Efectos del tratamiento con melatonina en el...
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2013 1
Jorge Escartín Valderrama
Efectos del tratamientocon melatonina en el
alotrasplante de páncreasen el cerdo
Departamento
Director/es
Cirugía, Ginecología y Obstetricia
García Gil, Francisco AgustínGarcía García, José Joaquín
UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA, GINECOLOGÍA Y OBSTETRICIA
Efectos del tratamiento con melatonina en el
alotrasplante de páncreas en el cerdo
Tesis Doctoral presentada por:
Jorge Escartín Valderrama
Directores de la tesis doctoral:
Prof. Dr. Francisco Agustín García Gil
Prof. Dr. José Joaquín García García
-2-
Los Dres. D. Fco Agustín García Gil y D. José Joaquín García García
Certifican:
Que D. Jorge Escartín Valderrama, licenciado en Medicina y Cirugía, ha realizado bajo
su dirección el presente trabajo de investigación sobre: “EFECTOS DEL
TRATAMIENTO CON MELATONINA EN EL ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS
EN EL CERDO”, que va a ser presentado como Tesis Doctoral, que han revisado dicho
trabajo, estimando que cumple las condiciones científicas y formales que deben serle
exigidas.
Zaragoza, a 27 de febrero 2012
Fdo. Dr. D. Fco Agustín García Gil Fdo. Dr. D. José Joaquín García García
-3-
A mi hija, Irene, porque representa el amor de mi
esposa, padres y hermano y porque es el mejor
ejemplo de que las mejores cosas de la vida vienen sin
manual de instrucciones.
-4-
AGRADECIMIENTOS
Quiero mostrar mi agradecimiento al profesor y director de esta tesis Dr.
Fco Agustín García Gil. Muchas son las razones para ello. Primero, porque como
profesor me atrapó con su ilusión por la cirugía. Segundo, como cirujano me ha servido
de modelo por su entrega incondicional al trabajo bien hecho. Y tercero, como director
de mi Tesis Doctoral, pues sin su ilusión ni su tesón no hubiera sido yo capaz de llevarla
a buen puerto.
Tambien deseo mostrar mi gratitud al Prof. José Joaquín García García, Catedrático de
Fisiología, codirector de esta Tesis, y a todos los entusiastas colaboradores de su grupo
de investigación. Sin su ayuda, este trabajo no se hubiera podido llevar a cabo.
-5-
INDICE
I INTRODUCCIÓN 10
1 DIABETES MELLITUS Y TRASPLANTE DE PÁNCREAS 11
2 LA LESIÓN DE ISQUEMIA-REPERFUSIÓN Y EL RECHAZO AGUDO 15
3 EL ESTRÉS OXIDATIVO/NITROSATIVO 15
4 BASES PARA EL ESTUDIO DE LA ADMINISTRACIÓN DE
MELATONINA EN EL TRASPLANTE DE ÓRGANOS
18
II HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 22
II HIPOTHESIS AND OBJECTIVES 25
III MATERIAL Y MÉTODOS 28
1 MODELO QUIRÚRGICO 29
1.1 Animales 29
1.2 Procedimiento anestésico 29
1.3 Procedimientos quirúrgicos y preservación del injerto 33
2 CUIDADO GENERAL DE LOS ANIMALES RECEPTORES EN
EL POSTOPERATORIO
58
3 DISEÑO EXPERIMENTAL. 58
3.1 Grupos experimentales 58
3.2 Muestras de sangre 59
3.3 Muestras tisulares para estudio del estrés oxidativo 60
3.4 Muestras tisulares para estudio histopatológico 60
4 DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS 61
4.1 Estudio de la función pancreática 61
4.2 Medición de la concentración sérica de la pMAP/ITIH4 61
5 ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO 61
5.1 Cuantificación de MDA+4-HDA 61
5.2 Cuantificación de los restos carbonilo de las proteínas 62
6 EXAMEN HISTOPATOLÓGICO 62
-6-
7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 63
IV RESULTADOS 65
1 PROCEDIMIENTO ANESTÉSICO 66
2 TIEMPO DE ISQUEMIA 67
3 PESO DE LOS INJERTOS 67
4 SUPERVIVENCIA DEL INJERTO PANCREÁTICO 69
5 FUNCIÓN ENDOCRINA DESPUES DEL TRASPLANTE DE
PÁNCREAS
70
6 FUNCIÓN EXOCRINA DESPUES DEL TRASPLANTE DE
PÁNCREAS
73
7 CONCENTRACIONES DE MDA y 4-HDA EN LOS INJERTOS
PANCREÁTICOS
75
8 CONCENTRACIÓN DE LOS RESTOS CARBONILO EN LOS
INJERTOS PANCREÁTICOS
77
9 RESPUESTA DE LA pMAP/ITIH4 AL TRASPLANTE DE
PÁNCREAS
78
10 ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO 79
V RESULTADOS INDIVIDUALIZADOS DE LOS ALOTRASPLANTES
DE PÁNCREAS EN EL CERDO
84
VI DISCUSIÓN 109
MODELO QUIRÚRGICO EXPERIMENTAL 110
1. Animal de experimentación 110
2. Procedimiento quirúrgico 111
3. Procedimiento anestésico 116
INFLUENCIA DE LA MELATONINA EN LA EVOLUCIÓN DEL
ALOTRASPLANTE DE PANCREAS EN EL CERDO
120
RESPUESTA DE FASE AGUDA EN EL ALOTRASPLANTE DE
PÁNCREAS EN EL CERDO EVALUADA POR LAS CONCENTRA-
CIONES SÉRICAS DE LA pMAP/ITIH4. INFLUENCIA DEL
TRATAMIENTO CON MELATONINA
125
-7-
OTRAS PROPIEDADES DE LA MELATONINA QUE JUSTIFICAN SU
APLICACIÓN EN EL TRASPLANTE DE ÓRGANOS
128
VII CONCLUSIONES 129
VII CONCLUSIONS 132
VIII BIBLIOGRAFÍA 135
-8-
ABREVIATURAS
4-HDA: 4-Hidroxialquenales
AA: Ácido ascórbico
ADN: Ácido desoxirribonucleico
AGD: Arteria Gastroduodenal
AMS Arteria Mesentérica Superior
ARN: Ácido ribonucleico
ATP: Adenosín Trifosfato
CAM: Concentración alveolar mínima
ERNs: Especies Reactivas del nitrógeno
EROs: Especies Reactivas de Oxígeno
EO: Estrés oxidativo
H2O2: Peróxido de hidrógeno
iNOS: Óxido nítrico sintasa inducible
IPTR: International Pancreas Transplant Registry
IR: Isquemia Reperfusión
IV: Vía intravenosa
LDP: Lóbulo Derecho del Páncreas
LIP: Lóbulo Izquierdo del Páncreas
LMP: Lóbulo Medio del Páncreas
MDA: Malonildialdehido
NF-kB: Factor nuclear-kappaB
•O2‾: Anión superóxido
•OH: Radical hidroxilo
ON: Óxido nítrico.
