción en

peces es la gonadotropina coriónica humana (GCH), con la cual se han dado resultados

exitosos en muchas especies, aun

la

demasiado alta. Actualmente es común el uso de análogos sintéticos de la hormona

ora de otropina L nRHa tados e

ubtropicales, logran o me esultados que c métodos anteriore

an análogos de amina como el

a , 1995).

ro de la fam tjan han realizado tr inducción al desove u

dosis la 1 muestra diferent osis y hormonas

u

En la hembra, la GCH se utiliza para estimular la maduración final de los huevos y el

desove. En el macho, la GCH estimula la producción de testosterona e influye en la

cantidad de esperma disponible.

23

Tabla 1. Diferentes tipos y dosis hormonales en trabajos realizados en especies de la familia Lutjanidae.

Especie Hormona Dosis Autor

L. argentimaculatus GCH 1500 U.I. / Kg P.C Emata et al. (1994) GCH 1000 U.I. / Kg P.C Emata et al. (1999) LHRHa 100µg / Kg P.C Gonatropin 300 – 600 U.I. Singhagraiwan and Doi (1993)

L. linnaeus GCH 1000 - 6300 U.I. / Kg P.C Rosas et al. (1998)L. analis GCH 500 + 1000 U.I. / Kg P.C Watanabe et al. (1998)

L. guttatus EPC 800 U.I. / Kg P.C Valverde y Boza (1999).GCH 900 + 900 U.I. / Kg P.C Boza et al. (2005)

Los resultados de los experimentos realizados anteriormente en la Estación de Biología

de 900 U.I. / Kg. del peso corporal (P.C) provocan

l desove. Sin embargo la sobrevivencia de las larvas es muy baja después de 5 días. Con

s

comendadas por la Empresa productora Syndel Ltda. en salmonidos. Además, con el fin

uevos de la hembra, y consecuentemente, una baja sobrevivencia de las larvas, debido a la

ar un experimento variando las concentraciones

con el fin de determ nor concentración de

producir mejores resultados.

.1 SELECCIÓN DE LA HORMONA

Marina indican que dos dosis parciales

e

el fin de determinar si el uso de otra hormona puede mejorar los resultados obtenidos con

la GCH se realizó un experimento comparando el análogo de la hormona liberadora de la

gonadotropina (GnRH) con la GCH. Los nombres comerciales de las hormonas utilizadas

fueron OVAPRIM (GnRHa + domperidon) y CHORULON (GtH). Las dosis de

OVAPRIM que se usaron en el experimento fueron tomadas a partir de las dosi

re

de determinar si la dosis de 900 UI GCH/ Kg. P.C provoca una sobrehidratación en los

h

agresividad de la GCH, se planteó el realiz

de las dosis parciales de GCH inar si una me

hormona podría

2

2.1.1 Procedimiento. El diseño experimental utilizado incluyó los siguientes tratamientos.

Un tratamiento de 900 + 900 UI / Kg. P.C. de GCH (Control positivo). Dos tratamientos de

OVAPRIM: 0.35 + 0.35 ml / Kg. P.C y 0.50 + 0.50 ml / Kg. P.C. Como control negativo

24

se usó una doble dosis 0.5 ml de diluyente sin hormona / Kg. P.C. Cada uno de los

tratamientos se realizó por triplicado (tres hembras y sus respectivos machos) ( Tabla 2).

Tabla 2. Dosis utiliz e s trata ón de hormona Tratamiento Dosis

ada en cada uno d lo mientos del experimento de selecci

Diluyente de GCH ( Control negativo) 0.5 + 0.5 ml de diluyente de GCH

GCH (Control positivo)

OVAPRIM 0.70 .C

OVAPRIM 1.0 0.50 + 0.50 ml/ Kg. P.C

900 + 900 UI/ Kg. P.C.

0.35 + 0.35 ml/ Kg. P

Una vez que las hembras y los machos fueron trasladados a la Estación de Biología Marina

(según procedimiento en capítulo 1), se asignaron al azar en cada tratamiento, al igual que

los machos. Cada hembra se anestesió y se le tomó una muestra de oocitos (n =50) por

medio de una cánula de polietileno, la cual fue analizada en cuanto a diámetro de oocitos

y estados de madurez según la metodología utilizada por Rodríguez (1992) en donde:

Estado uno El núcleo se ubica en el centro

Estado dos El núcleo empieza a migrar

Estado tres El núcleo esta en posición periférica

Estado cuatro El núcleo esta en su polo animal y se ha

tre el intervalo de las 24

oras a las 48 se controló cada hora la ocurrencia del desove en los tanques mediante la

diluido su membrana.

Luego las hembras se pesaron en una balanza semi-analítica (Denver Instrumental

Company 8K, ± 0.01), se calculó la cantidad de hormona necesaria y se inyectó, a cada

una, con una dosis parcial dependiendo del tratamiento; a las 24 horas de tratamiento, las

hembras fueron anestesiadas y se les extrajo otra muestra de oocitos (n = 50),

aplicándoles inmediatamente la segunda dosis de hormona. En

h

toma de una muestra de agua de la superficie de cada tanque. Luego del desove se

contaron los huevos y se estimó el porcentaje de huevos fertilizados. Después de las 48

25

horas, luego de comenzado el experimento, se tomó una muestra de oocitos de cada hembra

y se analizó de la misma manera que las anteriores.

Las hormonas que se utilizaron en el experimento fueron la GCH (CHORULON) y la

nRHa+domperidon (OVAPRIM). El CHORULON® (Intervet International) es una

licoproteína compleja, que se prepara disolviendo un polvo liofilizado que contiene la

CH en una concentración de 1500 U.I.. en 1.5 ml de una solución estéril de

aH2PO4/Na2HPO4. OVAPRIM ® (Laboratorios Syndel Ltd.) es un agente liquido muy

otente para lograr la ovulación. Contiene como principios activos (D-Arg6,Pro9-NEt)

nRH, Domperidon, y propilen glicol como solvente primario.

os promedios del diámetro de los oocitos fueron analizados por tratamiento por medio de

n análisis de varianza (ANDEVA) y se compararon por medio de una prueba de Tuckey.

ambién se realizó un análisis de distribución de frecuencias del diámetro de los oocitos.

os estados de madurez se expresaron como porcentajes para cada uno de los tratamientos

fueron comparados gráficamente.

G

g

G

N

p

G

L

u

T

L

y

26

2.1.2 Resultados. La bra s ut ri entre

los 487 y 1067 gramo u o para todos los tratam .0 gr. ±

151.2 gr. Con respecto al resultado de la inducción se dieron desoves en por lo menos una

hembra, exceptuando el control negativo (diluyente). Solo las hembras inducidas con GCH,

desovaron las tres, siendo uno de estos desoves el único que fue fertilizado aunque en un

porcentaje muy bajo. El tiempo transcurrido desde la pri yección hasta el desove fue

de 37 a 38 horas para las hembras tratadas con GCH, m que las hemb en los dos

tratam entos con OVA desovar

Tabla 3. Peso, número de huevos desovados, tiempo desde la primera inyección hasta el desove y

porcentaje de fertilización para cada una de las hembras de L. guttatus usadas en el experimento de

elección de hormona.

Tratamiento Peso Tiempo(Horas) Número de huevos Porcentaje de

s hem s de L. guttatu ilizadas en el expe mento pesaron

ientos d 678s n, co n prom de pesedio e

mera in

ientras ras

i PRIM on después de 42 horas (Tabla 3).

s

( gr) Inducción- desove desovados fertilización Diluyente 516 N.D N.D - 708 N.D N.D - 754 N.D N.D -

GCH 538 38 130,000 0 1067 37 489,500 10 730 38 80,750 0

OVAPRIM 0.7 641 43 101,666 0 708 N.D N.D - 713 42 65,000 0

487 N.D N.D -

OVAPRIM 1.0 606 N.D N.D - 672 43 141,606 0

* N.D indica las hembras en las que no se produjo desove en el experimento.

Al iniciar el experimento los diámetros promedio de los oocitos tuvieron un rango de

variación entre 411,27 µm ± 24.9 µm y 423.21 µm ± 26.4 µm. Después de 24 horas los

oocitos de los tratamientos aumentaron su diámetro exceptuando el control negativo, siendo

los oocitos del tratamiento GCH los que obtuvieron un mayor diámetro promedio. 48 horas

27

luego de la primera inyección los oocitos de los tratamientos en los que se uso OVAPRIM

incrementaron su diámetro acercándose al diámetro de los oocitos de GCH (figura 4).

Figura 4: Diámetros promedio de los oocitos tomados de las hembras tratadas con diluyente, GCH, OVAPRIM 0.7 y OVAPRIM 1.0, al iniciar el experimento (a), 24 (b) y 48 (c) horas después de la primera inyección.

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 0 0

D i l u y e n t e H C G O V A P R I M 0 , 7 O V A P R I M 1 , 0

( a )

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 0 0

Dia

me

tro


( b )

Di

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 0 0


( c )

amet

ro (µ

m)

as 24 horas después de comenzar la inducción fue con las

embras tratadas con GCH, incrementando su diámetro en un 47 %; mientras que en el

atamiento de OVAPRIM 0.70 y OVAPRIM 0.5 los incrementos fueron de 14.1 % y

.9%, respectivamente (Figura 4). En las muestras de oocitos tomadas a las 48 horas los

* Las líneas sobre las barras indican el error estándar de cada uno de los tratamientos

El mayor diámetro promedio a l

h

tr

8

incrementos en el diámetro fueron mayores en los tratamientos en los que se usó

OVAPRIM, siendo de 19.1 % para el tratamiento de OVAPRIM 0.7 y 18.6 % para el

tratamiento de OVAPRIM 1.0.

28

El incremento de diámetro en el tratamiento GCH fue de solo un 0.5 %, a las 48 horas

(626,81 µm ± 213,00 µm) superando en un 11% el diámetro del tratamiento de OVAPRIM

.7 y en un 15 % el tratamiento de OVAPRIM 1.0 (Tabla 4).

Tabla 4. Diámetros de los oocitos a las 0 horas, 24 horas y 48 horas e incremento ra hembras de L. guttatus, en cada uno de los tratamientos. Los datos de diámetro a 0 horas, 24 horas y ego de ecció sados y d ion ue fu btenidas de edid e las 0 hue or hede cada uno de los tratamientos. Letras diferent entre los tra 05

os de maduración (En el tratamiento de GCH), siendo los estadios

e maduración 1 y 4 los más altos con un 29 % cada uno, seguido por el estadio 3 con un

4 % y finalmente con un 12 % el estadio 2. En las muestras de las hembras de OVAPRIM

.7 el porcentaje de oocitos que cambiaron su estado de maduración fue de 44 %, en su

0

del diámetro pa

48 horas lu la primera iny n están expre en medias esviac es qeron o los huevos m os en cada una d tres hembras (5 vos p mbra)

es indican diferencias significativas tamientos (P<0. ).

Los estados de maduración de los oocitos cambiaron de manera significativa en todos los

tratamientos exceptuando el control negativo, en el cual la mayor parte de los huevos se

encontraban en estado uno. A las 24 horas después de la primera inyección se observaron

oocitos en todos los estad

Tratamiento Diámetro 0 horas (µm)

Diámetro 24 horas (µm)

Diámetro 48 horas (µm)

Incremento en el Diámetro (%) 24 H 48 H

Diluyente 411.2 ± 24.9 a 406.8 ± 25.4a 384.4 ± 36.7 a -1.0 -5.4GCH 423.2 ± 26.4 a 623.1 ± 140.7 c 626.8 ± 213.0 c 47.2 0.5

OVAPRIM 0.7 414.6 ± 20.8 a 473.5 ± 52.2 b 564.0 ± 144.5 b 14.1 19.1OVAPRIM 1.0 420.1 ± 24.8 a 457.9 ± 58.5b 543.3 ± 174.4b 8.9 18.6

d

2

0

mayoría a estado de maduración 2, mientras que los oocitos de las hembras de OVAPRIM

1.0 cambiaron su estado de maduración en un 61 % siendo el estado de maduración 2 un

57% del total (Figura 5).

29

Transcurridas 48 horas de la aplicación de la primera dosis en cada tratamiento se

observaron oocitos en estado de maduración 2 con un 54 % para el tratamiento con GCH,

n 33 % para el tratamiento de OVAPRIM 1.0 y un 10 % en el tratamiento de OVAPRIM

madas para iar el experimento

.), 24 horas (b.) y 48 horas (c.) después de la primera inyección.

u

0.7 (Figura 5).

Figura 5: Porcentaje de los estados de maduración de los oocitos, según las muestras tolos tratamientos de diluyente, GCH, OVAPRIM 0.7 y OVAPRIM 1.0 al inic(a

Estado 1Estado 2Estado3Estado 4

(b.)

0

80

Diluyente HCG OVAPRIM 0,75 OVAPRIM 1,0

20

40

60

Ooc

itos e

n ca

da estad

io (

100

%)

(c.)

0

20

40

60

80

100

Diluyente HCG OVAPRIM 0,75 OVAPRIM 1,0

Estado 1 Estado 2 Estado 3 Estado 4

(a.)

80

100

IM 0,75 OVAPRIM 1,0

Ooc

i)

0

20

40

60

Diluyente HCG OVAPR

tos

en c

ada

esta

do (%

El diámetro promedio de los huevos desovados en el tratamiento GCH fue de 761.5 µm ±

21.7 µm, seguido por OVAPRIM 1.0 con un diámetro de 741.8 µm ± 56.0 µm y

finalmente OVAPRIM 0.75 con un diámetro de 596.1 µm ± 224.1 µm.

30

Al iniciar el experimento se observó una distribución unimodal en el diámetro de los

oocitos de todos los tratamientos, pero luego de la inducción fue posible apreciar una

distribución multimodal en el tratamiento GCH a las 24 y a las 48 horas y en los dos

tratamientos de OVAPRIM solo a las 48 horas (Figura 6).

Figura 6: Distribución de frecuencias de los diámetros de los oocitos en los tratamientos de

diluyente (a.), GCH (b.), OVAPRIM 0.75 (c.) y OVAPRIM 1.0 (d.). al inicio, 24 y 48 horas luego

de la primera inyección

Frecuencia01

35525490000000000000000

Frecuencia03

4154455

0

20000000000000

0

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 9600

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 9600

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 960

0

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 9600

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 9600

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 960

0330 420 510 600 690 780 870 960

10

40

50

60

20

30

0330 420 510 600 690 780 870 960

10

40

50

60

20

30

0330 420 510 600 690 780 870 960

10

40

50

60

20

30

0

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 9600

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 9600

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 960

Diametro (µm)

Fr

ecue

ncia

(b)

(a)

(c)

(d)

0 Horas 24 Horas 48 horas

31

2.2 OPTIMIZACIÓN DE LA DOSIS HORMONAL DE GCH EN L. guttatus

2.2.1 Procedimiento. Tomando en cuenta los resultados del experimento anterior, se

utili se

tomo en cuenta la d res resu dió en el experimento anterior como un

control positivo (dob 900 o de la hembra). El

experimento consisti s dos ar si un aumento o

disminución en la d inal p los desoves y en la

fertilización de los h rente izadas se encuentran

escritos en la tabla 5.

zó la hormona GCH para un experimento de optimización de la dosis hormonal y

osis que mejo ltados

le inyección de UI por kilogramo de pes

ó en variar la is de GCH para determin

osis inicial o f rovocaba una mejora en

uevos. Los dife s tratamientos y dosis util

d

Tabla 5. Tratamientos y diferentes dosis de GCH usadas en el experimento de optimización

Tratamiento Dosis

Tratamiento A 900 +900 UI GCH / Kg P.C

Tratamiento B 250 +900 UI GCH / Kg P.C

Tratamiento C 250 +750 UI GCH / Kg P.C

Tratamiento D 750 +750 UI GCH / Kg P.C

Cada uno de los tratamientos se aplicó por triplicado (tres hembras y sus respectivos

machos). Las hembras y los machos de L. guttatus usados para el desarrollo del

experimento se trajeron de Punta Cuchillo a la Estación de Biología Marina, luego se

asignaron al azar en cada tratamiento al igual que los machos. Cada hembra fue

anestesiada y se le tomó una muestra de oocitos de cada hembra (n = 50), por medio de

una cánula de polietileno, la cual fue analizada en cuanto a diámetro de oocitos y estados

de madurez según la metodología utilizada por Rodríguez (1992).

