EFECTO DE LOS ÉSTERES ETÍLICO Y BENCÍLICO … · carcinogénico en animales de laboratorio...

V Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica XVI Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica

VI Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular

Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C. P. 02090, México, D. F. Tel. y Fax: 5623 3088 email: [email protected], [email protected]

Clave: 1401708

EFECTO DE LOS ÉSTERES ETÍLICO Y BENCÍLICO DEL ÁCIDO N-PROPIL OXAMICO SOBRE EL METABOLISMO ENERGÉTICO DE DOS CEPAS DE Trypanososma cruzi.

Aguirre-Alvarado, Charmina; Rodríguez-Páez, Lorena; Baeza-Ramírez, María Isabel; Nogueda-Torres, Benjamín; Wong-Ramírez, Carlos. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES Laboratorio de Enzimología del departamento de Bioquímica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Prol. Carpio y Plan de Ayala s/n. C.P. 11340. CORREO ELECTRÓNICO [email protected]




INTRODUCCIÓN Aspectos generales de T. cruzi La tripanosomiasis americana ò enfermedad de Chagas es causada por la infección de Trypanosoma cruzi; protozoario hematoflagelado (familia Trypanosomatidae, orden Kinetoplastida) cuyo ciclo de vida involucra el paso de un insecto vector , hematófago, perteneciente principalmente a las especies la Triatoma sp, Rhodnius sp, Pastrongylus sp. y un vertebrado (generalmente un mamífero), presentando diferentes estadios: El tripomastigote (que es la forma circulante flagelada que penetra a las células del huésped) es ingerido por el insecto, al llegar al intestino este se diferencia a su forma proliferativa flagelada de epimastigote hasta llegar a la porción anterior del intestino donde toma la forma de tripomastigote metacíclico. Esta última es la forma infectiva trasmitida al vertebrado con la consecuente diferenciación a amastigote (forma esférica, intracelular), el cual mediante varios ciclos reproductivos se convierte de nuevo en tripomastigote y finalmente lisa la célula huésped para liberarse a torrente sanguíneo y diseminar la infección a otras células (Hoare, 1966). La transmisión de la enfermedad ocurre en la mayoría de los casos mediante el insecto vector (80-90%), en menor proporción por transfusión sanguínea (5-20%), en México entre 1994 y 1996 se detectó una prevalencia de infección chagásica en los centros estatales de transfusión de México igual a 1,5% y por ruta congénita (0.5-8%) Adicionalmente puede ser transmitido, por trasplante de órganos contaminados o por auto-inoculación accidental en laboratorios y hospitales (Días, 2000). Esta enfermedad esta dispersada por todo el continente americano y según el informe de la OMS (2002) entre 16-18 millones de personas se encuentran afectadas por este padecimiento y más de 100 millones están en riesgo de contraer la infección. La enfermedad de Chagas ha sido catalogada como una de las enfermedades causadas por parásitos más importantes de Latinoamérica, teniendo un impacto socio-económico considerablemente mayor que el causado en conjunto por otro tipo de parásitos (OMS, 1991). En México algunas regiones endémicas son los estados de: Morelos, Oaxaca, Nayarit, Yucatán y Chiapas, en este último estado se han presentado reportes de comunidades con hasta el 30% de la población infectada (Guzmán, 2001). Tratamiento. Hasta ahora sólo dos compuestos han sido aceptados para el tratamiento de la enfermedad de Chagas: El Nifurtimox (Nf) y el Benznidazol (Bz) comercializados con los nombres de Lampit y Radanil respectivamente. Sin embargo estos fármacos solamente son efectivos en las primeras fases de la enfermedad y debido al su mecanismo de acción que implica la producción de radicales libres, para los cuales el sistema de detoxificación de T. cruzi es ineficiente, han resultado tener efectos adversos como nausea, cefalea, dermatitis y al usarse por periodos prolongados presentan carácter mutagénico y carcinogénico en animales de laboratorio (Teixeira et al, 1990).




