1JNlVERSlDAD AUTONOMA METROPOLITANA

IZTAPALAPA (:: , r I :-I .

EFECTO DEL ZINC SOBRE LA ESTEROIDOG~NESIS EN CÉLULAS DE LEYDIG ESTIMULADAS IN VITRO.

R E P O R T E

QUE PARA OBTENER ELTíTULO DE

LICENCIADO EN BlOLOGíA

EXPERIMENTAL

P R E S E N T A :

PÁEZ QUINTERO LAURA

MÉXICO, D.F. 1996

AGRADECIMIENTOS:

A la M. enC. María Elena Sánchez Contreras

(Biologa Experimental) por haberme orientado en

la redacción de este proyecto.

Agradezco especialmente a los profesores Enrique

Mendieta Marqudz y Joaquín Fernando Herrera

por el apoyo brnndado en la realización de este

proyecto.

A mi padre por haberme ayudado a concluír mis

estudios, por que gracias a ello he logrado llegar

hasta donde ahora estoy.

A mis abuelos y hermanos de quienes he recibido

siempre la ayuda necesaria.

Finalmente a mis amigos y maestros por haberme

brindado su apoyo en los momentos más difíciles.

NOMBRE: Paez Quintero Laura

MATRICULA: 87245403

LICENCIATURA: Biología Experimental ( UAM - I , CBSL 1 '

7 I " TRIMESTRE LECTIVO:

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HORAS POR SEMANA: 20 horas. . " ' , . ,

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TITULO DIEL TRABAJO: ,EFECTO DEL ZINC SOBRE LA ESTEROIDOGiENESIS EN CELULAS DE LEYDIG ESTIMULADAS IN VITRO.

ASESOR: M.en C. ENRIQUE MENDIETA MARQUE2

LUGAR DE REALIZACION: Laboratorio de Mecanismos de Requlación Testicular. Area de Biología Celular. Departamento de Ciencias de la Salud. UAM - I.

FECHA DE IIVICIO: Diciembre 16 de 1994. FEC HA bt T E & ~ ~ A C I OkJ ', >on10 i b ¿e \sqs CLAVE: BE.0131.95

ERO LAURA

¿?. /"-pt-."M M. en C. ENRIQUE MENDIETA M.

INTRODUCCI6N

La participación de los iones inorgánicos es crucial para casi todos los procesos bioquímicos y fisiológicos del organismo . Algunos se encuentran sólo en concentraciones mínimas titulares, microgramos a picogramos por gramo de órgano húmedo, y son arbitrariamente denominados elementos huella. De estos, se sabe en la actualidad que son esenciales para la vida animal el hierro, el yodo, el cobre, el manganeso, el molibdeno, el selenio, el cromo, el flúor, el silicio, el riíquel, el zinc, el estaño y el vanadio. Así, diversos metales participan en la catálisis enzimática mediante la unión del sustrato, la activación del complejo enzima-sustrato, o por la formación de un complejo de coordinación firme con la enzima, en forma tal que ambos son aislados en conjunto como una unidad, por ejemplo las metalo-enzimas. Los efectos biológicos de los metales, tanto esenciales como tóxicos, por io general son consecuencia de antagonismo metal-ión, es decir,un metal produce sus efectos Ibiológicos alterando los requerimientos de otro, generalmente por competencia a nivel del mismo sitio bioquímico (Harrison, 1984).

Estudios recientes demuestran que una deficiencia de zinc en humanos se caracteriza por cambios neurosensoriales, oligospermia en machos, decremento de la testosterona en suero de machos, hiperamonemia, decremento de la actividad de timulina en suero, decremento en la producción de IL-2, decremento en la actividad de las células asesinas, alteraciones en la subpoblaciories de las células I, daiio en las funciones neurosicológicas (Walsh T. Carol, 19914).

ZINC:

El conteriido corporal promedio en el hombre adulto de este elemento varia de 1.4 a 2.:3 g; las mayores concentraciones se encuentran en el hígado, músculos voluntarios, hueso, próstata y ojos. los requerimientos mínimos diarios (alrededor de 15 mg.) son provistos con facilidad por la mayoría de las dietas, ya que el zinc está ampliamente distribuido en los alimentos, particularmente en la carne, mariscos, hígado, gelatina, pan, cereales, lentejas, chícharos, frijoles y arrloz. Es un componente esencial de diversas enzimas hepáticas, pancreáticas y de otros Órganos, y su importancia en la síntesis proteica puede apreciarse sobre la base de que las polimerasas del DNA y el RNA son metalo- enzimas que contienen zinc. (Harrison, 1984).De aquí que la sola presencia de este metal tiene un importante papel en las funciones inmune, reproductiva. neurológica, y sistema cardiovascular.

Aunque el zinc es relativamente abundante en el medio ambiente natural no parece ser acumulado en el cuerpo conforme a la edad, no se conoce. hasta el momento an80rmalidades genéticas como resultado de acumulación excesiva de zinc en el cuerpo; a diferencia de ciertos metales como el cobre (enfermedad de Wilson's) y el hierro (hemocromatosis), por lo que el zinc es considerado generalmente un metal no tóxico ( Vllalsh T. C. 1994). El zinc , es uin elemento con un peso atómico de 65, esta clasificado en el grupo II B de post-transición miembro de la tabla periódica. Las características químicas del zinc son : a) Tendencita a perder dos electrones el catión 2' forma sales de solubilidad variada en solución acuosa , b) Forma unión coordinada estable con ligandos electronegativos como es el nitrógeno, oxígeno y sulfuro. c) El zinc diifiere de otros elementos de transición, relativamente porque es estable en eil estado divalente y no sufre cambios redox. Reacciones en solución acuosa. d) En solución acuosa el catión 2' del Zinc es hidratado a pH bajo ,a pH alto forma aniones secantes (posiblemente Zn(OH)4).