Una vez extraída la muestra se inyectó a cada hembra con una dosis parcial dependiendo

del tratamiento; a las 24 horas, las hembras fueron anestesiadas y se les extrajo otra

muestra de oocitos, aplicándoles inmediatamente la segunda dosis de hormona.

Normalmente entre el intervalo de las 24 horas a las 48 se da el desove, por lo que durante

32

este tiempo se controló cada hora, mediante la toma de una muestra de agua del tanque, si

había ocurrido el desove. Luego del desove se contaron los huevos y se estimó el

orcentaje de huevos fertilizados. Después de las 48 horas se tomó una muestra de oocitos

rencias por medio

e una prueba de Tuckey. También se realizó un análisis de distribución de frecuencias del

.2.2 Resultados.

p

de cada hembra analizándola de la misma manera que las anteriores.

Los valores promedio del diámetro de los oocitos fueron comparados entre los tratamientos

por medio de un análisis de varianza (ANDEVA) y se determinaron dife

d

diámetro de los oocitos .Los estados de madurez se expresaron como porcentajes para cada

uno de los tratamientos y fueron comparados gráficamente.

2 Los pesos de las hembras usadas para optimizar la dosis de GCH

ratamientos el número de huevos

esovados estuvo entre 7,650 y 40,800 huevos (tabla 6).

n el tratamiento B y D no se observó fertilización de los huevos en ninguna de las

solo

al 50 %, incluso en ue l un iento de

fertilización, tra e o C, uevos fueron

fertilizados, aunque en un porcentaje muy bajo (Tab

estuvieron entre 368 y 977 gr. El tiempo transcurrido desde la inducción hasta el desove

fue de entre 33 y 36 horas para las hembras del tratamiento A, mientras en los otros tres

tratamientos el tiempo transcurrido fue de entre 36 y 38 horas (Tabla 6).

Solo en los tratamientos A y C todas las hembras desovaron, aunque solo en el A , el

número de huevos sobrepaso los 100.000. En el resto de t

d

E

hembras, mientras que en los otros dos tratamientos se observó fertilización, aunque

s huevos de hembras del Tratamiento A mostraron porcentajes de fertilización superiores lo

los h vos de una de as hembras se dio

solo los h

ciento por c

de una hembra mien s qu en el tratamient

la 6).

33

Tabla 6. Pes e las he s, huevos ovados, tiempo desde la inducción hasta el desove y porcentaje de fertilización para L. gut el experimento de optimización de GCH

Trata nto Peso Tiempo(Horas) Inducción- desove

Número de huevos desovados

Porcentaje de fertilización (%)

o d mbra destatus .

mie ( gr) A 624 1 36 04000 90 741 34 1 100 539 33 163400 56

7650 0 N.D -

06633

B 526 38 26300 0 534 N.D N.D - 763 37 40800 0

C 641 38 25340 0 453 36 18334 4 564 37 16000 0

D 606 N.D N.D - 368 37 977 N.D

N.D indica a las hembras en las que no se produjo desove en el experimento

Al iniciar el experimento no hubo diferencias significativas en los diámetros de los oocitos

los tratamientos. Transcurridas 24 horas se observó un incremento en el diámetro de los

ocitos de todos los tratamientos especialmente en los tratamientos A y D. Al finalizar el

xperimento, los diámetros de los oocitos de los tratamientos se mantuvieron similares a la

l diámetro de los oocitos para el tratam m y 510.6

o

e

anterior medición exceptuando el tratamiento C, en donde fue notable el incremento del

diámetro de los oocitos (Figura 7).

E iento A estuvo entre 399.3 µm ± 40.3 µ

µm ± 57.4 µm, con un incremento en el diámetro de un 34 %, luego de 24 horas. Después

de 48 horas de la primera inyección se observó una reducción del 5% en el diámetro

promedio de los oocitos (Tabla 7).

34

Figura 7: rom s ooci a tratam inicio (c) horas después de comenzar el ex o de o n de la CH.

Diámetros p edio de lo tos en cad iento, al (a), 24 (b) y 48periment ptimizació dosis de G

( a . )

3 03 33 6 03 9 04 2 04 54 85 1 05 4 05 7 06 0

o A B T r a i e n t o D00

T r a m i e n t

00

0

t a T r a m i e n t ot a T r a t a e n t o Cm i t a m

( b

3 0 03 3 03 6 03 9 04 2 04 5 04 8 05 1 05 45 76 0

T r a t a m i e n t o A T r a t a m i e n t o B T r a t a m i e n t o C T r a t a m i e n t o D

Dia

me

tr

. )

000

( c . )

3 0 03 3 03 6 03 9 04 2 04 5 04 8 05 1 05 4 05 7 06 0 0

T r a t a m i e n t o A T r a t a m i e n t o B T r a t a m i e n t o C T r a t a m i e n t o D

Dia

met

ro (µ

rra representa el error estándar para cada media ( n = 150)

m)

1. La línea sobre la ba Tabla 7. Diámetros de los oocitos a las 0 horas, 24 horas y 48 horas e incremento del diámetro en L. guttatus, en cada uno de los tratamientos y dosis usadas. Los datos de diámetro a 0 horas, 24 horas y 48 horas luego de la primera inyección están expresados en medias y desviaciones estándar que fueron obtenidas de los huevos medidos en cada una de las tres hembras (50 huevos por hembra) de cada uno de los tratamientos. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos (P<0.05).

Tratamiento

Diámetro 0 h (µm)

Diámetro 24 h (µm)

Diámetro 48 h (µm)

Incremento (%) 24 H 48H

A 399.3 ± 40.3

a537.13± 87.5

c510.6 ± 57.4

b 34.0 -5.0

B 401.9 ± 49.3 a

456.6±98.2 a

454 ± 75.9 a 13.0 -0.4

C 410.6 ± 25.7

a486.51 ± 51.1

b566.9 ± 258.0

c 18.0 24.0

D 412.1 ± 36.8 a

523.9 ± 136 c

541.8 ± 161.0 bc 27.0 3.0

35

Para el tratamiento B el diámetro de los oocitos fue de 401.9 µm ± 49.3 µm

incrementándose en un 13 %, 24 horas luego de la primera inyección, en donde el

iámetro promedio fue de 456.6 µm ± 98.2 µm. Despues de 48 horas, luego de la primera

o en un 18 %, despues de 24 horas. A las 48 horas de

aber comenzado el experimento el diámetro promedio los oocitos fue de 566.9 µm ± 258

m, 24 % más grandes con respecto a la estimación realizada 24 horas antes (Tabla 7).

l diámetro de los oocitos del tratamiento D fue de 412.1 µm ± 36.8 µm al comenzar el

xperimento, incrementándose luego de 24 horas en un 27 % con un diámetro de 523.9 µm

n cuanto a la madurez de los oocitos antes de la primera inyección fueron en su mayoría

de estado uno en los cuatro tratamientos, y los porcentajes de oocitos en estados de

madurez dos y tres no superaron el 6% en ninguno de los tratamientos (Figura 8).

A las 24 horas de la primera inyección se dió una reducción del porcentaje de oocitos en

estado uno en todos los tratamientos; en el tratamiento A el 70 % de los oocitos observados

estaban en otros estados de maduración, mientras en el tratamiento B los estados de

maduración diferentes l uno representaron el 25 %, en el tratamiento C el 39 % y en el

tratamiento D el 40 % (Figura 8).

d

inyección, el diámetro promedio de los oocitos se redujo en un 0.4 % siendo promedio de

454 µm ± 75.9 µm (Tabla 7).

Los oocitos del tratamiento C tuvieron un diámetro promedio al iniciar el experimento de

410.6 µm ± 25.7 µm, aumentand

h

µ

E

e

± 136 µm. Al final del experimento el diámetro de los huevos fue de 541.8 µm ± 161 µm. E

36

Figura 8: Porcentaje de los estados de maduración de los oocitos las muestras tomadas para los tratamientos A, B, C y D, al iniciar el experimento (a.), 24 horas (b.) y 48 horas (c.) después de la primera inyección.

(a.)

0

20

40

60

80

100

Tratamiento A Tratamiento B Tratamiento C Tratamiento D

(b.)

0

20

40

60

80

100


Porc

enta

je (%

)

(c.)

0

20

40

60

80

100


Estado 1 Estado 2 Estado 3 Estado 4

Al finalizar el experimento, 48 horas después de la primera inyección, el estado de

maduración uno volvió a ser el más representativo en todos los tratamientos superando el

75 % del total de oocitos observados, exceptuando C en el cual se observó un porcentaje de

oocitos en estado cuatro del 30 % y del 66 % en estado uno. Los estados de maduración dos

tres no sobrepasaron el 10 % en ninguno de los tratamientos (Figura 8). y

37

Figura 9: Distribución de frecuencias de los diámetros de los oocitos en los tratamientos A (a), B

), C (c) y D (d) al inicio, 24 y 48 horas luego de la primera inyección (b

0

10

20

30

40

330 420 510 600 690 780 870 960

50

60

0

10

20

30

40

330 420 510 600 690 780 870 960

50

60

0

10

20

30

40

330 420 510 600 690 780 870 960

50

60

0

10

20

30

40

50

330 420 510 600 690 780 870 960

60

0

10

20

30

40

50

330 420 510 600 690 780 870 960

60

0

10

20

30

40

50

330 420 510 600 690 780 870 960

60

0

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 9600

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 960

0

10

20

30

40

50

60

330 420 510 600 690 780 870 960

0

10

20

30

40

50

330 420 510 600 690 780 870 960

60

0

10

20

30

40

50

330 420 510 600 690 780 870 960

60

0

10

20

30

40

50

330 420 510 600 690 780 870 960

60

Fr

ecue

ncia

0 Horas 24 Horas 48 horas

(a)

(c)

(b)

(d)

Diametro (µm)

Al iniciar el experimento se observó una distribución unimodal en el diámetro de los

oocitos de todos los tratamientos, pero luego de la inducción fue posible apreciar una

distribución multimodal en los tratamientos A, B y D (Figura 9).

38

2.3 DISCUSIÓN.

entre 180 y 830 gramos al igual que Millares et al.

979 En: Rosas et al. 1998) en hembras de L. synagris de pesos de entre 200 y 400 gr.

en

tras especies de la misma familia el diámetro de los oocitos presenta una distribución

Durante el desarrollo del experimento no se observó relación entre el peso de las hembras

y el tamaño del desove, es decir que al inducir, el número de huevos dependió

directamente de la capacidad de la hormona inductora y su concentración para provocar la

maduración final de los oocitos. Se ha comprobado en estudios anteriores que el tipo y

cantidad de hormona utilizada en la inducción afecta el tamaño del desove y el diámetro de

los huevos (Tucker, 1998). González et al. (1978, En: Rosas et al. 1998), produjo desoves

positivos con hembras de L. griseus

(1

Rosas et al. (1998), obtuvo desoves en hembras de L. griseus de entre 330 y 1150 gr.

En ambos experimentos todas las hembras usadas mostraron una distribución unimodal del

diámetro de los oocitos antes de ser inducidas, pasando a una distribución multimodal 24

horas después de comenzado el tratamiento hormonal. En algunas especies de lutjánidos se

ha observado una distribución unimodal de los oocitos (Watanabe et al., 1998), mientras

o

multimodal (Grimes, 1987. En: Watanabe et al., 1998), patrón que normalmente indica

desoves múltiples durante la época reproductiva. Sin embargo, la relación entre el número

de modas y el número de desoves aun no esta muy clara en esta familia y en estudios

realizados en otras especies se ha determinado que una distribución unimodal no excluye la

posibilidad de encontrar varios desoves de una hembra por época reproductiva (Watanabe

et al., 1998).

El diámetro promedio de los oocitos para todos los tratamientos al iniciar los experimentos

fue de 411.62 µm ± 7.6 µm. Este dato concuerda con lo observado para L. johni (400 µm)

(Lim et al. ,1985), L. campechanus (354 – 365 µm) (Minton et al., 1983) y L.

argentimaculatus (400 µm) (Emata et al., 1984). Los mayores diámetros promedio de los

oocitos 24 horas después de la primera inyección coincidieron con los tratamientos en los

que desovaron las tres hembras, en estos se dió un incremento de entre 14 % y 47 % y el

39

diámetro promedio estuvo sobre las 486 µm, resultado similar al obtenido para L. analis

(475 µm) (Watanabe et al., 1998).

En los tratamientos de 900 + 900 U.I. / GCH (en ambos experimentos) y 250 +750 U.I. /

GCH desovaron las tres hembras, aunque los tratamientos de 900 + 900 U.I. superaron en

número de huevos a los tratamientos en los cuales fue utilizado OVAPRIM y GCH en

otras concentraciones. En este experimento aunque OVAPRIM no produjo desoves en la

hembras, si logró la maduración de los oocitos. Es posible que la dos

is utilizada aunque fue

ayor a la recomendada, no fue lo suficientemente potente como para inducir al desove.

Tuckey (1995), afirma que la GCH en la familia Lutjanidae cumple con cuatro de los

oves de entre 120,000 a 1,180,000 huevos en

embras de L. argentimaculatus de entre 4.5 y 4.8 Kg. Rosas et al. Usaron en L. griseus

m

Aunque los resultados obtenidos en especies de la familias Acipenseridae, Chanidae,

Salmonidae, Centropomidae, Serranidae, Sparidae, Scianidae demuestran la efectividad de

los análogos de la GnRH para inducir al desove (Tuckey, 1995), los lutjánidos han

demostrado tener una sensibilidad especifica hacia el GCH. Así, Emata et al. (1999),

utilizó GCH y LHRHa, para inducir machos y hembras de L argentimaculatus obteniendo

desoves en solo las hembras inducidas con GCH.

cinco requisitos propuestos por Lin y Peter (1992) para una efectiva inducción al desove:

una tasa de ovulación alta, una ovulación casi completa, un tiempo de ovulación corto y

huevos fértiles y viables. Aunque la sensibilidad de los lutjánidos al GCH esta comprobada,

las dosis usadas son variadas. Watanabe (1998), usó dosis de 500 + 1000 U.I. / Kg P.C en

L. analis obteniendo desoves de entre 535 y 781 huevos. Emata et al. (1999) uso una dosis

de 1000 U.I. de GCH / Kg P.C obteniendo des

h

dosis de entre 1000 y 6300 U.I. de GCH/ Kg P.C con desoves entre 190,000 y 210,000

huevos. González et al. (1979) recomienda como la dosis más adecuada y viable para L.

griseus la inyección de 2000 U.I. de GCH/ Kg P.C. Teniendo en cuenta la variabilidad de

dosis y concentraciones usadas de GCH, determinar una dosis adecuada depende de

40

factores como la edad de los peces y su desarrollo ovárico, la temperatura del agua

(Shelton, 1989) y el tamaño del tanque de desove (Lim et al., 1985)

En el experimento de selección de hormona el porcentaje de huevos que cambiaron su

estado de madurez después de 24 horas fue mayor en el tratamiento de GCH, mientras que

en los dos tratamientos de OVAPRIM los oocitos que cambiaron su estado de madurez tan

olo llegaron a estado dos, aunque, a las 48 horas se dio un cambio significativo en los

spontáneos con o sin inducción

reeliminar pero estos desoves tienden a ser difíciles de predecir, además, producen

es de huevos relativamente pequeñas, aunque de buena calidad.

s

estados de madurez, predominando oocitos en estados II, III y IV. En el experimento de

optimización de la dosis de GCH tan solo el tratamiento A( 900 + 900 U.I. GCH/ Kg P.C)

mostró cambios importantes en la madurez de los oocitos a las 24 horas; después de 48

horas el estado I de madurez volvió a ser predominante en los cuatro tratamientos.

