EFECTO DEL ESTRÉS POR NADO EN LA PRODUCCIÓN DE LA …
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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD ÁREA INMUNOLOGÍA PRESENTA: M. C. y P. RICARDO CHÁVEZ RAMÍREZ DIRECTORES DE TESIS DR. ALDO ARTURO RESÉNDIZ ALBOR DR. ALEXANDRE KORMANOVSKI KOVZOVA MÉXICO, D. F. DICIEMBRE 2009 "EFECTO DEL ESTRÉS POR NADO EN LA PRODUCCIÓN DE LA IgA Y EN LAS POBLACIONES DE LINFOCITOS T Y B DE LA LÁMINA PROPIA Y PLACA DE PEYER DEL INTESTINO DELGADO DEL RATÓN"
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD
ÁREA INMUNOLOGÍA PRESENTA:
M. C. y P. RICARDO CHÁVEZ RAMÍREZ
DIRECTORES DE TESIS
DR. ALDO ARTURO RESÉNDIZ ALBOR
DR. ALEXANDRE KORMANOVSKI KOVZOVA
MÉXICO, D. F. DICIEMBRE 2009
"EFECTO DEL ESTRÉS POR NADO EN LA PRODUCCIÓN DE LA IgA Y EN LAS POBLACIONES DE LINFOCITOS T Y B
DE LA LÁMINA PROPIA Y PLACA DE PEYER DEL INTESTINO DELGADO DEL RATÓN"
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RESUMEN
“EFECTO DEL ESTRÉS POR NADO EN LA PRODUCCION DE IgA Y EN LAS POBLACIONES DE LINFOCITOS T Y B DE LA LAMINA PROPIA Y PLACAS DE PEYER DEL INTESTINO DELGADO DEL RATON”
El sistema inmunológico de las mucosas cubre aproximadamente 900m2 de
superficie corporal, el área mas grande del cuerpo, y ha desarrollado mecanismos
que discriminan entre los antígenos inofensivos, microorganismos comensales y
patógenos peligrosos. La función principal del sistema inmunológico de mucosas es
proporcionar defensa al individuo en esas superficies mucosas, y presenta
características diferentes al sistema inmunológico sistémico, tales características
incluyen la producción de la inmunoglobulina A (IgA) relacionada con las mucosas,
una población de células T con propiedades reguladoras o capacidades efectoras
especificas de la mucosas, y un sistema de residencia celular orientado hacia las
mucosas. El tejido linfoide asociado a intestino (GALT) esta constituido por dos sitios:
sitio inductor (placas de Peyer) y sitio efector (lamina propia y linfocitos
intraepiteliales). El Estrés es cualquier estímulo que se perciba como amenaza para
la homeóstasis y seguridad del individuo. La clasificación del estrés depende del
tipo de estimulo, duración y frecuencia, por lo tanto se puede clasificar en: estrés
agudo; que se define como la aplicación de un estimulo único corto, y estrés crónico:
que es la aplicación de estímulos repetitivos y que tienen una duración más larga. Se
ha visto que el estrés provoca cambios importantes en el tejido asociado a intestino.
El objetivo de este trabajo fue analizar el efecto del estrés por nado, considerado un
estrés agudo, en la producción de la IgA y en las poblaciones de linfocitos T y B de la
lámina propia y placas de peyer del segmento proximal y distal del intestino delgado
del ratón. En conclusion, el estrés por nado aumento los niveles de IgA como
respuesta al estres agudo, y probablemente por aumento de los linfocitos B
productoras de celulas plasmaticas para IgA en la lamina propia. En contraste en
las placas de Peyer aumentaron los LTCD4, LTCD8, probablemente por la
periférica de los receptores hormonales de superficie de los linfocitos T. En la lamina
propia el aumento de los CD19/B220, probablemente por la periférica de citocinas al
activarse los LT o por migración periférica.
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SUMMARY
“EFFECT OF THE STRESS BY SWIM IN THE PRODUCCION OF IgA AND IN THE POPULATIONS OF LINFOCITOS T AND B OF THE LAMINA PROPRIA AND PACH´S PEYER OF SMALL INTESTINE OF MICE”
The immunological system of the mucous ones covers approximately 900m2 of
corporal surface, the area very big of the body, and has developed mechanisms
against that retainers discriminate between the inoffensive antigens, microorganisms
and pathogenic dangerous. The principal function of the immunological system of
mucous is to provide defense to the individual in these mucous surfaces, and
presents characteristics different from the immunological systemic system, such
characteristics include the production of the immunoglobulin to (IgA) related to the
mucous ones, a population of cells T with regulatory properties or capacities effectors
specify of her mucous, and a system of cellular residence orientated towards the
mucous ones. The fabric lymphoid associated with intestine this (GALT) constituted
by two sites: inductor site (Peyer's pach´s) and site efector () sheet and lymphocytes
lamina propria) and intraephytelial lymphocites). The Stress is any stimulus that is
perceived as a threat for the homeóstasis and safety of the individual. The
classification of the stress depends on the type of stimulus, duration and frequency,
therefore it is possible to classify in: acute stress; that is defined as the application of
the only unique short stimulus, and chronic stress: that is the application of repetitive
stimuli and that have a longer duration. One has seen that the stress provokes
important changes in the fabric associated with intestine. The objetive of this work
was to analyze the effect of the stress for swin, considered a acute stress, in the
production of the IgA and in the populations of lymphocytes T and B of the own sheet
and Peyer pach´s of the segment proximal and distal of the small intestine of the
mice. In conclusion, the stress for swim increase IgA's levels as response to the
acute stress, and probably for increase of the lymphocytes B producers of plasmatic
cells for IgA in the lamina propria sheet. In contrast in Peyer's pach´s they increased
the LTCD4, LTCD8, probably for the peripheral one of the hormonal recipients of
surface of the lymphocytes T. In the lamina propria sheet the increase of the
CD19/B220, probably for the peripheral one of citocinas on the LT having activated or
for peripheral migration.
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INDICE
PAG.
Introducción 7
Antecedentes generales 7
Funciones 7
Organización del MALT 8
Inducción de la respuesta inmunitaria 12
IgA intestinal 15
Estrés 16
Tipos de estrés 22
Antecedentes directos 23
Planteamiento del problema 25
Justificación 25
Objetivo general 26
Objetivos particulares 26
Hipótesis 27
Materiales y métodos 28
Análisis estadístico 33
Resultados 34
Discusión 48
Conclusiones 50
Perspectivas 50
Bibliografía 51
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INTRODUCCION ANTECEDENTES GENERALES.
El sistema inmunológico es un sistema fisiológico cuyas funciones son las de
distinguir entre las moléculas de lo propio, aceptarlas y las de no lo propio,
procesarlas y eliminarlas. El sistema inmunológico esta compuesto por dos
compartimentos importantes: el sistema inmunológico sistémico compuesto por
medula ósea, bazo y nódulos linfoides; y el sistema inmunológico asociado a
mucosas (MALT), compuesto por tejido linfoide asociado a nariz (NALT), Tejido
linfoide asociado a bronquios (BALT), tejido linfoide asociado a intestino (GALT) y
tejido linfoide asociado a genitourinario.
El MALT cubre aproximadamente 900m2 de superficie corporal, el área más
grande del cuerpo y ha desarrollado mecanismos que discriminan entre antígenos
(Ag) inofensivos, microorganismos comensales y patógenos peligrosos. El MALT
está compuesto de los tejidos linfoides relacionados con las superficies mucosas de
los aparatos respiratorio, digestivo y genitourinario. Dicho sistema evoluciono dentro
de un ambiente antigénico muy distinto a aquel presente en el interior del organismo
y es por eso que posee múltiples características que lo diferencian del sistema
linfoide sistémico. Tales características incluyen la producción de inmunoglobulina
relacionada con las mucosas (IgA); una población de células T con propiedades
reguladoras o capacidades efectoras especificas de la mucosa; y un sistema de
residencia celular orientado hacia las mucosas, que permiten a los linfocitos
activados al inicio de los folículos de la mucosa migrar de manera selectiva a los
tejidos difusos de las mucosas situados por debajo del epitelio.
FUNCIONES.
La función primaria del MALT es proporcionar defensa al individuo en las
superficies mucosas.
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Esta función opera en concierto con diversos factores protectores no
inmunitarios, como son: 1) flora bacteriana residente, que inhibe el crecimiento de
patógenos potenciales; 2) actividad motriz de la mucosa, peristalsis y su función
ciliar, que mantiene el flujo de constituyentes de la mucosa, y por lo tanto disminuye
la interacción de patógenos potenciales con células epiteliales; 3) sustancias como
acido gástrico y sales biliares intestinales que crean en las mucosas un ambiente
desfavorable para el crecimiento de patógenos; 4) secreciones mucosas (glucocalix)
que forma una barrera entre los patógenos potenciales y las superficies epiteliales y
5) factores humorales innatos como la lactoferrina, lactoperoxidasa y lisozima que
tienen efectos inhibidores sobre uno u otro microorganismo especifico. Una segunda
función pero de igual importancia es evitar la entrada de antígenos de la mucosa a la
circulación y proteger así el sistema inmunológico sistémico.
