Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la

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:: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::

RESUMEN

Objetivo: determinar la viabilidad de los microorganismos que contienen cuatro bioterapeúticos: en-

terogermina, Saccharomyces boulardii, LBF (Lactobacillus acidophilus Rosell-52, Bifidobacterium bifidum

Rosell-7, Bifidobacterium infantis) y VSL # 3 (Streptococcus salivarius subs. Thermophilus, Bifidobacteria

(breve, infantis, longum), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactoba-

cillus delbrueckii subes. bulgaricus, Streptoccus faecium y fermentos lácticos liofilizados), a pruebas de

tolerancia a pH ácido y alcalino.

Métodos: se preparó jugo gástrico artificial con pepsina al 0,32% a pH de 2,18, utilizando cinco tiempos

de incubación (0, 30, 60, 90 y 120 minutos) y un pH alcalino con sales biliares en concentraciones de

0,25%, 0,5%, 0,75% y 1%. La viabilidad se determinó por el número de unidades formadoras de colonia

por mililitro (UFC/ml) sobre platos de agar para cada probiótico.

Resultados: en medio ácido, los cuatro probióticos no presentaron variaciones significativas en el re-

cuento de colonias (p≥0,089). Sin embargo, a pH alcalino se encontró que LBF y S. boulardii disminuyeron

sus conteos a partir de 0,50% hasta el 1% de bilis (p≤0,048). Para la enterogermina hubo un aumento en

sus conteos y para VSL#3, aunque las variaciones indicaron una disminución en sus conteos, no fueron

significativos (p≥0,056).

Conclusiones: los probióticos empleados en este estudio sugieren que son capaces de tolerar un pH

ácido; aunque la disminución en los conteos observados en S. boulardii, LBF y VSL#3 sugieren un efecto

más bacteriostático que bactericida de la bilis, los microorganismos son capaces de soportar condiciones

de pH alcalino manteniendo conteos altos. Para la enterogermina, indican que la cepa es capaz de man-

tener de manera estable la tolerancia a condiciones de pH ácido y alcalino. Aunque estas diferencias

observadas en pruebas in vitro dependen de las cepas que constituyen cada bioterapéutico, se puede

concluir que los empleados en este estudio pueden tolerar el pH gástrico y biliar.

Palabras clave: probióticos, tolerancia pH ácido, tolerancia pH alcalino, viabilidad.

Fernando Medina1,2, Álvaro M. Flórez 1, Yadira Pinto1

:: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos

1 Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad de Santander, UDES, Bucaramanga, Colombia.

2 Profesor adjunto de Gastroenterología Pediátrica, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia.

CorrespondenciaLaboratorio de Biología Molecular y Biotecnología, Campus Universitario, Lagos del

Cacique, Bloque 3-201, Universidad de Santander, UDES, Bucaramanga, ColombiaTeléfono: (577) 651-6500, extensión 253

[email protected]@hotmail.com

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INTRODUCCIÓNEn la última década se han documentado

ampliamente los efectos clínicos y el uso racio-nal de los bioterapeúticos y probióticos sobre la flora bacteriana intestinal para el tratamien-to de la diarrea aguda 1,2 intrahospitalaria y la relacionada con los antibióticos 3-5. Aunque en la mayoría de los estudios se demuestra la efectividad de los probióticos y agentes biot-erapéuticos en los procesos inflamatorios in-testinales, como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, síndrome de intestino irritable 6,7 y en el tratamiento de Helicobacter pylori 8,9, todavía existen precauciones para su uso 10. Estos mis-mos también se han utilizado en la reducción de las manifestaciones alérgicas para estimular el sistema inmune 11,12, para reducir la gravedad

de las enfermedades en prematuros, como la encefalopatía hepática, para disminuir la sin-tomatología de la artritis reumatoide y para la prevención en el desarrollo del cáncer, la re-ducción de la vaginosis bacteriana y el mejora-miento de la calidad de vida en pacientes con VIH/sida 13-15.