ONOO–: Peroxinitrito
ONT: Organización Nacional de Trasplantes
PCR: Proteína C-reactiva
PFA: Proteínas de Fase Aguda
PL: Peroxidación lipídica
RL: Radicales libres
RA: Rechazo agudo
-9-
RFA: Respuesta de fase aguda
SMP: Segmento Medio del Páncreas
TC: Tronco Celiaco
TP: Trasplante de páncreas
TPDR: Trasplaste de páncreas después del trasplante renal
TPS: Trasplante de páncreas sólo
TPSR : Trasplante de páncreas simultáneo con el trasplante de riñón
UW: Universidad de Wisconsin
VDP: Vasos PancreáticoDuodenales
VGD: Venas GastroDuodenal
VPPI: Ventilación a presión positiva intermitente
VRI: Vena renal izquierda
VMS: Vena Mesentérica Superior
XD: Xantina Deshidrogenada
XO: Xantina-Oxidasa
Introducción
-10-
I INTRODUCCIÓN
Introducción
-11-
1 DIABETES MELLITUS Y TRASPLANTE DE PÁNCREAS
La diabetes mellitus es la principal causa de daño renal crónico y ceguera en adultos y
conduce a la amputación de algún miembro o a la impotencia en más casos que ninguna
otra enfermedad. La diabetes mellitus tipo I o insulino dependiente es la causa más
frecuente de enfermedad crónica en niños.
La diabetes mellitus no es únicamente un desorden en el metabolismo intermedio,
es también la causa de lesiones específicas en los vasos sanguíneos y en el sistema
nervioso, como la retinopatía, nefropatía o neuropatía. Las descompensaciones agudas
metabólicas pueden ser evitadas mediante la administración exógena de insulina y su
inyección adecuada, en tiempo y dosis, puede prevenir muchas de las complicaciones.
Sin embargo, incluso en pacientes bien controlados, las inyecciones de insulina no
siempre consiguen mantener la euglucemia de una forma tan exacta como la secreción
de insulina endógena.
El trasplante de páncreas (TP) es un tratamiento eficaz para la diabetes mellitus
insulino-depediente. Su función es restaurar la normoglucemia con seguridad aportando
suficiente masa de células de islotes de Langerhans. Actualmente el TP es el único
tratamiento que proporciona un estado normoglucémico a largo plazo sin requerimiento
de inyecciones de insulina y que puede normalizar los niveles de hemoglobina glicada.
El TP es el tratamiento de elección para los pacientes diabéticos con fracaso renal
terminal (1-3); proporciona, además de una mejora en la calidad de vida, una ayuda para
la corrección de las complicaciones secundarias a la diabetes mellitus.
El trasplante de islotes celulares aislados es un tratamiento atractivo y poco
invasivo, pero actualmente el trasplante alogénico de islotes no consigue mantener una
independencia de la insulina exógena a largo plazo. Los datos muestran que incluso
Introducción
-12-
pacientes que reciben múltiples infusiones de islotes, pocos permanecen euglucémicos,
con lo que hoy en día la opción de referencia es el TP completo (4).
Desde el 16 de diciembre de 1966 hasta el 31 de diciembre de 2010 se han
presentado más de 35.000 TP en el International Pancreas Transplant Registry (IPTR),
que incluyen más de 24.000 realizados en los EEUU (5) y 12.000 (6) fuera de los
EEUU. El TP en pacientes diabéticos se divide en tres categorías: el TP simultáneo con
el trasplante de riñón (TPSR) que supone el 75%, el TP después de un trasplante renal
(TPDR) que suma el 18% y el TP sólo (TPS) que es el menos frecuente y que supone el
7%. Actualmente, la tasa de supervivencia del paciente trasplantado es mayor del 95%
al año en las tras modalidades de TP.
En nuestro ámbito, según la memoria de actividad de la Organización Nacional de
Trasplantes (ONT) (7), en el año 2010 se realizaron 94 TP. Desde 1984, año del primer
TP realizado en España, se han practicado un total de 1168 trasplantes. La tasa de TP
en nuestro país es de 2 por millón de población, en línea con la media europea y por
debajo de cifras de los EEUU (3,9 pmp) y del Reino Unido (3,4 pmp). La insuficiencia
renal crónica diabética es la causa más frecuente de indicación correspondiendo al 85
% de los trasplantes. Otras causas son la diabetes mellitus sin insuficiencia renal, el
retrasplante y el trasplante multivisceral.
Un aspecto fundamental del TP es el manejo de la secreción exocrina. A diferencia
de otros tipos de trasplantes, en el TP sólo una parte del tejido trasplantado se encamina
hacia el objetivo, es decir, al aporte continuado de insulina endógena, ya que el
componente endocrino de la glándula es menor del 5% y el tejido exocrino más del 95%
(8). Sucede que el reemplazamiento exocrino no sólo no es el propósito del TP, sino que
además es fuente de importantes complicaciones quirúrgicas postoperatorias. En
consecuencia, prevenir estas complicaciones ha sido siempre un tema de preocupación.
Introducción
-13-
A lo largo de la historia del TP se han desarrollado clínica y experimentalmente
numerosos métodos de manipulación de la secreción exocrina: ligadura del conducto
pancreático (9-14); obliteración del conducto pancreático con diversos polímeros
sintéticos tales como neoprene (15-18), prolamina (19, 20), silicona (21) y cianocrilatos
(22, 23); drenaje libre del jugo pancreático en la cavidad peritoneal (24, 25);
mantenimiento de la secreción exocrina mediante la anastomosis del sistema ductal al
estómago (26), esófago (27), uréter (28, 29) y pelvis renal (30, 31).
Estos procedimientos mencionados han sido abandonados y, en la actualidad,
prácticamente sólo se utiliza la derivación de la secreción exocrina a vejiga urinaria y a
intestino delgado (yeyuno o íleon), con evidente preferencia en los últimos años por la
derivación entérica en combinación con el drenaje sistémico del retorno venoso del
injerto (32).
El drenaje exocrino a vejiga urinaria ha sido el método preferido en la mayoría de
los centros de TP hasta algo más de mediados de los años 90 (32). Nosotros también lo
utilizamos experimentalmente en aquélla época (33). El procedimiento es seguro,
permite la monitorización urinaria de la secreción pancreática encaminada al
diagnóstico del rechazo (descenso de las amilasas y lipasas urinarias como marcador de
rechazo) (34), proporciona el acceso a la biopsia cistoscópica del injerto, es más
accesible a la biopsia percutánea por su emplazamiento en el cuadrante abdominal
inferior y facilita el tratamiento conservador de los problemas anastomóticos con la
colocación de una sonda vesical (35, 36). Sin embargo, la derivación a vejiga urinaria se
asocia con una morbilidad significativa, fundamentalmente por no ser un anastomosis
fisiológica, tal como hematuria, infección recidivante del tracto urinario (37, 38),
uretritis -irritación genitourinaria-, deshidratación (39), acidosis metabólica secundaria a
la pérdida por orina del bicarbonato excretado por el injerto, pancreatitis de reflujo (40,
Introducción
-14-
41) y fuga de anastomosis (35, 42, 43). Se requirió una conversión del drenaje vesical a
drenaje entérico en un 9% al año y 17% a los 3 años de los receptores con TP
registrados entre los años 2000-2003 (32).
Debido a las mencionadas complicaciones del drenaje a vejiga urinaria y su
impacto negativo en la calidad de vida y a los buenos resultados con la conversión
entérica después del drenaje vesical, el drenaje exocrino a intestino delgado ha
resurgido desde la segunda mitad de los años noventa. Efectivamente, según el IPTR,
antes del año 1996 menos del 10% de todos los TP fueron realizados con derivación
entérica. Desde entonces, la proporción de este procedimiento se incrementa
constantemente de manera que en los años 2002-2003 el 82 % de los TPSR, el 72% de
los TPDR y el 57 % de los TPS, se realizaron con derivación entérica de la secreción
exocrina y, la mayoría de ellos, con una anastomosis directa del segmento duodenal del
injerto al intestino delgado del receptor, es decir, sin asa desfuncionalizada en Y de
Roux (32). Se ha señalado una menor incidencia de complicaciones con la
duodenoenterostomía directa que con la Y de Roux (44).