ORGANIZACIÓN DEL MALT.
El MALT para mantener una respuesta apropiada esta organizado por dos
sitios importantes: sitio inductor y sitio efector. Los sitios inductores del MALT se
caracterizan por tener cúmulos de tejido linfoide que se asocia a intestino (GALT), el
tejido linfoide asociado a nasofaringe (NALT) y tejido linfoide asociado a bronquios
(BALT).
TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A INTESTINO (GALT)
El intestino delgado consiste en tres porciones: duodeno, yeyuno e ileon.
Anatómicamente el GALT se divide en dos compartimentos : a) GALT organizado,
inductor de la respuesta inmunitaria intestinal constituido por folículos linfoides
aislados, folículos linfoides asociados o placas de Peyer y ganglios linfáticos
mesentéricos; y b) GALT difuso, efector de la respuesta inmunitaria integrado por
poblaciones de linfocitos dispersos en el entramado epitelial, linfocitos intraepiteliales
(IEL) o en la lámina propia intestinal, linfocitos de la lamina propia (LPL).
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Las placas de Peyer están formadas por agregados linfoides macroscópicos
situados en la cara anti mesentérica de la mucosa intestinal. El tejido linfoide está
separado del lumen intestinal por una mono capa de células, formada por células
epiteliales columnares, células M, IEL y algunas células secretoras de moco
llamadas células de Globet. Las células M son enterocitos especializados en la
captación de antígenos luminales, carecen de recubrimiento de glicocálix y en su
superficie luminal presentan pliegues en lugar de los microvilli característicos del
resto de enterocitos. Por debajo de la mono capa de células, yace una región difusa
denominada cúpula subepitelial o región del domo, integrada por células dendríticas
y algunos macrófagos.
Las áreas interfoliculares están compuestas por linfocitos T, mayoritariamente
de tipo colaborador o helper (Th), células dendríticas maduras y macrófagos.
Inmersos en la placa de Peyer se encuentran multitud de folículos integrados por
linfocitos B IgM+, precursores de células plasmáticas productoras de IgA y en los
centros germinales de estos folículos se generan linfocitos B IgA+ memoria. A
diferencia del resto de órganos linfoides, las placas de Peyer sólo presentan vasos
linfáticos eferentes.
Los ganglios linfáticos mesentéricos se localizan en el mesenterio del intestino
y se dividen, estructuralmente, en tres regiones con distinta composición celular:
corteza, paracorteza y médula. La corteza contiene folículos primarios y secundarios
ricos en linfocitos B y células dendríticas. Por el contrario, la paracorteza se
caracteriza por una elevada proporción de linfocitos T y células dendríticas. La
médula, región más interna del ganglio, está integrada por linfocitos T y B y células
plasmáticas.
Los linfocitos T vírgenes circulantes llegan al ganglio a través de vénulas
postcapilares especializadas denominadas vénulas endoteliales altas. El paso de
linfocitos T a la paracorteza a través de estas vénulas está dirigido por quimiocinas
que se unen a los receptores de la célula T virgen y que son producidas por células
endoteliales, células del estroma y células dendríticas.
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En la corteza, las células dendríticas residentes internalizan y procesan los
antígenos que llegan a través de la linfa. Las células dendríticas maduras migran
hacia la paracorteza donde presentan el antígeno a los linfocitos Th o T citotóxicos
(Tc) vírgenes y de esta forma se originan células T especializadas y se inicia la
respuesta inmunitaria adaptativa. Mientras que los linfocitos efectores abandonan los
ganglios linfáticos y migran hacia los tejidos no linfoides, algunos linfocitos Th
permanecen en el ganglio linfático como células memoria o migran hacia los centros
germinales de los folículos para promover el proceso final de diferenciación de los
linfocitos B.
Los IEL residen en los espacios intraepiteliales del intestino, bajo las uniones
estrechas y por encima de la membrana basal. Si consideramos la gran superficie de
la mucosa intestinal y su proporción respecto a células epiteliales, los IEL
representan una población muy abundante de células inmunocompetentes.
Aunque los IEL constituyen una población muy heterogénea, la mayor parte
presenta un fenotipo supresor o citotóxico atípico y específico del compartimento
mucosal (CD8αβ+), que difiere del resto de órganos linfoides donde predominan
otros fenotipos más convencionales (CD4+ y CD8αβ+). A pesar de que hoy en día,
su origen y desarrollo continua en discusión, se sabe que presentan un fenotipo
activado típico de células efectoras/memoria con capacidad inmunorreguladora, y
que proporcionan una respuesta inmediata y muy efectiva sobre células epiteliales
infectadas. El conjunto de las diversas subpoblaciones de IEL desempeña un papel
crucial en la prevención de la sensibilización a antígenos luminales, es decir, son
mediadores del proceso de tolerancia oral.
Por otra parte, la lámina propia, comprendida entre el epitelio y la muscularis
mucosa, contiene células plasmáticas maduras productoras de IgA, linfocitos T
(principalmente Th) y otros tipos celulares como macrófagos, células dendríticas y
mastocitos. Estas poblaciones se encuentran en estado continuo de migración,
diferenciación y renovación.
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Las dos poblaciones efectoras mucosales, IEL y LPL, se hallan bajo la
influencia de bacterias comensales presentes en el intestino, las cuales contribuyen
al desarrollo de su función inmunitaria.
En este sentido, la flora bacteriana intestinal promueve la expansión y
adquisición de la actividad citotóxica de los linfocitos del epitelio intestinal y desarrolla
un papel importante en la inducción y mantenimiento de la tolerancia oral frente a
antígenos presentes en la dieta, mediante la potenciación de la producción de IgA
por parte de los LPL. Los microorganismos comensales interaccionan también con
células presentadoras de antígeno (APC) del epitelio y lámina propia, promoviendo
una interacción diferente en los linfocitos Th e inducen así la activación de células
reguladoras y con ello se desarrolla la tolerancia ante estos microorganismos.
CAPTACIÓN DE ANTÍGENOS LUMINALES.
Los antígenos luminales pueden penetrar en la mucosa intestinal y alcanzar el
GALT a través de distintas vías. La entrada a través de células M presentes en las
placas de Peyer constituye la vía más conocida.
La membrana apical de las células M está diseñada para favorecer la
adhesión y captación de antígenos luminales como macromoléculas, partículas
adhesivas, virus y bacterias. Las células M también pueden captar ciertas proteínas
alimentarias e IgA. Una vez efectuada la captación se inicia el proceso de
transcitosis: las células M internalizan los antígenos luminales mediante mecanismos
de endocitosis o fagocitosis y los transportan a través de sus vesículas hacia la
membrana basolateral, donde son liberados al espacio extracelular. La membrana
basolateral de las células M presenta una profunda invaginación o bolsillo
intraepitelial, que alberga linfocitos y macrófagos, encargados de procesar los
antígenos para la posterior presentación antigénica.
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Los enterocitos constituyen una segunda posible vía de entrada de antígenos.
Presentan menor accesibilidad que las células M debido a su recubrimiento externo
de glicocálix rico en enzimas hidrolíticas, hecho que impide la entrada de agregados
macromoleculares y microorganismos. Hoy en día se acepta que los enterocitos no
sólo son capaces de captar los antígenos solubles que llegan a la superficie celular,
sino también de procesarlos y presentarlos a los linfocitos T. La captación de
antígenos luminales también puede producirse mediante un mecanismo paracelular a
través de los espacios entre enterocitos, donde células dendríticas proyectan sus
dendritas gracias a la expresión de proteínas asociadas a las uniones estrechas.
INDUCCIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA.
Las células M captan y transportan los antígenos luminales hacia las APC
situadas en la cúpula de las placas de Peyer. Las APC interiorizan y procesan los
antígenos hasta péptidos antigénicos que se expresarán en la membrana plasmática
asociados a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) para ser
reconocidos por el receptor de células T (TCR). Las APC activadas pueden
interaccionar con linfocitos T de las áreas interfoliculares de la placa de Peyer o
migrar hacia los ganglios linfáticos mesentéricos a través de vasos linfáticos.
Una vez activados, los linfocitos Th pueden diferenciarse principalmente en
dos subpoblaciones efectoras denominadas Th1 y Th2, con diferente función basada
en el perfil de citocinas que secretan (Fig. 1).
Fig .1 Clasificacion de linfocitos T helper activados. El tipo de estimulo condiciona las citocinas secretadas en el momento del reconocimiento antigénico, favoreciéndose asi de linfocitos T en una determnada subpoblacion afectora o regladora.