Metabolismo energético de Trypanosoma cruzi. La fuente principal de energía para este parásito es la glucosa, por tanto la glicólisis juega un papel muy importante. El metabolismo anaeróbico de los carbohidratos, requiere de un balance de la coenzima NAD+ la cual actúa como agente oxidante, sin embargo la cantidad de NAD+ en cualquier célula es limitado por lo tanto la glicólisis se detendrá tan pronto como el NAD+ desaparezca. En T cruzi el reciclaje de este cofactor oxidado lo realiza una enzima que utiliza como sustratos otros α-cetoácidos además del piruvato, es por esta razón que se le ha denominado como α-hidroxiacido deshidrogenasa (α-HADH). Esta enzima presenta dos isoenzimas; la tipo I que utiliza como sustrato el piruvato y butirato, y la tipo II que utiliza como sustratos a una gran cantidad de α-cetoácidos como el α-cetocaproato (Blanco. 1991). Por otro lado se ha demostrado que la HADH-isoenzima II participa en un sistema de lanzadera que le permite a T. cruzi transferir los equivalentes reductores (NADH) del citoplasma al interior de la mitocondria (Gerez de Burgos. 1978), en donde son oxidados en la cadena respiratoria, para la consecuente producción de ATP. (Fig.1).

α-HADH α-HADH

FIGURA 1. Esquema del metabolismo energético de T. cruzi (Gerez de Burgos. 1978) Inhibición de la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II de T.cruzi (α- HADH). Efecto del ácido N-propil oxámico sobre el metabolismo energético de T.cruzi. En la búsqueda de compuestos análogos a estos sustratos que funcionen como inhibidores de la α-HADH se han diseñado y sintetizado derivados del ácido oxámico (Chena et al., 2005) como el N-propil oxámico (NPOx). Estos compuestos demostraron ser excelente inhibidores competitivos de la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II (α-HADH-II) de T. cruzi debido a la similitud estructural con los sustratos de la enzima como se muestra en la figura 2.




O

O

OH

O

OHN

O

Ácido α-cetocapróico éster bencílico del NPOX

NOH

O

OH

O

OHN

O

Ácido N-propil oxámico éster etílico del NPOX

Figura 2. Estructura química del ácido α-cetocapróico, sustrato de la α-HADH de T. cruzi y sus análogo estructural, el acido N-propil oxámico, así como los ésteres bencílico y etílico del NPOx. Cuando se probaron los oxamatos N-sustituidos in vitro sobre cultivos de T. cruzi e in vivo sobre la parasitemia en animales de laboratorio no resultaron tener actividad tripanomicida a pesar de presentar un buen efecto inhibidor in vitro de la α-HADH-II de T. cruzi. Se considero entonces que debido a la polaridad de los oxamatos N-sustituidos son incapaces de atravesar las membranas celulares para inhibir la enzima (Elizondo. 2003). Por esta razón se ha optado por la síntesis de los ésteres correspondientes de menor polaridad que puedan atravesar las membranas celulares y una vez dentro del tripanosoma ser hidrolizadas por las esterasas intracelulares (Aldunate, 1987) y liberen los oxamatos N-sustituidos con actividad biológica(Elizondo, 2003), tal y como se muestra en la figura 3, utilizando el éster bencílico del ácido N-propil oxámico (NPOx-B) como profármarco inhibidor de la α-HADH de T. cruzi. Debido a lo anterior el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del NPOx-B y NPO-Et sobre el metabolismo energético de las cepas INC-5 y NINOA de T. cruzi mediante las siguientes actividades: a) Estudiar el efecto del NPOx-B, NPOx-Et y el ácido N-propil oxámico sobre la actividad de la α-hidroxiácido deshidrogenasa de T. cruzi, tanto en un homogenizado del parasito como sobre la enzima purificada y b) Determinar el efecto del NPOx-B, NPOx-Et sobre los niveles de ATP de las cepas de T. cruzi en estudio.