El drenaje exocrino a intestino delgado es un procedimiento sencillo, más
fisiológico, con menor morbilidad, no presenta las complicaciones metabólicas ni
urológicas y no requiere la conversión de la derivación urinaria (42, 45). Los principales
inconvenientes incluyen la imposibilidad de monitorizar la amilasa urinaria como
marcador de rechazo, una tasa sólo ligeramente superior de abscesos abdominales,
aunque con mayor gravedad y difusión intraperitoneal puesto que sucede en un terreno
intestinal contaminado y en un injerto con emplazamiento medioabdominal, y menor
accesibilidad a las biopsias percutáneas.
Introducción
-15-
2 LA LESIÓN DE ISQUEMIA-REPERFUSIÓN Y EL RECHAZO
AGUDO: DOS OBSTÁCULOS DEL TRASPLANTE DE
PÁNCREAS
Durante la última década se han alcanzado importantes progresos en el TP debido a
a los avances en la terapia inmunosupresora, refinamientos en los procedimientos
quirúrgicos, mejor tratamiento postoperatorio y mejoras de los protocolos de
preservación (2, 3, 32, 46). Sin embargo, la disfunción precoz aguda del injerto todavía
representa una morbilidad postoperatoria significativa. La no función primaria del
injerto se ha descrito en el 3-5% de los receptores (32); la pancreatitis del injerto, un
factor de alto riesgo de trombosis vascular, se ha observado en el 20% de los receptores
(47). Además, el rechazo agudo (RA) se sigue produciendo en 13-22% de los TP en los
primeros tres meses (48) y es la causa más frecuente de pérdida del injerto entre los días
8 y 30 post-trasplante (49). La no función primaria y la pancreatitis del injerto son dos
causas importantes de pérdida del injerto y pueden ser desencadenadas por una grave
lesión de isquemia-reperfusión (IR) (50, 51). El daño de IR también puede aumentar la
inmunogenicidad del injerto haciéndolo más susceptible al RA ácido ascórbico (52-55).
Hasta donde hoy sabemos, una lesión tisular no inmune-específica puede llevar a la
aloactivación de células T y, por tanto, inducir la respuesta aloinmune (56).
3. EL ESTRÉS OXIDATIVO/NITROSATIVO: MEDIADOR CLAVE
EN LA ISQUEMIA-REPERFUSIÓN Y EN EL RECHAZO
AGUDO
La IR inicia una cascada de eventos no inmunológicos antígeno independientes en el
injerto. Estos eventos incluyen disfunción de la microcirculación que conlleva un fallo
de la perfusión vascular, liberación de mediadores proinflamatorios que provocan la
Introducción
-16-
infiltración de los tejidos con leucocitos, necrosis celular y apoptosis que ponen en
peligro la supervivencia del injerto (51, 57). La lesión pancreática por IR también
involucra el estrés oxidativo (EO) que surge del desequilibrio entre la producción
excesiva de radicales libres (RL) y una insuficiente defensa antioxidante (50, 56, 58).
Los mecanismos específicos por los que se produce la formación de RL en la IR no
están suficientemente explicados. Sin embargo, se han propuesto varias fuentes
potenciales que causan sobreproducción de RL, tales como defectos en la cadena de
transferencia de electrones mitocondrial, activación de la xantina/xantina
oxidoreductasa y la combustión fagocítica de los leucocitos polimorfonucleares que, por
quimiotaxis, se concentran en el área tisular de lesión (57, 59-61).
Hay gran evidencia de que el exceso de producción de especies reactivas del
oxígeno (EROs) y del nitrógeno (ERNs) juega un papel fundamental en las alteraciones
que se producen durante la reperfusion postisquémica de los órganos trasplantados (51,
56, 62-64). Se ha demostrado también que la isquemia fría promueve la producción de
EROs, probablemente debido al daño mitocondrial (65, 66). Durante la isquemia fría se
produce descenso del adenosín trifosfato (ATP) celular, degradación del ATP a
adenosina, inosina e hipoxantina, y conversión de la xantindeshidrogenasa en
xantinoxidasa (62). En la reperfusión, los metabolitos del ATP acumulados sirven como
sustrato para la producción y liberación de EROs: la xantinoxidasa en presencia de
oxígeno cataliza la degradación de hipoxantina a xantina y ácido úrico y formación de
peróxido de hidrógeno (H2O2) y anión superóxido (•O2‾) (67, 68). A partir de estas dos
EROs, en presencia de metales de transición (Fe, Cu), se forma radical hidroxilo (•OH)
que es un radical libre extremadamente reactivo. El hierro libre o chelatable no es sólo
un catalizador de la formación de EROs, sino que también contribuye directamente a la
lesión inducida por la hipotermia por mediación de daño mitocondrial y la inducción de
Introducción
-17-
la apoptosis (69-71). El •OH extrae un átomo de hidrógeno de un ácido graso
poliinsaturado de los fosfolípidos de membrana, lo que inicia la peroxidación lipídica
(PL), produciéndose una reacción en cadena de oxidaciones sucesivas que se propagan
por toda la bicapa lipídica de la membrana (72) (Figura A). El daño de los EROs
también se extiende gravemente a las proteínas y a los ácidos nucleicos (73-74). El
mecanismo de muerte celular posterior parece ser dependiente del ATP. El ATP es
necesario para la ejecución del programa de muerte celular apoptótica, mientras que el
completo agotamiento de ATP dará lugar a necrosis (75, 76).
Fig. A. Efectos mediados por los RL derivados del oxígeno.
Introducción
-18-
También se acepta que el estrés oxidativo y nitrosativo ejerce un papel perjudicial
en el proceso patogénico del rechazo (77-81). Las EROs y ERNs dañan el aloinjerto,
activan el sistema inmune innato tanto del donante como del receptor, e inician e
inducen la respuesta adaptativa aloinmune (rechazo agudo) predominantemente a través
de las células presentadoras de antígeno (56). Se ha observado experimental y
clínicamente que la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la
generación de óxido nítrico (ON) están incrementadas durante el desarrollo del RA del
injerto pancreático (77, 82), renal (83, 84), cardiaco (85-88), hepático (89-93), pulmonar
(94) e intestinal (95). El ON, generado en exceso, reacciona con el •O2‾ para formar
ERNs, tal como peroxinitrito (ONOO–) que tiene efectos tóxicos que conducen a la PL
de los fosfolípidos de la membrana celular, oxidación de proteínas y daños en el ácido
desoxirribonucleico (ADN) (96). La PL altera la fluidez normal y la permeabilidad de
las membranas celulares provocando edema celular, sobrecarga masiva de Ca2+ y Na+ y
lisis celular.
Sin duda, la IR es una de las principales cuestiones a resolver en trasplante de
órganos y en consecuencia hay un enorme interés en las moléculas antioxidantes que
limitan el daño causado por los RL y que pueden prevenir los efectos deletéreos de la
IR, inluyendo la PL (78).