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Los linfocitos Th1 se caracterizan por la secreción de interferón γ (IFNγ),
interleucina 2 (IL-2) y linfotoxina (LT o TNF-β) y su función principal es la defensa
mediada por fagocitos contra infecciones, especialmente frente a microorganismos
intracelulares (virus, bacterias y algunos protozoos). Por otra parte, los linfocitos Th2
productores de IL-4, IL-5 e IL-13 actúan como mediadores de reacciones alérgicas y
en la defensa frente a infecciones producidas por helmintos y artrópodos.
Las citocinas producidas por estas subpoblaciones no sólo determinan sus
funciones efectoras, sino que también participan en su desarrollo y expansión. De
esta manera, cada subpoblación se amplifica a sí misma y además ejerce un papel
regulador sobre la otra.
Recientemente se ha descrito la existencia de una tercera subpoblación
efectora denominada Th17 caracterizada por la secreción de IL-17 e IL-6. Aunque
sus funciones biológicas no se hallan totalmente clarificadas, dicha subpoblación
efectora parece estar implicada en la defensa frente a infecciones bacterianas y
fúngicas no cubiertas totalmente por la respuesta Th1 y Th2.
Además de estas tres subpoblaciones efectoras, actualmente está establecida
la presencia de linfocitos T reguladores: linfocitos Tr1 productores principalmente de
IL-10 y linfocitos Th3 caracterizados por la secreción de factor de transformación del
crecimiento β (TGF-β).
Estos linfocitos son especialmente importantes en el intestino por su
capacidad reguladora de la respuesta inmunitaria durante procesos inflamatorios e
infecciosos. Además desempeñan un papel clave en el desarrollo de la tolerancia
oral frente antígenos inocuos procedentes de la dieta y de la microbiota,
entendiéndose por tolerancia oral la ausencia de respuesta inmunitaria sistémica
frente a un antígeno, al cual un individuo ha estado previamente expuesto a través
del tracto gastrointestinal.
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Como se ha mencionado, la diferenciación de linfocitos T vírgenes a
subpoblaciones efectoras está condicionada por el tipo de estimulación y en especial
por las citocinas secretadas durante el reconocimiento antigénico. La IL-12 es la
principal responsable de la diferenciación Th1, mientras que IL-4 promueve la
subpoblación Th2. Algunas bacterias extracelulares conducen a la diferenciación
Th17 mediante la inducción de la secreción de IL-23 por parte de las APC. Además,
los linfocitos T reguladores se originan en respuesta a IL-10 y/o TGF-β.
Ciertas citocinas como IL-4, IL-5 y TGF-β inducen la síntesis de IgA en
linfocitos B de los folículos de las placas de Peyer. Estos linfocitos B, precursores de
células plasmáticas, migran hacia los ganglios linfáticos mesentéricos donde tiene
lugar la maduración y expansión clonal. A continuación, estos linfocitos se dirigen a
circulación sistémica a través del conducto torácico. Después de varias
recirculaciones, dichos linfocitos migran a los tejidos efectores, entre ellos la lámina
propia intestinal, donde ejercerán su función. Una gran variedad de factores influye
en esta migración, entre ellos se encuentran fenómenos generales como irrigación
tisular, inflamación, inervación y señales hormonales, y también factores específicos
como la expresión de moléculas de adhesión de linfocitos, señales estromales,
citocinas, antígenos y producción de quimiocinas por parte del endotelio.
Los linfocitos T activados en el GALT presentan un patrón de moléculas de
adhesión y receptores de quimiocinas diferente al de los linfocitos activados en
órganos linfoides periféricos, lo que promueve su movilización hacia mucosas y, en
concreto, a aquella donde se inició la respuesta.
Los linfocitos que alcanzan la lámina propia del intestino se distribuyen en
diferentes compartimentos.
Las células plasmáticas permanecen en la lámina propia donde finalizan su
maduración a células secretoras de IgA. Los linfocitos Th también permanecen en la
lámina propia y se distribuyen uniformemente a lo largo de las vellosidades y criptas,
mientras que los linfocitos Tc migran preferentemente al epitelio, convirtiéndose así
en IEL.
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Ambos tipos linfocitarios activados se mantienen en estado latente como
células memoria y, una vez se reencuentran con el antígeno, ejercen las funciones
efectoras para las que se hallan programados.
IgA INTESTINAL.
IgA es la inmunoglobulina más abundante presente en la mucosa intestinal
(80-90%) y desempeña un papel muy importante como primera defensa frente a
toxinas y a la colonización e invasión de patógenos. Se sintetiza principalmente en la
lámina propia del intestino en respuesta a la activación de linfocitos T de las placas
de Peyer. Estructuralmente, se distinguen dos isoformas de IgA: monomérica y
polimérica.
La IgA polimérica secretada (IgA-S) en la mucosa intestinal está compuesta
por dos moléculas de IgA unidas covalentemente a través de sus regiones
constantes y asociadas con una molécula de unión denominada cadena J. Además
consta de un componente secretor formado por un segmento del receptor de Ig
poliméricas (pIgR). La IgA polimérica (pIgA) es mayoritaria en secreciones mucosas,
mientras que en suero predomina la IgA monomérica (mIgA). La pIgA es
transportada hacia la superficie mucosa mediante transcitosis epitelial. En este
proceso, la IgA que contiene la cadena J se une al receptor de Ig poliméricas (pIgR)
presente en la membrana basolateral de las células epiteliales.
El complejo IgA pIgR es internalizado y transportado mediante vesículas a la
membrana apical de la célula epitelial para ser liberado al lumen intestinal. Durante el
proceso de liberación, el pIgR se fragmenta y el dominio extracelular, componente
secretor, queda unido a la pIgA, confiriendo resistencia frente a proteasas presentes
en el lumen intestinal (Fig. 2). La producción de IgA mucosal está regulada por el
perfil de citocinas presente. Así, IL-5, IL-6 e IL-10 facilitan la fase final de
diferenciación de los linfocitos B en células plasmáticas secretoras de IgA.
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Fig. 2. Transporte de IgA, IgM e IgG al lumen intestinal. IgA e IgM se sintetizan en el intestino de forma de polímeros y son transportadas al lumen intestinal mediante la interaccion con el receptor de Ig polimericas (pIgR), mientras que IgG, procedente en su mayoría de circulación sistémica es liberada al lumen por via paracelular. CS: Componente secretor.
Debido a que la síntesis de IgA tiene lugar mayoritariamente a nivel intestinal y
que el transporte hacia el lumen intestinal es muy eficaz, este isotipo constituye un
componente minoritario de la inmunidad no mucosal en comparación con IgG e IgM.
La IgA-S, además de ser resistente a la proteólisis intraluminal, no desencadena
respuesta inflamatoria, por lo que resulta un mecanismo ideal para la protección de la
mucosa intestinal. En el lumen, la IgA-S puede formar inmunocomplejos con el
antígeno evitando así la penetración de microorganismos intraluminales y antígenos
de la dieta. La IgA también puede actuar a nivel intraepitelial y subepitelial captando
los antígenos que atraviesan la barrera intestinal.
ESTRÉS.
Estrés es cualquier estímulo que se perciba como amenaza para la
homeóstasis y seguridad del individuo.
En 1936 Hans Selye introdujo el término estrés al campo de las ciencias
biológicas para denotar un síndrome producido por diversos agentes nocivos, cuya
finalidad era promover la adaptación del organismo a su medio cambiante.
Actualmente se considera que el concepto estrés denota la relación que existe entre
estímulos aversivos que perturban gravemente la homeostasis del organismo y las
respuestas, fisiológicas y conductuales del organismo, ante la estimulación aversiva.
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La respuesta al estrés está controlada por el sistema nervioso central (SNC) y
la coordinación que éste ejerce sobre los tres sistemas encargados de mantener la
homeostasis: autónomo, endocrino e inmunológico.
RELACION DEL SISTEMA INMUNOLOGICO, EL SNC Y SISTEMA ENDOCRINO.
La función básica del sistema inmunológico es reconocer lo que es propio de
aquello que no lo es y defender al organismo de sustancias extrañas. Para cumplir
esta función recibe información del sistema nervioso central (SNC) y el sistema
endocrino. El SNC recibe información de los órganos sensoriales, de los sistemas
inmunológico y endocrino y de esta manera controla y regula sus respuestas. A su
vez, la función del sistema endocrino es recibir información del cerebro y el sistema
inmunológico, y mediante la secreción de hormonas regular la actividad de éstos. El
cerebro tendría así una función triangular dirigida al mantenimiento de la
homeostasis, que integraría estrechamente los tres sistemas señalados.
INTERRELACIONES SNC Y SISTEMA INMUNE
El cerebro modula el sistema inmunológico mediante la inervación directa o
por la acción de neurotransmisores, neuropéptidos y hormonas.