Al comparar la distribución de frecuencias del diámetro de los oocitos con el estado de

madurez, se apreció una relación entre el estado de madurez y el diámetro, así, las modas

de menor diámetro coincidieron con el porcentaje de huevos menos maduros. Se ha

demostrado que el tamaño de los huevos es indicador de la eficiencia del agente inductor,

ya que la serie de cambios que se originan dentro del huevo al ser estimulada la hembra a

desovar hacen, que este aumente su tamaño.

El estado de madurez de las muestras de oocitos después de 48 horas de la inducción

estaba dividido entre huevos de madurez avanzada y otros menos maduros, estos oocitos

son reabsorbidos por la hembra o son posteriormente desovados en los tanques en los

cuales se mantienen a los reproductores después de realizar la inducción. Aunque no

fueron observados desoves espontáneos luego de concluido el experimento en otras

experiencias realizadas en la Estación de Biología Marina, las hembras produjeron desoves

seriales luego de una inducción preeliminar, influenciadas por las fases lunares y las

mareas lo que confirma lo observado por Watanabe et al. (1998). Otras especies de la

familia Lutjanidae también han tenido desoves e

p

cantidad

41

En el experimento de selección de hormona solo fue posible observar fertilización en los

uevos de una de las hembras inducida con GCH en un 10 %, mientras en el experimento

e optimización de la dosis de GCH el tratamiento A (900 + 900 U.I. de GCH) tuvo

orcentajes de fertilización de entre un 56% y un 100% . En otros estudios realizados en

tjánidos, se han observado diferentes porcentajes de fertilización. Watanabe (1998),

btuvo porcentajes de fertilización de 84% usando una proporción de tres machos por

hembras de L.

argentimaculatus es debida a baja calidad de los huevos y a la premadurez de los huevos

e la

otilidad, la capacidad de fertilización y la concentración de esperma (Bromage and

h

d

p

lu

o

hembra. Singhagraiwan y Doi (1993), sugieren que la baja fertilización de

desovados, además, de la baja calidad de la esperma La calidad del huevo se define como

las características del huevo que determinan su capacidad de desarrollarse hasta llegar a una

larva de alimentación exógena. La apariencia del corion, la apariencia y distribución de la

gota de aceite y la tasa de fertilización son usados para estimar la calidad del huevo

(Bromage and Roberts, 1995).la calidad de la esperma es medida por medio de la d

m

Roberts, 1995). Otro de los factores que afecta la calidad de los productos sexuales de los

peces es el estrés. Schreck et al. (2001), afirma que frente un agente estresor, los peces

generan respuestas fisiológicas con el fin de evitar la muerte o establecer la normalidad

homeostática, las cuales afectan algunas funciones vitales y la calidad de los productos

sexuales. Campbell et al. (1992, En: Bromage and Roberts, 1995) reporta que la ovulación

fue retrasada en peces estresados, los huevos fertilizados fueron pobres de calidad y el

esperma también se redujo en los machos estresados.

42

3. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN PRELARVAS DE L. guttatus

Actualmente la producción de larvas de peces marinos se lleva acabo bajo condiciones

controladas y requiere de técnicas específicas de cultivo, estrategias de alimentación y

control microbial. Esto se realiza así debido a la fragilidad y poco desarrollo al momento

de la eclosión de sus órganos de percepción y de su sistema digestivo, por esta razón antes

que la larva se alimente por primera vez se le da el nombre de prelarva (Segner, 2001).

La prelarva de un pez marino posee determinadas características las cuales van a depender

del tipo de estrategia de vida de la especie (Winemiller y Rose, 1992 En: Tucker, 1998).

Existen tres tipos diferentes de estrategias: periódica, oportunista y equilibrada. La

estrategia periódica se caracteriza por una maduración sexual tardía, talla de maduración

muy grande en los reproductores, grandes desoves de huevos pequeños, crecimiento larval

y juvenil rápido y una época de desove corta (Atún, cobia, striped bass). En los peces con

estrategia oportunista la talla de maduración de los reproductores es pequeña y temprana,

huevos pequeños, rápido crecimiento larval y una época de desove larga y con varios picos

nchoas, pargos). Sus larvas son poco competentes pero son producidas por un largo (a

intervalo de tiempo. La estrategia equilibrada esta entre de las dos anteriores (tilapia, pez

gato), produciendo larvas altamente competentes al medio. En el caso de L. guttatus la

estrategia es oportunista con prelarvas caracterizadas por la ausencia de boca, tubo

digestivo y ojos, dependiendo completamente de su reserva vitelina para terminar esta fase

(Tucker, 1998).

Sin importar el tipo de estrategia, algunas características son compartidas por todas las

prelarvas de peces marinos. La longitud de las prelarvas al momento de eclosionar en la

mayoría de especies esta entre uno y cinco milímetros de longitud total, el saco vitelino

mantiene a la prelarva dentro de la columna de agua gracias a una pequeña gota oleosa, que

es la última parte del vitelo en ser absorbida, rica en ácidos grasos altamente insaturados,

indispensables para el adecuado desarrollo de las enzimas digestivas. Al no tener que

43

alimentarse durante esta etapa, el optimo desarrollo de la prelarva depende de la calidad del

huevo, los factores fisicoquímicos (Temperatura, salinidad, oxigeno disuelto, nitritos, etc.)

y el control microbial (Sargent, 2005).

La temperatura del agua juega un papel decisivo en el desarrollo larval, al afectar el

antenimiento del metabolismo (Tucker, 1998). El mantenimiento del metabolismo tiene

se rango se reduce su crecimiento e incrementa

susceptibilidad a las enfermedades. Las temperaturas altas reducen la solubilidad de

tes. Si por el contrario, el rango

temperatura es bajo, el período de incubación será muy largo aumentando la

. Dentro de un rango normal, pequeños

crementos en la temperatura en el momento de eclosionar los huevos, puede reducir las

m

un costo energético alto o bajo de acuerdo al rango de tolerancia de temperatura de cada

especie, si el costo de mantenimiento del metabolismo es bajo, habrá un aporte importante

al crecimiento. Sin embargo, el rango en el que los costos de mantenimiento son bajos

(afectando únicamente la tasa de crecimiento) es muy reducido (Bermudes and Ritar,

1999).

En larvicultura los rangos de tolerancia a la temperatura son pequeños (2 y 3 °C). A nivel

del trópico se consideran temperaturas altas las que superan los 28 °C, y bajas por debajo

de los 25 °C. Las larvas de cada especie poseen un rango de temperatura que incluye el

óptimo, cuando la temperatura no esta en e

la

oxígeno contribuyendo a la reducción del oxígeno disuelto y tienen un efecto indirecto en

la calidad del agua ya que al cambiar las tasas metabólicas de los organismos, las

cantidades de desechos metabólicos tales como dióxido de carbono y amonio aumentan

afectando a las larvas debido a su toxicidad. (Tucker, 1998). En los huevos de los peces el

vitelo tiende a ser agotado rápidamente y las larvas eclosionan prematuramente dando

como resultado la larvas con reservas energéticas deficien

de

probabilidad de enfermedades (Tucker, 1998)

in

enfermedades, e incrementar los requerimientos alimenticios para sobrevivencia,

mantenimiento y crecimiento (Tucker, 1998).

44

Una manera de evaluar el efecto de la temperatura en el mantenimiento y crecimiento es la

estimación de la longitud larval y el volumen del vitelo. En estudios anteriores se ha

portado para especies como Hippoglossus hippoglosus y Dicentrarchus labrax, que altas

de ser alterada por

tras variables como la carga microbiana.

.1 PROCEDIMIENTO

re

temperaturas afectan los huevos produciendo larvas pequeñas con reservas vitelinas

pequeñas. Otras estimaciones como la sobrevivencia son de utilidad al evaluar el efecto de

la temperatura en las prelarvas. Un alto porcentaje de sobrevivencia al finalizar la fase

prelarval a una temperatura dada, demuestra una óptima utilización de las reservas

energéticas por parte de la larva, claro que siempre debe de apoyarse sobre la información

de la longitud larval y el volumen del vitelo ya que la sobrevivencia pue

o

Por lo anterior se desarrolló un experimento en el cual prelarvas de L. guttatus fueron

sometidas a tres diferentes temperaturas con el fin de encontrar el rango óptimo para el

desarrollo prelarval de esta especie. Las temperaturas con las cuales re realizó el

experimento fueron seleccionadas tomando en cuenta las temperaturas máximas de cultivo

reportadas para otras especies de la familia y la temperatura mas baja observada en los

tanques de la Estación de Biología Marina en Puntarenas.

3

Para el desarrollo del experimento se utilizó a una hembra y dos machos de L. guttatus

sexualmente maduros (ver capitulo uno) que fueron transportados desde las jaulas flotantes

en Punta Cuchillo hasta la Estación de Biología Marina en Puntarenas. El experimento fue

hecho por triplicado, usando en cada experiencia un grupo de reproductores diferente, pero

del mismo lugar y origen.

Tomando como base los experimentos de reproducción (Capitulo 2), se comprobó que la

dosis que mejor funciona con respecto a los desoves y porcentajes de fertilización en L.

guttatus es la doble inyección de 900 UI GCH/ Kg. P.C, dosis con la cual se inyectó a la

hembra utilizada para el experimento con el fin de inducirla a desovar. Los machos fueron

45

inyectados con 250 U.I. de GCH sin importar su peso. Luego de obtener el desove los

huevos fertilizados fueron pasados al tanque de eclosión (Capitulo uno).

Con el fin de encontrar la temperatura adecuada para el desarrollo prelarval de L guttatus

se hizo un montaje de tres baterías cada una con cuatro incubadoras cilíndricas en PVC

de fondo plano, color transparente, con fondo en malla de 40 micras y con capacidad para

cinco litros; sumergidas en un baño maría con una capacidad de 250 litros, a temperaturas

de 22 ºC (Tratamiento I), 25 ºC (Tratamiento II) y 28 ºC (Tratamiento III) (± 1 ºC),

mantenidas con un termostato (figura 7). La temperatura externa se mantuvo en un rango de

15 – 20 ºC por medio del aire acondicionado del laboratorio que durante el desarrollo del

experimento funciono continuamente.

igura 10: Montaje utilizado para evaluar el efecto de la temperatura en las prelarvas de L. guttatus. F

El número en cada incubadora indica la cantidad de larvas colocadas.

Termostato

Aireador

200 100 100 100

(Álvarez-Lanjonchere, 1994). Posterior al montaje, las larvas se colectaron del tanque de

Tanto el baño maría, como cada incubadora, se llenó con agua marina clorada a razón de

0.06 ml /l, pasada por luz ultravioleta, filtrada a 1 µm y con aireación moderada

46

eclosión y se aclimataron a la temperatura de cada tratamiento, el proceso de aclimatación

tomo aproximadamente una hora. En seguida se colocaron en tres de las incubadoras de

cada tratamiento 100 larvas y en la cuarta incubadora se colocaron 200 larvas.

De la cuarta incu de 30

larvas cada 12 horas y se estimó la longitud total y el volumen del vitelo (figura 6). La

Volumen de vitelo = (π/6) × LV × AV2

badora de cada uno de los tres tratamientos se tomo una muestra

ecuación utilizada para encontrar el volumen del vitelo es:

Donde LV es la longitud del vitelo y AV es el alto del vitelo (Ávila and Juario, 1987 En:

Bermudes and Ritar, 1999) (Ver Figura 1). Al cabo de dos días, momento en el que las

larvas pigmentan los ojos y la boca se vuelve funcional (Drass et al., 2000) y después de

haber mantenido constantes las condiciones ambientales en las diferentes baterías, se

contó el número de larvas en los tres incubadoras que no fueron manipulados duranteel

experimento, con el objeto de determinar la sobrevivencia.

Figura 11: Medidas morfológicas estimadas en la prelarva de L. guttatus

En cada uno de los tratamientos se hizo un seguimiento de la temperatura, el oxígeno

isuelto y la salinidad con el fin de llevar el control de estas variables durante el desarrollo

e la experiencia.

d

d

47

Los promedios de longitud y volumen de vitelo de la prelarva fueron comparados entre

ada uno de los tratamientos por medio de un análisis de varianza (ANDEVA) y las

iferencias entre promedios se detectaron por medio de una prueba de Tuckey. La

obrevivencia se expresó como porcentaje para cada uno de los tratamientos y se comparo

ráficamente. La relación entre la longitud y el volumen del vitelo fue expresada como una

gresión de la longitud en función de vitelo para cada tratamiento, determinando el índice

e Pearson y su significancia por medio de una prueba t planteando las siguientes hipótesis:

H0: Longitud Tratamiento n ≠ Volumen del vitelo Tratamiento nHa: Longitud Tratamiento n = Volumen del vitelo Tratamiento n

c

d

s

g

re

d

48

3.2 RESULTADOS

El tratamiento I tuvo una temperatura promedio de 22.1 °C ± 0,47. Para el tratamiento II la

temperatura promedio fue 24.7 °C ± 0.38 °C. La media de temperatura del tratamiento III

fue 27.6 °C ± 0.42 °C (Tabla 8).

Para los tratamientos de I y II los promedios de oxigeno disuelto fueron de 6.20 mg/ l ±

0.66 mg/ l y 5.90 mg/ l ± 0.67 mg/ l, respectivamente. El tratamiento III, el oxígeno

disuelto tuvo un promedio de 5.7 mg / l. Durante el desarrollo de las tres replicas del

xperimento se manejo una salinidad de 35 ‰ sin que esta hubiese cambiado en ningún e

momento (Tabla 8).

Tabla 8. Diferentes parámetros fisicoquímicos monitoreados durante el experimento de temperatura en prelarvas de L guttatus. Los datos de temperatura y oxígeno disuelto están expresados en medias y desviaciones que fueron obtenidas del total de mediciones hechas en las tres repeticiones del experimento.

Tratamientos Temperatura (°C) Oxigeno Disuelto (mg/l) Salinidad (UPS)

(22°C) 22.10 ± 0.47 6.20 ± 0.66 35

(25°C) 24.70 ± 0.38 5.90 ± 0.67 35

(28°C) 27.60 ± 0.42 5.70 ± 0.62 35

En las primeras 12 horas no se observaron diferencias en la longitud total de las prelarvas,

no obstante en los muestreos subsiguientes se observaron diferencias significativas en la

longitud prelarval en todos los tratamientos, exceptuando el muestreo realizado a las 36

horas en el cual no se observaron diferencias significativas entre el tratamiento I y III.

abla 9). El volumen del vitelo fue significativamente diferente en los tres tratamientos a

e los tres tratamientos agotaron sus reservas vitelinas. ( Tabla 9).