Aproximadamente, 70% de todo el sistema inmune se localiza en el sistema digestivo. La saliva, las secreciones gástricas y la flora bacteri-ana son importantes para su óptimo funciona-miento. En total, se producen diariamente cer-ca de 2,5 litros de saliva, 2,5 litros de secreción gástrica, 0,5 litros de bilis y entre 1 y 5 litros de secreción del intestino delgado y colon. Estas secreciones tienen factores necesarios para el sistema inmune y el control de las infecciones,

ABSTRACT

Objective: To determine the viability of microorganisms that contains four probiotics: enterogermin, Sac-

charomyces boulardii, LBF and VSL#3, to evidence of tolerance to acid and alkaline pH.

Methods: Gastric juice prepared with artificial pepsin to 0.32% to pH 2.18 using 5 incubation times (0, 30,

60, 90 and 120 minutes) and an alkaline pH with bile salts at concentrations of 0.25, 0.5, 0.75 and 1%. The

viability was determined by the number of colony-stimulating factor units per milliliter (CSF/ml) on agar

plates for each probiotic.

Results: In the acid media, the four probiotics did not show significant variations in the colony counts

(p≥0,089). However, in alkaline pH it was found that S. boulardii and LBF decreased their counts in 0.50%

to 1% of bile salt (p≤0,048). Enterogermin shows an increase in their counts and VSL#3, although the

changes indicate a decrease in their counts, they were not significant (p≥0,056).

Conclusions: The probiotics used in this study suggest that they are able to tolerate a low pH. The de-

crease in the counts observed in S. boulardii, LBF and VSL#3, suggest a more bacteriostatic that bacteri-

cidal effect of bile. The microorganisms are capable of withstanding conditions at alkaline pH maintaining

high counts. Enterogermin indicates a stable tolerance to conditions of acid and alkaline pH. Although

these differences observed in vitro tests depends on the strains within each probiotic, we conclude that

probiotics used in this study can tolerate gastric pH and bile.

Keywords: probiotics, pH tolerance, diarrhea, biotherapeutics

:: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos ::

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como inmunoglobulinas, lactoferrinas, lisozi-mas y fibronectinas 16. Estas moléculas, junto con otros mecanismos inmunológicos, preser-van la tolerancia inmunológica necesaria para que los microorganismos presentes en el tubo digestivo no comprometan la salud del indi-viduo 17. Los microorganismos que allí habitan son los más abundantes y llegan a pesar hasta 2 kg; la mayor concentración se encuentra en el intestino delgado, especialmente el íleon, y el colon 18,19.

Algunos microorganismos pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus y Streptococcus, entre otros, hacen parte del tubo digestivo y se han venido empleando como constituyentes de medicamentos probióticos, como la enterogermina, VSL #3 (Streptococcus salivarius subs. Thermophilus, Bifidobacteria (breve, infantis, longum), Lactobacillus acidophilus, Lacto-bacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii subes. bulgaricus, Streptoccus faecium y fermentos lácticos liofilizados) y LBF (Lactobacillus acidophilus Rosell-52, Bifidobacterium bifidum Ro-sell-7, Bifidobacterium infantis) 20,21. A diferencia de éstos, se han descubierto otros que exhiben propiedades similares a los probióticos, pero que provienen de plantas como la levadura Saccharomyces boulardii 22.

Tanto los bioterapeúticos como Saccharomy-ces boulardii como los probióticos deben llegar al intestino, en donde inducen la producción de IgA secretora, ayudan a inhibir la produc-ción de IgE, modulan la respuesta de la citoci-nas estimulando los macrófagos y producen nutrientes y antioxidantes 23,24. Para desempe-ñar esta función, los probióticos deben colo-

nizar el intestino delgado y el colon, habiendo sobrevivido previamente a las condiciones de pH ácido que se encuentra en el estómago y al pH alcalino producido por las sales biliares en el duodeno. Por su pH, el jugo gástrico y las sales biliares se consideran bactericidas. Por lo tanto, lograr obtener cepas capaces de soportar pH iguales a los del tubo digestivo, es una car-acterística indispensable para todos los biotera-péuticos y probióticos. 25 Aunque hay una gran diferencia entre géneros y especies de las cepas que conforman los bioterapeúticos y los pro-bióticos, éstos exhiben propiedades intrínsecas de tolerancia al pH.26 Sin embargo, en algunos probióticos se ha encontrado una gran sensi-bilidad a un pH menor de 3,0, con una mortali-dad aproximada entre 10² y 104 UFC/g.27,28