4. BASES PARA EL ESTUDIO DE LA ADMINISTRACIÓN DE
MELATONINA EN EL TRASPLANTE DE ÓRGANOS
La melatonina (N-acetil-5-metoxi-triptamina) es un derivado indólico del triptófano
que se produce en la glándula pineal de los mamíferos. La melatonina tiene influencia
en los ritmos biológicos y es, así como sus metabolitos, un importante componente del
sistema de defensa antioxidante (97-99). Estas moléculas proporcionan una protección
Introducción
-19-
sustancial frente a los RL generados en una variedad de condiciones experimentales
como las lesiones de IR (100-104).
La melatonina es actualmente la única molécula disponible que reune en sus
acciones la capacidad de depurar EROs, como el anion superóxido y el radical
hidroxilo, y ERNs, incluyendo el peroxinitrito, así como la capacidad de inhibir enzimas
pro-oxidantes como la iNOS, de activar los enzimas antioxidantes a nivel de la
expresión ácido ribonucleico (ARN) y de bloquear los factores de transcripción como el
factor nuclear-kappaB (NF-kB) que inducen citoquinas proinflamatorias (96). La
melatonina también aumenta la eficiencia de la cadena respiratoria disminuyendo la
formación de RL y aumentando la síntesis de ATP (105), procesos muy alterados en la
fisiopatología de la IR.
La vitamina C o ácido ascórbico (AA) es otro “barredor” de RL y antioxidante
ampliamente conocido (106, 107). Gracias a su hidrosolubilidad el AA puede acceder al
ambiente acuoso de la célula y por tanto proteger los componentes citosólicos contra el
daño oxidativo, pero el hecho de que el AA no sea liposoluble limita su capacidad para
proteger la membrana celular. En cambio la melatonina es altamente soluble en lípidos
(108), además de poseer una considerable capacidad hidrosoluble (109). Así, la
melatonina supera fácilmente las barreras fisiológicas y puede alcanzar una
concentración suficiente para proporcionar protección frente a los EROs (97, 98).
La melatonina tiene también propiedades anti-inflamatorias (110, 111). En estudios
in vivo se ha demostrado que esta indolamina reduce el edema y la peroxidación lipídica
causados por pancreatitis aguda inducida por ceruleína o por IR del páncreas (112, 113).
En los últimos años se ha destacado la importante relación de la melatonina con el
sistema inmune. Se ha documentado ampliamente la existencia de receptores de
membrana y receptores nucleares de melatonina en las células inmunocompetentes y se
Introducción
-20-
han estudiado sus implicaciones (114-122). Se ha evidenciado la síntesis de melatonina
por los linfocitos humanos (123). También se ha observado que la melatonina participa
en la regulación de la apoptosis de las células T (124) y B (125). En distintos modelos
experimentales, la administración exógena de melatonina ha tenido un efecto modulador
positivo de la respuesta inmune celular (126), de la respuesta inmune humoral (127), de
la producción de citoquinas (128-130) y de la respuesta inmune no específica (131).
Estas acciones inmunopotenciadoras de la melatonina han sido más evidentes en
situaciones en las que el sistema inmune está deprimido que en situaciones de
normalidad (132). Contrariamente, también se ha atribuido a la melatonina una acción
inmunosupresora. En estudios in vitro, la melatonina ha ejercido un efecto inhibitorio
sobre la producción de citoquinas (133) y sobre la proliferación de linfocitos (134). En
un modelo de trasplante cardiaco en ratas, el tratamiento con melatonina a dosis
elevadas ocasionó un retraso en el advenimiento del RA y una disminución de la
respuesta inmune humoral y celular (135). No están claras las razones de estas
propiedades aparentemente opuestas de la melatonina sobre la respuesta inmune. En
este contexto puede estar implicada la cantidad administrada, dosis bajas serían
inmunopotenciadoras y dosis altas ejercerían un efecto contrario inmunodepresor (98,
135, 136).
Debido a que se piensa que la melatonina es un importante modulador del sistema
inmune y un antioxidante eficaz, se ha propuesto recientemente la idea de que la
melatonina podría aplicarse al trasplante de órganos (70, 98, 137). Sin embargo, la
aplicabilidad de la melatonina en el trasplante de órganos ha sido poco estudiada. Hasta
el momento sólo se han dado a conocer tres estudios, realizados todos en ratas. En los
tres se han observado efectos favorables con la administración de melatonina: 1) retraso
en el advenimiento del RA, con prolongación significativa de la supervivencia del
Introducción
-21-
injerto, en un modelo de trasplante cardiaco (135); 2) protección de las lesiones de
reperfusión después de isquemia prolongada en un modelo de trasplante ortotópico de
pulmón (138); 3) efecto beneficioso sobre la recuperación de la función renal y celular
después de la reperfusión e incremento de la supervivencia del receptor en un modelo de
trasplante renal (139).
Hipótesis de trabajo.Objetivos
-22-
II HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Hipótesis de trabajo.Objetivos
-23-
El EO debido a una generación excesiva de RL es una vía fundamental del daño de IR
en el trasplante de órganos. La melatonina, una indolamina derivada del triptófano, tiene
una potente acción antioxidante a la que se suman propiedades antiinflamataorias e
inmunomoduladoras. Nuestro planteamiento se basa en estas acciones de la melatonina
que sugieren fuertemente que esta indolamina puede ser de eficacia en la prevención de
las lesiones de IR en el trasplante de órganos. Sin embargo, existe poca documentación
en este sentido.
En el presente trabajo, evaluamos la eficacia del tratamiento con melatonina en el
alotrasplante de páncreas en el cerdo y comparamos sus efectos con el ácido ascórbico,
cuyas propiedades antioxidantes son bien conocidas. Este es el primer estudio, salvo
mejor conocimiento, sobre la utilidad terapéutica de la melatonina en el TP y en el
trasplante de órganos en una especie animal grande, como es el cerdo.
Objetivo principal del estudio.
Evaluar la influencia de la administración de melatonina en la supervivencia del
aloinjerto pancreático, estimada por el matenimiento de la normoglucemia.
Objetivos secundarios.
Conocer si la administración de melatonina, en las condiciones experimentales del
estudio, conlleva una mejora en:
1. La función endocrina y exocrina del aloinjerto pancreático.
2. La peroxidación lipídica del daño oxidativo de IR evaluada por las
concentraciones tisulares en el injerto pancreático de malonildialdehido (MDA)
+ 4-hidroxialquenales (4-HDA), productos finales de la peroxidación lipídica.
3. La oxidación de las proteínas de la membrana celular según las concentraciones
tisulares en el injerto pancreático de restos carbonilo de las proteínas.
Hipótesis de trabajo.Objetivos
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4. La respuesta de fase aguda al alotrasplante de páncreas en el cerdo cuantificada
por las concentraciones séricas de la pMAP/ITIH4, una proteína de fase aguda
positiva dependiente de la IL-6 (tipo II).
Hipótesis de trabajo.Objetivos
-25-
II HYPOTHESIS AND
OBJECTIVES
Hipótesis de trabajo.Objetivos
-26-
Oxidative stress, due to the production of free radicals and/or reactive oxygen species, is
known to be one of the main causes of ischemia-reperfusion injury during organ
transplantation. Melatonin, an indol derivative from tryptophan, has a strong antioxidant
activity, but also some anti-inflammatory and immunomodulation properties. Our
approach is based on these properties of melatonin, which suggest that can be effective
in the prevention of I-R injury in organ transplantation. Nevertheless, we hardly have
found data about this fact.