Las lesiones cerebrales, el estrés, las enfermedades psiquiátricas y
neurodegenerativas pueden alterar significativamente la síntesis, liberación y
metabolismo de los neurotransmisores y, por lo tanto, alterar la inmunidad celular y
humoral. Inversamente, la respuesta inmunológica e inflamatoria y las enfermedades
autoinmunes afectan las funciones del SNC. El principal nexo entre el cerebro y el
sistema inmunológico lo constituye el sistema nervioso autónomo, simpático y
parasimpático. El timo posee inervación vagal mediada principalmente por
acetilcolina. La conexión del sistema nervioso autónomo simpático (SNS) con los
órganos del sistema inmunológico es principalmente noradrenérgica. La
noradrenalina (NA) interactúa con las células inmunológicas del bazo de dos
maneras: mediante el contacto directo con los linfocitos y macrófagos del bazo y por
difusión directa para unirse a los receptores adrenérgicos localizados en estas
células.
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En los nódulos linfoides, la NA puede afectar a los linfocitos por activación de
los receptores o por la inducción de la liberación de citocinas por otras células. En el
hueso, las fibras noradrenérgicas entran a la médula acompañando a las arterias y
allí pueden afectar la hematopoyesis y la migración celular. Diversos
neurotransmisores ejercen sus efectos sobre la función inmunológica.
La NA, dopamina (DA) y adrenalina (A) regulan la actividad hipotalámica, en
tanto que la serotonina, acetilcolina, GABA y los opiodes controlan la función de la
hipófisis. Durante varios años se consideró que la barrera hematoencefálica (BHE)
separaba completamente al SNC de otros órganos y sistemas de la periferia del
organismo.
Ahora se ha probado que cuando se presentan trastornos neuropatológicos
los leucocitos activados cruzan esta barrera. Igual sucede con las citocinas
producidas por los linfocitos que llegan al SNC por varias vías. En el cerebro existen
receptores para estas citocinas que ayudan a su transporte. Además, la microglia y
las neuronas pueden producir citocinas localmente, las cuales ayudan al desarrollo,
diferenciación, reparación y envejecimiento del SNC.
El SNC responde a la activación del sistema inmunológico con un aumento de
las concentraciones de las aminas biógenas en varias de sus regiones, como lo hace
frente al estrés. Por el contrario, en el timo y el bazo se reduce la concentración de
NA mientras se aumenta la de DA. El funcionamiento del SNC y la neurotransmisión
pueden presentar anormalidades como consecuencia de la alta concentración de
citocinas producidas por los leucocitos en respuesta a la infección o durante el
proceso inflamatorio. Estos cambios son producidos por la activación del cAMP y de
la proteincinasa C, aumento de la síntesis de óxido nítrico, liberación de ácido
araquidónico y cambios en el flujo de los iones de calcio y potasio.
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INTERRELACIONES SISTEMA ENDOCRINO Y SISTEMA INMUNOLOGICO.
La comunicación entre el sistema endocrino y el sistema inmunológico se
logra por acción de hormonas y citocinas. El sistema endocrino modula la respuesta
del sistema inmunológico a través de los receptores hormonales que poseen las
células inmununologicas. A la inversa, los tejidos del sistema endocrino poseen
receptores para citocinas que permiten modificar su actividad.
Además, los leucocitos bajo condiciones normales o de infección, o por
activación de los neurotransmisores pueden producir diferentes hormonas mientras
que las células de los tejidos endocrinos en condiciones normales o de estrés
pueden producir diferentes citocinas.
En el timo se encuentran diferentes hormonas como ACTH, vasopresina (VP),
CRH, hormona de crecimiento, hormona luteinizante, hormona liberadora de
hormona luteinizante (LHRH), hormona estimulante de tirotropina y prolactina.
La CRH es clave en la modulación inmunoendocrina durante la inflamación y
el estrés. Es producida a nivel del SNC por el hipotálamo y la pituitaria, mientras que
a nivel periférico es producida por el bazo y algunas células inmunológicas como los
linfocitos T y los macrófagos, en los sitios que hay inflamación aguda o crónica.
Periféricamente la CRH parece actuar como un mediador proinflamatorio
autocrino y paracrino. Después de que se une a los receptores de los leucocitos se
produce la activación del cAMP, lo cual estimula la secreción de IL-1, IL-6 y ACTH
por parte de los monocitos y macrófagos.
En la fase aguda, la CRH induce aumento de la quimiotaxis de los leucocitos,
de la producción de superóxido por las células fagocitarias, de la proliferación de
linfocitos B y de la expresión de receptores de IL-1.
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La ACTH en la circulación actúa sobre la suprarrenal estimulando la síntesis
de glucocorticoides. La deficiencia inmunológica está relacionada con los
corticosteroides.
Los efectos inmunosupresivos y antiinflamatorios de los glucocorticoides son
debidos a la retroalimentación negativa de la respuesta inmunológica e inflamatoria.
La hipersecreción de estas hormonas puede suprimir la respuesta
inmunológica, inhibir algunas funciones de los linfocitos y granulocitos y reducir, por
ejemplo, la proliferación de linfocitos y la fagocitosis de los neutrófilos. Existe
evidencia de que las hormonas sexuales tienen un papel en la modulación del
sistema inmunológico, como parece señalarlo la mayor frecuencia de enfermedades
autoinmunes en las mujeres. El papel clave en la modulación del sistema
inmunológico, dentro de las hormonas sexuales, parece tenerlo la LHRH.
La hormona de crecimiento y la prolactina estimulan la maduración y
diferenciación de los timocitos. Los linfocitos periféricos y otros leucocitos pueden
producir hormonas del tipo de ACTH, encefalinas, TSH, hormona de crecimiento,
prolactina, péptido intestinal vasoactivo (VIP) y CRH. Su secreción es regulada por
los reguladores hipotalámicos de las hormonas hipofisiarias, hecho que apoya la
evidencia de una comunicación bidireccional entre el sistema inmunológico y el
sistema endocrino.
INTEGRACIÓN DE SNC, INMUNOLOGICO Y ENDOCRINO
Una conducta o un estresor pueden estimular la corteza cerebral y el sistema
límbico produciendo la liberación de NA, DA, serotonina, acetilcolina, GABA y otros
neurotransmisores, así como la secreción de CRH, el cual activa la inervación
simpática del núcleo paraventricular (NPV) del hipotálamo.
21
Esta inervación controla los patrones rítmicos de la secreción de péptidos
neuroendocrinos del eje hipotálamo‑hipófisis‑adrenal (HHA). La CRH secretada por
el hipotálamo estimula en la hipófisis la liberación de ACTH, hormona que estimula
en la corteza suprarrenal la producción de glucocorticoides. Los glucocorticoides se
unen a sus receptores en las células inmunológicas suprimiendo la función
inmunológica.
Además, los órganos inmunológicos y los leucocitos pueden producir
glucocorticoides que ejercen un efecto de retroalimentación sobre la suprarrenal y la
hipófisis.
Las citocinas liberadas por los leucocitos a la circulación atraviesan la BHE
para unirse a los receptores de citocinas en el cerebro, hipotálamo e hipófisis. La IL-1
es el péptido con mayor capacidad de estimular la liberación de CRH en el
hipotálamo. De esta forma el sistema inmunológico modula la neurotransmisión, la
conducta y la secreción hormonal. La modulación ejercida por el sistema
inmunológico sobre los neurotransmisores, la CRH y otras hormonas no es debida
solamente a la acción de los glucocorticoides. En los diferentes tipos de leucocitos se
han encontrado receptores para neurotransmisores, CRH y otras hormonas.
Los neurotransmisores y la CRH liberados por el SNC, y las hormonas
producidas por la hipófisis al entrar al torrente sanguíneo se pueden combinar con
estos receptores y modular la respuesta inmunológica, tanto celular como humoral.
La NA y la CRH producidos por el NPV pueden modificar la actividad del SNS
incrementando la liberación de NA y neuropéptido Y (NPY).
La inervación simpática de los órganos linfoides y endocrinos (glándula
suprarrenal) permite que la NA y el NPY se puedan unir a sus receptores en los
linfocitos, células NK y adrenales y regular las funciones endocrinas e inmunológicas.
22
TIPOS DE ESTRÉS.
La clasificación del estrés depende del tipo de estimulo, duración y
frecuencia, por lo tanto se puede clasificar en: estrés agudo; que se define como la
aplicación de un estimulo único corto, y estrés crónico: que es la aplicación de
estímulos repetitivos y que tienen una duración más larga.
MODELOS EMPLEADOS EN ROEDORES PARA EL ESTUDIO DEL EFECTO DEL
ESTRÉS EN EL SISTEMA INMUNOLÓGICO.
Muchos investigadores han examinado los efectos del estrés en el sistema
inmunológico, usando mamíferos pequeños, particularmente roedores. Los roedores
son con frecuencia escogidos por esa área de investigación, porque es posible el
fácil desarrollo para emplear modelos de estrés, que pueden ser utilizados para
entender los mecanismos en los cambios inmunológicos inducidos por estrés. Hay
diferentes modelos de estrés que han sido comúnmente utilizados para el estudio de
este fenómeno. Algunos investigadores han estudiado el efecto del estrés in vitro en
la respuesta inmunológica.