Actualmente, existen diversas presenta-ciones comerciales de las cuales se desconoce el comportamiento de sus constituyentes mi-crobianos al exponerse a un ambiente ácido o alcalino. El objetivo de este estudio consistió en determinar la viabilidad de diferentes mi-croorganismos como constituyentes de bioter-apeúticos y probióticos, cuando son sometidos a pH ácido y a sales biliares con pH alcalino.

MATERIALES Y MÉTODOSProbióticos y sus componentes

Se utilizaron los cuatro medicamentos más usados en la industria farmacéutica colombi-ana (tabla 1). Estos medicamentos se adqui-rieron en diferentes depósitos farmacéuticos de la ciudad, se registró el número del lote de producción y se constató que su fecha de cadu-cidad estuviera vigente.


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Recuento de coloniasPara realizar el recuento de colonias, se

tomaron 0,04 g de VSL#3 y 0,03 g de LBF en condiciones de esterilidad y se resuspendieron en 1 ml de caldo MRS® (Scharlau) que con-tiene en 1 litro: 10 g de peptona de caseína, 8 g de extracto de carne, 4 g de extracto de levadura, 20 g de D(+)-glucosa, 2 g de fosfato dipotasio de hidrógeno, 1 ml de Tween® 80, 2 g de citrato hidrógeno diamonio, 5 g de acetato de amonio, 0,2 g de sulfato de magnesio, 0,04 g de sulfato de manganeso y 14 g de agar. En el caso de S. boulardii, se pesaron 0,03 g y se resuspendieron en 1 ml de caldo YEPD, que contiene en 1 litro, 20 g de peptona, 20 g de dextrosa y 10 g de extracto de levadura. En el de la enterogermina, se tomaron 40 μl directa-mente de la ampolla.

Los productos se resuspendieron y se hici-eron diluciones en base diez y se hicieron las diluciones, así: 10-5, 10-6 y 10-7 en medio Sabouroud Agar® (Scharlau), para S. boular-dii; 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 en medio Rogosa Agar® (Scharlau), para VSL#3; 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 en medio Rogosa Agar, para LBF; y, 10-4, 10-5 y 10-6 en medio Luria Bertani® (LB) (Scharlau), para la enterogermina; el me-dio Luria Bertani® (LB) (Scharlau) contiene

en 1 litro: 10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio y 20 g de agar. Todos los productos se sembraron por duplicado. Se incubaron a 37°C por 48 horas, en aerofilia para S. boulardii, y enterogermina, y en microaerofilia (5% de CO2) para VLS#3 y LBF. Los recuentos se informaron en UFC/ml y se realizaron en un cuentacolonias digital marca E&Q.

Curvas de crecimientoPara realizar la curva de crecimiento, se pe-

saron 0,04 g de VSL#3 y 0,03 g de LBF, se diluyeron en 1 ml de caldo de cultivo MRS® y se sembraron 100 μl de cada uno en 5 ml de caldo MRS®. Para S. boulardii, se pesaron 0,03 g, se resuspendieron en 1 ml de caldo YEPD y se sembraron 100 μl en 5 ml de caldo YEPD. Para la enterogermina, se tomó 1 ml de la am-polla y se sembró en 4 ml de caldo LB. Todos los medios se incubaron a 37°C por 24 horas, en aerofilia para S. boulardii y enterogermina y, en microaerofilia (5% de CO2) para VLS#3 y LBF. Luego, 100 μl de estos cultivos en crec-imiento se inocularon nuevamente en 5 ml de caldo MRS®, YEPD y LB, respectivamente, y se midió la absorbancia a los tiempos de 0 min y 1, 2, 3, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½ horas, para determinar el comienzo de la fase Log de crec-imiento microbiano.