Varios compuestos de zinc difieren significativamente en su solubilidad acuosa. Por ejemplo, la solubilidad del cloruro de zinc (mw 136) en agua a 25 "C es 432 g/lOO ml mientras que el oxido de zinc (mw 81) a 29 "C es 0.00016 g/lOOml.(Walsh T. C. 1994).

Mecanismos de acción de hormonas esteroides

Las hormonas esteroides difunden directamente a través de la membrana plasmática de sus células blanco y se unen a proteínas receptoras intracelulares. La unión del ligando activa a los receptores, los cuales regulan directamente la transcripción de genes específicos fig 1 A. Estos receptores son estructuralmente relacionados y (constituyen la superfamilia de receptores intracelulares. Las hormonas esteroides son fabricadas en la testis y ovario y son responsables para los caracíeres sexuales secundarios masculinos y femeninos. Las hormonas esteroides, por contraste, persisten en la sangre por horas y la hormona de la tiroide poi. días. Los receptores intracelulares para las hormonas eisteroides y tiroides, relinoides, y vitamina D todos se unen a las secuencias (del DNA especificas adyacentes a los genes de los ligandos que regulan. Algunos como los receptores de cortisol, son localizados en el citosol y se unen al DNA solamente si esta unido el ligando fig 1 B.

Otros, coma los receptores de retiiioides , son localizados en el núcleo y son unidos al DNA en la ausencia de ligandos. En otros casos. la unión de ligandos altera la conformación de la proteína receptora, activando entonces (ocasionalmente suprimen) la transcripción del gene. (Bruce Alberts, 1995 ).

I

\ Yo%

1 SU-DNA L

H 2 e w COCiH

DU-DNA

N-C receptor del cortisol N c

receptor de estrogeno

receptor de progesterona N ' C

receptor de vitamina D N c

receptor de la hormona tiroide N-C

receptor del ácido retinoico

(B)

Fig 1 A) Modelo de una proteína receptora intracelular: 1,complejo de proteína inhibitoria, SUH sitio de unión de la hormona, DU-DNA, sitio de unión a DNA, DAT dominio de activación de la transcripción, HE, hormona esteroide, RP, región puesta, SU-DNA-L sitio de unión a DNA libre. (A) Un modelo de una proteína del receptor intracelular es (En su estado inactivo el receptor esta unido a una proteína inhibitoria, la unión del ligando al receptor provoca un cambio conformacional, liberando a la proteína inhibitoria, y activando al receptor al exponer su sitio de union al DNA).(B) Dominios de unión al DNA (DU-DNA) en distintos receptores; el modelo en A es en base al receptor de cortisona pero todos los receptores de esta super familia tienen una estructura relacionada. ( Bruce alberts 1995)

Superfamilia de receptores intracelular.

DEDOS DE ZINC:

Es una proteína de unión a DNA con una estructura característica llamada dedos de zinc esta proteína fue conocida por primera vez en el factor de transcripción1 de Xenopus leavis (TFIIIA). El estudio de las secuencias de cDNA que codifican para estas proteínas revela la existencia de dos clases de proteínas de unión con estructura,s semejantes a dedos. Estas clases, son caracterizadas de acuerdo al número y posición de residuos de cisteina e histidina disponibles para la coordinación con zinc.La clase CzHz es tipificada por TFlllA y sus proteínas contienen como unidad estructural básica pares de cisteína e histidina separados por tin loop de 12 aminoácidos. Aunque es más fácilmente visualizado como un dedo de aminoácidos anclado por Zn y proyectado de la superficie de la proteína Fig. 2. Un modelo alternativo inferido de estructurtas de métalo proteínas conocidas, propone que la estructura en forma de dedo esta compuesta por una secuencia mínima de dos repetidos en tandem (7 a 8 aminoácidos) enlazando las unidades separadas de histidina- cisteina Fig :3.

fig. 2 fig. 3

Las pro'teínas de la clase Cx tienen un número variable de cisteínas disponibles para la quelación de metales . Para los factores transcripcionales de levaduras tall como GAL4. esta formado como un racimo de seis cisteinas, mientras qui- los receptores a esteroides contienen aparentemente dos estructuras semejantes a dedos codificadas por exones separados el primero con cuatro ci:steínas y el segundo con cinco cisteínas. La evidencia disponibles indica que Icis dedos de proteínas actúan como reguladores transcripcionales con una amplia variedad de funciones: TFlllA regula la transcripción de RNA polimerasa II . La SP1 actúa como un elemento regulatorio upstream mientras que ADRl, GAL4, y receptores esteroides se unen a secuencias enhancer.( Evans M.R, 1988).

El factor de transcripción SP1 es IJn miembro de la proteína de dedos de Zinc (ZFP) . El SP1 unido a la caja GC (elemento promotor rico en GC) se cree que juega un papel integral en la transcripción de genes caracteres de caja TATA. Las cantidadies limitadas de SP1 pueden ser un mecanismo regulatorio en la expresión de los genes que contienen la caja de GC,. Sin embargo las concentraciones de SP1 no parecen ser limitados en las células espermatogé,nicas y los niveles altos de la proteína SP1 es detectada en las espermatidaa. El gen ZFY humano <que codifica una proteína de dedos de Zinc (ZFP) originalmente se descubrió en todo el cromosoma Y para el factor determinado en el testículo. Aunque este factor no tiene un papel principal en la formación del testículo.