CH3

CH2

CH2

NH2

C O

COO CH2

CH3

CH2

CH2

NH2

C O

COO CH2

ESTERASAS

H2O

+ CH2-OH

Figura 3. Mecanismo propuesto para el posible efecto inhibitorio de la α-HADH de T. cruzi que ejercerá el éster bencílico del ácido N-propil oxámico MATERIALES Y MÉTODOS Compuestos químicos

El NPOx-B, NPOx-Et fueron sintetizados anteriormente en el laboratorio de enzimología Depto. Bioquímica de ENCB-IPN, al igual que el NPOx que proviene de la hidrtolisis de cualquiera de los dos esteres (Chena 2004), Material biológico

a) T. cruzi cepa INC-5. Fue aislada en el año de 1997 a partir de una paciente de 58 años de edad, con cuadro crónico de la enfermedad. La paciente era procedente de la localidad Congregación del estado de Guanajuato, México. b) T. cruzi cepa NINOA. Fue aislada en el año de 1986 a partir de una paciente de 8 años de edad, con cuadro agudo de la enfermedad. La paciente era procedente del estado de Oaxaca. Estas cepas han sido conservadas en el departamento de Parasitología de la ENCB-IPN. Los epimastigotes de la cepa INC-5 y NINOA fueron cultivados en medio BHI suplementado con solución Locke (NaCl 0.7M, KCl 0.05M, Na2HPO4 0.4M, glucosa 0.1M) al 10%, hemina 50 mg/L, suero bovino fetal 1% y antibióticos (penicilina 100 UI/ml y estreptomicina 100µg/ml). Se utilizaron cultivos en la fase logarítmica de crecimiento para




los estudios del efecto de los compuestos sobre la viabilidad de epimastigotes y para la obtención del extracto crudo de T. cruzi que se utiliza en la determinación de la actividad enzimática de la α-HADH. Obtención del extracto crudo de T. cruzi para los ensayos enzimáticos

Los cultivos fueron centrifugados a 3000g durante 5 min para cosechar los epimastigotes. El paquete celular se lavó 3 veces con buffer de fosfatos (0.15M, pH=7.4). Posteriormente fue resuspendido en un volumen de solución estabilizadora (DTT 0.5mM, EDTA 0.5mM, ácido–ε- amino- N-caproico 0.5mM, la mezcla de diluyó 1:10 antes de usarse) y se verificó al microscopio la integridad de los epimastigotes. Los parásitos dentro de esta suspensión fueron lisados mediante choque térmico (congelación en nitrógeno liquido/ descongelación 37°C tres veces). Este extracto se observó al microscopio para la verificación del lisado y se almacenó a -20°C para los ensayos enzimáticos posteriores. La determinación del tipo de inhibición y la constante de inhibición se realizaron utilizando tanto el extracto crudo de T. cruzi, como la α-hidroxiácido deshidrogensa isoenzima II purificada previamente en el laboratorio de enzimología del departamento de bioquímica de la ENCB (Chena, 2004) utilizando α-cetoisocaproato como sustrato, de acuerdo con el método reportado por Coronel et al. (1981). Estudio del NPOx y NPOx-B sobre la actividad de la α-HADH de T. cruzi. La actividad enzimática de la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II de T. cruzi fue determinada utilizado el método de Bergmeyer (1995). Este método consiste en medir el curso de la reacción por la disminución en la absorbancia a 340nm, que es un indicativo en la disminución del NADH el cual tiene su pico de absorbancia a esta longitud de onda. Para estos ensayos se utilizó como sustrato de la enzima el α-cetoisocaproato (5mM), como cofactor el NADH (0.1M) y como fuente de ésta 0.1ml la enzima purificada o del extracto crudo de T. cruzi a la dilución que presentará un cambio de absorbancia promedio entre 0.05-0.08/ min. La mezcla de reacción se llevo a 3mL con regulador de fosfatos (0.15 M pH=7.4) y la reacción transcurrió a 37°C. Los cambios en la absorbancia fueron medidos cada minuto durante 6 min, utilizando diferentes concentraciones del inhibidor (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mM disueltos en DMSO). Los inhibidores utilizados fueron el ácido N-propil oxámico y el éster bencílico del ácido N-propil oxámico. El promedio de las diferencias en las lecturas de absorbancia nos da el cambio de absonbancia por minuto y de esta manera se obtiene la actividad total de la enzima. Posteriormente se calculó el porcentaje de actividad enzimático tomando como 100% el cambio de densidad óptica/min en ausencia del inhibidor.