In this study, we have evaluated the effectiveness of melatonin in a model of
pancreas allotransplantation in pigs. We have compared the effects of melatonin with
those the ascorbic acid, a well-known antioxidant drug. As far as we know, this is the
first research about the therapeutic use of melatonin in pancreas transplantation and,
also, in the use in organ transplantation in big animals, such as pigs.
Main objective
To evaluate the influence of the administration of melatonin in the survival rate of the
pancreatic allograft in pigs, estimated by measuring the level of glycaemia.
Other objectives
To determinate if the administration of melatonin in experimental conditions leads to an
improvement in:
1. Exocrine and endocrine function of the pancreatic graft.
2. Lipid peroxidation due to I-R injury, estimated by the tissue concentrations in
the pancreatic graft of malondialdehyde (MDA) and 4-hydroxyalkenals (4-
HDA), as end products of lipid peroxidation.
3. Oxidation of the cell membrane proteins by determination of carbonyl groups of
the proteins.
Hipótesis de trabajo.Objetivos
-27-
4. The acute-phase response to the pancreas allotransplantation in pigs, quantified
by serum concentrations of pMAP/ITIH4, an interleukin 6 (IL-6)-dependent
acute-phase protein (type II).
Material y métodos
-28-
III MATERIAL Y MÉTODOS
Material y métodos
-29-
1 MODELO QUIRÚRGICO
1.1 Animales
Hemos utilizado 48 cerdos Landrace hembras (24 donantes y 24 receptores) de 40 ± 5
kg de peso para realizar 24 alotrasplantes de páncreas con derivación entérica de la
secreción exocrina y drenaje venoso sistémico.
Todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo Licencia del Proyecto PI036/09
aprobado por Comisión Ética Asesora para la Experimentación Animal de la
Universidad de Zaragoza. El cuidado y uso de los animales se realizaron de acuerdo con
la Política Española de Protección de los Animales RD1201/05, que cumple con la
normativa de la Unión Europea (Directive 86/609/EEC) sobre protección de los
animales utilizados para experimentación y otros fines científicos.
1.2 Procedimiento anestésico
1.2.1 Evaluación preoperatoria
La fase experimental se llevó a cabo en las instalaciones de la Unidad Mixta de
Investigación de la Universidad de Zaragoza.
La evaluación preoperatoria se llevó a cabo valorando el estado de salud de los
cerdos, mediante el registro de los siguientes parámetros fisiológicos: temperatura
rectal, frecuencia cardiaca, color de las mucosas, tiempo de relleno capilar, peso
corporal y auscultación torácica, evaluando tanto la frecuencia como la profundidad de
la respiración. Los valores de los parámetros fisiológicos resultaron ser normales, dentro
de los límites fisiológicos de la especie porcina, en todos los animales. Se sometió a los
mismos a un ayuno previo de 12 horas para sólidos y 6 horas para líquidos.
Material y métodos
-30-
1.2.2 Premedicación anestésica
Debido al difícil manejo de los animales, y a la imposibilidad de cateterizar una vía
periférica sin una sedación previa, la premedicación para lograr una inmovilización
farmacológica de los mismos se realizó en la jaula de estabulación mediante la
administración intramuscular de los siguientes fármacos:
- Tiletamina-zolazepam, (Zoletil®), a dosis de 3,5 mg/kg; y
- Medetomidina, (Domtor®), a dosis de 0,03 mg/kg.
Estos fármacos se asociaron a atropina (Atropina Braum®) 0,02 mg/kg, para evitar
el exceso de secreción salivar, bradicardia y arritmias cardiacas durante la anestesia. La
administración se realizó con una jeringa conectada a una aguja hipodérmica con
prolongador, para evitar la movilidad de la misma durante la inyección intramuscular en
la región cervical posterior del animal.
Una vez conseguida la inmovilización y decúbito lateral del animal (5-10 minutos),
se procedió a su traslado hasta la mesa de quirófano para realizar el acceso a venas
periféricas. Para evitar la hipotermia y prevenir la aparición de paresias o úlceras
cutáneas por decúbitos prolongados durante la intervención, se colocó al cerdo en
decúbito dorsal sobre un lecho mullido con una manta eléctrica.
1.2.3 Cateterización intravenosa
La punción se realizó en la vena auricular de la cara dorsal de la oreja, con catéteres
intravenosos (Abbocatt®) de calibre 18-20 G. Tras cateterizar la vía, ésta se fijó con
cinta adhesiva para evitar su salida accidental y se conectó a una llave de tres vías y
línea de infusión para la administración de fluidoterapia y fármacos.
Material y métodos
-31-
1.2.4 Intubación endotraqueal y anestesia inhalatoria
A los 10 minutos de la premedicación, se procedió a la intubación de cada animal, con
tubos endotraqueales de los números 7-7,5, ayudados de laringoscopio con pala recta de
Miller del nº 3, y en posición de decúbito prono. Si fuese necesario, se emplearía una
dosis reducida de propofol para completar las maniobras de intubación. Se procedió a
inflar el balón de neumotaponamiento y se fijó el tubo con cinta adhesiva.
Posteriormente el tubo se conectó a un circuito circular cerrado de un sistema de
anestesia general (mod. Aestiva/5, Datex-Ohmeda) equipado con ventilador mecánico.
Se administró sevoflurano a 0,75 veces la concentración alveolar mínima (CAM),
EtSEVO = 2,0%, en oxígeno, con su vaporizador específico (Sevotec, Datex-Ohmeda), en
un flujo de gas fresco de 2 l/min.
1.2.5 Fluidoterapia y analgesia intraoperatoria
La analgesia intraoperatoria se proporcionó mediante la administración intravenosa de
un bolus de 2 mcg/kg de fentanilo (Fentanest ®), seguido de una infusión intravenosa
continua a dosis de 4,5-6,5 mcg/kg/hora, cubriendo los requerimientos necesarios y
manteniendo la frecuencia cardiaca y la presión arterial media dentro de los límites
considerados como normales.
Durante la intervención se administró la fluidoterapia adecuada con solución ringer
lactato (Ringer Lactato, B/Braun ®) a un ritmo de infusión de 10 ml/kg/hora.
1.2.6 Ventilación mecánica
Se instauró la ventilación a presión positiva intermitente (VPPI), fijando la frecuencia
respiratoria en el ventilador (modelo 7100, Datex-Ohmeda) a 10 resp/min, con una
relación inspiración:espiración de 1:2, con una presión media en vías aéreas de 6 cm
H2O, y variando el volumen tidal para mantener estables los valores de saturación de
Material y métodos
-32-
oxígeno en hemoglobina (95-100 %) y normocapnia (34-36 mm Hg) durante todo el
periodo anestésico.
1.2.7 Monitorización anestésica
Se procedió a la instalación y monitorización completa de cada animal, tanto de los
parámetros cardiacos y hemodinámicos (frecuencia cardiaca, electrocardiograma,
presión arterial), como respiratorios (frecuencia respiratoria, volumen minuto y tidal,
saturación de oxígeno en hemoglobina, fracción inspirada de oxígeno y fracción
espirada de dióxido de carbono), que fueron registrados por un monitor de parámetros
cardiorrespiratorios (Cardiocap/5, Datex-Ohmeda) (Tabla 1). La monitorización de la
dosificación de sevoflurano se realizó mediante la concentración final espirada del
mismo. Otro parámetro monitorizado durante el periodo anestésico fue la temperatura
rectal.
Se realizó la aspiración gástrica continua mediante una sonda gastroesofágica
colocada por vía oral.