Determinación de las unidades formado-ras de colonias en fase logarítmica

En cada uno de los productos, se determinó el número de UFC en fase logarítmica de acu-erdo con el anterior procedimiento. Después

Probiótico ComposiciónVSL3# Streptococcus salivarius subs . Thermophilus, Bi�dobacteria

(breve, infantis, longum), Lactobacillus acidophilus ,

Lactobacillus plantarum , Lactobacillus casei , Lactobacillus

delbrueckii subes . bulgaricus , Streptoccus faecium y

fermentos lácticos lio�lizadosSB Saccharomyces bourlardiiEnterogermina Bacillus clausiiLBF Lactobacillus acidophilus Rosell-52, Bi�dobacterium

bi�dum Rosell-7, Bi�dobacterium infantis

Tabla 1. Composición microbiológica de los probióticos


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de 24 horas de incubación, se tomaron 100 μl y se reinocularon en 5 ml de caldo MRS para VSL#3 y LBF,en 5 ml de caldo YEPD para S. boulardii y en 5 ml de caldo LB para enterog-ermina.

Posteriormente, se incubaron por 7 horas a 37°C en aerofilia para enterogermina y S. bou-lardii, y en microaerofilia para VSL#3 y LBF. Luego se realizaron diluciones 1:10 y se prepa-raron las diluciones 10-6, 10-7 y10-8 en medio Rogosa agar para VLS#3 y LBF, en LB agar para enterogermina y en Sabouroud agar para S. boulardii. Todos los recuentos se hicieron por duplicado. Se incubaron a 37°C por 48 horas en aerofilia para S. boulardii y enterog-ermina y en microaerofilia (5% de CO2) para VLS#3 y LBF. Se realizó el respectivo recuen-to en un cuentacolonias digital (E&Q®).

Prueba de tolerancia a pH ácidoSe preparó una solución de pepsina (Mer-

ck®) al 0,32% (p/v) con un pH final de 2,18, igual al pH gástrico. Para cada uno de los pro-bióticos, se cultivó de igual forma que en la determinación de las UFC en fase logarítmico. Luego, los cultivos de cada uno de ellos creci-dos a las 7 horas, se centrifugaron a 7.000 rpm por 10 minutos; el botón de las células se lavó con solución tampón de fosfato 1X (PBS) a pH 7,4. Después se centrifugaron nuevamente por 10 minutos a 7.000 rpm y se suspendieron nuevamente en 5 ml de una solución de pep-sina al 0,32%, y se dejaron en contacto las cé-lulas con esta solución por 0, 30, 60, 90 y 120 minutos.

A cada uno de los tiempos tratados se le

realizaron diluciones 1:10 y se sembraron en placas de agar, así: 10-6, 10-7 y 10-8 para LBF en agar Rogosa, para S. boulardii en agar Sa-bouroud, (Scharlau®) y para VSL#3 en agar Rogosa; y 10-5, 10-6 y 10-7 para enteroger-mina en agar LB. Todos los tratamientos se realizaron por duplicado. Se incubaron a 37°C por 48 horas en aerofilia para S. boulardii y en-terogermina, y en microaerofilia para VLS#3 y LBF. El respectivo recuento se realizó en un cuentacolonias digital (E&Q®).

Prueba de tolerancia a pH alcalinoSe prepararon 5 ml con concentraciones de

0,25%, 0,5%, 0,75% y 1% de sales biliares (Ox-oid®), de cada uno de los medios MRS, LB y YEPD. Estos caldos se inocularon con 100 μl de cultivos crecidos por 7 horas y se llevaron a incubar por 24 horas para LBF, S. boulardii y enterogermina, y por 15 horas a 37°C para VSL#3, en aerofilia y microaerofilia según el correspondiente probiótico.

Después de este tiempo de incubación, se hicieron diluciones 1:10, y se sembraron 10-6, 10-7 y 10-8 para LBF (agar Rogosa), S. boular-dii (agar Sabouroud) y VSL#3 (agar rogosa), y 10-5, 10-6 y 10-7 para enterogermina (agar LB). Todos los tratamientos se realizaron por du-plicado. Se incubaron a 37°C por 48 horas, en aerofilia para S. boulardii y enterogermina, y en microaerofilia para VLS#3 y LBF. El respec-tivo recuento se realizó en un cuentacolonias digital (E&Q®).