Filteau et al., en 1992 empleo un modelo de estrés por ejercicio y determino
un incremento en la proliferación celular a nivel del sistema inmunológico, por otra
parte, Hermann et al., en 1994, utilizando el modelo de estrés por restricción,
observo una disminución en las células inmunológicas y una disminución de la
actividad de los macrófagos, posteriormente Shimizu et al., en 1996 en el modelo de
estrés por inmovilización, determino una disminución de la actividad de las células
Natural Killer (NK).
23
ANTECEDENTES DIRECTOS.
Los estudios anteriormente descritos, demuestran que los diferentes tipos de
estrés afectan la respuesta inmunológica. Por otro lado, estudios recientes han
demostrado los efectos del estrés en el sistema inmunológico de mucosas.
Adriana Jarillo et al., en abril 2007, estudió los efectos del estrés repetitivo por
restricción en los niveles de IgA intestinal del ratón, el objetivo de este experimento
fue determinar los efectos del estrés repetitivo por restricción en la producción y
secreción de los niveles de IgA y así también el número de células productoras de
IgA de la lamina propia del intestino, en relación a la liberación de glucocorticoides y
catecolaminas. Utilizó diferentes tratamientos como: adrenalectomía, simpatectomía
química, tratamiento con antagonista de glucocorticoides (RU486), dexametasona y
epinefrina. El principal descubrimiento fue que 1) el estrés crónico por restricción,
reduce la concentración de IgA intestinal, sin cambios en el número de células
productoras de IgA en la lamina propia del intestino delgado; 2) la adrenalectomía
restauró la producción de IgA intestinal en el ratón estresado; 3) RU486 y la
simpatectomía química particularmente bloqueo la disminución de IgA intestinal en le
ratón estresado y 4) dosis farmacológicas de dexametasona y epinefrina, reducen
significativamente la concentración de IgA intestinal y el número de células
productoras de IgA. En conclusión, el estrés por restricción, reduce la concentración
de IgA intestinal atraves de los efectos de los glucocorticoides y catecolaminas.
Por otro lado L. Hoffman-Goetz et al., en julio 2007, describieron los efectos de
ejercicio por repetición en la alteración de la expresión de IL-10 y TNFα en los
linfocitos intestinales del ratón. Determinaron tres grupos de ratones; 1) grupo
sedentario (control); 2) grupo sacrificado inmediatamente después del ejercicio y 3)
grupo con ejercicio y sacrificado 24 hrs después del ejercicio. En este estudio se
observo que en el grupo 2 hubo incremento en la expresión de la citocina anti
inflamatoria la IL-10, en los linfocitos intestinales del ratón, y a las 24 horas después
del ejercicio todavía se encontraba elevada la expresión de IL-10 comparado con el
24
grupo control; la expresión de la citocina proinflamatoria TNFα, se incremento en el
grupo 2, pero fue significativamente baja la expresión de TNFα en los linfocitos
intestinales del ratón después de las 24 horas del ejercicio; y esto podrá tener una
gran importancia en el control de enfermedades inflamatorias intestinales en la
determinación del ejercicio asociado a la expresión de citocinas del patrón Th1/Th2
observados en este estudio.
Posteriormente Adriana Jarillo et al., en septiembre 2007, estudio el efecto del
estrés por restricción en la población de linfocitos intraepiteliales intestinales del
ratón; incluyendo el incremento de glucocorticoides y catecolaminas. Los efectos del
estrés por restricción fueron analizados en diferentes tratamientos: adrenalectomía,
simpatectomía química, tratamiento con antagonistas de glucocorticoides (RU486),
dosis farmacológicas de dexametasona y epinefrina. El principal descubrimiento fue
que: 1) el estrés crónico por restricción, reduce la población de linfocitos
intraepiteliales del intestino delgado; 2) la adrenalectomía, el tratamiento con RU486
y la simpatectomía química disminuyen el número de células Tγδ, CD4+ y CD8+ en
grupos no estresados; 3) la dexametasona reduce el número de células Tγδ y células
TCD8+ y 4) la epinefrina reduce el número de células Tγδ, CD4+ y CD8+.
Estos resultados demostraron que el estrés por restricción disminuye el número de
linfocitos intraepiteliales en la parte proximal del intestino delgado del ratón,
principalmente en combinación de la acción de la alta concentración de
catecolaminas y glucocorticoides, y bajas concentraciones de glucocorticoides y
catecolaminas en ratones no estresados se preservo la población de linfocitos
intraepiteliales.
25
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿Cuáles son los efectos del estrés por nado en la producción de IgA y en las
poblaciones de linfocitos T y B de la lámina propia y placas de peyer del intestino
delgado del ratón?
JUSTIFICACION
El sistema inmunológico asociado a intestino constituye la parte más extensa y
compleja del sistema inmunológico. Las superficies mucosas recibe diariamente una
enorme carga antigénica y es sorprendente la capacidad que tienen para distinguir
entre patógenos invasivos y antígenos inocuos procedentes de los alimentos y de
bacterias comensales.
El intestino posee mecanismos de defensa que limitan el acceso de sustancias
nocivas al organismo. Esta barrera intestinal está integrada por diversos elementos
como enzimas digestivas pancreáticas, el epitelio intestinal y las bacterias que
constituyen la flora intestinal. Sin embargo, la barrera más efectiva está constituida
por el tejido linfoide asociado al intestino o GALT.
La mayoría de los trabajos se han enfocado en analizar el efecto del estrés
crónico a nivel intestinal, sin embargo no existen estudios que analicen el efecto del
estrés agudo en la producción de IgA y si modifica las poblaciones celulares en
intestino delgado.
26
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto del estrés por nado en la producción de IgA y en las
poblaciones de los linfocitos T y B de la lámina propia y placas de payer del intestino
delgado del ratón.
OBJETIVOS PARTICULARES. 1. Determinar los niveles de corticosterona en animales control y estresados.
2. Determinar los niveles de IgA en animales control y estresados.
3. Determinar poblaciones de linfocitos B y T CD4, TCD8 en placas de Peyer
del segmento proximal y distal del intestino delgado del ratón.
4. Determinar poblaciones de linfocitos B y T CD4, TCD8 en ganglio
mesentérico.
5. Determinar poblaciones de linfocitos B y T CD4, TCD8 de la lamina propia
del segmento proximal y distal del intestino delgado del ratón.
27
HIPOTESIS
Si el estrés crónico disminuye la respuesta inmunológica a nivel del GALT,
por lo tanto al aplicar un estrés agudo aumentara la producción de IgA así como
también modificará las poblaciones de linfocitos T y B de la lámina propia y placas de
Peyer del intestino delgado del ratón
28
MATERIALES Y METODOS.
ANIMALES.
Se utilizaron 30 ratones Balb/c machos, de 8 semanas de edad,
proporcionados por el bioterio de la Escuela Superior de Medicina. El manejo de los
animales se realizo de acuerdo a las normas de la Comisión de Bioética de la
Escuela Superior de Medicina. Los animales se dividieron en 3 grupos de 5 animales
cada uno. Todos los ratones se mantuvieron en ciclo día-noche de 12hrs por dos
meses, la comida y agua a libre demanda.
PROTOCOLO DE ESTRÉS. Antes del estudio del estrés, el grupo problema, los animales se tuvieron que
adaptar al nado de la siguiente manera: inicio de adaptación al nado, primer día,
15min, segundo día: 30 min, tercer día: 45 min, cuarto día: 60 min, cada tercer día; a
partir de este momento cada tercer día adaptación al nado por 60 min durante 1 y
medio mes. En una tina de policarbonato de dimensiones de 2m de largo X 1m de
ancho y divididos los compartimentos de 40cmx50cm cada uno, se utilizo agua
potable, a una temperatura de 30º C, en una temperatura del ambiente de 27º C. El
día del experimento se tomo un grupo control el cual no fue estresado, estos se
mantuvieron tranquilos/serenos en sus cajas; el grupo experimental se sometió a
estrés por nado durante 4hrs. El grupo control fue sacrificado inmediatamente, y el
grupo experimental se sacrifico inmediatamente después de las 4hrs de nado.
OBTENCION DE MUESTRAS
OBTENCION DE SUERO. Inmediatamente después del estrés por nado los ratones fueron anestesiados
con éter, y fueron sacrificados por dislocación cervical, inmediatamente se realizo
puncion cardiaca para extracción de sangre, se coloca en tubo eppendorf, se
centrifuga a 3000 rpm 5 min, para separación de suero, y realizar detección de
hormonas por método de inmunoensayo.