Los facto'res de transcripción que usan estructuras de dedos de Zinc para unirse al DIVA incluyen receptores hormonales. Esta superfamilia incluye receptores de hormonas esteroides, hormona tiroide T3, vitamina D3, y ácido retinoico. Aunque es expresado en tejidos reproductivos, muchos de estos receptores rto están presentes en las células espermatogenicas. El receptor andrógeno y el receptor estrógeno no son detectables en las células espermatogenicas ( Kretser David, 1993)

Interacción zinc-enzimas (metalo-enlzima).

El zinc es requerido para la actividad optima de muchas enzimas. En las metalo-enzimas el zinc participa en las funciones catalíticas y funciones regulatorias. Las metalo-enzimas dse zinc están involucradas en la formación o hidrólisis de compuestos endógenos ( proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) El análisis cristalográfico a identificado enzimas que contienen zinc, entre las que

se incluyen la alcohol deshidrogenasa, carboxipeptidasas A y B,fosfatasa alcalina y anhidrasa carbónicas I y YI. Los sitios vitales de unión al zinc pueden incluir combinaciones de histidina, glutamina, aspartato y cisteina en el sitio catalítico. (VL'alsh T. C., et al, 1994)

lnteraccitjn receptor hormona

El zinc es itambién requerido para la actividad optima de la hormona de crecimiento. Recientemente, (Walsh T. C. et al, 1990) demostró que el zinc incrementa la afinidad por la hormona de crecimiento para el dominio de unión extracelular del receptor de prolactina humana. El rangci de zinc libre en el plasma es de 0.4 p M en condiciones fisiológicas y se denomina Kd. El análisis de la constainte de unión para mutmtes indican que el zinc forma un complejo tetravalente através de coodinacihn con dos sitios de histidina y un sitio de glutamina en la hormona de crecimiento y una histidina en el receptor de prolactina. VValsh indica la importancia de examinar el papel del zinc en las interaccionec de unión de hormonas con receptores de la superfamilia de citocinas el cual es homólogo al receptor de prolactina.

lnteracciones de membranas.

Se ha hipotetizado que el zinc juega un papel en la función fisiológica de la célula porque tiene la capacidad de "estabilizar a las membranas". Este fenómeno es probablemente a consecuencia de la unión del zinc a ligandos en membranas, el cual es esencial para el mantenimiento de la estructura geométrica iiormal de componentes como proteínas y lípidos. Los sistemas experimentalles donde se observó esta propiedad del zinc fue en los eritrocitos, donde el zinc disminuye la fragilidad osmótica y protege a los eritrocitos contra varios induclores de hemolisis como los gradientes osmóticos y toxinas bacterianas.i( Walsh T. C. 1994).

ANDR~GENOS Y ESTROGENOS

Las vías pera la biosintesis de andrógenos y estrógenos son esencialmente iguales en la corteza suprarrenal, el ovario y el testículo. El colesterol es el principal precursor en esta sintesis. la hormona luteinizante (HL) es la causa de la sintesis y la secreción de andrógenos y estrógenos por las gónadas en los dos sexos. La testosterona, es el prinlcipal andrógeno; se forma a partir de la androstendioria y los andrógenos se forman en pasos subsecuentes. El estradiol es el estrógeno mas potente secretado;la testosterona es su precursor inmediato, o bien se forma a partir de la androstendiona a través de la estrona . (fig. 4). (Vick. R. 1986)

Fig. 4 Biosintesis y metabolismo de andrógenos,estrógenos y progesterona.

En el liombre la testosterona es el principal androgen0 secretado, es sintetizado y secretado por las cklulas de Leydig (células intersticiales) y es regulada completamente por la HL. Dos terceras partes de la testosterona en la circulación !se encuentran fijas a una globulina del plasma (globulina fijadora de testosterone y de estrógenos, GFTE). que también fija estradiol. Sólo la testosterona libre es biológicamente activa. La concentración normal de testosterona total (la fija más la libre) en el plasma del hombre es aproximadamente 0.6 pgldl, y la concentración normal, de testosterona en el plasma de la mujer es de aproximadamente 0.03 pgidl. Los testículos del varón joven normal secretan entre 4 y 8 mg, de estradiol; otros 25 a 35 pg, de estradiol se forman 51 partir de la testosterona y de la androstano-3 alfa, 17 &-dioles. La excreción total diaria de 17 cetosteroides en los varones, es de 8 a 18 mg de los cuales aproximadamente 4mg provienen de los testículos y el resto de las suprarrenales.( Harrison. 1984)

Control hormonal de la espermatogénesis.

Como se menciono anteriormente la espermatogénesis en mamíferos es regulada por hormonas de la pituitaria . La literatura provee evidencias de que la hormona luteinizante (HL) y la hormona folículo estimulante (FSH) son los principales ireguladores de los procesos espermatogénicos en los mamíferos, la FSH actúa directamente en el epitelio de los seminiferos mientras que la LH ejerce ciertos efectos en los procesos espermatogénicos através de la producción 'de testosterona por las células de Leydig en respuesta a LH (fig. 5). La síntesis y liberación de las hormonas gonadotropicas LH y FSH son disparados por la hormona liberadora de gonadotropina peptidica hipotalamica (GNRH) y están sujetas a la regulación de la regeneración mediada por esteroides tlesticular (principalmente testosterona).