(T

las 12, 36 y 48 horas, mientras que a las 24 horas los promedios de volumen de vitelo de

los tratamientos I y III no mostraron diferencias significativas. Luego de 60 horas las larvas

d

49

En el tratamiento tud total aumento e ión con

la medida inicial, llegando a una longitud prom s

0 v vitelo en las primeras 12 horas fue de 101.64

µ 3 n re ic in e

com et v om de ± as

t ie C u en 65 mparación con

id b a omedio de 2.66 mm 2 mm al fi l del

xperimento. El volumen del vitelo a las 12 horas luego de la eclosión fue de 94.36 µm³ ±

ltima medición de 11.51 µm³ ± 4.99 µm³ , 36 horas después de la eclosión (Tabla 9).

volumen del vítelo en prelarvas de L. guttatus.. Los datos de ngitud total, y volumen del vítelo son promedios y desviaciones estandar obtenidas del total de

mediciones hechas en las tres repeticiones para cada muestreo(n= 90). Letras diferentes indican diferencias entre los tratamientos (P<0.05). Muestra Longitud total (mm)

22 °C 25°C 28°C Volumen del vitelo ( µm³ )

22 °C 25 °C 28 °C

I (22 °C), la la longi n un 63.91 % en comparac

edio al momento de la pigmentación de lo

ojos de 2.63 mm ± .11 mm. El olumen del

m³ ± 7.5 µm³ y o tuvo dife ncias signif ativas con el icial. Antes d desaparecer

pl amente el olumen pr edio fue 14.93 µm³ 2.7 µm³. L larvas del

ratam nto II (25 º ) mostraron n aumento longitud del .21 % en co

la med a inicial, o servando un longitud pr ± 0.1 na

e

19.59 µm³, y de 2.13 µm³ ± 0.45 µm³ 48 horas después de la eclosión (tabla 9). Las larvas

mantenidas a una temperatura de 28 ºC (Tratamiento III) mostraron un aumento en longitud

del 52.17 % en comparación con la medida inicial. La longitud promedio al final del

experimento fue de 2.47 mm ± 0.09 mm. La altura del cuerpo se redujo en un 52.17 %. El

vitelo fue absorbido 12 horas antes que en los otros dos tratamientos con un promedio en la

ú

abla 9. Estimación de la longitud el yTlo

t 0 h 1.61 ± 0.09 a 1.61 ± 0.09 a 1.61 ± 0.09 a 99.77± 0.02 a 99.77± 0.02 a 99.77± 0.02 a

t 12 h 2.17 ± 0.20 a 2.18 ± 0.40 a 2.20 ± 0.42 a 101.64 ± 37.5 c 94.36± 19.59 b 92.99± 15.6 a

t 24 h 2.47 ± 0.18 b 2.57 ± 0.18 c 2.40 ± 0.19 a 40.85 ± 9.70 a 59.31± 12.82 b 43.48± 9.9a

t 36 h 2.52 ± 0.19 a 2.67 ± 0.18 b 2.56 ± 0.13 a 22.45 ± 4.22 c 15.65± 4.22 b 11.51± 4.99 a

t 48 h 2.60 ± 0.19 b 2.66 ± 0.12 c 2.43 ± 0.25 a 14.93 ± 2.70 c 2.13± 0.45 b 0.00 a

t 60 h 2.63 ± 0.11 b 2.66 ± 0.12 c 2.47± 0.09 a 0.00 a 0.00 a -

La longitud prelarval mostró un comportamiento similar en los tres tratamientos,

aumentando rápidamente para luego estabilizarse transcurridas 24 horas. En los

tratamientos de 22 y 28 ºC se observó una variación en la longitud luego de las 24 horas. Al

50

finalizar el experimento, la longitud de las prelarvas fue mayor para los tratamientos de 22

y 25 ºC, mientras en el tratamiento de 28 ºC se observó un menor crecimiento (Figura 12).

Figura 12. Cambios en la longitud de las prelarvas (a) y el volumen del vitelo (b) durante las primeras 60 horas luego de la eclosión. Cada uno de los puntos representa el valor promedio de la longitud y el volumen del vitelo (n= 90).

HORAS 22 ºC 25 ºC 28 ºC0 99,77 99,77 99,77

12 101,64 94,36 92,9924 40,85 59,31 43,4836 22,45 15,65 11,5148 14,93 2,13 060 0 0 0

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

2,5

2,7

2,9

0 10 20 30 40 50 6Horas

Long

itud

(mm

)

(a)

0

01020

0 10 20 30 40 50 60Horas

30405060708090

100110

Vol

umen

( µm

³)

22 ºC25 ºC28 ºC

(b)

El tratamiento I tuvo una rápida reducción en el volumen de vitelo entre las 12 y 24 horas,

aunque luego de 36 horas se redujo la velocidad de absorción y desapareció por completo

0 horas posteriores a la eclosión. El vitelo del tratamiento II después de 12 horas tuvo un

decrecimiento constante, desapareciendo completamente a las 60 horas de la eclosión. El

6

51

vitelo de las prelarvas mantenidas del tratamiento III fue el que desapareció más

rápidamente de los tres tratamientos, siendo consumido completamente a las 48 horas

(Figura 12).

En el tratamiento I (22 °C) se dió una sobrevivencia promedio de 63.22 % ± 21.55 % con

n máximo de 92.06%. El tratamiento II (25 °C) tuvo un porcentaje promedio de 62.93 % ±

% (Figura 13).

plicas y

u

25.92 % con un máximo de 97.77 %. A 28 °C (Tratamiento III) tan solo se dió la

sobrevivencia de las larvas en la primera repetición, reduciendo así el promedio final a un

26.18 % ± 39.66

Figura 13: Porcentajes de sobrevivencia en prelarvas de L guttatus 60 horas después del comienzo del experimento. Las barras muestran el promedio de sobrevivencia obtenido de las tres relas repeticiones realizadas del experimento. (n= 9).La línea sobre la barra indica el error estándar de cada tratamiento

26,2%

62,9%63,2%

0

20

40

60

80

22°C 25°C 28°C Tratamientos

Porc

enta

je

52

Figura 14: Fotografías de prelarvas de L. guttatus a 22 ºC ( A, B y C), 25 ºC( D, E y F) y 28 ºC(G y H), tomadas 12, 48 y 60 horas luego de la eclosión.

12 h

48 h Tratamiento I ( 22°C)

12 h

60 h

Tratamiento II ( 25 °C)

En las prelarvas se adelantó o retrasó la aparición de algunas estructuras dependiendo del

tratamiento. En las 12 horas posteriores a la eclosión no se observaron diferencias

morfológicas entre los tres tratamientos. En todos se observaba claramente a la prelarva

sobre el vitelo, con un diámetro de gota oleosa similar para los tres, sin estructuras bucales,

pigmentos ópticos u órganos digestivos. Tan solo se notó que las prelarvas del tratamiento

ostraban ligeras deformaciones o imperfecciones en su vitelo (Figura 14).

48 h

12 h

48 h

60 h

Tratamiento III ( 28 °C)

III m

53

Luego de 48 horas las prelarvas de los tres tratamientos habían consumido parte de su

itelo, aunque en el tratamiento I la gota oleosa tenia un tamaño mayor comparado al de

los otros tratamientos. El desarrollo morfológico de las prelarvas fue similar si bien en el

tratamiento II las estructuras ópticas se observaban más definidas, aunque aún sin

pigmentar. Las prelarvas del tratamiento III mostraban algunas irregularidades; su

notocordo se veía en muchos casos doblado o recogido y el tamaño del vitelo y la gota

oleosa variaba mucho entre una prelarva y otra (Figura 14).

I el desarrollo de las estructuras bucales y la

aparición de los pigmentos ópticos en las prelarvas no se había terminado , el vitelo aún no

e había consumido por completo y la gota oleosa había sido consumida completamente, En

n las observaciones realizadas cada 12 horas fue apreciable una mayor resistencia a la

s prelarvas mantenidas a 22 y 25 ºC, puesto que a 28 ºC las prelarvas se

eterioraban rápidamente dificultando así la observación de sus características. La figura 13

v

Después de 60 horas, en el tratamiento

s

el tratamiento II la fase de prelarva había concluido y eran apreciables larvas con ojos

pigmentados completamente y boca e intestinos, mientras que en el tratamiento III que

igualmente había concluido la fase prelarval la pocas larvas vivas mostraban muchas

deformaciones en su notocordo a parte de ser muy sensibles a la manipulación por lo que

no fue posible lograr un registro fotográfico.

E

manipulación en la

d

muestra el estado de una prelarva mantenida a 28 ºC 12 horas luego de la eclosión minutos

después de haber sido capturada y anestesiada para su observación.

Figura 15: Prelarva de L. guttatus mantenida a 28 ºC luego de haber sido capturada para su observación.

54

Figura 16: Regresión lineal entre la longitud y el volumen del vitelo de la prelarva para los

tratamientos de 22 ºC (a), 25 ºC (b) y 28 ºC (c).

y = -129,59x + 357,94R2 = 0,5785y = -86,871x + 255,5R2 = 0,4433y = -67,463x + 194,68R2 = 0,2693

(a)

0255075

100125150175200225250275

1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3

(b)

0255075

100125150175200225250275

1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3

(c)

0255075

100125150175200225250275

1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3

Vol

umen

del V

itelo

(µm

³)

Longitud Total (mm)

La relación entre la longitud total de la prelarva y el volumen de vitelo fue inversa en los

tres tratamientos, siendo el tratamiento I en el que se obtuvo una mayor pendiente y el

tratamiento III el de menor pendiente (figura 12). El índice de correlación de Pearson

superó en los tres tratamientos el 50 %, siendo más alto en el tratamiento I con un valor de

.76, seguido por el de II y III con un valor de 0.60 y 0.51, respectivamente. 0

55

3.3 DISCUSION

La longitud total de las prelarvas de L. guttatus al momento de la eclosión fue de 1.61 ±

0.09 mm, Emata et al. (1994) encontró una longitud total inicial de 1.61 ± 0.018 mm (n =

20) a 28 º C para L. argentimaculatus, mientras que Singhagraiwan and Doi. (1993)

observaron una Longitud total inicial de 1.8 mm a una temperatura que fluctuó entre los 27

y 32 º C para la misma especie. En L. griseus, la longitud total al momento de la eclosión

fue de 1.872 ± 88.21 mm con una temperatura del tanque de eclosión de 28 ± 1 ºC (Rosas et

al., 1998). Así , las prelarvas de las diferentes especies del género Lutjanus guardan

características similares y que las diferencias especificas se dan cuando el desarrollo larval

se encuentra mas adelantado.

La longitud total de las prelarvas de los tratamientos I (22ºC) , II (25º C) y III (28º C),

fueron significativamente diferentes en las primeras 12 horas (I = 2.17 mm ± 0.20 mm, II =

2.18 mm ± 0.40 mm y III = 2.20 mm ± 0.42 mm ), aunque luego de las primeras 24 horas

fue la longitud total de las prelarvas del tratamiento II (2.57 mm ± 0.18 mm ) la mayor de

las tres, con un crecimiento que se detuvo entre las 48 y 60 horas. El Tratamiento I

mantuvo un crecimiento estable, a diferencia del tratamiento III, en el cual luego de 36

horas se redujo la longitud total en un 5.06 % (2.56 mm ± 0.13 a 2.43 ± 0.25). Watanabe et

al (1998), encontraron una longitud total para L. analis de 2.66 ± 0.12, 48 horas luego de la

eclosión a una temperatura promedio de 25.7 ± 0.2 ºC; Rosas et al.(1998) midieron la

prelarva de L. griseus 55 horas después de la eclosión cuyo valor fue de 2.54 mm a una

temperatura de 28 ºC Aunque las diferencias con otras especies de la familia Lutjanidae

son muy pequeñas, en ninguno de los artículos citados se realizaron trabajos en los cuales el

efecto de la temperatura en las prelarvas fuera estudiado directamente. A las 48 horas de

iniciado el experimento es apreciable una reducción en el incremento de la longitud total en

s tres tratamientos; esta reducción posiblemente este relacionada con la manera en que la lo

prelarva utiliza la energía del vitelo. Antes de que las reservas vitelinas de la prelarva se

agoten, la prioridad es desarrollar las estructuras que van a permitir a la larva procurarse

de alimento, por esto la formación de los órganos mecano-receptores, quimiorreceptores y

56

óptico receptores es crucial. Estos órganos se encuentran ubicados en su mayoría en la

región cefálica, por lo que ésta es la parte de la prelarva que mas cambios tiene en su

proceso de transformación en una larva verdadera y debido a que el desarrollo de estos

órganos no contribuyen a la longitud total, es normal que el incremento de la longitud total

se vea reducido (Segner, 2002; Tucker, 1998). Teniendo en cuenta lo anterior una

temperatura de 25 °C favorece el crecimiento de las prelarvas de L. guttatus, puesto que

llegan rápidamente a la longitud máxima, dejando a disposición de la prelarva una mayor

cantidad de energía para el desarrollo de las estructuras necesarias en el momento en el cual

la reserva vitelina se termina.

éticas deficientes, afectando así la

sistencia de la larva y su posterior habilidad para capturar alimento. Una temperatura alta

vorece el incremento de poblaciones bacterianas que van a afectar directamente la salud

de la larva. Cuando el rango de temperatura es óptimo se da una sincronización entre el

crecimiento, la disponibilidad de energía y el momento de comenzar a alimentarse.

Además, la cantidad de energía que usa la larva para su mantenimiento se reduce y es

utilizada desarrollo estructural (Tucker, 1998, Bermudes and Ritar. 1999). Es de gran

En la mayoría de trabajos realizados no se hace mención al volumen del vitelo. El único

dato reportado es el de Rosas et al. (1998) para L. griseus con un vitelo inicial de 861.4

mm ± 61.2 mm dato que no es posible ya que la prelarva solo mide 1.8 mm (99.77± 0.02

µm³). El tratamiento I (22 ºC) tuvo una rápida reducción en el volumen de vitelo entre las

12 y 24 horas, aunque a las 36 horas se redujo la velocidad de absorción desapareciendo

por completo 60 después de la eclosión. El vitelo del tratamiento II (25º C) a las 12

horas tuvo un decrecimiento constante, desapareciendo completamente transcurridas 60

horas desde la eclosión. El vitelo de las prelarvas del tratamiento III (28º C) fue consumido

más rápidamente que el de los otros dos tratamientos, desapareciendo completamente a las

48 horas. A temperaturas por debajo del rango óptimo, las prelarvas de peces pueden

aumentar en exceso tiempo de absorción del vitelo, aumentando las probabilidades de

contraer enfermedades, además, puede afectar la viabilidad de las larvas. Si por el contrario

la temperatura excede el rango normal la tendencia del vitelo es de agotarse rápidamente

dando como resultado larvas con reservas energ

re

fa

57

importancia el momento en que la prelarva se transforma en una larva verdadera ya que si

la energía del vitelo fue correctamente aprovechada, la larva podrá comenzar a alimentarse

y seguir con su desarrollo ontogénico, pero si la larva no aprovecho adecuadamente la

energía del vitelo y atrasa el momento de su primera alimentación cruza un punto de no

retorno (PNR), luego del cual, aunque se alim te no va a lograra terminar su desarrollo y

morirá (Tucker, 1998). Así, según lo observado durante el experimento la temperatura de

25 °C favorece el crecimiento y desarrollo de estructuras en la prelarva de L guttatus sin

agotar rápidamente el volumen del vitelo ni retrasar su absorción.

No hay trabajos realizados en sobrevivencia prelarval para la familia Lutjanidae. Tan solo

se encontró reportada una sobrevivencia de 79.16 % para L. griseus calculada 24 horas

luego de la eclosión (Rosas et al., 1998). La sobrevivencia de las larvas fue mayor en los

tratamientos I y II (63.22 % ± 21.55 % y 62.93 % ± 25.92 % respectivamente), mientras el

tratamiento III observó un porcentaje de sobrevivencia mas bajo (26.18 % ± 39.66 %).

Tomando en cuenta lo anterior, aunque en edio la sobrevivencia a60 horas post-

eclosión del tratamiento I sea mayor , las prelarvas del tratamiento II tienen más

probabilidades de culminar su desarrollo ontogénico ya que se han convertido en larvas

verdaderas y están listas para alimentarse, m entras que en el tratamiento I aún no se ha

completado el desarrollo de toda boca y entre mas se retrase el

omienzo de la alimentación las probabilidades que las larvas mueran aumentan

ignificativamente.