29
Procedimiento del inmunoensayo, se utilizo un kit de inmunoensayo
enzimático (assay designs, Stressgen)(No. 901-097, de 480 pocillos (5x96 pocillo)
Kit); siguiendo el instructivo del kit se realizo primero determinar el número de
pocillos que serán usados y poner algunos pocillos restantes con el desecante al
revés dentro de la bolsa y cerrar la cierre de la bolsa. Agregar 100μl del diluyente
estándar dentro del NSB y en el Bo. Posteriormente colocar 100μl de estándar #1
hasta el #5 dentro de los pocillos apropiados. Posteriormente colocar 100μl de la
muestra dentro de los pocillos indicados. Después colocar 50μl de la solución buffer
15 dentro de los pocillos NSB. Colocar 50μl del conjugado azul dentro de cada
pocillo, excepto en el de actividad total (TA) y en el pocillo banco. Después colocar
50μl del anticuerpo amarillo dentro de cada pocillo, excepto en los pocillos blanco, TA
y NSB. Después incubar la placa a temperatura ambiente en plato de agitación por 3
hrs a 500rpm. Posteriormente vaciar el contenido de los pocillos y lavar añadiendo
400μl de solución de lavado a todo los pocillos, repetir dos lavados mas para ser un
total de lavados de tres lavados. Después de ultimo lavado vaciar y aspirar los
pocillos y firmemente golpear la placa y con un pedazo de papel remover el exceso
de la solución de lavado. Adicionar 5μl del conjugado azul al pocillo TA. Adicionar
200μl de solución de sustrato pNpp a todos los pocillos. Incubara temperatura
ambiente por 1hr sin agitación. Adicionar 50μl de la solución para parar la reacción a
todos los pocillos. Una vez parada la reacción leer inmediatamente. Se lee a
densidad óptica de 405nm.
OBTENCION DE LIQUIDOS INTESTINALES DE SEGMENTO PROXIMAL Y DISTAL DEL INTESTINO DELGADO DEL RATON.
Se realizo una incisión abdominal, una vez expuesto la cavidad abdominal, el
intestino delgado fue removido con cuidado y se dividió en segmento proximal y
segmento distal, se hicieron lavados intestinales con 3ml de RPMI-1640(SIGMA) una
sola vez, se le agrega inmediatamente 200μl de inhibidor de proteasas, se disgrega
bien los residuos se colocan en tubos cónicos y se centrifuga a 4º C/ 4700rpm/
30
15min, posteriormente el sobrenadante fue recolectado y se almacena a 4º C, para la
determinación de IgA por método de ELISA.
ELISA PARA CUANTIFICAR IgA EN EL SEGMENTO PROXIMAL Y DISTAL DEL INTESTINO
Se utilizo micro placas de ELISA de 96 pocillos de plástico fondo cuadrado, se
coloco 100 mL del antígeno diluido en buffer de carbonato en cada uno de los pozos
de la placa, se incubó a 4ºC, toda la noche, para lograr la sensibilización de la
placa. Al dia siguiente se lavó la placa 3 veces com PBS-T. Se agrega leche svelty al
6% a los pocillos, se incubo durante 3hrs a 37ºC, para bloquear todos los espacios
en los que el antígeno no se hubiera adherido. Se lavo la placa 3 veces con PBS-T
y 1 vez com PBS1x.
Se añadió en cada pozo de la placa 100 mL de los lavados intestinales,
dejando una fila o columna conocidas que sirvieron como controles blanco. Se
incubó la placa durante 2hrs a 37ºC, para permitir la reacción antígeno anticuerpo.
Se lavó la placa 3 veces con PBS-T y 1 vez com PBS1x. Se añadió en cada pozo de
la placa 100 mL del conjugado peroxidasa, que es inmunoglobulina anti-IgA de
raton. Se incubó la placa durante 2hrs a 37ºC, para permitir la reacción del conjugado
con el anticuerpo. Se lavó la placa 3 veces con PBS-T y 1 vez com PBS1x. Se
añadió en cada pozo de la placa 100 mL del sustrato correspondiente: una tableta de
orto-fenil-dietanolamina (OPD) disuelta en una mezcla de ácido cítrico y fosfato
disódico a pH 5,0, a la que se añadió 20 mL de peróxido de hidrógeno. Se incubó la
placa durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente y protegida de la luz, para
permitir la reacción del conjugado con el sustrato, que origina coloración amarilla-
naranja. Se detuvo la reaccion com 25 mL de acido sulfúrico (H₂SO₄), se procedió a
lectura de la densidad óptica en espectrofotómetro a 492 nm.
OBTENCION DE LINFOCITOS DE BAZO Se obtuvieron los bazos con cuidado de cada uno de los ratones, se
disgregaron en una rejilla de acero inoxidable con 5ml de RPMI-1640(SIGMA), sobre
un refrigerante, posteriormente se filtro con organza a un tubo cónico, se deja en
posición vertical durante 10min, para la sedimentación de los eritrocitos, se filtra con
31
organza a otro tubo conico el sobrenadante, centrifugo a 4º C/ 1200rpm/ 5min, se
decanto el sobrenadante, y al pellet se le agrego 3 ml de RPMI-1640(SIGMA) se re
suspendió y se obtuvo la suspensión, las células fueron contadas en una cámara de
NewBauer y se ajustaron a un millón de células por mililitro.
OBTENCION DE LINFOCITOS DE PLACAS DE PEYER Obtención de linfocitos de placas de peyer: las placas fueron removidas con
cuidado de cada uno de los segmentos (proximal y distal), se disgregaron en una
rejilla de acero inoxidable con 5ml de RPMI-1640(SIGMA), sobre un refrigerante,
posteriormente se filtro con organza a un tubo cónico, se centrifugo a 4º C/ 1200rpm/
5min, se decanto el sobrenadante, y al pellet se le agrego 1 ml de RPMI-
1640(SIGMA) se re suspendió y se obtuvo la suspensión, las células fueron
contadas en una cámara de NewBauer y se ajustaron a un millón de células por
mililitro.
OBTENCION DE LINFOCITOS DE LA LÁMINA PROPIA Obtención de linfocitos de la lamina propia: una vez que se retiraron la placas
de peyer de los segmentos del intestino proximal y distal, se evirtieron los intestinos
con un gancho de de acero inoxidable con cuidado y se colocaron en un tubo cónico
de 50ml, se le agrego colagenasa (from Clostridium hystoliticum Type IV, SIGMA-
Aldrich, St. Louis, MO,USA) y 200μl Ditioteitrol (DTT[AMRESCO, SOLON-OHIO]), se
incubo a 37º C/170rpm por 30 min, en agitación constante, en posición horizontal,
posteriormente se disgregaron los intestinos suavemente con el embolo de una
jeringa en una caja de petri, se filtro los residuos con organza en un tubo cónico de
50ml, posteriormente se centrifugo a 4º C/ 1500rpm/10min, posteriormente el
sobrenadante se decanto y a la pellet se le agrego 10ml de RPMI-1640 SIGMA se re
suspendió y se filtro a otro tubo cónico de 15ml y se centrifugo a 4º
C/1500rpm/10min, se decanto el sobrenadante y se re suspende la pellet y se le
agrego 200 μl de suero fetal bovino, y 4ml de percoll (SIGMA, Ph 8.5-9.5, 25ºC) al
40% y se re suspendió sin hacer espuma, en otro tubo cónico vacio se agrego 4 ml
de percoll al 75% y muy despacio y resbalando por las paredes sin que se mezclaran
los percolles se añade el percoll al 40% que contiene la suspensión celular.
32
Se centrifugo a 4º C/2500rpm/30min/0 aceleración y 0 desaceleración, una vez
que ya salió la interfase se quito el moco primero con una pipeta Pasteur, con mucho
cuidado, con otra pipeta se extrajo con mucho cuidado el anillo de la interfase donde
están los linfocitos, a otro tubo cónico de 15ml, a este tubo se le añadió 10ml de
RPMI-1640 SIGMA y 200μl de suero fetal bovino, se centrifugo a 4º C/1500rpm/5min,
se decanto el sobrenadante y al pellet se le agrego 1ml de RPMI se re suspendió, las
células fueron contadas en una cámara de NewBauer y se ajustaron a un millón de
células por mililitro.
INMUNOTINCION
Todos los ensayos de los fenotipos de los linfocitos de la lamina propia, placas
de peyer, ganglios mesentéricos, y bazo fueron realizados en paralelo. Para la
caracterización de los linfocitos T y B de los tejidos se prepararon y fueron
suspendidos en 0.5% de albumina serica bovina (ASB), que han sido disueltos en
PBS a una concentración de 10⁶ células /ml, seguido de incubación a 4º C en la
oscuridad con 10 μl del anticuerpo de membrana (mAb) propiamente diluido, por 30
min. Las células fueron lavadas, con 0.5% ASB-PBS, se suspendieron en 500 μl de
formaldehido en PBS y se almacenaron en oscuridad a 4º C hasta que se analizaron.