Determinación del tipo de inhibición producido por el NPOx sobre la α-HADH de T. cruzi. Para la determinación del tipo de inhibición producida por el ácido N-propil oxámico sobre la α-hidroxiácido deshidrogenasa se emplearon dos concentraciones del ácido N-propil oxámico (0.1 y 0.3 mM), y se midió la actividad de la α-HADH utilizando diferentes concentraciones de α-cetoisocaproato (0.05, 0., 0.2, 0.5 y 1 mM) como sustrato para determinar de que manera se afecta la cinética de esta reacción. Los cambios en la absorbancia/min se refieren a la velocidad enzimática (V). Los datos obtenidos de la cinética enzimática se graficaron de acuerdo con el método de Lineweaver-Burk. Se obtuvieron los recíprocos de los valores obtenidos para la velocidad y la concentración de sustrato con y sin inhibidor y se integraron en una sola gráfica del inverso de la velocidad (1/V) contra el inverso de la concentración de sustrato1/[S]. Con los datos de la cinética anterior, se determinó tanto el tipo de inhibición como el valor de la constante de inhibición (Ki) utilizando el método descrito por Dixon y Webb (1979). Este consiste en graficar el valor de las pendientes de la gráfica de Lineweaver-Burk (Km/Vmax) contra la concentración de inhibidor y la ordenada al origen corresponde al valor de Ki.

Medición de los niveles de ATP.

Se midieron los niveles de ATP en ausencia y presencia del NPOX-Et y NPOx-B en las concentraciones de 2, 4 y 8 mM para cada compuesto, después de incubarlos 60 min con epimastigotes en cultivo de las cepas NINOA e INC-5. Para este ensayo se utilizó un juego de reactivos que contiene todas las substancias necesarias para realizar este experimento (Sigma, ATP bioluminescent somatic cell assay kit, FL-ASC), y que fueron preparadas de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La determinación se llevó a cabo mediante el uso de un contador de centelleo líquido Beckman L6500, para medir la quimioluminiscencia producida por la reacción de la luciferasa dependiente de ATP: Durante 1 min las muestras fueron leídas en un rango abierto de lectura de cuentas por minuto (cpm). El primer paso fue obtener una suspensión de epimastigotes, a una concentración de 3 x 107 epimastigotes/mL en medio BHI, los cuales se incubaron durante 60 min con los compuestos (NPOx-Et, NPOx-B, DMSO 2.5% como control) a una temperatura ambiente. Al término del tiempo se colocaron 25 µL de la muestra celular en un tubo cónico y se calentaron por 3 min en un baño de agua hirviendo para inactivar las fosfatasas endógenas e inmediatamente se trasladaron a un baño de hielo. Después se adicionaron el reactivo de lisis y se dejó reposar en hielo por 5 min, más tarde se adicionó la mezcla de ensayo fría que contenía luciferina, luciferasa, EDTA y MgSO4. Los tubos se dejaron reposar por 5 min a temperatura ambiente para después ser colocados en viales de centelleo para medir la intensidad de la quimioluminiscencia




RESULTADOS Estudio del NPOx y NPOx-B sobre la actividad de la α-HADH de T. cruzi.