La pru

vitelo T

de la p lumen del vitelo de la misma. El modelo que mejor se

justo a los datos de los tres tratamientos fue el logarítmico, esto debido a la reducción en el

increm

varió p

tratami ente). Al observar el comportamiento de la

nea de tendencia es apreciable que la pendiente de las gráficas depende de la temperatura,

en

prom

i

s las estructuras de la

c

s

eba t de significancia rechazó la hipótesis Longitud Tratamiento n ≠ Volumen del

ratamiento n, es decir, que existe una relación entre el aumento en la longitud total

relarva y la reducción del vo

a

ento de la longitud total luego de 36 horas de la eclosión. El índice de correlación

ara cada uno de los tres tratamientos encontrando así una mayor correlación en los

entos I y II, (0.58 y 0.43 respectivam

lí

58

es i

temper

condici como resultado una larva mas grande, fuerte y

ejor nadadora. Sin embargo, Alderdice and Velsen (1971, En: Bermudes and Ritar,

199

opacad

dec r que la cantidad de vitelo de la prelarva en un momento dado dependerá de la

atura a la cual este. Blaxter (1969, En: Bermudes and Ritar, 1999), sugiere que las

ones ideales de temperatura dan

m

9), dicen que la ventaja de tener una larva mas grande a bajas temperaturas puede verse

a por una reducción en la actividad de larva.

59

6. CONCLUSIONES

1. Las dosis de OVAPRIM utilizadas en el experimento (0.35 + 0.35 ml/ Kg. P.C y 0.5

+ 0.5 ml/ Kg. P.C ) son eficaces para inducir la maduración final de los oocitos de

L. guttatus, aunque su desempeño para inducir el desove en las concentraciones

utilizadas es deficiente.

2. El tiempo que requieren las dosis de OVAPRIM utilizadas para lograr la

maduración final de los oocitos es el doble del que necesita la GCH en una

concentración de 900 + 900 U.I/ P.C.

3. Las dosis de GCH menores a 900 + 900 U.I / P.C, son eficaces al inducir la

maduración final de los oocitos, mas su desempeño es irregular y poco confiable al

inducir el desove de L. guttatus.

4. Las hembras de L. guttatus son afines a la GCH como hormona inductora de la

maduración y el desove , además, una dosis de 900 + 900 U.I / P.C es la cantidad

de hormona que produce me a que dosis menores no poseen la

potencia suficiente para asegurar la m duración de los oocitos y el posterior desove

de los huevos.

L. guttatus consumen más

rápidamente su vitelo, crecen menos, son más sensibles a la manipulación, a parte

Las prelarvas mantenidas a 22 °C tienen un adecuado crecimiento, consumen

lentamente su vitelo, pero retrasan el desarrollo de la boca y la pigmentación de los

jores resultados, y

a

5. A una temperatura de 28 °C, las prelarvas de

de generarse deformaciones en el notocordo.

6.

ojos aumentándose las probabilidades de que la larva pase el punto de no retorno

sin alimentarse.

60

7. A 25 °C las prelarvas tienen un importante incremento en su longitud y el final de

su reserva vitelina esta sincronizada con la aparición de la boca y la pigmentación

de los ojos así, la nueva larva esta lista para alimentarse justo cuando se termina el

vitelo.

e en 22 °C aún no se ha terminado la fase de prelarval en la cual se reduce de

manera importante la sobrevivencia.

vitelo y sobrevivencia es a los 25 °C.± 1°C.

8. La sobrevivencia es alta entre los 22 y 25 °C , 60 horas luego de la eclosión,

aunqu

9. La temperatura en la cual la prelarva tiene un mejor desarrollo morfológico,

crecimiento, adecuada absorción del

61

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. A., 1: 109 – 115. C

65

ANEXO A. Jaulas flotantes ubicadas en Punta Cuchillo y Estación de Biología Marina en

untarenas. P

66

67

ANEXO B. Diferentes estados de madurez de los oocitos y huevos de L. guttatus. (a) fase I, (b) fase III, (c) fase IV, (d) Huevo fertilizado, (e) clivajes tempranos, (f) embrión post-neurula, (g) prelarva a punto de eclosionar.

a. b.

c. d.

e. f.

g.

A C s v r e e u pap a .

NEXO . Característica obser adas pa a la sel cción d reprod ctores y método usado ara licar la hormon en L. guttatus

P a e s sresenci de sem n en lo macho

Pr to s aesencia de ooci s en la hembr s

Mét ad a l o

odo us o para plicar a horm na

68

69

A D i e e e se strando l e lo to e IL H P 7 1

m A

m R

R

NEXO . Matr z compl ta del xperim nto de lección de hormona mo os diám tros des oocitos (µm) de los tratamien s Diluy nte (D ), GC , OVA RIM 0. Y OVAPRIM .0.

Diá etro (µm ) 0 HOR S DIL. GCH OV 0,7 OV1,0

Diá etro (µm ) 24 HO AS DIL. GCH OV 0,7 OV1,0

Diámetro (µm ) 48 HO AS DiL. GCH OV 0,7 OV1,0

375,0 454,5 409,1 431,8 386,4 511,4 875,0 795,5 352,3 920,5 750,0 397,7375,0 420,5 409,1 409,1 352,3 545,5 488,6 250,0 318,2 931,8 750,0 397,7409,1 443,2 431,8 409,1 386,4 534,1 465,9 454,5 340,9 954,5 829,5 431,8431,8 397,7 431,8 318,2 397,7 477,3 454,5 477,3 329,5 897,7 772,7 363,6386,4 375,0 443,2 397,7 386,4 500,0 465,9 420,5 363,6 943,2 750,0 454,5397,7 431,8 443,2 409,1 431,8 488,6 443,2 409,1 363,6 999,9 772,7 488,6431,8 443,2 443,2 420,5 409,1 477,3 454,5 454,5 329,5 977,3 750,0 431,8386,4 409,1 409,1 386,4 409,1 500,0 443,2 465,9 363,6 943,2 761,4 454,5431,8 443,2 431,8 352,3 409,1 465,9 465,9 443,2 352,3 886,4 784,1 363,6397,7 465,9 431,8 352,3 397,7 443,2 454,5 443,2 340,9 909,1 761,4 386,4409,1 409,1 454,5 420,5 397,7 522,7 431,8 420,5 340,9 909,1 750,0 409,1375,0 420,5 454,5 409,1 409,1 477,3 465,9 431,8 352,3 897,7 761,4 454,5386 ,8 397 ,5 329 0,5,4 375,0 420,5 431 ,7 465,9 488,6 454 ,5 840,9 806,8 42397,7 397,7 409,1 420,5 386,4 534,1 443,2 454,5 363,6 829,5 772,7 454,5409,1 454,5 386,4 443,2 386,4 465,9 488,6 420,5 340,9 840,9 750,0 431,8454,5 409,1 443,2 420,5 386,4 500,0 454,5 465,9 340,9 806,8 772,7 454,5420,5 420,5 386,4 454,5 409,1 477,3 477,3 500,0 386,4 806,8 750,0 431,8386,4 397,7 375,0 397,7 386,4 465,9 477,3 454,5 386,4 829,5 761,4 488,6420,5 431,8 431,8 420,5 409,1 511,4 522,7 477,3 295,5 875,0 750,0 409,1397,7 397,7 431,8 454,5 431,8 500,0 477,3 454,5 318,2 920,5 761,4 409,1431,8 431,8 409,1 443,2 397,7 465,9 477,3 420,5 329,5 897,7 761,4 431,8443,2 443,2 397,7 409,1 454,5 511,4 454,5 454,5 352,3 840,9 738,6 420,5397,7 431,8 409,1 397,7 409,1 488,6 465,9 454,5 363,6 829,5 750,0 386,4409,1 454,5 397,7 409,1 420,5 477,3 488,6 443,2 340,9 920,5 750,0 397,7431,8 465,9 409,1 443,2 375,0 511,4 500,0 431,8 352,3 863,6 750,0 465,9409,1 420,5 375,0 375,0 386,4 511,4 443,2 375,0 386,4 909,1 761,4 409,1397,7 409,1 375,0 420,5 386,4 500,0 420,5 386,4 352,3 931,8 761,4 488,6454,5 431,8 397,7 397,7 397,7 500,0 454,5 363,6 363,6 886,4 761,4 431,8409,1 397,7 386,4 465,9 431,8 511,4 522,7 409,1 306,8 909,1 772,7 409,1409,1 409,1 431,8 431,8 420,5 465,9 556,8 420,5 352,3 784,1 761,4 443,2397,7 397,7 431,8 420,5 420,5 511,4 488,6 420,5 318,2 806,8 715,9 443,2397,7 431,8 420,5 443,2 454,5 477,3 477,3 409,1 352,3 818,2 750,0 431,8431,8 409,1 409,1 431,8 363,6 488,6 443,2 431,8 329,5 875,0 772,7 250,0397,7 420,5 375,0 420,5 409,1 488,6 511,4 477,3 340,9 829,5 750,0 386,4443,2 420,5 409,1 420,5 397,7 488,6 511,4 477,3 329,5 772,7 727,3 420,5443,2 431,8 386,4 431,8 386,4 477,3 511,4 477,3 363,6 818,2 750,0 409,1431,8 420,5 397,7 420,5 386,4 477,3 511,4 431,8 329,5 909,1 772,7 465,9443,2 443,2 397,7 443,2 420,5 500,0 465,9 420,5 318,2 909,1 772,7 443,2386,4 465,9 420,5 397,7 420,5 465,9 465,9 431,8 318,2 886,4 772,7 454,5386,4 477,3 409,1 431,8 397,7 465,9 454,5 386,4 352,3 511,4 761,4 431,8386,4 443,2 397,7 397,7 420,5 477,3 488,6 454,5 375,0 477,3 738,6 409,1

Diám A

m R

R

etro (µm ) 0 HOR S DIL. GCH OV 0,7 OV1,0

Diá etro (µm ) 24 HO AS DIL. GCH OV 0,7 OV1,0

Diámetro (µm ) 48 HO AS DiL. GCH OV 0,7 OV1,0

397,7 431,8 431,8 397,7 431,8 511,4 647,7 443,2 340,9 500,0 761,4 431,8409,1 454,5 443,2 409,1 431,8 465,9 488,6 420,5 318,2 352,3 750,0 431,8386,4 443,2 431,8 443,2 409,1 477,3 397,7 443,2 318,2 784,1 761,4 409,1397,7 454,5 409,1 386,4 409,1 500,0 454,5 454,5 352,3 886,4 761,4 465,9420,5 465,9 397,7 465,9 420,5 477,3 454,5 443,2 352,3 386,4 761,4 431,8409,1 488,6 375,0 443,2 409,1 488,6 511,4 477,3 352,3 329,5 738,6 420,5431,8 431,8 375,0 431,8 397,7 465,9 488,6 431,8 363,6 886,4 761,4 409,1409,1 443,2 386,4 477,3 443,2 465,9 477,3 409,1 397,7 897,7 477,3 420,5409,1 488,6 409,1 431,8 420,5 454,5 477,3 465,9 375,0 852,3 556,8 443,2409,1 420,5 409,1 431,8 397,7 295,5 625,0 454,5 397,7 897,7 477,3 409,1431,8 431,8 386,4 431,8 397,7 352,3 477,3 443,2 397,7 681,8 465,9 409,1386,4 431,8 409,1 420,5 352,3 306,8 397,7 443,2 409,1 693,2 477,3 443,2375,0 443,2 409,1 420,5 375,0 784,1 397,7 443,2 397,7 272,7 511,4 420,5409,1 409,1 386,4 431,8 386,4 727,3 431,8 443,2 409,1 681,8 465,9 454,5431,8 431,8 375,0 409,1 431,8 784,1 488,6 420,5 386,4 488,6 465,9 397,7454,5 431,8 386,4 386,4 375,0 750,0 465,9 477,3 409,1 500,0 465,9 409,1443,2 409,1 409,1 409,1 431,8 818,2 454,5 579,5 397,7 454,5 465,9 409,1443 ,8 386 ,8 397 2,3

409,1 386,4 397,7 397,7 386,4 431,8 397,7 715,9 465,9 534,1 431,8 409,1 488,6 397,7454,5 409,1 375,0 465,9 420,5 727,3 454,5 500,0 397,7 704,5 500,0 443,2431,8 420,5 420,5 443,2 386,4 704,5 465,9 511,4 386,4 465,9 511,4 409,1431,8 431,8 431,8 443,2 420,5 704,5 454,5 500,0 409,1 431,8 511,4 431,8420,5 409,1 409,1 409,1 420,5 738,6 488,6 545,5 386,4 329,5 500,0 409,1397,7 409,1 431,8 420,5 386,4 647,7 409,1 545,5 375,0 704,5 477,3 454,5409,1 431,8 420,5 443,2 409,1 500,0 431,8 545,5 397,7 806,8 500,0 397,7431,8 397,7 420,5 454,5 409,1 511,4 454,5 522,7 454,5 375,0 556,8 420,5397,7 431,8 420,5 375,0 409,1 750,0 477,3 511,4 352,3 443,2 534,1 431,8397,7 431,8 431,8 431,8 409,1 727,3 477,3 545,5 363,6 420,5 511,4 409,1420,5 420,5 420,5 443,2 431,8 681,8 465,9 454,5 443,2 386,4 488,6 409,1443,2 420,5 420,5 420,5 420,5 659,1 477,3 511,4 397,7 397,7 454,5 386,4409,1 420,5 420,5 443,2 375,0 568,2 465,9 500,0 443,2 409,1 488,6 409,1420,5 409,1 431,8 420,5 386,4 681,8 465,9 511,4 306,8 420,5 511,4 454,5

,2 454,5 420,5 431 ,4 784,1 590,9 556 ,7 409,1 477,3 35409,1 420,5 431,8 454,5 375,0 761,4 625,0 522,7 409,1 454,5 500,0 386,4454,5 431,8 386,4 431,8 386,4 840,9 477,3 488,6 363,6 477,3 534,1 420,5431,8 443,2 409,1 431,8 443,2 693,2 477,3 443,2 397,7 363,6 522,7 420,5409,1 443,2 397,7 431,8 420,5 795,5 477,3 431,8 352,3 352,3 511,4 465,9420,5 431,8 386,4 454,5 386,4 750,0 488,6 465,9 375,0 431,8 511,4 454,5340,9 409,1 409,1 465,9 420,5 761,4 465,9 431,8 431,8 420,5 500,0 443,2363,6 386,4 409,1 420,5 375,0 795,5 465,9 420,5 352,3 454,5 488,6 420,5431,8 386,4 397,7 431,8 397,7 738,6 488,6 465,9 375,0 397,7 511,4 397,7443,2 409,1 386,4 420,5 397,7 772,7 625,0 488,6 375,0 375,0 534,1 386,4420,5 488,6 431,8 420,5 443,2 784,1 477,3 477,3 375,0 420,5 488,6 454,5420,5 386,4 409,1 397,7 363,6 727,3 454,5 488,6 397,7 409,1 511,4 420,5420,5 386,4 431,8 386,4 397,7 772,7 477,3 511,4 386,4 625,0 511,4 420,5363,6 420,5 409,1 420,5 375,0 738,6 454,5 488,6 409,1 454,5 488,6 420,5