Cerebro Endocrino-Ejes del Testiculo Hipotálamo (-) -....,

t GnRH ''.. .,

inhibina activina

I (+) i:spermatogenesis (+l. I TESTICULO

FIG. 5. Representación de la interrelación hormonales entre el cerebro y el testículo.

Los procesos de la espermatogenesis tiene lugar el los tubulos seminiferos de la testis, abarcando una serie de eventos coordinados que culminan en la formación y liberación del espermatozoos testiculares . La espermatogenesis comienza con las divisiones mitoticas diploide de la espermatogonia tipo A y B. Las Últimas ctilulas son nombradas espermatocito primario uno de ellos entra en meiosis I y da origen al espermatosito secundario . Estas células contienen un número de cromosomas haploides. Durante la meiosis II, evolucionan las espermatides circulares haploides . Las espermatides circulares no se dividen por desarrollo entre las espermatides elongadas (espermatozoos testiculares). Estos procesos designados en la espermatogenecis, es seguido por la liberación del espermatozoos testiculares (espermiación). teóricamente, un espermatocito primario da origen a cuatro espermatidas circulares. En el testículo prirnitiva, dos tipos de espermatogonia A se identificaron, la espermatogoriia A-oscura y A-clara.

La espermatogonia A-oscura sufre divisiones sólo después de la deplecion de sólido, la espermatogonia A-clara e!; considerada como célula stem de reserva testicular. La espermatogonia A-clara se multiplica regularmente por todos los procesos espermatogenicos y es considerada testicular renovadora de las células stem. En adición a las células germinales, células somáticas como son, células de Leydig, células peritubular y células de Sertoli, que juegan un papel clave en los procesos espermatogénicos. ( Kretser David, 1993)

Gonadotropiria Coriónica humana (hCG) : La hormona glucoproteíca que actúa en forma muy parecida a la LH y esproducida por las células trofoblásticas de la placenta susile denominarse gonadotropina coriónica humana. Difiere de la hormona LH porque después de la hiposectomía no puede producir en un animal todos los fenómenos que origina esta. Sin embargo, si a un animal al cual se le ha extirpado la hipbfisis se le administra algo de hormona gonadotrófica prehipofisiaria, la gonadotropina corionica ejerce la misma acción que la hormona LH. En otras palabras, si colabora la hipófisis anterior, la gonadotropiria coriónica actúa igual que la hormona LH.(Ham, 1975). La hCG al igual que las hormonas glucoproteicas (TSH, LH, FSH) esta compuesta cle subunidades a La secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa de todas estas hornnonas son semejantes solo que la de hCG presenta 2 inversiones de aminoácidos y la deleción de tres en el extremo terminal, mientras que la subunidati beta de estas cuatro hormonas es Única desde el puinto de vista estructural, y les confiere especificidad biológica ( Pierce, J. G. 1971).

y p.

TESTOSTERONA

La testosterona es esencial para la fertilidad en el adulto masculino. La LH acelera la siriteis de testosterona disparando el numero de reacciones químicas incluyendo la producción de AMP(:, la activación de la proteina cinasa y la sintesis de proteinas en la testis y otros organos blancos.La testosterona influencia la diferenciación de las células mieloides y modula síntesis de las células de Sertoli, pero no actúa directamente con las células germinales (Rommerts, 11 972).

Efectos de la hormona esteroide (testosterona)

La testosterona afecta en grados diversos células corporales: penetra en la mayor parte de células, pero puede afectarlas o ser afectada en grado mayor, menor o nulo. En las células hepáticas puede sufrir grandes cambios metabólicos. En otras células que podemos denominar células que responden a sus andrógeiios, es modificada y en forma cambiada estimula el crecimiento y secreción. lals células que responden a sus efectos tienen la capacidad de convertir la testosterona en 5-dihidrotestosterona ( esta conversión tiene lugar en el citoplasma y en los núcleos ) que después es reducida a otros metabolitos pero en el núcleo de estas células la dihidrotestosterona no se altera, sino que se une, por medio de una proteína, a la eucromatina, ( es la cromatina que se halla en el !núcleo por medio de una proteína de interface desenrrollada y proporcionando información). La enzima que en el núcleo convierte la testosterona en dihidrotestosterona está firmemente uriida al complejo de eucromatina proteica aunque la fijación probablemente no sea de tipo covalente. Si un núcleo dispone de dihidrostestosterona y esta fija en la eucromatina, esto sugeriría que actúa a nivel de los genes mediante aumento de la cantidad de RNA que sf? forma, lo que daría por resultado que las células afectadas sinteticen miis proteínas y por lo tanto aumenten de tamaiio.( Ham 1975)

Mecanismos de acción de la LH ( y tiCG )en la esteroidogenesis

La LH y la ACTH aceleran la esteroidogenesis en su respectivo tejido blanco por influencia en la conversión del colesterol a pregnenolona, el cual es el porcentaje lirnitado en la via biosint6tica (fig. 6 ).

COLESTEROL PREGNENOLONA - PROGESTERONA

Fig. 6.Reaccines involucrados en la conversión de colesterol a pregnenolona. HCLC hendidura de la cadena lateral del colesterol , 3B-HSD, hidrixi- esteroide deshidrogenesa.