La cinética enzimática tanto del ácido NPOx como del NPOx-B se realizó con la finalidad de observar la inhibición de la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II purificada de un extracto crudo (Gráfica 1A) y un extracto crudo de T. cruzi de la cepa INC-5 y de la cepa NINOA (Gráfica 1B). Como podemos observar solo el NPOx muestra actividad inhibitoria sobre la α-hidroxiácido deshidrogenasa purificada, mientras que el NPOx-B no presenta actividad sobre la enzima purificada para ambas cepas. Sin embargo cuando se utiliza el extracto crudo de T. cruzi la inhibición de la α-HADH fue proporcional a la concentración del inhibidor. Determinación del tipo de inhibición producida por el NPOx-B sobre la α-HADH de T. cruzi.

. Para determinar el tipo de inhibición que produce el NPOx sobre la actividad de la α--HADH isoenzima II de T. cruzi se empleó el método de Lineweaver-Burk (Gráfica 2A). El tipo de inhibición mostrado fue de tipo competitivo, ya que en presencia o ausencia del inhibidor se obtiene la misma velocidad máxima (Vmax) en tanto que el valor de Km aumenta a medida que se incrementa la concentración de sustrato. El valor de Km fue para el ácido α-cetoisocaproico de 0.3mM. Con los datos de esta gráfica se calculó la constante de inhibición (Ki) por el método de Dixon y Webb (1979) se representa en la gráfica 6. El valor para la Ki calculado fue de 0.069mM (Grafica 2B).

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.220

40

60

80

100

concentración del inhibidor (mM)

% d

e ac

tivid

ad d

e la

α-H

AD

His

oenz

ima

II

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.220

40

60

80

100

Concentración del inhibidor (m M)

% d

e ac

tivid

ad d

eα

-HA

DH

isoe

nzim

a II

Gráfica 1. Efecto del ácido N-propil oxámico (NPOx) ( ) y del éster bencílico del ácido N-propil oxámico (NPOx-B) ( ) sobre la actividad de la α–hidroxiacido deshidrogensa (α-HADH) purificada (A) y en un extracto crudo de T. cruzi de la cepa NINOA (B), utilzando α- cetoisocaproato como sustrato. Resultados similares se obtuvieron con la cepa INC-5.

BA




-Km

0

0.005

0.01

0.015

-0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3

Km

/ V m

ax

ácido N-propil oxámico (mM)

Ki = 0.068 mM-Ki

Gráfica 2. (A) Efecto inhibitorio del ácido N-propil oxámico sobre la actividad de la α-hidoxiácido deshidrogensa de T. cruzi. Se graficó el reciproco de la velocidad (expresado como el cambio de absorbancia/min a 340nm) contra el inverso de la concentración de α-cetoisocaproato. Ensayos sin inhibidor ( ) y en presencia de 0.1mM ( ) y 0.3mM ( ) de ácido N-propil oxámico como inhibidor. (B) Determinación de la constante de inhibición (Ki) del ácido N-propil oxámico sobre la α-HADH de T. cruzi. Los datos fueron tomados del la gráfica 5. (Dixon y Webb 1979) Medición de los niveles de ATP. La presencia de los compuestos disminuyó considerablemente los niveles de ATP sobre todo cuando los epimastigotes fueron tratados con el NPOx- B en comparación con el NPOx-Et. Estos resultados fueron similares para amabas cepas (gráfica 4).

0.0 2.5 5.0 7.5 10.00

20

40

60

80

100

Concentracion (mM)

% d

e A

TP±

ESM

n= 4

Grafica 5. Porcentaje de ATP total en epimastigotes de la cepa NINOA debido e la presencia del NPOx-B ( ) y NPOX-Et ( ) se tomo como 100% la cantidad de ATP determinada en el control (DMSO, 2.5%). Resultados similares se obtuvieron para epimastigotes de la cepa INC-5.