409,1 409,1 375,0 647,7 465,9 534,1 386,4 590,9 511,4 409,1

70

Diámetro (µm ) 0 HORAS DIL. GCH OV 0,7 OV1,0

Diámetro (µm ) 24 HORAS DIL. GCH OV 0,7 OV1,0

Diámetro (µm ) 48 HORAS DiL. GCH OV 0,7 OV1,0

375,0 420,5 409,1 420,5 397,7 659,1 465,9 568,2 443,2 420,5 522,7 386,4443,2 420,5 409,1 431,8 409,1 704,5 488,6 534,1 340,9 306,8 477,3 420,5465,9 443,2 386,4 420,5 397,7 681,8 465,9 534,1 409,1 409,1 477,3 443,2409,1 409,1 431,8 431,8 386,4 704,5 465,9 511,4 443,2 306,8 488,6 443,2443,2 443,2 409,1 431,8 397,7 750,0 454,5 454,5 386,4 306,8 477,3 409,1420,5 397,7 443,2 431,8 375,0 522,7 454,5 500,0 409,1 250,0 511,4 375,0431,8 420,5 443,2 454,5 386,4 454,5 465,9 522,7 397,7 375,0 477,3 454,5443,2 431,8 431,8 409,1 386,4 454,5 488,6 488,6 420,5 386,4 522,7 420,5409,1 397,7 420,5 409,1 363,6 500,0 488,6 602,3 420,5 352,3 761,4 465,9443,2 386,4 443,2 420,5 363,6 568,2 488,6 522,7 397,7 295,5 625,0 772,7431,8 431,8 431,8 409,1 375,0 636,4 488,6 579,5 431,8 409,1 625,0 840,9465,9 420,5 420,5 431,8 420,5 795,5 500,0 545,5 420,5 397,7 693,2 795,5409,1 420,5 420,5 431,8 431,8 772,7 488,6 545,5 420,5 431,8 647,7 738,6386,4 454,5 431,8 409,1 409,1 818,2 420,5 443,2 420,5 795,5 681,8 772,7420,5 375,0 443,2 397,7 420,5 829,5 477,3 431,8 397,7 829,5 681,8 761,4409,1 397,7 431,8 420,5 431,8 840,9 431,8 431,8 431,8 840,9 636,4 772,7

829,5397,7 465,9 420,5 420,5 454,5 477,3 431,8 397,7 454,5 386,4 647,7 772,7386,4 386,4 431,8 409,1 500,0 579,5 465,9 420,5 420,5 329,5 681,8 818,23 397,7 420 ,2 806,8

9 4 772,7, , 0 4 7 3 818,2, , 9 0 7 4 772,7, , 9 3 1 3 795,5, , 7 2 7 4 761,4, , 9 0 9 4 761,4, , 9 2 1 4 784,1, , 6 2 8 4 806,8, , 7 8 3 3 750,0, , 1 9 8 4 750,0, , 4 9 8 5 784,1, , 0 3 1 4 806,8, , 9 0 9 3 750,0, , 1 3 8 4 806,8, , 0 9 6 4 818,2, , 5 8 5 4 750,0, , 5 8 3 4 795,5, , 5 0 4 4 795,5, , 5 6 8 4 761,4, , 9 9 0 4 772,7, , 7 0 7 4 727,3, , 7 9 1 4 750,0, , 9 0 9 4 806,8, , 1 9 8 3 772,7

443,2 386,4 420,5 443,2 431,8 738,6 477,3 409,1 386,4 579,5 659,1 750,0397,7 409,1 420,5 431,8 443,2 772,7 477,3 352,3 420,5 602,3 795,5 840,9375,0 409,1 454,5 420,5 500,0 670,5 431,8 431,8 409,1 522,7 511,4

63,6 443,2 409,1 443,2 681,8 465,9 ,5 409,1 500,0 568420397

,5 , 0 4437 454

2 425 409

,5 40,1 42

,1 4,5 4

3 8 41,8 63,2 6

1,80,5 4

20,531,8

20,586,4

397,7 375,0

454,5 556,8

670,5568,2

443 2 409 1 409,1 40 ,1 4 9,1 7 2,7 409,1 54,5 409,1 590,9 579,5397 7 454 5 386,4 40 ,1 4 1,8 7 5,9 500,0 86,4 443,2 863,6 431,8386386

4 4434 420

2 4095 397

,1 47,7 40

,3 4,1 4

0,5 79,1 7

2,7 45,5 5

88,600,0

09,154,5

409,1 409,1

875,0 727,3

409,1534,1

386 4 409 1 420,5 40 ,1 4 0,5 8 8,2 397,7 43,2 386,4 625,0 568,2375 0 409 1 409,1 38 ,4 4 0,5 7 4,1 500,0 09,1 420,5 636,4 568,2386397

4 4437 431

2 4208 431

,5 39,8 43

,7 3,8 3

6,4 67,7 7

6,4 44,1 4

77,331,8

97,765,9

465,9 409,1

613,6 636,4

681,8693,2

375 0 352 3 454,5 45 ,5 3 7,7 7 4,1 420,5 00,0 375,0 602,3 534,1409 1 386 4 431,8 42 ,5 4 1,8 8 8,2 420,5 65,9 397,7 670,5 545,5386431

4 3868 409

4 4201 431

,5 40,8 43

,1 4,8 4

9,1 71,8 6

5,5 31,8 4

86,431,8

86,431,8

386,4 409,1

693,2 852,3

465,9579,5

397 7 465 9 420,5 42 ,5 3 7,7 3 3,6 465,9 43,2 420,5 500,0 681,8420 5 420 5 409,1 37 ,0 3 6,4 6 9,1 443,2 43,2 397,7 863,6 579,5431386

8 4094 386

1 4314 397

,8 37,7 37

,0 3,0 4

6,4 79,1 8

8,6 40,9 5

88,600,0

54,543,2

397,7 409,1

795,5 625,0

602,3625,0

409 1 375 0 409,1 37 ,0 4 5,9 6 1,8 500,0 31,8 397,7 875,0 579,5375 0 363 6 375,0 40 ,1 3 7,7 8 6,8 488,6 20,5 420,5 545,5 647,7409409

1 3861 443

4 4202 409

,5 39,1 39

,7 4,7 3

9,1 77,7 8

2,7 48,2 4

54,543,2

54,520,5

397,7 420,5

659,1 590,9

579,5556,8

431 8 431 8 375,0 40 ,1 4 9,1 6 3,2 431,8 31,8 352,3 840,9 556,8431 8 431 8 420,5 43 ,8 3 7,7 7 4,1 431,8 97,7 420,5 420,5 590,9

71

Diámetro ( H

tr L G

me RAS G OV1,0

µm ) 0 ORAS DIL. GCH OV 0,7 OV1,0 DI

Diáme o (µm ) 24 HORAS . CH OV 0,7 OV1,0

Diá tro (µm ) 48 HODiL. CH OV 0,7

420, , 9 4 1 4 829,55 454 5 431,8 40 ,1 4 3,2 7 5,9 465,9 09,1 386,4 397,7 568,2375, , 0 8 8 4 784,1

, , 6 0 3 4 761,4, , 1 7 8 4 772,7, , 0 9 9 4 772,7, , 7 0 8 4 806,8, , 0 2 8 3 829,5, , 5 9 5 3 750,0, , 7 2 7 4 772,7, , 5 2 2 4 795,5, , 3 5 0 4 818,2, , 0 8 6 4 806,8

1 7 5 3 761,4

0 465 9 386,4 42 ,5 3 6,4 7 4,1 488,6 43,2 420,5 375,0 568,2443 2 409 1 397,7 38 ,4 4 9,1 7 8,6 488,6 20,5 443,2 613,6 590,9454 5 443 2 443,2 43 ,8 3 5,0 6 1,8 522,7 20,5 397,7 579,5 579,5465 9 363 6 454,5 42 ,5 3 7,7 7 5,5 454,5 09,1 386,4 590,9 681,8409 1 397 7 409,1 39 ,7 4 9,1 7 4,1 465,9 54,5 397,7 590,9 477,3386 4 409 1 477,3 42 ,5 4 0,5 6 1,8 511,4 86,4 375,0 465,9 579,5397 7 420 5 431,8 37 ,0 3 7,7 5 6,8 500,0 97,7 397,7 522,7 579,5375 0 420 5 431,8 47 ,3 4 0,5 4 7,3 454,5 09,1 431,8 465,9 602,3409 1 454 5 420,5 46 ,9 4 0,5 3 9,5 454,5 54,5 409,1 556,8 534,1409 1 420 5 397,7 44 ,2 3 2,3 8 6,8 420,5 54,5 409,1 363,6 500,0431 8 375 0 409,1 42 ,5 3 6,4 5 8,2 454,5 31,8 431,8 340,9 522,7

431,8 43 ,8 4 7,3 7 0,0 431,8 97,7 443,2 545,5 625,0

72

ANEXO E. M c t x e n d os de los s d a 9 0 C g B + Kg P.C),

. ( .

R

atriz omple a del e perimento de dosis d GCH mostra do los iámetroocito (µm) e los tr tamientos A ( 00 +9 0 UI G H / K P.C), (250 900 UI GCH /C (250 +750 UI GCH / Kg P C) y D 750 +750 UI GCH / Kg P.C)

Diámetro (µm ) 0 HORAS A B C D

Diámetro (µm ) 24 HO AS A B C D


381,3 409,1 397,7 409,1 554,6 477,3 431,8 556,8 543,1 431,8 477,3 579,5 346,6 397,7 431,8 397,7 462,2 511,4 454,5 636,4 520,0 454,5 2784,1 659,1 381,3 439,1

454,5 443,2

386,4 443,2

454,5 443,2

496,9 473,8

500,0 488,6

420,5 511,4

670,5 397,7

508,4 508,4

420,5 511,4

556,8 454,5

613,6 636,4

392,9 420,5 443,2 443,2 392,9 488,6 420,5 545,5 508,4 420,5 545,5 568,2 346,6 431,8 409,1 465,9 473,8 534,1 454,5 613,6 554,6 454,5 568,2 613,6 381,3 346,6

420,5 431,8

375,0 386,4

465,9 409,1

520,0 508,4

477,3 556,8

454,5 477,3

511,4 670,5

531,5 554,6

454,5 477,3

511,4 488,6

590,9 579,5

369,8 375,0 454,5 454,5 543,1 488,6 488,6 625,0 496,9 488,6 534,1 625,0 323,5 420,5 431,8 409,1 473,8 477,3 454,5 670,5 485,3 454,5 522,7 602,3 323,5 358,2

409,1 431,8

397,7 409,1

454,5 443,2

427,5 531,5

488,6 454,5

500,0 454,5

602,3 636,4

496,9 520,0

500,0 454,5

522,7 488,6

704,5 613,6

416,0 443,2 420,5 443,2 50 ,2 53 5 8,4 500,0 522,7 568 1,5 522,7 500,0 579,416,0 375,0 397,7 443,2 450,6 454,5 454,5 704,5 496,9 454,5 522,7 556,8 416,0 454,5 454,5 454,5 485,3 534,1 454,5 704,5 520,0 454,5 500,0 534,1 392,9 397,7 431,8 420,5 462,2 465,9 465,9 681,8 485,3 465,9 465,9 556,8 358,2 431,8 420,5 443,2 450,6 500,0 443,2 670,5 462,2 443,2 579,5 625,0 358,2 431,8 363,6 454,5 450,6 522,7 454,5 625,0 543,1 454,5 511,4 625,0 358,2 465,9 409,1 454,5 485,3 488,6 454,5 602,3 520,0 454,5 556,8 568,2 369,8 386,4 397,7 443,2 462,2 488,6 556,8 670,5 543,1 556,8 511,4 545,5 392,9 340,9 409,1 443,2 485,3 454,5 465,9 590,9 589,3 465,9 500,0 556,8 381,3 386,4 386,4 465,9 404,4 500,0 477,3 670,5 554,6 477,3 511,4 613,6 369,8 431,8 431,8 454,5 416,0 511,4 545,5 659,1 566,2 443,2 500,0 704,5 381,3 363,6 477,3 454,5 427,5 477,3 511,4 681,8 566,2 511,4 534,1 750,0 381,3 431,8 431,8 386,4 462,2 420,5 522,7 670,5 520,0 522,7 556,8 647,7 369,8 375,0 477,3 454,5 439,1 500,0 465,9 590,9 473,8 465,9 454,5 522,7 369,8 443,2 409,1 454,5 427,5 465,9 420,5 625,0 508,4 420,5 522,7 579,5 381,3 409,1 375,0 477,3 439,1 454,5 500,0 636,4 416,0 500,0 568,2 602,3 427,5 420,5 386,4 340,9 508,4 488,6 477,3 670,5 496,9 477,3 590,9 625,0 346,6 363,6 465,9 454,5 450,6 465,9 431,8 568,2 520,0 431,8 431,8 579,5 323,5 409,1 397,7 420,5 531,5 465,9 465,9 693,2 520,0 465,9 534,1 602,3 392,9 420,5 409,1 465,9 485,3 465,9 477,3 681,8 496,9 477,3 488,6 681,8 416,0 352,3 386,4 477,3 439,1 477,3 500,0 602,3 496,9 500,0 500,0 693,2 439,1 443,2 420,5 420,5 473,8 465,9 465,9 625,0 508,4 465,9 488,6 636,4 404,4 443,2 420,5 420,5 450,6 488,6 488,6 681,8 496,9 488,6 534,1 602,3 392,9 409,1 386,4 431,8 473,8 488,6 500,0 704,5 543,1 500,0 488,6 568,2 427,5 397,7 409,1 488,6 473,8 465,9 465,9 659,1 531,5 465,9 556,8 500,0 416,0 397,7 375,0 488,6 439,1 522,7 590,9 636,4 496,9 590,9 534,1 579,5 358,2 431,8 409,1 454,5 496,9 465,9 454,5 613,6 508,4 454,5 534,1 670,5 462,2 454,5 420,5 454,5 508,4 465,9 431,8 568,2 462,2 431,8 568,2 556,8 404,4 369,8 42

443,2 0,5 42

386,4 0,5 40

465,9 9,1 56

473,8 6,2 48

454,5 8,6 48

477,3 8,6 62

659,1 5,0 56

508,4 6,2 48

477,3 8,6

545,5 568,2 73

636,4 8,6

73

Diámetro (µm ) 0 HORAS A

R

B C D

etro (µm ) 24 HO AS Diám A B C D


312,0 443,2 420,5 409,1 485,3 534,1 454,5 556,8 531,5 454,5 534,1 556,8 392,9 352,3 431,8 454,5 462,2 534,1 420,5 659,1 554,6 420,5 568,2 647,7 358,2 375,0 386,4 454,5 450,6 477,3 500,0 659,1 520,0 500,0 511,4 659,1 381,3 409,1 431,8 454,5 485,3 477,3 534,1 681,8 520,0 534,1 500,0 556,8 323,5 409,1 409,1 477,3 450,6 477,3 465,9 681,8 496,9 465,9 454,5 636,4 381,3 409,1 420,5 454,5 496,9 568,2 500,0 681,8 496,9 500,0 465,9 625,0 369,8 397,7 409,1 454,5 416,0 420,5 431,8 693,2 520,0 431,8 522,7 647,7 346,6 363,6 363,6 409,1 439,1 488,6 465,9 568,2 496,9 465,9 556,8 534,1 381,3 386,4 375,0 375,0 612,4 386,4 477,3 613,6 577,7 636,4 500,0 897,7 392,9 340,9 363,6 363,6 520,0 386,4 556,8 579,5 531,5 443,2 318,2 715,9 358,2 386,4 420,5 375,0 554,6 261,4 488,6 568,2 543,1 443,2 511,4 852,3 381,3 386,4 386,4 386,4 531,5 215,9 318,2 681,8 566,2 431,8 500,0 397,7 358,2 420,5 431,8 397,7 589,3 340,9 329,5 681,8 554,6 363,6 795,5 875,0 369,8 386,4 397,7 397,7 439,1 363,6 397,7 625,0 508,4 397,7 1

404 ,9 48 ,1 288 1 5,0 9,1 5,0

1

04,4 375,0 409,1 386,4 496,9 363,6 545,5 738,6 566,2 534,1 454,5 420,5 9,8 306,8 409,1 375,0 600,9 465,9 579,5 625,0 589,3 318,2 340,9 545,5

58,2 409,1 409,1 397,7 566,2 431,8 534,1 647,7 554,6 363,6 1125,0 670,5 92,9 295,5 409,1 386,4 496,9 579,5 556,8 306,8 566,2 500,0 1000,0 784,1 92,9 284,1 386,4 397,7 485,3 250,0 534,1 295,5 589,3 784,1 488,6 681,8 69,8 386,4 397,7 363,6 496,9 250,0 409,1 352,3 589,3 465,9 522,7 488,6 2,9 397,7 420,5 340,9 543,1 295,5 556,8 602,3 554,6 852,3 500,0 500,0