Análisis estadísticoSe determinaron los promedios de los re-


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cuentos en UFC/ml, así como, las desviaciones estándar para cada uno de ellos. Igualmente, se determinó la significancia de los valores de p mediante la prueba t de Student, comparando los valores de los recuentos controles con los cultivos a pH ácido y alcalino. Los valores de p iguales o inferiores a 0,05 se consideraron significativos.RESULTADOS

Los estudios de susceptibilidad a pH ácido y pH alcalino de los probióticos analizados en este estudio, se llevaron a cabo mediante re-

cuento de colonias viables en placas de agar por volumen, teniendo en cuenta la fase loga-rítmica o fase logarítmica de crecimiento mi-crobiano y que, para efectos de los ensayos de susceptibilidad, se estandarizó a las 7 horas para todos los probióticos (figura 1).

Para los ensayos de tolerancia a condiciones de pH ácido, hubo variaciones en los recuentos a diferentes tiempos de contacto (figura 2); no obstante, estas variaciones no fueron significa-tivas (p≥0,089) cuando se compararon con el

Figura 1. Curvas de crecimiento de probióticos

tiempo cero (control) para los cuatro probióti-cos (tabla 2). En condiciones de pH alcalino a diferentes concentraciones de bilis, se encon-traron variaciones en los recuentos (figura 3); se observaron diferencias significativas en una disminución de los recuentos para S. boulardii y LBF a concentraciones superiores a 0,5% de bilis a 24 horas de incubación (tabla 3) (p≤0,048). Para VSL#3 las variaciones no fu-eron significativas (p≥0,056) (tabla 3), aunque se observó una disminución en los recuentos que ocurrió a partir de concentraciones de bi-lis de 0,25% a 15 horas de incubación (figura 4). Para la enterogermina no se demostraron variaciones significativas a condiciones de pH ácido o alcalino.

DISCUSIÓNUn número importante de microorganismos

presentes en el tubo digestivo han desarrollado mecanismos que les permite tolerar condiciones

Figura 1. Curvas de crecimiento determinadas por espectrofotometría en absorbancia a DO=600 nm para cada uno de los probióticos estudiados

Figura 2. Prueba de tolerancia a pH ácido determinada en UFC/ml en pepsina 0,32% a pH 2,18 en tiempos de contacto de 0, 30, 60, 90 y 120 minutos.

extremas de pH; además, han desarrollado mecanismos bioquímicos que complementan el equilibrio de la flora intestinal y mejoran la


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Tiempo

(minutos)

Enterogermina SB LBF VSL#3

30 0,202 0,179 0,089 0,356

60 0,235 0,216 0,129 0,436

90 0,255 0,302 0,086 0,215

120 0,292 0,207 0,165 0,217

Tabla 2. Valores de p de tolerancia a pH

Valores de p de tolerancia a pH ácido obtenidos mediante la comparación de UFC/ml para cada punto de crecimiento a diferentes tiempos de contacto en pepsina 0,32% a pH 2,18

motilidad en el vaciamiento gástrico e influyen en los complejos motores intestinales.5,24

El uso de probióticos ha ido en aumento por las propiedades que se relacionan con su efecto benéfico sobre el sistema inmunológico11 y por las relaciones simbióticas con la flora microbi-ana que se producen en el tubo digestivo, para el tratamiento de la diarrea y de las enferme-dades intestinales.4,29 Para cumplir con los efec-tos terapéuticos deseados, estos probióticos, además de poseer características microbiológi-cas y de seguridad, deben ser resistentes al pH ácido y a la bilis, dado que es necesario que alcancen el intestino delgado y logren coloni-zar el huésped. Generalmente, los microorgan-ismos constituyentes de los probióticos son de los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Strepto-coccus, Bacillus y levaduras como Saccharomyces, entre otros, que son intrínsicamente resistentes al pH ácido.5