DISCUSIÓN. La glicólisis provee prácticamente toda la energía a T. cruzi (Opperdoes, 1985), por lo que las enzimas que participan en la glicólisis o en su regulación se han propuesto como un blanco bioquímico para el diseño de agentes con actividad tripanomicida (Bakker 2000; Verlinde ,2001). Es por esta razón, que este trabajo se enfoca en estudiar el posible efecto tripanomicida de un derivado del ácido oxámico como posible inhibidor del metabolismo energético de T. cruzi. Tripanosoma cruzi, presenta una oxidoreductasa unida a NAD+ designada como α-hidroxiácido deshidrogenasa (α-HADH). Esta enzima presenta dos formas moleculares (I y II), las cuales han sido caracterizadas y purificadas (Coronel, 1981; Gerez de Burgos, 1978). La isoenzima I es la responsable de la poca actividad de lactato deshidrogensa encontrada en extractos de T. cruzi mientras que la isoenzima II no muestra actividad contra piruvato y es activa sobre otros sustratos de cadena lineal y ramificada, especialmente sobre el α-cetocaproato y α-cetoisocaproato. Este ultimo es además un metabolito fisiológico derivado de la leucina, el cual proviene de una reacción de trasaminación (Coronel, 1981). Se ha establecido que la α-HADH isoenzima II de T. cruzi se encuentra integrada en rutas metabólicas que proporcionan la energía necesaria para la movilidad del flagelo y la sobrevivencia de estos parásitos (Montamat, 1987), debido a que esta isoenzima participa tanto en la regeneración del NADH durante la glicólisis (Coronel, 1981), como en el sistema de lanzadera, que transfiriere equivalentes reductores (NADH) del citosol al interior de la mitocondria (Montamat, 1987). Consecuentemente, un inhibidor de la α-HADH isoenzima II no sólo inhibirá la glicólisis, sino que también inhibirá el sistema de lanzadera, por lo tanto, se ha propuesto que los inhibidores de esta isoenzima podrían reducir la movilidad y la sobrevivencia de este parásito (Gerez de Burgos, 1984; Elizondo, 2003; Chena, 2004). Como la α-HADH isoenzima II mostró la actividad máxima utilizando como sustratos el α-cetocaproato y α-cetoisocaproato (Coronel, 1981), nosotros consideramos, que el NPOx presentaría los requerimientos estructurales y estéricos adecuados para ser un inhibidor competitivo de la α-HADH isoenzima II de T. cruzi, debido a la semejanza estructural con los sustratos naturales de esta isoenzima. Encontramos que el NPOx fue un excelente inhibidor competitivo y selectivo de la α-HADH isoenzima II, con lo cual, nosotros esperábamos un buen efecto tripanomicida. Sin embrago, no se detectó actividad tripanomicida con este oxamato en cultivos de epimastigotes de T. cruzi. Se demostró entonces que este oxamato no penetra en epimastigotes de T. cruzi debido a la polaridad del carboxilato presente en esta molécula,.ya a que las membranas biológicas se comportan como barreras hidrofóbicas contra sustancias polares, así que, la carga negativa del carboxilato presente en el oxamato a pH fisiológico fue la responsable de la falta de actividad tripanomicida de este compuesto, estos resultados concuerdan con los reportados (Chena, 2005). En tanto que NPOx-B con mayor afinidad por las biomemebranas, por su alta hidrofobicidad, produjo una mejor absorción del compuesto por el parasito y la eficiente hidrólisis por las carboxi-esterasas presentes dentro del mismo generan in situ el