La hormona LH ( y hCG) unida a su receptor activa a la proteína Gs, el cual resulta una activación de la adenilato ciclasa ( AC ) y finalmente la conversión de ATP a AMPc el cual es considerado como un segundo mensajero. El AMPc activa a la proteína cinasa A, que conlleva a la fosforilación de la proteína especifica, L.as evidencias experirnentales sugieren que la LH ( y hCG) incrementan la producción de AMPc de las células de leydig, aunque este segundo mensajero no es capaz de explicar todas las acciones de la LH . La acción de la LH puede ser modulada por otros factores endocrino I paracrino I autocrino, por estos mecanismos alternativos. El principal argumento tiende a ser que la síntesis de testosterona es estimulada por las concentraciones de la LH que resulta menos del 1 % de satluración de los receptores y no es detectable en el aumenito de niveles de AMPc intracelular. La explicación de como estos nucleotidos pueden acelerar la conversión de colesterol a pregnenolona son varias: El AhIPc puede acelerar esta reacción por su aumento, a) Los niveles del cofactor INADPH, b) La cantidad total del colesterol libre intracelular, c) El transporte del colesterol a el sistema enzimático responsable del procesamienito del colesterol, Ó d) lia actividad de la enzima que realiza este procesamiento (Fig. 7) ( Austin, 1979).

LH 4

fig. 7 Posibles sitios de acción de LH y AMPc en la esteroidogenesis.R,receptor hormona; AC',adenilato ciclasa.

Estudios designados a investigar la toxicida de cationes metalicos en la producción de testosterona en células de Leydig in vitro e identificar o caracterizar el sitio(s) celular de acción de Cd2+ y otros cationes metalicos, examinar las similaridades y/o diferencias expuestas in vivo por ' ultimo determinar el sitio de acción toxico, utilizando hCG, DE-AMPc y varios otros sustratosreqiieridos para la biosíntesis de testosterona. El sitio(s) celular de acción inhibitoria por Cd2' Co2', Ni" y Zn2' parece ser

subsecuente al receptor de membrana , la producción de AMPc ,y a la enzima 20,22 desmolasa(enzima que convierte el colesterol a pregnenolona en la membrana interna de la mitocondriéi), el sitio(s) estimulatorio parese ser entre la enzima 20, 22 desmolasa. y la enzima 3R-hidroxilasa (convierte la pregnenolona a progesterona)incluyendo la conversión enzimatica de HCHOL, PREG y PROG A TESTOSTERONA(F1G. 8).Ellos especulan que la inhibición en la producción de testosterona puede ser causado por la supresión del movimiento dle calcio transmembrane1 por estos cationes .Tambien sugieren una hipotesis alternativa que el Co2' puede desinhibir a la fosfoproteína fosfatasa(s) el cual inhibe la LH y AMPc-Gib estimuladores de la esteroidogenesis desfosforilanldo a las fosfoproteínas involucradas en los procesos esteroidogénico. Otros autores concluyeron que varios cationes metalico tienen afinidad por 110s sitios de cisteina e histidina en las proteínas y que la unión de estos cation(-s puede resultar en estimulación o inhibición de la actividad catalítica (La:skey ,1991),

R //----n&i; I--

FIG 8 Representación esquematica de la biosíntesis de testosterona en células de Leydig de rata en cultivo.Usando hCG en lugar de LH ,20 - hidroxicolesterol en lugar del colesterol. Abreviaciones; P45Oscc, enzima que corta a la cadena del citocrorno mitocondrial P450; HSD/ISOM, 3B- hidroxiesteroide deshidrogenasa y las enzimas isomerasa; P450c,la enzima 17 -hidroxilasa; P450cl7,20, la enzima 17,20 liasa; 17CETO RED, la enzima 17- cetoreductas,a.

El marcado incremento de la producción, uso y disposición de diversas especies químicas durante los Últimos años ha tenido un profundo impacto sobre el medio ambiente y ha creado riesgos potenciales para la función reproductiva humana , para caracterizar estos riesgos, los; investigadores interesados en determinar los efectos tóxicos causados por la exposición a diferentes sustancias, han utilizado modelos animales en el laboratorio y han extrapolado esta información obtenida in vivo o in vitro a los seres humanos (Frazier 1993).

Esta aproximación ha sido utilizada para determinar los retos que presentan para la salud una variedad de xenobióticos que incluye a los éteres de glicol, pesticidas orgánicos, intermediarios químicos de síntesis tales como estireno o cloruro de viriilo por metales pesados como plomo, cadmio o boro. La producción de testosterona en células de Leydig es también esencial para la maduración del esperma normal en el epididimo, manteniendo los accesorios de organos sexuales y un efectivo fun'cionamiento sexual debido a la sintesis de androgenos. Un tóxico en las células de Leydig puede afectar la fertilidad disminuyendo los niveles de la espermatogénesis, alterando la movilidad del esperma , disminuyendo la actividad del esperma fertilizado, o del libido^ Ciertamente algunos de estos efectos puede representar tóxico por comprometer la via esteroidogenica dentro de las células de Leydig que puede o no ser detectado por un cambio de la testosterona en la circulación (Steinberger, 1993).

Existen evidencias de que la exposición aguda o crónica de diversos organismos a cationes metálicos puede causar daños generalizados que incluyen lesiones de varios órganos, tales como el higado, riñón y gónadas. Estas accciories deleterias se reflejen directa o indirectamente en la existencia de riesgos ocupacionales que conllevan la disminución de la función reproductiva y un marcado descenso en la fertilidad de las poblaciones expuestas.

Se a demostrado que ciertos metales pesados son necesarios para la función testicular (zinc , el manganeso y selenio). Sin embargo las cantidades excesivas de ciertos metales pesados puede resultar en desplazamiento de metales esenciales del tejido blanco, dando un rompimiento en la función metabólica. La administración de metales esenciales puede provocar el desplazamiento del metal tóxico y ayudar a prevenir el daño de tejidos. Esta es la base para estudios que involucrim el uso de zinc para proveer protección contra el cadrnio y plomo que inducen lesión testicular (Anderson, 1993).