La cirugía se inició con la cateterización de la vena yugular externa en el lado
derecho, para mantener una vía venosa permeable durante todo el periodo de
seguimiento del animal en el postoperatorio y extracción de muestras de sangre.
1.2.8 Fin de la anestesia y analgesia postoperatoria
Al finalizar la intervención, se cerró el vaporizador de sevoflurano, cesando la anestesia.
Durante la recuperación inmediata, se procedió a la extubación tras comprobar que
respiraba espontáneamente y mantenía una ventilación y una saturación adecuadas.
Para continuar la analgesia durante el periodo postoperatorio, se adminisitró
buprenorfina a dosis de 10 mcg/kg a los 15 minutos antes de cerrar el vaporizador y
Material y métodos
-33-
finalizar la infusión de fentanilo y, posteriormente, se colocó un parche transdérmico de
buprenorfina (Transtec® 35 mcg/h) en la región cervical posterior.
A continuación se trasladó a la jaula de estabulación individual en el animalario, donde
tuvo lugar la recuperación postoperatoria en condiciones de luminosidad y homeotermia
adecuadas.
Tabla 1: parámetros fisiológicos a mantener durante la anestesia
Parámetros
Frecuencia cardiaca 50-160 latidos/minuto M
Frecuencia respiratoria 8-15 respiraciones /minuto
Saturación O2 95-100%
Volumen Tindal corriente 10 ml/kg T
Volumen minuto 4,5/7,5 l/min
Relación inspiración/espiración 1:2, 1:3
Presión en vías aéreas
Máxima 15-20 cm de agua
Mínima 1 cm de agua
Media 5-8 cm de agua
Et CO2 34-36 mm Hg
FiO2 85-99
Temperatura 36-39 grados centígrados
Presión de insuflación 15-20 cm de agua
1.3 Procedimientos quirúrgicos y preservación del injerto
1.3.1 Intervención en el donante
Del animal donante extraemos en bloque un injerto pancreático-duodenal que
comprende la totalidad del páncreas, un segmento del duodeno con la desembocadura
de los conductos pancreáticos, un parche de aorta que incluye el tronco celíaco (TC) y la
arteria mesentérica superior (AMS) con las ramas que irrigan el injerto (arteria
esplénica, arteria hepática común, arteria gastroduodenal (AGD) y arterias pancreático-
Material y métodos
-34-
duodenales superiores e inferiores), y el drenaje venoso constituido por las venas
mesentérica superior, esplénica y porta.
Incisión. Se aborda la cavidad peritoneal a través de una laparotomía media
suprainfraumbilical (Figura 1).
Preparación del injerto a nivel del hilio hepático. Manteniendo levantada la cara
ántero-inferior del hígado, se expone el hilio hepático (Figura 2)
Fig. 1. Aspecto de la cavidad addominal porcina tras la laparotomía
Fig. 2. Exposición del hilio hepático
Material y métodos
-35-
Se diseca el colédoco (Figura 3) que se secciona entre ligaduras de seda 2/0 en la
proximidad del borde superior del duodeno (Figura 4).
Fig. 3. Disección del colédoco en el hilio hepático
Fig. 4. Sección del colédoco entre ligaduras
Se liberan y seccionan entre ligaduras de seda 3/0 las ramas de la arteria hepática propia
(Figura 5) y las ramas que desde esta arteria se dirigen hacia la curvadura menor del
Material y métodos
-36-
estómago. Es imprescindible conservar AGD ya que de ella depende fundamentalmente
el riego del duodeno y del lóbulo derecho del páncreas. Se diseca la vena porta (Figura
6) en la proximidad del hígado, con cuidado de preservar la vena gastroduodenal
(VGD). Se ha de ligar también una pequeña rama arterial que transcurre por la cara
posterior de la porta.
Fig. 5. Disección de las ramas de la arteria hepática propia previamente a su ligadura
Fig. 6. Se han seccionado las ramas de la arteria hepática propia. Se ha disecado la vena
porta. La peparación del injerto a nivel del hilio hepático ha quedado ultimada.
Material y métodos
-37-
Preparación del cuerpo y cola (lóbulo izqquierdo) del páncreas y su vascularización.
El lóbulo izquierdo del páncreas (LIP) es largo y se extiende transversalmente de
izquierda a derecha desde la proximidad del hilio esplénico hasta la vena mesentérica
superior. En una anatomía comparada, el LIP porcino correspondería al cuerpo y cola
del páncreas humano.
Traccionando del estómago cranealmente, del colon transverso en sentido caudal y
del bazo, que es muy grande, alargado y móvil, hacia la izquierda, se ponen tensos los
epiplones gastrocólico y gastroesplénico (Figura 7) que son finos, tenues, carentes de
grasa, por lo que siendo transparentes dejan ver a su través el páncreas. Se secciona el
epiplon mayor, así como los vasos gastroepiplóicos izquierdos y los vasos gastro-
esplénicos (vasos cortos) para acceder al LIP, que yace fijo a la pared dorsal de la
cavidad abdominal (Figura 8), adherido a las estructuras adyacentes por finísimas capas
avasculares de tejido conjuntivo.
Fig. 7. Epiplon gastrocólico y gastroesplénico. Bazo. Lóbulo izquierdo del páncreas.
Material y métodos
-38-
Fig. 8. Bazo, ya liberado, con los vasos esplénicos en su hilio. El lóbulo izquierdo del
páncreas yace fijo en la pared abdominal dorsal.
En el hilio esplénico se disecan y seccionan entre ligaduras la arteria (Figura 9) y la
vena esplénicas por separado (Figuras 10). De esta manera queda ultimada la
esplenectomía y libre el extremo izquierdo del páncreas.
Fig. 9. Ligadura, para su sección, de la arteria esplénica.
Material y métodos
-39-
Fig. 10. Vena esplénica después de la sección de la arteria esplénica.
Se libera, a continuación, el LIP seccionando las finas conexiones que lo fijan al
colon y al retroperitoneo, especialmente en la proximidad de la glándula suprarrenal
izquierda. A este nivel, rechazando delicadamente el LIP hacia la izquierda, se
identifica y libera el TC, se secciona el plexo celíaco adyacente al mismo y se diseca y
circunda la aorta abdominal cranealmente al TC. Distalmente se identifica y libera la
vena renal izquierda (VRI); su borde superior está en íntima relación con la AMS. Con
precaución, se deben separar VRI y AMS y a nivel del espacio interpuesto, distalmente
a la AMS, se diseca y circunda la aorta abominal. De esta manera, la aorta abdominal
queda preparada para ser seccionada por encima del TC y por debajo de la AMS en el
momento final de la extracción del injerto (Figura 11). Se deja descansar el LIP en su
posición anatómica (Figura 12).
Traccionando al cénit del estómago, se ponen tensos los llamados vasos diverticulares
que discurren verticalmente entre el fundus gástrico y los vasos esplénicos a nivel de la
Material y métodos
-40-
parte medial del LIP. Se liberan los vasos diverticulares del abundante tejido
conjuntivo y linfograso que los cubre y luego se seccionan entre ligaduras (Figura 13).
Fig. 11. Aorta abdominal circundada por encima del tronco celíaco y por debajo de la
arteria mesentérica superior. Se observa la relación de esta arteria con el borde superior
de la vena renal izquierda. El lóbulo izquierdo del páncreas se ha rechazado hacia la
izquierda.
Fig. 12. Lóbulo izquierdo del páncreas en su posición anatómica normal.