NPOx (inhibidor de la α-HADH isoenzima II de T. cruzi,) presentando así su efecto tripanomicida. Para corroborar esto ultimo, el siguiente paso a la síntesis del NPOx-B fue medir el carácter inhibitorio del NPOx sobre la actividad de la α-HADH isoenzima II de T. cruz, lo cual, fue confirmado plenamente ya que el NPOx mostró claramente que se trata de un inhibidor competitivo. Esto era de esperarse ya que la estructura química del inhibidor es muy similar a la del substrato y puede unirse al sitio activo de la enzima y bloquear el acceso del sustrato a este sitio. El valor obtenido para la Ki concuerda con el anteriormente reportado para esta sustancia obtenida a partir del NPOx-Et (Chena, 2004). También se comprobó que el carácter inhibitorio del NPOx-B sobre la actividad de la α-HADH isoenzima II en un homogenizado de T. cruzi, es debida a la formación in situ del ácido correspondiente (NPOx), ya que el NPOx-B no tiene efecto sobre la enzima purificada de T. cruzi, pero si, cuando se utiliza un extracto crudo de T. cruzi donde se encuentran además las esterasas (Repetto, 1983) para hidrolizarlo y formar el ácido NPOx. El comportamiento que siguen el NPOx, NPOx-B en las cinéticas de inhibición realizadas con el extracto crudo son similares, sólo que para el NPOx-B comparado con el NPOx los valores de inhibición son menores. Esto probablemente se deba a que la velocidad de hidrolisis no es muy rápida y en el momento de la determinación de la actividad de la α-HADH, el éster no se ha hidrolizado al 100%. En cuanto la los niveles de ATP detectados en epimastigotes debido a la presencia de los esteres del NPOx, pudimos observar que estos disminuyeron en mayor proporción con el éster bencílico en comparación con el etílico. Esto pudiera deberse a varios factores:a) la hidfofobicidad del éster bencílico que es mayor (logPteor2.15±0.57) que la del éster etílico (logPteor0.93±0.57, estos valores fueron calculados con el programa Chem Scketch 10.0), lo que permitiría una mejor biosidponibilidad del compuesto a nivel intracelular y por lo tanto un mayor efecto inhibitorio de la HADH, b) presencia del alcohol bencílico después de la hidrólisis del NPOx-B por las carboxiesterasas lo que podría estar potenciando el efecto tripanomicida (Aguirre, 2006) y por tanto los niveles de ATP y debido que la hidrólisis depende del tipo de carboxiesterasas, las cuales, se clasifican en dos grandes grupos (A y B). Las carboxiestrasas de tipo A presentan actividad preferentemente sobre ésteres aromáticos, mientras que las de tipo B lo hacen sobre ésteres alifáticos (Bergmeyer, 1984). Probablemente el NPOx-B se estén hidrolizando por ésterasas de tipo A y el NPOx-Et por las de tipo B y la actividad de estas esterasas presentes en T. cruzi sea diferente, lo que explicaría porque se obtiene resultados diferentes con estos dos compuestos sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos. CONCLUSIONES. • El éster bencílico del ácido N-propil oxámico, resultó ser un profármaco, ya que

requiere de las carboxiesterasas de este parasito para producir el ácido N-propil oxámico, el cual es el inhibidor de la α- hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II de T. cruzi.




• El ácido N-propil oxámico resultó ser un inhibidor competitivo de la α- hidroxiácido

deshidrogenasa isoenzima II, mecanismo por el cual ejerce su acción tripanomicida, el éster bencílico del ácido N-propil oxámico.

• El éster bencílico del ácido N-propil oxamico presentó un mayor efecto sobre la

disminución de los niveles de ATP que el éster etílico del ácido N.propil oxamico sobre epimastigotes de la cepa NINOA e INC-5.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

I. Aguirre A. Ch. 2006. Síntesis y Estudio del éster bencílico del ácido N-propil oxamico como posible agente tripanomicida. Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN.

II. Aldunate J., Repetto Y., Letelier M., Morello A. 1987. The carboxilesterases of Trypanosoma cruzi. Comp. Bichem. Physiol. 13:67-71.