En este estudio, se analizó la tolerancia al pH ácido (pepsina) y al alcalino (bilis) de los con-stituyentes biológicos de cuatro probióticos, de los cuales LBF y VSL#3 están constituidos por múltiples cepas, y enterogermina y S. bou-lardii están compuestos por una sola cepa. Por lo tanto, y dado que los aislamientos de cada

una de las cepas para probióticos con múlti-ples cepas son más difíciles, los resultados en las curvas y en los recuentos se determinaron como un grupo microbiano. Según lo anterior, las variaciones encontradas en los recuentos a pH ácido hasta tiempos de contacto de 120 minutos para los cuatro probióticos no fueron significativas (p≥0,086), lo cual sugiere que los cuatro poseen tolerancia a pH ácido hasta por 2 horas de contacto. Los microorganismos constituyentes de cada

uno de los probióticos pertenecen a especies de los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Strep-tococcus, Bacillus y Sacharomyces, y aunque existen diferencias entre géneros y especies, la gran mayoría poseen reconocida tolerancia al pH ácido. Los Lactobacillus, además de poseer una acción inhibitoria contra bacterias patógenas30,31 y de producir algunos componentes inhibito-rios como peróxido de hidrógeno, bacteriocinas y reuterinas32,33, tienen una gran tolerancia al pH ácido y a la bilis, así como la habilidad de adher-irse a la superficie intestinal.29 La tolerancia al pH ácido de los lactobacilos y de otros géneros de bacterias Gram positivas, como Bifidobacte-rium, Streptococcus y Bacillus, es causada por la ac-ción de la ATPasa F0-F1; esta enzima protege a


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Tabla 3. Valores de p de tolerancia a pH alcalino

Concentración

de bilis

Enterogermina SB LBF VSL#3

0,25% 0,025 0,107 0,058 0,058

0,50% 0,044 0,048* 0,048* 0,056

0,75% 0,026 0,034* 0,0 34* 0,057

1% 0,101 0,031* 0,031* 0,056

Tabla 3. Valores de p de tolerancia a pH alcalino obtenidos mediante la comparación de UFC/ml para cada punto de crecimiento de cada probiótico a diferentes concentraciones de bilis a tiempos de incubación de 15 horas para VSL#3 y de 24 horas para enterogermina, LBF y Saccharomyces boulardii.*: significativo

las bacterias contra la acidez, mediante el man-tenimiento de un gradiente constante entre el pH extracelular y el citoplasmático.25 Debido a estas características, los constituy-

entes de estos probióticos pueden tolerar pH ácidos iguales a los producidos en el tubo di-gestivo.34 No obstante, se ha demostrado que una gran mayoría de las cepas de lactobacilos no sobreviven a un pH de 2,5 por 4 horas.35 Estudios similares en bacterias acidolácticas. como L. acidophilus y Bifidobacterium Bb-12, con pruebas de tolerancia entre pH de 1 y de 4, muestran mayores diferencias entre un pH de 2 y uno de 3.36 Sin embargo, se ha sugerido que los alimentos ejercen un efecto protec-tor sobre los microorganismos en cuanto a su tolerancia o resistencia al pH ácido o alcalino, lo cual puede mejorar las características de un probiótico para ejercer su potencial ideal. No obstante, este efecto protector varía en función del número de células viables en una población microbiana.37 De hecho, se ha demostrado que la adición de glucosa mejora la resistencia de bacterias acidófilas, como L. rhamnosus, en HCl a un pH de 2,0.38

Para S. boulardii, cuyo constituyente es una levadura que ha sido efectiva para la preven-ción de la diarrea aguda, especialmente la pro-ducida por Clostridium difficile, Escherichia coli o Candida albicans, posee mecanismos de activi-dad probiótica demostrada mediante estudios clínicos; además de secretar proteasas, estim-ular la producción de IgA, eliminar toxinas y modificar la mucosa intestinal, posee una resistencia intrínseca a pH ácido.22,26,39-41 De hecho, se ha demostrado que en las cepas de S. boulardii, a medida que disminuye el pH a 2,0, la viabilidad de las células permanece igual, con-trario a lo observado con otro tipo de levadu-ras similares, como S. cerevisiae Σ1278b y BY3, las cuales reducen su capacidad de tolerancia hasta un poco más de 50%.26 Sin embargo, en este mismo estudio ninguna de las cepas anali-zadas, incluso S. boulardii, sobrevivió a un pH de 1,0.26