Diversos ¡investigadores han determinado que cationes metálicos tales como Cd”, Mn2’, tig2’, Pb”, Cu”, Ni2’, Coz’ son capaces de interferir directamente con la función testicular normal in vivo induciendo por ejemplo degeneración de los tubulos seminiferos, disminución en la concentración plasmática de testosterona (T) y hormonas gonadotrópicas, oligo o azoosperma e incluso necrosis testicular, probablemente 51 través de un efecto tóxico directo sobre las arterias testiculares. Mientras que el Cd ’+, Coz’, Hg“, Ni” y Zn2’ reducen la producción de testosterona por las células de Leydig in vitro a altas concentraciones y tienen efecto estimulatorios excepto el Hg ’+ a concentraciones moderadas aprox.1 x 10-4M). Otrlx metales catiónicos ( Ca 2*, Cr , Fe-, Pb”, Mg + y Na” aparentemente no tienen efectos un alguna estimulación en la producción de testosterona ;todos los cationes excepto el plomo en la forma de cloruro indica que este anión no es responsable para algunas de las alteraciones vistas en la estimulación en la producción de testosterona. (Laskey 1991).

9 i

Por otra lparte, los cultivos primarios de las diferentes estirpes celulares del testículo se han covertido en una inetodologia cada vez más utilizada para el estudio de 18 fisiología gonadal y recientevente han sido también utilizada para evaluar los efectos tóxicos de diversas sustancias in vitro.

Aunque aparentemente es m l s sencillo evaluar los efectos tóxicos de diferentes sustancias en cultivos primarios de células de Leydig (CL) a través de la medición directa de la producción de testosterona, el mantenimiento de la funcionalidad de estas células durante periodos largos de incubación ha representadso un problema, lo que permite explicar el bajo número de publicaciones que reportan el uso de estas células in vitro, para la realización de estudios toxicológicos.

El deterioro en la biosíntesis de andrógenos esta particularmente relacionado a la deficiencia de zinc y altos niveles de prolactina en pacientes con insuficiencia renal crónica (CRF). La administración oral de zinc mejora los niveles de andrógenos en el pl’asma dependiendo de la magnitud de la hiperprolactinemia. Sin embargo todos estos cambios hormonales son frecuentemente inversos solo cuando es llevado acabo un transplante de riñón. Existen evidencias indirectas de una conversión decreciente de androstendiona (A) a testosterona (T), secundario a el estado uremic0 y una deficiencia de zinc, en pacientea con CRF.(Exaire, 198,2).

Se estudió en 15 pacientes masculinos con insuficiencia renal crónica, el efecto de la administración oral de sulfato de zinc sobre los andrógenos, gonadotrofina y prolactina (PRL). Después de tres semanas de ingerir el elemento se observó un franco incremento del zinc plasmatico en todos los enfermos, con aumento de la testosterona hasta cifras normales en aquellos pacientes en los que la PRL no estaba extraordinariamente elevada. No se obtuvo cambios significativos en los valores de androstendiona (A), Dihidrotestosterona (DHT), gonadotrofinas, ni en la prolactina. Estos resultados sugieren que el zinc actúa como protector de membrana favoreciendo la sintesis de testosterona, y que la prolactina, tiene un efecto negativo en la síntesis de andrógenos, igual que ocurre en sujetos con adenomas hipofisiarios, actuando sobre la 5 a reductasa (Paniagua, 1982).

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Estudio del efecto del zinc sobre la esteroidogénesis en células de Leydig (CL) de ratas adultas normales durante un periodo de tres horas de incubación.

OBJETIVOS PARTICULARES

Evaluacióri del efecto del ZnC12, Zn(NO& y ZnS04 sobre la estereoidogénesis de fracciones, enriquecidas en CL incubadas durante un periodo de tres horas.

Evaluación del efecto de las dosis efectivas de zinc, sobre la estereidogenesis de CL estimuladas con gonadotropin,a corionica humana (hCG) .

METODOLOGiA

Material Biolbgico.

edad las cuales fueron sacrificadas por dislocación cervical. Se utilizaron ratas macho adultas normales de la cepa Wistar de 90 días de

Preparación 'de tejidos. Los testículos fueron descapsulados y se elimino la sangre mediante varios lavados con una solución Krebs-Ringer (KRBG, 125mM NaCI, 5mM MKCI, 1.2 mM MgS04, 35 mM tris, 1 mM Nati2P04, pH 7.4 ) adicionado con glucosa al 0.2% y gentamicina al 0.05%.

Separación celular 1 .-Los testículos se trataron con colagenasa (tipo la, SIGMA, 1 mglml en KRBG) durante 18 rriinutos a 37°C con agitación periódica, la actividad enzimatica fue detenida con una solución de NaCl 0,956 dejándola reposar durante 10 minutos después se separon las fracciones crudas por filtración a traves de una malla de 50-1OOpm de poro.

2.- El filtrado (fracción intersticial cruda) se centrifugó a 1500 g (2800rpm) durante 10 minutos a 10 "C , l,a pastilla celular fue resuspendida en un volumen mínimo de KRBG y centrifugada a través de una solución KRBG-ficoll 400-BSA(sigrna, 13-0.2%, pH 6.5) a lOOOg (2300 rpm) durante 15 minutos. El botón celular fue resuspendido en KRBG obteniendose la fracción enriquecida de CL y se ajusto la densidad 6 X

Se utilizaron tubos de ensayo di? 7 x 12 a los cuales se les adiciono 500 pI de la suspensión celular ( por tubo ;I, a los tubos control se les adiciono 500 pI de KRBG , a los experimentales de les añadió a 500 pI del doble de la dosis del catión correspondiente(Zn), a otro:: con 500 VI de gonadotropina corionica humana (hCC;) y los Últimos con 250 pI del catión correspondiente junto con 250 pl de la gonadotropina ( ver cuadro 1).