III. Bakker B.M., Westerhoff H. V., Opperdoes F.R., Michaels P.M. 2000. Metabolic control analysis of glycolisis in trypanosomes as an approach to improve selectivity and effectiveness of drugs. Mol Biochem Pharmacol. 106:1-10.

IV. Bergmeyer U. H. 1995. Methods of Enzymatic Análisis. Third edition. Vol. 3 Enzymes 1:Oxidoreductases, Transferase. Capitulo 2.

V. Coronel C.E., Roval L.E., Gerez de Burgos N.M., Burgos C., Blanco A. 1981. Properties of α-hydroxyacid dehydrogenase isozymes from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 4:29-38.

VI. Chena A.M., Elizondo J.S., Rodríguez P.L., Torres N.B., Baeza R.I., Wong

R.C.2004.Trypanosoma cruzi: Inhibition of α-hydroxyacid dehidrogenase isozyme II by N-allyl and N-propyl oxamates and their effects on intact epimastigotes. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 99 (8): 831-837.

VII. Chena M.A, Elizondo S., Rodríguez L., Nogueda B, Baeza I., Wong C. 2005.

Trypanocidalactivity of N-isopropyl oxamate on cultured epimastigotes and murine trypanosomiasis using different Trypanosoma cruzi strains. J. of Enzyme inhibition and medical chemistry. 20(2):189-197.




VIII. Dias J. C. P. 2000. Epidemiología. In Z. Brener, Z. Andrade, M. Barral-Netto.

Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. 2° ed., Guanbara Koogan. Rio de Janeiro: 48-74pp.

IX. Dixon M and Webb EC. 1979. Enzyme inhibitors and activation. Enzymes 3rd

Longman Group. Ltd. London. pp. 332-381.

X. Elizondo J.S. 2003. Desarrollo de análogos del oxamato como inhibidores selectivos de la α-hidroxiácido deshidrogenasa de Trypanosoma cruzi con posible actividad tripanomicida. Tesis para obtener el grado de doctor en Ciencias. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN.

XI. Gerez de Burgos N.M. Blanco A. Paulone I., Segura E. L. 1978. Actividad de la

α-hidroxiácido deshidrogenasa de Tripanosoma cruzi. Acta Physiol Latinoam. XII. Guzmán B.C. 2001. Epydemiology of Chagas deisease in Mexico: an update Trens

in Parasitol. 17:372-376.

XIII. Hoare C.A. y Wallace F.G. 1966. Development stage of trypanosomatid flagellates: A New terminology. Nature. 244: 69-67.

XIV. Montamat E. E, Arauso S. S, Blanco A. 1987. Subcellular localization of leucine

aminotransferase and α-hydroxiacid dehydrogenase in Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 22:185-93.

XV. OMS. Organización Mundial de la Salud (World –Health organization) 1991. Control of Chagas Disease. Geneva. Technical Report Series; 811: 95pp.

XVI. OMS. Organización Mundial de la Salud (World –Health organization). 2002.

Report of the Scientific Working Group meeting on Insect Vectors and Human Health Geneva.

XVII. Opperdoes F. R. 1985. Biochemical peculiarities of trypanosomes, African and

South American. Br Med Bull. 41:130-136.

XVIII. Repetto Y, Aldunate J, Morello A. 1983. Trypanosoma cruzi: carboxylesterase activity on intact epimastigotes. Comp Biochem Physiol B.:76(1):61-4.

XIX. Teixeira A.R., Calixto M. A., Teixeira M.L. 1994. Carcinogenic activity of

antitrypipanosomal nitroarenes in mice. Mut. Res. 305:189-195.

EFECTO DE LOS ÉSTERES ETÍLICO Y BENCÍLICO … · carcinogénico en animales de laboratorio...

Documents

Transcript of EFECTO DE LOS ÉSTERES ETÍLICO Y BENCÍLICO … · carcinogénico en animales de laboratorio...