La superficie del fenotipo de las células fueron analizadas usando el mAb anti raton
(Becton Dickinson Technologies, Gaithersburgs, MD) comprados de PharMingen
(San Diego, CA). Los mAb usados en este estudio fueron incluidos el anti-CD45R+ o
B220+ Proteína Clorofila Peridinina (PerCP) (RA3-6B2), el anti-CD19+ (APC) (1D3),
el anti-CD4+ Proteína Clorofila Peridinina (PerCP) (RM4-5), y El anti-CD8a+
Ficoeritrina (PE) (RA3-6B2). Las células fueron teñidas con la combinacion del mAb
reconociendo los siguientes determinantes: CD19/CD4/CD8, CD19/B220.
Para la preparacion del analisis de la citometria de flujo para la relacion de la
intensidad de fluorescencia fueron medidos con citometro de flujo FACScan (Becton
Dickinson, San Jose, CA) equipado con un laser de íon-argon. Los datos fueron
colectados para 10,000 eventos. El fenótipo de los linfócitos fueron determinados por
tres colores de inmunofluorescencia.
33
El porcentaje de los linfocitos marcados con cada mAb fueron calculados en
comparacion con las células marcadas con el isotipo control del anticuerpo. Los
datos fueron analizados usando el software WinMDI.
Cada analisis fue preparado con un mínimo de tres veces para verificacion, y
los resultados representan el significado ± de la desviacion estandar de tres
experimentos. Los resultados son mostrados en porcentaje de células positivas.
ANALISIS ESTADISTICO.
Las diferencias significantes de cortisol, IgA intestinal y los fenotipos de las
poblaciones de los linfocitos de cada muestra fueron determinadas usando dos vías
ANOVA siguiendo el test de Tukey. Una P<0.05 fue considerado estadísticamente
signifacativo.
34
RESULTADOS Cuantificacion de niveles de cortisol en suero.
La determinación de cortisol en suero se realizo por método de radioinmunoensayo, y se observo que al aplicar el estrés por nado, aumentaron los niveles de cortisol en suero como una respuesta sistémica al estrés. (Fig. 3).
Fig. 3. Niveles de cortisol en suero. La grafica muestra el aumento de niveles de cortisol en suero al aplicar estrés por nado. Se nota el aumento del los niveles del cortisol en el estrés de 4hrs. Las barras representan la media ± D.S. de al menos tres experimentos independientes entre si.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CONTROL 4HR NADO
CONTROL
4HR NADO
35
Cuantificación de IgA en el segmento proximal y distal del Intestino Delgado. La determinación de IgA en los líquidos intestinales se analizaron por el
método de ELISA, y se observó un incremento en la producción de IgA en los
ratones que se sometieron a estrés por nado. (FIG. 4).
Figura 4. Niveles de IgA intestinal en ratones Balb/c machos. Comparacion de los niveles de IgA entre el grupo control y estrés por nado 4 hrs. Se observa el aumento de la producción de IgA del intestino delgado total en el estrés por nado de 4 hrs. Las barras representan la media ± D.S. de al menos tres experimentos independientes entre si.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
CONTROL 4 HRS
CONTROL
4 HRS
36
LINFOCITOS DE BAZO.
Al analizar por citometría de flujo el porcentaje de linfocitos T y B en bazo , en animales estresados se encontró un aumento en el porcentaje de los linfocitos CD4+ y una disminución de los linfocitos TCD8+, y los linfocitos CD19+/B220+ disminuyeron en estrés por nado de 4 hrs. (Fig.5). Se realizo análisis estadístico donde se observan los porcentajes y desviación estándar de las poblaciones de linfocitos del bazo. CD4+ (25% ±0.5% vs 40% ±3%), CD8+ (13% ±1% vs 9% ±0.5%), CD19+/B220+ (49% ±1% vs 41% ±1%).(Fig. 6).
Figura 5. Citometria de flujo de poblaciones de linfocitos del bazo. Comparacion de los subtipos de las poblaciones de linfocitos T y B del bazo del raton Balb/c, del grupo control y estrés nado por 4 hrs. La expresion de los CD4+, CD8+ y CD19+/B220+ dobles positivos se marcaron con anticuerpos de membrana (mAb).
CONTROL NADO4HRS
CD
4⁺PERC
P
CD8⁺ PE
CD
19⁺APC
B220⁺ PERCP
CD
19⁺APC
CD4⁺ PERCP
37
Figura 6. Poblaciones de linfocitos T y B del bazo. La grafica muestra la comparación de las poblaciones de los subtipos de linfocitos T y B en bazo. Las barras representan la media ± D.S. de al menos tres experimentos independientes entre si.
0
10
20
30
40
50
60
CD4 CD8 CD3 CD19 CD19/BB20
CONTROL4HRS NADO
38
Linfocitos de Placas de Peyer Parte proximal.
Al analizar por citometría de flujo el porcentaje de linfocitos T y B en placas de peyer parte proximal, en animales estresados se encontró un aumento en el porcentaje de los linfocitos CD4+ y también hay un aumento en los linfocitos TCD8+, y los linfocitos CD19+/B220+ disminuyeron en estrés por nado de 4 hrs. (Fig.7). Se realizo análisis estadístico donde se observan los porcentajes y desviación estándar de las poblaciones de placas de peyer parte proximal. Los linfocitos CD4+ (17% ±2% vs 20% ±6%), CD8+ (4% ±0.1% vs 9% ±3%), CD19+/B220+ (63% ±1% vs 36%±12%)(Fig. 8).
Figura 7. Citometria de flujo de poblaciones de linfocitos T y B de placas de peyer proximal. Comparacion de los subtipos de las poblaciones de linfocitos T y B de placas de peyer parte proximal del raton Balb/c, del grupo control y estrés nado por 4 hrs. La expresion de los CD4+, CD8+ y CD19+/B220+ dobles positivos se marcaron con anticuerpos de membrana (mAb).
CD
4⁺PERC
PC
D1
9⁺APC
CD8⁺ PE
B220⁺ PERCP
CONTROL NADO 4HRPROXIMAL
CD
19⁺APC
39
Figura 8. Poblaciones de linfocitos T y B de placas de peyer parte proximal.. La grafica muestra la comparación de las poblaciones de los subtipos de linfocitos T y B de placas de peyer parte proximal. Las barras representan la media ± D.S. de al menos tres experimentos independientes entre si.
0
20
40
60
80
CD4 CD8 CD3 CD19 CD19/B220
CONTROL4HRS NADO
40
Parte distal. Al analizar por citometría de flujo el porcentaje de linfocitos T y B en placas de peyer parte distal, en animales estresados se encontró un aumento en el porcentaje de los linfocitos CD4+ y también hay un aumento en los linfocitos CD8+, y los linfocitos CD19+/B220+ disminuyeron en estrés por nado de 4 hrs. (Fig.9). Se realizo análisis estadístico donde se observan los porcentajes y desviación estándar de las poblaciones de placas de peyer parte distal. Los linfocitos CD4+ (12% ±1% vs 21% ±5%), CD8+ (4% ± 1% vs 11% ±0.3%), CD19+/B220+ (71% ±7% vs 51% ±10%) (Fig. 10).
Figura 9. Citometria de flujo de poblaciones de linfocitos T y B de placas de peyer distal. Comparacion de los subtipos de las poblaciones de linfocitos T y B de placas de peyer parte distal del raton Balb/c, del grupo control y estrés nado por 4 hrs. La expresion de
CD
4⁺PERC
P
CD8⁺ PE
CD
19⁺APC
B220⁺ PERCP
CONTROL NADO 4hrsDISTAL
CD
19⁺APC
CD4⁺PERCP
41
los CD4+, CD8+ y CD19+/B220+ dobles positivos se marcaron con anticuerpos de membrana (mAb).
Figura .10. Figura 8. Poblaciones de linfocitos T y B de placas de peyer parte distal. La grafica muestra la comparación de las poblaciones de los subtipos de linfocitos T y B de placas de peyer parte distal. Las barras representan la media ± D.S. de al menos tres experimentos independientes entre si.
0102030405060708090
CD4 CD8 CD3 CD19 CD19/B220
CONTROL
4HRS NADO
42
Linfocitos de la lamina propia Parte proximal
Los resultados de las poblaciones de los linfocitos T y B de la lamina propia segmento proximal del intestino delgado, se analizaron por citometría de flujo, y en animales estresados se encontró una disminucion en el porcentaje de los linfocitos CD4+ y también disminuyeron los linfocitos CD8+, y los linfocitos CD19+/B220+ aumentaron en estrés por nado de 4 hrs. (Fig.11). Se realizo análisis estadístico donde se observan los porcentajes y desviación estándar de las poblaciones de linfocitos de la lamina propia del segmento proximal del intestino delagdo. Los linfocitos CD4+ (39% ±2% vs 14% ±2%), CD8+ (12% ± 0.5% vs 3% ±0.3%), CD19+/B220+ (24% ±1% vs 46% ±1%) (Fig. 12).