Material y métodos
-41-
Fig. 13. Disección, ligadura y sección de los vasos diverticulares que desde
los vasos esplénicos se dirigen hacia el fundus gástrico.
Preparación de los lóbulos derecho y medio del páncreas y su vascularización
El lóbulo derecho del páncreas (LDP) es pequeño, continuación del segmento medio del
páncreas (SMP) (istmo pancreático en anatomía humana) y sigue el borde mesentérico
de la segunda porción duodenal, que es móvil e intraperitoneal. El LDP está unido al
lóbulo medio del páncreas (LMP) por un meso translúcido por el que discurren los
vasos pancreáticoduodenales (VPD). Estos vasos van dando ramitas para el duodeno y
para el parénquima pancreático; seccionando estas ramitas, puede separarse el páncreas
del duodeno sin comprometer la irrigación e integridad de la pared duodenal. Los VPD
superiores se continúan de manera inaparente con los VPD inferiores que discurriendo
por el meso antes mencionado se dirigen hacia la AMS y VMS.
El LMP, más corto y grueso que el LIP, y en cierto modo verticalizado, se extiende
desde el SMP hasta el final de la tercera porción duodenal. El LMP por su cara medial
está en contacto prácticamente en toda su longitud con la VMS (Figura 14). Por su cara
Material y métodos
-42-
lateral se relaciona con la vena cava inferior infrahepática, glándula suprarrenal derecha
y VRI de las que puede separarse a través de un buen plano de clivaje (Figura 15). El
LDP y el LMP corresponderían a la cabeza del páncreas y al proceso uncinado
respectivamente en el hombre. LIPLIPLIP
Fig. 14. Anatomía del páncreas porcino. LIP: lóbulo izquierdo pancreático. SMP:
segmento medio (istmo) del páncreas. LDP: lóbulo derecho pancreático. LMP: lóbulo
medio del páncreas. D: duodeno. VMS: vena mesentérica superior.
Fig. 15. Relaciones de los lóbulos derecho y medio del páncreas con estructuras
vecinas. GS: glándula suprarrenal derecha; VCI: vena cava inferior.
LIPP LIPP
SMPPP
LDPP
LMPP
VMSP
D
VCIP
GSP
Material y métodos
-43-
La preparación del injerto pancreático-duodenal se prosigue con la adecuación del
LDP y LMP. Se secciona el meso que une estos dos lóbulos y se ligan y seccionan los
vasos pancreático-duodenales a nivel de la confluencia distal del LDP y el duodeno.
El LMP se libera por su borde inferior mediante sección del peritoneo parietal
posterior, y se separa sucesivamente de la glándula suprarrenal derecha, vena cava
inferior infrahepática y VRI. Asimismo, se separa su extremo más caudal de la tercera
porción del duodeno.
La liberación del LMP se completa mediante la sección entre ligaduras de las
primeras ramas arteriales y venosas yeyunales (Figura 16). También se disecan la AMS
y la vena mesentérica superior (VMS) en 1-2 cm por debajo del borde caudal del LMP
(Figuras 17). De esta manera queda preparado este lóbulo con la AMS hasta su origen
en la aorta y la VMS.
Fig. 16. Ligadura y sección de las ramas arteriales yeyunales para liberar en
bloque el lóbulo medio del páncreas con la AMS y sus ramas pancreáticas.
A: aorta. AMS: arteria mesentérica superior. AY: arteria yeyunal. VRI: vena
renal izquierda. P: páncreas.
AMS
A VRI
AY P
Material y métodos
-44-
Fig. 17. Disección de la arteria mesentérica superior (AMS) y vena mesentérica
superior (VMS), 1-2 cm distalmente al lóbulo medio pancreático LMP
Preparación del segmento duodenal incluido en el injerto
Ultimada la liberación del páncreas, se secciona distalmente el duodeno en el lugar
donde se ligaron los vasos pancreático-duodenales inferiores, en la confluencia del LDP
y el duodeno. El cabo duodenal se cierra mediante sutura continua de seda 3/0 (Figura
18). Se ligan y seccionan los vasos pilóricos y gastroepiplóicos derechos duodeno
inmediatamente por debajo del píloro. A este nivel se secciona el duodeno y se cierra su
cabo con sutura continua seda 3/0 (Figura 19). El duodeno queda unido en bloque al
SMP y LDP, incluyendo en su luz el abocamiento de los conductos pancreáticos.
Extracción del injerto
Se administra heparina sódica por vía intravenosa (IV) a dosis de 3 mg/kg de peso antes
del clampaje y sección de las estructuras vasculares principales.
Para obtener el injerto pancreático duodenal no queda sino seccionar los pedículos
vasculares: la AMS y la VMS caudalmente al LMP, un segmento de la aorta abdominal
que incluye el TC y la AMS y la vena porta en la proximidad del hígado.
A
VMS
AMS
LMP
Material y métodos
-45-
Fig. 18. Extremo distal del duodeno seccionado y suturado, donde están ligados los
vasos pancreático-duodenales inferiores Debajo del píloro, se han preparado los vasos
gastroepiplóicos derechos para su inmediata ligadura y sección.
Fig. 19. Segmento duodenal, incluido en el injerto, completamente preparado.
Material y métodos
-46-
1.3.2 Perfusión-lavado ex situ y almacenamiento frío del injerto
Una vez extraído, el injerto se pesa (Figura 20). Se coloca en un recipiente metálico
estéril y se procede a su lavado y perfusión a través del TC y de la AMS con la
solución de preservación de la Universidad de Wisconsin (UW) (Viaspan®) a 4ºC, a
una presión de 100 cm H2O y con un volumen suficiente (150-200 cc) hasta que el
líquido de perfusión que drena a través de la porta sale completamente limpio (Figura
21).
Después de la perfusión, se vuelve a pesar el injerto pancreático-duodenal (Figura 20) y
luego se almacena sumergido en UW dentro de una convencional bolsa ésteril que
cerramos herméticamente. El injerto se embala en otra bolsa estéril y ésta en una
tercera. De esta manera los injertos son almacenados durante 8 horas a 4º C.
Fig. 20. Se ha pesado el injerto pancreático-duodenal inmediatamente después de su
extracción (izquierda) y después del lavado-perfusión ex situ con la solución de
preservación UW (derecha). Nótese en la pantalla de la balanza que después del lavado-
perfusión el peso del injerto ha disminuido.
Material y métodos
-47-
1.3.3 Intervención en el receptor
El aloinjerto pancreático-duodenal se implanta mediante anastomosis del parche de
aorta y de la vena porta del injerto a la aorta y vena cava infrarrenales del receptor. El
duodeno del injerto se anastomosa a una asa ileal del receptor.
Fig. 21. Injerto pancreático-duodenal después del lavado-perfusión ex situ. Parche de
aorta con los orificios del tronco celíaco y de la arteria mesentérica superior.
1.3.3.1 Canalización de la vía venosa central
Una vez realizada la inducción anestésica y la intubación endotraqueal, se procede a
canular la vena yugular externa en el lado derecho.
Se realiza una incisión vertical en la cara anterolateral del cuello a unos dos
traveses de dedo de la línea media y unos 3-4 cm por encima del cartílago tiroides. Se
secciona el platisma y en la cara posterolateral del músculo esternocefálico se identifica
la vena yugular externa, que se diseca y se liga distalmente con seda 3-0.
A continuación se realiza una incisión en la vena, se introduce el catéter en
dirección de la vena cava superior (Certofix ®) y se fija con una ligadura doble de seda
3-0.