3.- Las células fueron incubadas a :37"C durante un periodo de tres horas, al final del período de incubación la e:steroidogénesis fue detenida por la adición de 500 pl de una solución de hidróxido de sodio (desnaturaliza a las proteínas). Se utilizó unal concentración alta de 1000pM de cloruro de zinc, sulfatos de zinc y nitritos de zinc para evaluación del efecto del anión sobre la posible toxicidad del metal; asimismo se utilizaron concentraciones de 14.01 nM,1.4nM,O. 14nM sin la presencia de los metales y concentraciones de 33.59 nM, 3.73 nM, 0.415 nM con la presencia de los metales y de gonadotropina coriónica humana para la

células por ml.

evaluación del efecto de la dosis efectiva del catión sobre la esteroidogénesis de CL.

4.- Estos ensayos fueron realizados por triplicado y los tubos fueron mantenidos en refrigeración hasta que se determinó la concentración de testosterona presente, en las suspenciones celulares por medio de inrnunoanálisis específico (IRIA), se determinó I B curva de inhibición de la síntesis de testosterona.

Radioinmuncianalisis

Los tubos fiueron descongelados a temperatura ambiente, después se les adicionaron '1 ml de éter etilico, seguido de una agitación vigorosa durante un minuto. Los tubos fueron posteriormente introducidos en una mezcla de hielo seco -acetona con el objeto de congelar la fase acuosa y facilitar su separación de la fase orgánica, el cual se recuperó en otros tubos de aproximadamente 15 ml. Este tratamiento se repitió una vez mas para cada tubo procesado, previa descongelación de la fase acuosa (después de la primera extracción. Una vez reunidas las fases acuosas( el éter con los esteroides) se dejaron evaporar a sequedad. Se les añadió a todos los tubos la testosterona radiactiva cantidades variables y el anticuerpo. Los tubos se incubaron durante toda la noche a 4 "C y los esteroides libres fueron separados por la adición de una solución de carbón activado-dextran seguida por agitación vigorosa y centrifugación durante 15 minutos a 4 "C. Los sobrenadantes se decantaron a viales de vidrio y se les adicionaron cantidades suficientes de lnstagel (packard) como liquido de centelleo y si? contó en un espectrofotómetro de centelleo líquido Los valores obtenidos fueron compa,rados con la curva patrón de testosterona y el anticuerpo específico para esta: Para la curva: patrón se utilizó un anticuerpo especifico para la testosterona y se hicieron diluciones de este de 1:10,000 final, se utilizaron cinco disoluciones de testosterona marcada con tritio (0.1 pg IpI. lpg/VI, 10 pg/p,lOO pg/pI y 1 ng/pI ). Esta curva en teoría nos explica que a mayor cantidad de anticuerpo mayor es el porciento de unión de hormona, por lo tanto hay menor cantidad de testosterona presente y a menor cantidad de anticuerpo menor es el porciento de unión por lo tanto mayor cantidad de testosterona presente, para saber que cantidad se {tenía de testosterona no radiactiva en los tubos experimentales se utilizaron el mismo anticuerpo y testosterona de la curva patrón lo cual es posible porque se lleva acabo iun método de competencia; es decir, la testosterona radiactiva y la no radiactiva compiten por los sitios de unión disponibles en la molécula del anticuerpo de la testosterona, la cantidad de hormona presente en el tubo de ensayo, s9 determina por la cantidad de testosterona iradiactiva unida al anticuerpo.

CUADRO 1

Tubos solución

control KRBG KRBG+hCGl KRBG + hCG2 KRBG + hCG3 KRBG+ZnCI2 KRBG+ZnS04 KRBG+Zn( N03)2 KRBG+ZnClz+hCGi KRBG+ZnS04+hCiJ

9 KRBG+Zn(NO&+hICG *

Cantidad (pi)

500 500 + 500 500 + 500 500 + 500 500 + 500 500 + 500 500 + 500 500 +250 +250 500+250 +250 500 +250 +250

Nota: Cada ensayo se hizo por triplicido * Estos ensayos se hicieron con 3 concentraciones distintas, ver cuadro 2

de resultados.

RESULTADOS

células de Leydig (CL) de hCG

CUADRO 2.

Respuesta como % de testosterona producida (pg)

- 14.01 1.4 0.14

33.59 3.73 O 415

33.59 3.73 0.41 5

3.73 0.41 5

33.5

KRBG +CL hCG 1 + CL hCG2 +CL hCG3 +CL hCGl + CL + ZnCl2 hCG2 + CL + ZnClz hCG3 + CL + ZnCl2 hCGl + CL + ZnS04 hCG2 + CL + ZnS04 hCG3 + CL + ZnS04 hCGl + CL + Zn(NO3)z hCG2 + CL + Zn(NO3)z

13.54 3519.52 480.32 193.35

2387.47 453.8 186.6 30.89 18.20 12.66 29.77 21.15 10.27

Tratamiento con distintos metales.

Dosis en pM % de testosterona del metal. producida( pg)

CL + ZnC12 CL + ZnS04 CL + Zn(NOj:i2

1 O00 1 O00 1 O00

38.25 17.73 10.52

Nota: Estos datos fueron utilizados' para obtener las gráficas correspondientes a cada uno de los tratamientos utilizados.