16,0 375,0 477,3 352,3 520,0 488,6 488,6 556,8 566,2 454,5 511,4 522,7 92,9 386,4 431,8 375,0 520,0 397,7 500,0 738,6 554,6 443,2 465,9 465,9 92,9 329,5 386,4 340,9 543,1 352,3 522,7 659,1 520,0 409,1 1090,9 477,3 92,9 375,0 420,5 352,3 543,1 329,5 545,5 636,4 577,7 340,9 1000,0 704,5 81,3 420,5 454,5 409,1 543,1 295,5 534,1 693,2 485,3 454,5 852,3 909,1

000,0 750,0 358,2 306,8 329,5 420,5 531,5 500,0 431,8 647,7 577,7 363,6 977,3 670,5 358,2 352,3 409,1 340,9 427,5 454,5 500,0 647,7 543,1 352,3 590,9 431,8

,4 386,4 397,7 340 5,3 465,9 420,5 784 ,9 329,5 715,9 909,323,5 375,0 409,1 37 439,1 352,3 454,5 65 508,4 431,8 977,3 37381,3 329,5 431,8 363,6 462,2 352,3 454,5 727,3 462,2 409,1 988,6 454,5 381,3 340,9 409,1 386,4 496,9 534,1 465,9 363,6 566,2 340,9 761,4 420,5 392,9 306,8 409,1 363,6 520,0 352,3 443,2 318,2 589,3 386,4 011,4 477,3 392,9 295,5 409,1 352,3 554,6 261,4 477,3 352,3 543,1 318,2 943,2 454,5 381,3 318,2 386,4 375,0 554,6 284,1 477,3 647,7 543,1 409,1 920,5 420,5 358,2 386,4 386,4 363,6 485,3 204,5 454,5 647,7 589,3 431,8 954,5 465,9 369,8 386,4 386,4 363,6 462,2 363,6 522,7 579,5 416,0 340,9 522,7 761,4 381,3 420,5 409,1 409,1 520,0 250,0 522,7 613,6 543,1 375,0 511,4 602,3 358,2 352,3 397,7 352,3 473,8 204,5 556,8 534,1 554,6 340,9 454,5 738,6 381,3 295,5 409,1 409,1 496,9 215,9 500,0 636,4 554,6 431,8 454,5 454,5 358,2 340,9 409,1 409,1 589,3 261,4 443,2 363,6 508,4 477,3 522,7 454,5 369,8 431,8 420,5 340,9 508,4 250,0 443,2 329,5 520,0 477,3 556,8 454,5 404,4 329,5 375,0 386,4 566,2 511,4 488,6 340,9 531,5 465,9 454,5 465,9 404,4 295,5 420,5 363,6 531,5 465,9 363,6 579,5 508,4 363,6 534,1 465,9 358,2 329,5 420,5 375,0 624,0 579,5 397,7 568,2 554,6 465,9 568,2 488,6 369,8 431,8 431,8 340,9 531,5 329,5 488,6 613,6 566,2 340,9 545,5 443,2 43633333943333

74

Diámetro (µm ) 0 HORAS C D


Diámetro (µm ) 48 HORAS A B C D A B

392,9 329,5 443,2 352,3 543,1 352,3 397,7 681,8 531,5 454,5 977,3 477,3 43

04,4 318,2 397,7 363,6 358,2 352,3 488,6 329,5 496,9 829,5 1022,7 477,3 81,3 363,6 397,7 363,6 508,4 352,3 409,1 318,2 520,0 340,9 1045,5 477,3 58,2 284,1 397,7 409,1 473,8 340,9 488,6 556,8 520,0 397,7 522,7 534,1 46,6 386,4 409,1 431,8 543,1 329,5 556,8 659,1 531,5 318,2 659,1 511,4 04,4 329,5 443,2 409,1 346,6 465,9 522,7 340,9 543,1 454,5 522,7 454,5 04,4 409,1 409,1 409,1 566,2 318,2 522,7 306,8 520,0 454,5 522,7 500,0 2,9 363,6 386,4 420,5 520,0 340,9 431,8 625,0 531,5 477,3 511,4 443,2

69,8 329,5 420,5 420,5 485,3 397,7 500,0 659,1 554,6 340,9 511,4 454,5 46,6 375,0 340,9 409,1 543,1 500,0 431,8 318,2 531,5 352,3 511,4 465,9 16,0 340,9 363,6 363,6 543,1 295,5 500,0 363,6 485,3 340,9 511,4 454,5 63,6 465,9 454,5 431,8 647,7 659,1 602,3 420,5 431,8 454,5 261,4 795,5 1,8 443,2 409,1 443,2 625,0 590,9 488,6 375,0 409,1 454,5 227,3 704,5

31,8 465,9 397,7 431,8 704,5 568,2 454,5 375,0 352,3 500,0 465,9 375,0 97,7 431,8 420,5 431,8 579,5 568,2 477,3 386,4 454,5 465,9 340,9 329,5 86,4 431,8 431,8 397,7 636,4 545,5 477,3 409,1 477,3 454,5 511,4 375,0

4 545,5 465,9 511,4 375,0 477,3 431,8 534,1 454,5 45,5 420,5 420,5 386,4 545,5 477,3 454,5 397,7 454,5 420,5 431,8 818,2

454,5 420, ,1 409,1 568,2 556,8 386,4 568,2 409,1 920,5 6 1,

1 4 ,2 1 7 4 ,9 6 2 1 397,7 602,3 454,5 534,1 375,0 465,9 431,8 397,7 738,6

420,5 443,2 386,4 420,5 534,1 534,1 443,2 397,7 454,5 431,8 352,3 931,8 420,5 363,6 386,4 420,5 454,5 568,2 431,8 375,0 431,8 409,1 534,1 306,8 454,5 409,1 431,8 431,8 511,4 500,0 454,5 352,3 363,6 409,1 488,6 806,8 420,5 465,9 409,1 397,7 613,6 534,1 545,5 420,5 829,5 352,3 545,5 272,7 443,2 420,5 363,6 397,7 500,0 454,5 522,7 352,3 534,1 375,0 659,1 340,9 431,8 443,2 409,1 443,2 613,6 477,3 511,4 375,0 477,3 568,2 625,0 772,7 443,2 420,5 431,8 397,7 647,7 488,6 556,8 386,4 511,4 522,7 613,6 363,6 454,5 465,9 409,1 420,5 681,8 522,7 511,4 375,0 488,6 465,9 488,6 431,8 409,1 409,1 443,2 420,5 761,4 534,1 545,5 431,8 590,9 500,0 568,2 397,7 488,6 454,5 420,5 420,5 750,0 443,2 534,1 363,6 454,5 477,3 227,3 340,9 409,1 420,5 409,1 397,7 613,6 579,5 511,4 340,9 409,1 443,2 511,4 352,3 443,2 386,4 386,4 420,5 568,2 522,7 534,1 397,7 511,4 454,5 477,3 329,5 409,1 465,9 397,7 386,4 556,8 511,4 545,5 465,9 465,9 454,5 318,2 340,9 409,1 477,3 420,5 386,4 659,1 500,0 500,0 454,5 477,3 477,3 488,6 340,9 420,5 397,7 431,8 375,0 738,6 488,6 545,5 454,5 500,0 420,5 556,8 375,0 454,5 454,5 386,4 397,7 681,8 488,6 477,3 454,5 511,4 409,1 227,3 318,2 443,2 465,9 409,1 386,4 670,5 534,1 568,2 397,7 352,3 488,6 488,6 340,9 409,1 454,5 420,5 409,1 727,3 545,5 477,3 409,1 500,0 420,5 556,8 352,3 443,2 477,3 386,4 454,5 625,0 579,5 568,2 409,1 511,4 443,2 602,3 431,8 477,3 431,8 477,3 454,5 681,8 500,0 534,1 386,4 488,6 454,5 556,8 625,0 443,2 420,5 409,1 477,3 534,1 488,6 454,5 454,5 511,4 431,8 465,9 340,9 443,2 443,2 397,7 397,7 681,8 454,5 511,4 454,5 534,1 409,1 386,4 363,6

334439334343433420,5 431,8 420,5 454,5 750,0 602,3 488,6 340,9 477,3 465,9 375,0 375,0 431,8 375,0 397,7 386,5

5 409 409,1 625,0 420,5 454,5 409,1 352,3 25,0 511,4 534,1 352,3 43 8 500,0 454,5 920,5 443,2 409, 409,1 397,7 625,0 54,5 454,5 318 477,3 5 1,4 329,5 681,8 397,7 397, 386,4 431,8 556,8 77,3 556,8 340 500,0 4 5,9 227,3 886,4 420,5 443, 409,

75




454,5 431,8 397,7 397,7 522,7 522,7 556,8 363,6 420,5 477,3 511,4 352,3 477,3 454,5 454,5 443,2 659,1 465,9 477,3 352,3 488,6 477,3 511,4 329,5 477,3 625,0 443,2 409,1 715,9 500,0 431,8 375,0 465,9 443,2 568,2 363,6 454,5 454,5 454,5 454,5 704,5 465,9 420,5 386,4 477,3 454,5 488,6 352,3 420,5 443,2 386,4 397,7 647,7 454,5 522,7 363,6 454,5 454,5 454,5 306,8 465,9 431,8 420,5 431,8 647,7 511,4 545,5 431,8 420,5 454,5 215,9 284,1 454,5 409,1 454,5 431,8 681,8 500,0 590,9 477,3 454,5 465,9 193,2 375,0 443,2 397,7 454,5 386,4 750,0 568,2 454,5 306,8 500,0 454,5 579,5 386,4 443,2 431,8 375,0 431,8 579,5 613,6 454,5 386,4 522,7 465,9 647,7 340,9 477,3 420,5 420,5 397,7 579,5 534,1 534,1 431,8 511,4 534,1 522,7 306,8 488,6 420,5 397,7 386,4 625,0 522,7 534,1 431,8 590,9 443,2 454,5 329,5 465,9 397,7 386,4 397,7 647,7 568,2 545,5 352,3 454,5 454,5 340,9 306,8 465,9 454,5 420,5 420,5 659,1 590,9 556,8 420,5 409,1 465,9 340,9 465,9 409,1 358,2 443,2

443,2 409,1 420,5

409,1 420,5 420,5

420,5 409,1 420,5

727,3 496,9 431,8

545,5 227,3 522,7

500,0 409,1 511,4

352,3 443,2 431,8

522,7 462,2 522,7

477,3 454,5 420,5

340,9 954,5 375,0

465,9 465,9 318,2

76

ANEXO F. Matriz completa de la longitud total (mm) del experimento de temperatura en las prelarvas de L. guttatus.

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

2,30 2,17 2,17 2,61 2,39 2,50 2,39 2,91 2,61 2,61 2,17 2,17 2,61 2,50 2,50 2,33 2,11 2,39 2,50 2,83 1,67 2,28 2,28 2,61 2,54 2,50 2,17 2,61 2,76 2,39 2,17 2,17 2,39 2,50 2,70 2,50 2,17 2,50 2,72 2,57 2,28 2,39 2,65 2,61 2,57 2,28 2,17 2,39 2,52 2,61 2,61 2,28 2,28 2,87 2,50 2,43 2,50 2,52 2,50 2,52 2,30 2,13 2,28 2,61 2,76 2,28 2,17 2,50 2,78 2,50 2,50 2,50 2,67 2,61 2,39 2,17 2,17 2,17 2,39 2,67 2,28 2,17 2,91 2,76 2,61 1,74 2,52 2,61 2,50 2,50 2,28 2,09 2,39 2,61 2,67 2,50 2,43 2,72 2,50 2,72 1,63 2,50 2,76 2,61 2,39 2,24 2,17 2,17 2,57 2,70 1,72 2,72 2,72 2,61 2,76 2,39 2,65 2,39 2,50 2,50 2,30 2,83 2,17 2,61 2,76 1,63 2,83 2,83 2,83 2,61 2,52 2,39 2,61 2,61 2,17 2,33 2,83 2,28 2,39 2,70 2,50 2,76 2,61 2,61 2,76 2,50 2,61 2,61 2,50 2,39 2,28 2,76 2,30 2,43 2,61 1,59 2,74 2,61 2,50 2,78 2,50 2,67 2,59 2,50 2,39 2,28 2,61 2,28 2,72 2,61 2,59 2,76 2,80 2,61 2,78 2,54 2,50 2,61 2,57 2,43 2,28 2,74 2,11 2,72 2,50 1,63 2,61 2,72 2,61 2,85 2,61 2,74 2,59 2,50 2,52 2,28 2,72 2,28 2,83 2,63 2,43 2,83 2,72 2,61 2,50 2,63 2,28 2,50 2,50 2,50 2,28 2,50 2,28 2,50 2,57 2,59 2,78 2,57 2,50 2,50 1,72 2,13 2,61 2,43 2,52 2,30 2,61 2,28 2,63 2,61 1,67 2,80 2,43 2,83 2,61 1,67 2,17 2,07 2,65 2,57 2,28 2,72 2,17 2,57 2,61 2,54 2,72 2,93 2,87 2,61 1,63 2,07 2,28 2,67 2,35 2,30 2,50 2,28 2,61 2,50 2,46 2,61 2,28 2,87 2,39 1,63 2,17 2,28 0,33 2,46 2,17 2,54 2,65 2,50 2,57 2,57 2,67 2,61 2,83 2,46 1,59 2,17 2,39 2,50 2,50 2,28 2,39 2,50 2,50 2,61 1,65 2,76 2,61 2,76 2,50 1,65 2,17 2,57 2,39 2,54 2,24 2,67 2,80 2,61 2,54 2,46 2,76 2,50 2,63 2,76 1,41 2,13 2,72 2,43 2,57 1,65 2,50 2,76 2,50 2,39 1,65 2,76 2,61 2,61 2,78 2,61 2,17 2,61 2,39 2,39 1,57 2,57 2,65 2,70 2,65 2,54 2,67 2,96 2,39 2,87 2,39 2,17 2,78 2,50 2,61 1,57 2,74 2,83 2,61 2,61 2,61 2,76 2,61 2,50 2,80 2,48 2,17 2,78 2,61 2,50 1,74 2,61 2,76 2,57 2,61 1,74 2,39 2,50 2,57 2,78 2,54 2,61 2,72 2,50 2,28 2,17 2,61 2,61 2,61 2,50 1,41 2,43 2,61 2,61 2,72 2,39 2,50 2,83 2,65 2,43 1,52 2,74 2,28 2,61 2,61 1,52 2,35 2,50 2,74 2,50 1,52 2,57 2,61 2,46 2,50 2,37 2,46 2,72 2,72 2,50 2,54 2,35 2,54 2,72 2,54 1,30 2,39 2,61 2,50 2,39 1,70 2,61 2,17 2,72 2,57 1,70 2,39 2,50 2,65 2,50 1,70 2,61 2,78 2,43 2,43 2,37 2,72 2,72 2,61 2,39 1,52 2,17 2,54 2,72 2,50 1,52 2,09 2,61 2,39 2,39 2,17 2,61 2,72 2,61 2,72 2,52 2,83 2,87 2,65 2,78 2,54 2,43 2,39 2,28 2,61 2,28 2,61 2,70 2,50 2,65 2,39 2,83 2,83 2,61 2,78 2,39 2,61 2,39 2,39 2,61 2,28 2,65 2,61 2,74 2,61 1,63 2,80 2,93 2,65 2,50 2,54 2,39 2,76 2,39 2,63 2,28 2,61 2,65 2,39 2,76 1,63 2,72 2,80 2,65 2,61 2,37 2,61 2,57 2,28 2,61 2,30 2,57 2,72 2,50 2,72 2,50 2,67 2,61 2,61 2,61 2,50 2,43 2,72 2,39 2,50 2,33 2,50 2,61 2,63 2,50 2,54 2,61 2,76 2,61 2,83 2,43 2,50 2,72 2,28 2,61 2,17 2,46 2,72 2,61 2,39 2,39 2,72 2,17 2,52 2,80 1,63 2,39 2,61 2,57 2,57 2,28 2,61 2,76 2,61 2,39 2,54 2,83 2,50 2,63 2,61 1,67 2,28 2,65 2,65 2,39 2,17 2,72 2,72 2,54 2,72 1,63 2,17 2,17 2,61 2,72 1,63 2,50 2,72 2,50 2,39 2,33 2,39 2,76 2,61 2,39 2,50 2,41 2,39 2,61 2,67 1,67 2,17 2,50 2,28 2,50 2,37 2,17 2,61 2,39 2,61 1,63 2,39 2,89 2,61 2,72 1,67 2,17 2,39 2,35 2,61 2,37 2,39 2,54 2,61 2,72 1,72 2,39 2,96 2,50 2,78 2,43 2,17 2,61 2,35 2,61 1,65 2,39 2,78 2,57 2,83 2,39 2,65 2,87 2,61 2,61 2,50 2,39 2,39 2,28 2,39