En cuanto al pH alcalino, las concentraciones de bilis produjeron una reducción significati-va (p≤0,05) en los recuentos para S. boulardii y LBF. Para la enterogermina, las variaciones estuvieron más asociadas a un incremento que


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Figura 3. Prueba de tolerancia a pH alcalino

Figura 3. Prueba de tolerancia a pH alcalino determinada en UFC/ml a concentraciones de 0,25%, 0,50%, 0,75% y 1% de bilis en medio de cultivo enriquecido por 24 horas de incubación para los probióticos enterogermina, LBF y Saccharomyces boulardii.

a una disminución en el recuento de colonias, a concentraciones de 0,75% y 1% (p≤0,02). Para VSL#3, las variaciones sugieren una dis-minución en sus recuentos a concentraciones superiores a 0,25%, pero no demostraron diferencias significativas (p≥0,05). La disminución en los recuentos para S. bou-

lardii, LBF y VSL#3, sugiere un efecto bacte-riostático mas no bactericida de la bilis. Los estudios realizados han demostrado que el efecto bactericida de las sales biliares en varias especies ácido-lácticas27, incluso en estudios in vivo, puede llegar a reducir la viabilidad de dichas bacterias hasta 70% y 90% en el duo-deno.37 No obstante, existen cepas que son resistentes a las sales biliares, en las que sólo se observa un retardo en el crecimiento, es decir, que las cepas que evidencian crecimiento en 1 hora, se pueden demorar 4 horas en bilis.35 En este mismo estudio también se demuestra un efecto bacteriostático de la bilis, así como

la capacidad de tolerancia de las cepas al pH alcalino. De hecho, los autores informan que una de las cepas analizadas exhibió tolerancia a la bilis a concentraciones de 3%, por 4 hor-as.35

En nuestro estudio, los microorganismos constituyentes de enterogermina, LBF y S. boulardii, tuvieron tiempos de tolerancia en medios de cultivo con concentraciones de bi-lis hasta de 1% en 24 horas de incubación y, los de VSL#3, de 15 horas, lo cual sugiere una gran capacidad de adaptación sin producir la muerte celular. Es importante resaltar el papel de la levadura S. boulardii que, a pesar de ser eucariota y filogenéticamente diferente a las bacterias e incluso entre especies del mismo género26, es capaz de tolerar el pH ácido y el al-calino, de igual manera como lo hacen las bac-terias ácido-lácticas, lo cual sugiere la presencia de mecanismos bioquímicos y moleculares aún no conocidos que le confiere tolerarancia a pH extremos y la convierten en un modelo inte-resante de estudio para entender los mecanis-mos que regulan su tolerancia. Los rangos de tolerancia a diferentes concen-

traciones de bilis, así como a la pepsina con pH de 2,18, sugieren la gran capacidad de los microorganismos que constituyen los probióti-cos estudiados, para tolerar pH similares al del jugo gástrico y al de las sales biliares del tubo digestivo. Por lo tanto, poseen una caracterís-tica fisiológica importante porque pueden so-brevivir al atravesar el estómago y el duode-no, y llevar a cabo la actividad bioterapeútica deseada.


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Figura 4. Prueba de tolerancia a pH alcalino para VSL#3

Figura 4. Prueba de tolerancia a pH alcalino determinada en UFC/ml a con-centraciones de 0,25%, 0,50%, 0,75% y 1% de bilis en medio de cultivo en-riquecido por 15 horas de incubación para VSL#3

AGRADECIMIENTOSEste proyecto fue financiado por la compa-ñía Merck, en colaboración con el Labora-torio de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de Santander, UDES, Bu-caramanga. Agradecemos la colaboración de Barbarita Mantilla Cardozo, quien inició la determinación de las curvas de crecimiento para cada probiótico.


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Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la

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