TRATAMIIENTO APLICADO A DOSIS PORCENTAJE DE TESTOSTERONA CELULAS DE LEYDIG ink!) PRODUCIDA (pg) C O 13.54 CL

hCG +

0.14

14 1.4

.~ 193.4

480,32 3519.52

Gráfica 1 . Producción de testosterona en presencia de hCG

o 0.14 1.4 I4 C CL + HCti

Dosis die hCG

~O¡lÜ66A~~)1

7 .

TRATAMIENTO APLICADO A DOSIS PORCENTAJE DE TESTOSTERONA CELULAS DE LEYDIG n M PRODUCIDA (pg) C CL+ hCG + CI

O 1334 C1,42 186,6

33,6 23873 3,73 4533

__.

Gráfica 2.Producción de tectocterona en presencia de hCG y ZnCl2

TRATAMIENTO APLICADO A DOSIS PORCENTAJE DE TESTOSTERONA CELULAS' DE LEYDIG iiM PRODUCIDA (pg) C O 13,54 hCG 0,42 12.66 + 3,73 18,2 SO4 33,6 3039

Gráfica 3. Produccidn de testocterona en presencia de hCG y Zn(S04)

O 0.42 3.73 33.6 C hCG i SO4

Doris

I~PORCENTAJE DE I

I _ O s > ~ _ ~-

1 TESTOSTERONA PRODUCIDA

TRATAMIENTO APLICADO A DOSIS PORCENTAJE DE TESTOSTERONA CELULAS DE LEYDIG (nM) PRODUCIDA (pg) C hCG

403

m c

c m VI O VI c

ii W U W

c W

O

'3

2 a

c

O 0,42 3,73 33.6

13.54 10.27 21.15 29.77

Gráfica 4. Producción de Testosterona en presencia de hCG y Zn(N03)2

O 0,42 3.73

Dos1s

-

- F

~

'ORC - EN7

- 'A - JE

~

DE ~ TESTOSTERONA PRODUCIDA (w)

TRATAM'IENTO APLICADO A DOSIS PORCENTAJE DE TECTOSTERONA CELULAII DE LEYDIG pM PRODUCIDA (pg) C control O 13.54 1 ZnCií' 1 O00 38.25 2 3

ZnSOLi Zn (NO31 2

1 O00 1 O00

17,73 10,52

Gráfica 5. Producción de testosterona en presencia de Zn y distintos aniones

Dosis

DISCUSI~N

Diversos autores han reportado que el zinc tiene un efecto protector celular en presencia de compuestos tóxicos (Anderson, 1993, Walsh, 1994 ). Sin embargo algunas sales de zinc a concentraciones altas puede dañar al tejido epitelial, la inlhalación, ingestión o exposición en la piel puede producir efectos patológicos locales (Walsh, 1994). Analizando Icis resultados obtenidos para evaluar el efecto del cloruro, sulfato y nitrato de zinc en la esteroidogénesis nosotros encontramos que el porcentaje de producción de testosterona por las células de Leydig aumenta con la adición de cantidades cresientes de hormona (hCG), ( Grafica 1 ) lo que concuerda con lo reportado por Lackey (1991), el propone que la interacción de la hCG con el receptor de la LH incrementa la producción de testosterona, en ensayos realizados in vitro con células de Leydig. El porcentaje de testosterona producida en presencia de cloruro de zinc no se equipara con los porcentajes producidos por células de Leydig solo utilizando la hormona hCG; a pesar de que se iitiliza el doble de la cantidad de hormona adicionada con cloruro de zinc (Gráfica 2). Sin embargo la hormona hCG mantiene niveles altos de testosterona ya que si comparamos la gráfica 5 y la gráfica 2 observamos que la producción de testosterona con cloruro de zinc sin estimulación con la hormona disminuye considerablernente. Es importante hacer notar que en el cloruro de zinc produce mayor cantidad de testosterona que el control (Gráfica 5) lo que prodria indicar un cierto efecto protector del zinc en presencia del anión cloruro y sulfato (este con un menor efecto) . La concentración de cloruro de zinc utilizada (1000 pM) es una dosis alta elegida de un ensayo de diferentes concentraciones de cloruro de zinc realiz,ado anteriormente y en base a esto se eligió como dosis alta para sulfato de zinc y nitrato de zinc. El nitrato de zinc y el sulfato de z:inc disminuyen también la producción de testosterona aun incrementando 511 doble la cantidad de hormona hCG adicionada (Gráficas 3 y 4). Cuando se comparan los aniones de nitrato y sulfato de zinc (Gráfica 5) con respecto a su control observamos que tienen mayor porcentaje de testosterona clue el control aunque en cantidades muy bajas, lo que reforzarla el hecho de el zinc tiene efecto protector. El orden de protección de mayor a menor es ZnClz > ZnS04 > Zn(N03), (Gráfica 5).

CONCLUSIONES.

Como ::e ha mensionado anteriormente el zinc puede tener efectos estimu1atorio:s a bajas concentraciones, así como efectos deletereos a concentracioines muy altas. de acuerdo a lo obtenido en los resultados la disminución en el porcentaje 'de producción de testosterona depende de los distintos elementos utilizados en combinación con el zinc, ZnC12 > ZnS04 > Zn(N0s).

La hormona hCG no incrementa los niveles de producción de testosterona por las células de L.eydig en presencia de los metales, a excepción de la combinación ZnC12, donde si se observa un incremento considerable.

La prciducción de testosterona en ausencia de hCG podría corresponder a un efecto protector del zinc.

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