Figura 11. Citometria de flujo de poblaciones de linfocitos T y B de la lamina propia segmento proximal del intestino delgado. Comparacion de los subtipos de las poblaciones de linfocitos T y B de la lamina propia del segmento proximal del intestino delgado del raton Balb/c, del grupo control y estrés nado por 4 hrs. La expresion de los CD4+, CD8+ y CD19+/B220+ dobles positivos se marcaron con anticuerpos de membrana (mAb).
CD
4⁺PERC
P
CD8⁺ PE
CD
19⁺APC
B220⁺ PERCP
CONTROL NADO 4 hrs
CD
19⁺APC
CD4⁺ PERCP
43
Figura 12. Poblaciones de linfocitos T y B de la lamina propia del segmento proximal del intestino delgado. La grafica muestra la comparación de las poblaciones de los subtipos de linfocitos T y B de la lamina propia del segmento proximal del intestino delgado. Las barras representan la media ± D.S. de al menos tres experimentos independientes entre si.
0102030405060708090
CD4 CD8 CD3 CD19 CD19/B220
CONTROL4HRS
44
Parte distal
Los resultados de las poblaciones de los linfocitos T y B de la lamina propia segmento distal del intestino delgado, se analizaron por citometría de flujo, y en animales estresados se encontró una disminucion en el porcentaje de los linfocitos CD4+ y también disminuyeron los linfocitos CD8+, y los linfocitos CD19+/B220+ disminuyeron en estrés por nado de 4 hrs. (Fig.13). Se realizo análisis estadístico donde se observan los porcentajes y desviación estándar de las poblaciones de linfocitos de la lamina propia del segmento distal del intestino delgado. Los linfocitos CD4+ (49% ±3% vs 13% ±0.5%), CD8+ (12% ± 3% vs 4% ±2%), CD19+/B220+ (50% ±0% vs 43% ±0.1%) (Fig. 14).
Figura 13. Citometria de flujo de poblaciones de linfocitos T y B de la lamina propia segmento distal del intestino delgado. Comparacion de los subtipos de las poblaciones de linfocitos T y B de la lamina propia del segmento distal del intestino delgado del raton Balb/c, del grupo control y estrés nado por 4 hrs. La expresion de los CD4+, CD8+ y CD19+/B220+ dobles positivos se marcaron con anticuerpos de membrana (mAb).
CD
4⁺PERC
P
CD8⁺ PE
CD
19⁺APC
B220⁺ PERCP
CONTROL NADO 4hrs
CD
19⁺APC
CD4⁺ PERCP
45
Figura 14. Poblaciones de linfocitos T y B de la lamina propia del segmento distal del intestino delgado. La grafica muestra la comparación de las poblaciones de los subtipos de linfocitos T y B de la lamina propia del segmento distal del intestino delgado. Las barras representan la media ± D.S. de al menos tres experimentos independientes entre si.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CD4 CD8 CD3 CD19 CD19/B220
CONTROL
4 HRS
46
Ganglio mesentérico Los resultados de las poblaciones de los linfocitos T y B del ganglio
mesenterico, se analizaron por citometría de flujo, y en animales estresados se encontró una disminucion en el porcentaje de los linfocitos CD4+ y también disminuyeron los linfocitos CD8+, y los linfocitos CD19+/B220+ disminuyeron en estrés por nado de 4 hrs. (Fig.15). Se realizo análisis estadístico donde se observan los porcentajes y desviación estándar de las poblaciones de linfocitos de ganglio mesenterico. Los linfocitos CD4+ (50% ±5% vs 46% ±3%), CD8+ (17% ± 5% vs 15% ±1%), CD19+/B220+ (31% ±6% vs 25% ±3%) (Fig. 16).
Figura 15. Citometria de flujo de poblaciones de linfocitos T y B de ganglio mesenterico. Comparacion de los subtipos de las poblaciones de linfocitos T y B de ganglio mesenterico del raton Balb/c, del grupo control y estrés nado por 4 hrs. La expresion de los CD4+, CD8+ y CD19+/B220+ dobles positivos se marcaron con anticuerpos de membrana (mAb).
CD
19⁺APC
B220⁺ PERCP
CONTROL NADO 4 hrs
CD8⁺ PE
CD
4⁺PERC
PC
D19
⁺APC
CD4⁺ PERCP
47
Figura 16. Poblaciones de linfocitos T y B de ganglio mesenterico. La grafica muestra la comparación de las poblaciones de los subtipos de linfocitos T y B de ganglio mesenterico. Las barras representan la media ± D.S. de al menos tres experimentos independientes entre si.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
CD4 CD8 CD3 CD19 CD19/B220
CONTROL
4HRS
48
DISCUSION.
La importancia de este estudio fue analizar los efectos del estrés por nado en
la producción de IgA y en las poblaciones de linfocitos de la lamian propia y placas
de Peyer del ratón.
Se sabe que dependiendo del tipo de estrés físico o psicológico se activan las
neuronas del tallo cerebral o las de áreas del sistema límbico, las cuales inciden
sobre neuronas del núcleo para ventricular del hipotálamo, que sintetizan hormona
liberadora de corticotropina (CRH), las neuronas CRHergicas hipofisiotropicas envían
sus proyecciones a la eminencia media de donde, en respuesta a un estimulo, se
libera la CRH a la circulación portal que llega a la pituitaria y controla la síntesis y
liberación de corticotropina ( ACTH), que viaja por el torrente sanguíneo a la glándula
suprarrenal, liberando glucocorticoides ( cortisol en el humano y corticoesterona en
otros mamíferos) (de Gortari P. et al 2000). en este estudio preliminar del efecto del
estrés por nado se notó un aumento de la corticoesterona en sangre debido a la
activación del eje hipotálamo-hipofisis- adrenal en respuesta al estrés.
El estrés por nado aumento la producción de IgA intestinal.
Los estudios acerca del estrés en la respuesta inmunológica del intestino son
muy raros, en particular la influencia del estrés por nado en la respuesta de IgA
intestinal no se ha reportado. En este estudio se observó un incremento significativo
en la producción de IgA intestinal en animales por nado de 4 hrs comparados con el
grupo sedentario. Esto puede deberse posiblemente a la activación del eje
hipotálamo-hipofisis- adrenal, y liberación de hormonas (glucocorticoides), en sangre
periférica, y activación de las células plasmáticas productoras de IgA.
El estrés por nado modificó las poblaciones de linfocitos T y B de las placas de peyer y de la lamina propia del intestino delgado del ratón.
La información acerca de los efectos del estrés en las poblaciones de linfocitos
en el intestino son limitados. Algunos estudios han demostrado cambios significantes
en la distribución de los leucocitos del cuerpo después del estrés agudo (Dhabhar,
2002; Dhabhar et al. 1995, 1996).
49
Sin embargo en nuestro estudio se observo un incremento de los linfocitos
CD4+ y CD8+ en placas de Peyer, probablemente por la relación de hormonas de
estrés sobre estas poblaciones sobre sus receptores de superficie o por migración
periférica a este sitio. Por otro lado se observo un incremento significativo de las
poblaciones de linfocitos CD19+ y B220+ en la lámina propia del intestino delgado
del ratón, probablemente debido a la liberación de citocinas y activación de estas tipo
de células plasmáticas productoras de IgA en este sitio o también puede deberse ala
migración de estas células de la sangre periférica por medio de moléculas de
adhesión o por quimiocinas.
50
CONCLUSIONES.
En conclusión, basados en los resultados obtenidos de este proyecto, se sabe
que el estrés por nado, como estrés agudo, modifica la producción de IgA en el
intestino delgado del ratón, por otro lado también afecta a las poblaciones celulares
de linfocitos B y T de las placas de Peyer y lamina propia del intestino delgado del
ratón.
1. La producción de IgA intestinal aumento como respuesta al estrés agudo, y
probablemente por aumento de los linfocitos B plasmáticos en la lamina
propia del intestino.
2. En placas Peyer aumentaron los LTCD4 Y LTCD8, probablemente por la
activación de los LT por los receptores hormonales de superficie.
3. En Ganglio mesentérico el estrés no modifico las poblaciones de linfocitos.
4. En lamina propia aumentaron los CD19/B220, probablemente por la liberación
de citocinas al activarse los LT o por migración periférica.
PERSPECTIVAS
A) Analizar la expresión del componente secretor en células epiteliales del
segmento proximal y distal del intestino delgado de ratón
B) Analizar las células productoras de IgA en sitios inductores y efectores a nivel
intestinal
C) Analizar la expresión de TGF- b, IL-5
D) Analizar los niveles de catecolaminas (adrenalina y noradrenalina)
E) Analizar la expresión de moléculas de adhesión a nivel intestinal
51
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