77

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

1,41 2,17 2,74 2,72 2,57 2,43 2,61 2,50 2,43 2,61 2,59 2,54 2,61 2,17 2,43 2,17 2,39 2,61 2,59 2,72 2,35 2,72 2,50 2,70 2,61 2,59 2,63 2,50 2,59 2,28 2,28 2,39 2,39 2,61 2,61 2,39 2,70 2,80 2,87 2,78 2,46 2,59 2,61 2,28 2,61 2,17 2,28 2,65 2,65 2,76 2,50 2,65 2,74 2,59 2,83 2,54 2,61 2,63 2,39 2,39 2,28 2,39 2,50 2,52 2,61 2,39 2,39 2,54 2,83 2,72 2,50 2,59 2,50 2,35 2,61 2,26 2,33 2,57 2,83 2,72 2,50 2,76 2,72 2,70 2,72 2,39 2,28 2,61 2,57 2,50 2,35 2,39 2,65 2,61 2,67 1,57 2,72 2,67 2,76 2,54 2,54 2,17 2,50 2,35 2,61 2,33 2,39 2,67 2,72 2,72 1,57 2,78 2,67 2,83 2,50 1,63 2,65 2,50 2,39 2,39 2,17 2,33 2,57 2,72 2,72 2,50 2,28 2,50 2,87 2,61 1,65 2,70 2,72 2,52 2,48 2,17 2,33 2,72 2,76 2,72 2,50 2,39 2,61 2,83 2,50 1,63 2,50 2,67 2,50 2,50 2,33 2,39 2,28 2,61 2,61 2,39 2,43 2,67 2,83 2,57 2,48 2,43 2,50 2,39 2,46 2,24 2,33 2,28 2,74 2,59 1,63 2,39 2,61 2,72 2,61 2,57 2,39 2,52 2,39 2,39 2,33 2,39 2,28 2,72 2,72 2,39 2,39 2,48 2,74 2,57 2,54 2,43 2,61 2,30 2,50 2,33 2,28 2,17 2,76 2,61 2,61 2,39 2,76 2,61 2,80 2,39 2,50 2,59 2,61 2,61 2,37 2,35 2,61 2,72 2,59 1,63 2,72 2,72 2,72 2,72 2,59 2,54 2,72 2,28 2,50 2,17 2,43 2,28 2,72 2,61 1,30 2,72 2,61 2,65 2,72 2,50 2,57 2,67 2,39 2,39 2,28 2,35 2,70 2,72 2,72 1,65 2,72 2,59 2,61 2,78 2,57 2,50 2,50 2,46 2,33 2,39 2,63 2,57 2,80 2,39 2,65 2,87 2,57 2,72 2,39 2,70 2,59 2,28 2,24 2,33 2,54 2,67 2,78 2,46 2,72 2,61 2,61 2,54 2,50 2,28 2,61 2,50 2,17 2,39 2,39 2,72 2,83 2,17 2,61 2,83 2,50 2,76 1,65 2,46 2,39 2,39 2,17 2,37 2,61 2,70 2,76 2,57 2,80 2,93 2,76 2,61 1,57 2,50 2,61 2,57 2,17 2,28 2,39 2,70 2,72 2,39 2,72 2,89 2,61 2,80 1,57 2,28 2,61 2,52 2,28 2,35 2,50 2,65 2,78 1,63 2,72 2,83 2,50 2,72 1,74 2,17 2,61 2,39 2,15 2,28 2,59 2,72 2,78 1,67 2,43 2,61 2,61 2,67 1,41 2,61 2,59 2,50 2,09 2,17 2,61 2,61 2,83 2,39 2,43 2,50 2,50 2,72 2,50 2,39 2,78 2,39 2,17 2,39 2,61 2,50 2,59 2,50 2,28 2,50 2,61 2,78 2,61 2,61 2,72 2,50 2,17 2,57 2,61 2,61 2,61 2,28 2,39 2,43 2,50 2,83 2,61 2,17 2,50 2,17 2,24 2,61 2,39 2,50 2,63 2,39 2,43 2,39 2,61 2,83 2,50 1,96 2,39 2,39 2,26 2,50 2,61 2,43 2,61 2,17 2,46 2,50 2,50 2,85 2,61 2,09 2,39 2,39 2,22 2,65 2,61 2,61 2,57 2,39 2,39 2,50 2,50 2,72 2,50 2,17 2,46 2,44 2,26 2,72 2,39 2,39 2,50 2,28 2,76 2,72 2,57 2,78 2,63 2,07 2,33 2,52 2,22 2,61 2,50 2,61 2,65 2,17 2,61 2,78 2,50 2,83 2,39 2,61 2,61 2,50 2,26 2,57 2,54 2,54 2,61 1,41 2,67 2,87 2,50 2,57 2,61 2,61 2,50 2,52 2,17 2,67 2,39 2,50 2,61 2,07 2,57 2,93 2,44 2,61 2,39 2,50 2,39 2,57 2,17 2,61 2,39 2,61 2,61 2,61 2,63 2,87 2,65 2,50 2,61 2,54 2,50 2,35 2,07 2,54 2,74 2,50 2,67 1,63 2,74 2,89 2,67 2,43 2,50 2,61 2,52 2,46 2,02 2,57 2,61 2,39 2,52 2,39 2,54 2,91 2,50 2,41 2,28 2,52 2,50 2,50 1,91 2,65 2,50 2,72 2,61 2,61 2,78 2,87 2,50 2,59 2,61 2,17 2,61 2,54 2,17 2,59 2,39 2,61 2,83 2,61 2,61 2,83 2,39 2,76 2,50 2,50 2,39 2,57 2,13 2,61 2,76 2,72 2,72 2,50 2,57 2,91 2,44 2,83 2,54 2,52 2,48 2,39 2,09 2,39 2,72 2,80 2,65 2,46 2,54 2,80 2,39 2,72 2,46 2,59 2,50 2,61 2,07 2,33 2,78 2,72 2,61 2,57 2,61 2,83 2,50 2,61 1,63 2,39 2,46 2,50 2,11 2,61 2,72 2,78 2,67 2,52 2,39 2,76 2,61 2,78 1,72 2,61 2,61 2,28 2,17 2,57 2,61 2,50 2,67 2,54 2,50 2,61 2,50 2,76 1,63 2,61 2,61 2,44 2,09 2,61 2,67 2,39 2,70 2,61 2,76 2,78 2,65 2,72 1,63 2,61 2,39 2,50 2,13 2,72 2,54 2,72 2,72 2,46 2,72 2,87 2,46 2,67 2,57 2,63 2,39 2,39

78

ANEXO G. Matriz completa del volumen del vitelo (µm³) del experimento de temperatura en las prelarvas de L. guttatus.

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

151,3 26,0 27,3 19,4 0,0 86,1 64,7 14,5 2,0 0,0 151,0 57,8 19,5 0,0 151,3 33,3 19,5 10,9 0,0 117,2 78,4 11,8 4,0 0,0 151,0 74,9 15,6 0,0 158,0 48,4 27,3 18,2 0,0 117,2 71,5 15,1 2,0 0,0 113,8 54,5 14,5 0,0 139,4 28,7 27,3 13,4 0,0 96,8 70,0 14,5 2,0 0,0 123,9 49,6 16,1 0,0 92,5 38,2 19,5 14,0 0,0 96,8 87,4 16,1 1,9 0,0 87,4 52,0 15,6 0,0

136,3 25,4 23,2 15,1 0,0 81,6 71,5 17,6 2,2 0,0 76,7 66,8 15,6 0,0 114,6 54,4 16,1 17,6 0,0 96,8 80,2 13,1 1,9 0,0 86,1 71,5 9,0 0,0 112,0 26,0 19,5 10,9 0,0 87,4 81,6 19,5 2,9 0,0 113,8 53,3 13,4 0,0 86,1 87,4 13,4 12,9 0,0 117,2 78,4 16,1 2,0 0,0 86,1 40,9 8,6 0,0 59,1 28,7 14,5 13,4 0,0 119,5 68,4 18,9 2,9 0,0 59,0 52,0 15,6 0,0 87,4 24,7 42,4 16,9 0,0 86,1 78,4 31,6 2,9 0,0 87,4 52,0 13,4 0,0 87,4 57,5 16,1 19,4 0,0 104,1 71,5 12,2 2,7 0,0 87,4 34,5 8,6 0,0 96,8 53,7 16,1 14,0 0,0 98,9 74,6 13,1 2,9 0,0 96,8 27,1 14,0 0,0 89,3 52,3 16,1 14,0 0,0 106,8 40,9 16,1 1,9 0,0 87,4 49,6 14,5 0,0

106,8 44,8 16,1 10,5 0,0 90,4 52,0 16,1 2,2 0,0 106,8 50,8 16,9 0,0 90,4 42,4 13,1 18,2 0,0 106,8 40,9 12,6 2,0 0,0 99,0 44,3 8,6 0,0 77,7 44,8 18,9 13,4 0,0 107,6 42,4 12,6 2,5 0,0 78,4 42,2 10,5 0,0 86,1 34,5 19,5 14,5 0,0 106,8 50,8 13,1 2,0 0,0 86,1 36,9 12,4 0,0

106,7 54,4 19,5 10,5 0,0 83,5 70,0 15,1 1,9 0,0 106,8 36,9 12,2 0,0 134,5 48,4 15,1 19,5 0,0 94,9 62,2 12,2 2,9 0,0 123,9 38,0 11,3 0,0 85,4 30,9 20,2 15,6 0,0 86,1 52,0 17,6 2,0 0,0 86,1 48,4 15,1 0,0 99,6 31,8 20,8 10,9 0,0 90,4 62,0 18,9 1,9 0,0 99,0 42,2 15,6 0,0 87,8 26,3 18,8 15,6 0,0 96,8 53,3 14,5 1,9 0,0 87,4 48,4 8,6 0,0 83,0 41,1 19,5 14,0 0,0 151,3 69,7 17,6 2,0 0,0 80,2 43,2 10,0 0,0 83,9 36,9 49,8 12,4 0,0 99,6 54,5 12,6 2,9 0,0 84,0 48,4 14,0 0,0 88,5 55,1 19,5 10,5 0,0 90,4 55,7 16,1 2,9 0,0 87,4 40,1 12,2 0,0 79,6 52,3 16,7 18,2 0,0 96,8 54,5 12,6 2,0 0,0 80,2 48,4 26,4 0,0 64,6 31,8 39,9 10,9 0,0 90,4 52,0 12,2 2,9 0,0 65,0 55,1 12,2 0,0 77,7 38,0 20,8 16,3 0,0 96,8 40,9 21,5 2,9 0,0 78,4 43,2 12,6 0,0 79,6 47,2 21,5 15,5 0,0 96,8 48,4 12,6 1,5 0,0 80,2 42,2 8,6 0,0 55,7 42,4 23,2 12,6 0,0 151,3 94,7 13,9 4,0 0,0 99,0 31,8 14,0 0,0

130,1 41,2 25,6 15,1 0,0 151,3 54,5 17,2 2,0 0,0 96,8 30,0 17,6 0,0 79,6 27,1 24,8 16,1 0,0 158,0 59,2 16,1 2,0 0,0 96,8 40,1 10,9 0,0 71,5 39,9 19,5 16,7 0,0 139,4 33,3 18,8 4,0 0,0 96,8 46,8 6,3 0,0

130,9 42,4 20,2 17,6 0,0 92,5 69,7 16,1 2,5 0,0 96,8 34,8 13,4 0,0 154,7 34,8 18,3 11,8 0,0 136,3 60,6 13,1 1,6 0,0 92,5 36,9 10,5 0,0 99,0 42,4 21,5 22,5 0,0 114,6 31,0 13,1 2,0 0,0 96,8 38,0 10,9 0,0

119,8 39,9 16,7 16,1 0,0 112,0 52,0 20,8 2,0 0,0 96,8 43,6 10,5 0,0 77,7 35,8 25,6 16,7 0,0 86,1 59,2 13,1 2,0 0,0 87,4 46,8 13,4 0,0 86,1 39,0 20,2 13,1 0,0 59,1 56,5 16,7 2,0 0,0 87,4 56,0 12,9 0,0 96,8 43,6 17,8 16,1 0,0 87,4 62,2 17,2 1,6 0,0 99,0 38,0 10,0 0,0

101,1 43,6 17,2 16,1 0,0 87,4 66,2 16,7 2,5 0,0 85,4 35,8 10,9 0,0

79

80

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

22 ºC 12 h 24h 36h 48h 60h

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193,7 36,4 25,6 14,0 0,0 93,2 46,4 15,1 2,4 0,0 93,0 37,0 13,4 0,0 193,7 48,4 27,3 14,0 0,0 99,0 62,0 5,6 1,5 0,0 80,2 38,0 11,3 0,0 107,6 44,8 24,0 10,5 0,0 83,9 62,0 15,1 1,5 0,0 115,0 38,0 0,0 0,0 107,6 47,2 23,4 18,2 0,0 106,8 42,7 12,2 2,3 0,0 87,4 22,0 8,6 0,0 245,4 36,9 20,8 13,4 0,0 83,7 62,0 15,6 1,5 0,0 94,7 30,1 13,4 0,0 77,7 35,5 27,1 14,5 0,0 70,0 54,5 16,1 1,5 0,0 94,7 54,4 10,9 0,0

107,6 40,1 19,4 10,5 0,0 87,1 62,0 15,6 1,5 0,0 87,4 38,0 10,9 0,0 77,7 49,6 27,1 19,5 0,0 77,7 54,5 16,1 1,5 0,0 86,1 27,1 10,9 0,0

117,2 35,5 27,1 15,6 0,0 76,2 48,4 18,9 1,5 0,0 90,1 37,0 0,0 0,0 117,2 41,1 27,9 10,9 0,0 77,7 62,0 13,5 1,9 0,0 92,5 26,0 11,8 0,0 97,1 51,0 27,1 15,6 0,0 76,2 62,0 13,5 1,5 0,0 76,7 36,9 13,4 0,0

193,7 35,5 32,7 14,0 0,0 81,9 49,6 15,1 1,9 0,0 74,9 36,9 14,5 0,0 97,1 40,1 23,2 12,4 0,0 83,7 53,7 15,6 2,2 0,0 87,4 46,8 10,9 0,0

261,8 41,1 27,1 10,5 0,0 77,7 62,0 16,7 2,3 0,0 87,4 56,0 10,9 0,0 85,4 36,4 27,3 18,2 0,0 77,7 62,0 15,6 2,4 0,0 90,4 38,0 0,0 0,0

EFECTO DE LA TEMPERATURA EN PRELARVAS DE L guttatus

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Transcript of EFECTO DE LA TEMPERATURA EN PRELARVAS DE L guttatus