Material y métodos
-48-
El extremo distal del catéter se tuneliza por el tejido subcutáneo hasta la región
cervical posterior, donde se fija con puntos de seda 2-0 (Figura 22). La vía venosa se
mantendrá durante todo el postoperatorio.
Fig. 22. Catéter venoso central insertado en la vena yugular externa y exteriorizado por
la región póstero-lateral cervical derecha.
1.3.3.2 Preparación de la zona del implante
El aloinjerto pancreático-duodenal se coloca en posición heterotópica en la cavidad
peritoneal.
Se realiza una laparotomía media supra-infraumbilical (Figura 23). A continuación,
se disecan la aorta y la vena cava inferior distalmente a los vasos renales. Rechazando
las asas intestinales en sentido craneal y el recto lateralmente hacia la izquierda, se
expone el peritoneo parietal posterior que cubre la cava y la aorta infrarrenales. Por
delante de la cava inferior, distalmente a las venas renales, se secciona el peritoneo
parietal posterior hasta cerca de la bifurcación iliaca, disecando dicha vena cava por sus
caras anterior y lateral en una extensión de 4-5 cm. De igual forma, se procede a la
Material y métodos
-49-
disección de la aorta infrarrenal, algo más distalmente que la de la cava, para facilitar
las anastomosis vasculares (Figura 24).
Fig. 23. Laparotomía media supra-infraumbilical en el receptor
Fig. 24. Vena cava inferior y aorta abdominal disecadas por debajo de los vasos renales.
Material y métodos
-50-
1.3.3.3 Preparación del pedículo arterial del injerto
Tras extraer el injerto pancreático-duodenal de su almacenamiento con la solución fría
de preservación UW y colocarlo en un recipiente sumergido en dicha solución, se
prepara un parche de Carrel de la aorta que engloba el TC y la AMS (Figuras 25 y 26).
Fig. 25. Preparación de un parche de Carrel de la aorta que engloba el TC y la AMS.
Fig. 26. Injerto pancreático duodenal con el parche de aorta un momento antes de
implantarlo en el receptor.
Material y métodos
-51-
1.3.3.4 Realización del implante
Se coloca el injerto en la cavidad peritoneal del receptor de manera que el duodeno
quede orientado en sentido craneal.
Se procede al clampaje lateral de la aorta infrarrenal del receptor con un clamp de
Satinsky (Figura 27). Se efectúa un corte longitudinal en la cara anterior de la aorta y se
procede a la anastomosis término-lateral entre el parche de Carrel aórtico del injerto y la
aorta infrarrenal del receptor con suturas continuas de polipropileno 4/0 (Figuras 28 y
29).
Se coloca a continuación un clamp de Satinsky en la vena cava infrarrenal, se
efectúa una venotomía elíptica anterior longitudinal y se confecciona la anastomosis
término-lateral entre la vena porta del injerto y la vena cava receptora, mediante suturas
continuas de polipropileno 5/0, un poco por encima del lugar de la anastomosis arterial
(Figuras 30-32).
Fig. 27. Clampaje de la aorta abdominal infrarrenal.
Material y métodos
-52-
Fig. 28. Anastomosis entre el parche de aorta del injerto y la aorta infrarrenal del
receptor. Puntos de polipropileno 4/0 en los extremos de la anastomosis.
Fig. 29. Anastomosis entre el parche de aorta del injerto y la aorta infrarrenal del
receptor. Se está realizando la sutura de la cara posterior.
Material y métodos
-53-
Fig. 30. Anastomosis entre la vena porta del injerto y la cava infrarrenal del receptor.
Puntos de polipropileno 5/0 en los extremos de la anastomosis.
Fig. 31. Anastomosis entre la vena porta del injerto y la cava infrarrenal del receptor.
Se está realizando la sutura de la cara posterior.
Material y métodos
-54-
Fig. 32. Anastomosis ultimada entre la vena porta del injerto y la cava del receptor.
Terminadas las anastomosis se retiran los clamps vasculares, primero el de la vena
cava y luego el de la aorta, y se observa la recuperación del latido arterial, el adecuado
drenaje venoso y la buena coloración del injerto (Figura 33).
Fig. 33. Tras el desclampaje, la excelente coloración del injerto pancreático-duodenal,
similar a la de las estructuras vecinas, testimonia la adecuada reperfusión del injerto.
Material y métodos
-55-
1.3.3.5 Derivación entérica de la secreción exocrina del injerto pancreático-
duodenal
Finalmente, el duodeno se anastomosa látero-lateralmente a un asa ileal a unos 40
centímetros de la válvula ileocecal, con suturas continuas de seda 3/0 (Figuras 34 y 35).
Fig. 34. Anastomosis látero-lateral entre el duodeno del injerto y el íleon del receptor.
Fig. 35. Anastomosis ultimada entre el duodeno del injerto y el íleon del receptor.
Material y métodos
-56-
1.3.3.6 Pancreatectomía del receptor
Con objeto de que la única fuente de insulina sea la aportada por el injerto pancreático-
duodenal, se extirpa la totalidad del páncreas del animal receptor con conservación del
duodeno y de su irrigación (Figuras 36-41).
Fig. 36. Pancreatectomía del receptor. Liberación del lóbulo izquierdo pancreático.
Fig. 37. Pancreatectomía en el
receptor. Liberación del lóbulo
izquierdo del páncreas. Se observan
los vasos esplénicos respetados.
Fig. 38. Pancreatectomía en el receptor.
Se ha ultimado la liberación del lóbulo
izquierdo del páncreas nativo.
Material y métodos
-57-
Fig. 39. Pancreatectomía en el receptor. Vena porta, vasos esplénicos y vasos diverticu-
lares respetados
Fig. 40. Pancreatectomía en el receptor. En la imagen de la izquierda se muestran el
segmento medio y el lóbulo derecho pancreáticos. En la imagen de la derecha se ha
comenzado su liberación respetando el duodeno y su vascularización.
Fig. 41. Exéresis del páncreas nativo terminada; el duodeno y su vascularización están
preservados (imagen izquierda). Pieza de exéresis de la totalidad del páncreas (derecha).
Material y métodos
- 58 -
1.3.3.7 Fin del procedimiento del trasplante
Tras el lavado con suero fisiológico templado y posterior aspirado de la cavidad
abdominal, se revisa la hemostasia y se procede al cierre de la laparotomía en dos
planos (peritoneo- aponeurosis y tejido celular subcutáneo) con suturas continuas de
ethylon nº 1 y de la piel con grapas.
2. CUIDADO GENERAL DE LOS ANIMALES RECEPTORES EN
EL POSTOPERATORIO
No se administró inmunosupresión ni se realizó tratamiento del rechazo cuando este se
produjo.
Después del trasplante los animales se trasladaron a la jaula de estabulación
individual con temperatura regulable y luz natural. Para continuar con la analgesia, se
colocó un parche transdérmico de buprenorfina (Transtec® 35 mcg/h) en la región
cervical posterior. El primer día del postoperatorio se les permitía acceso al agua y
recibieron 1500 mL de solución Ringer Lactato por vía intravenosa. A partir del
segundo día se les permitió libre acceso a la alimentación oral con piensos comerciales.
En los siete primeros días se les administró cefoxitina 2 g/día IV.Todos los días se
comprobó su estado general, consciencia, hidratación, frecuencia respiratoria, la ingesta
de agua y alimentos y las características organolépticas y frecuencia de heces y orina.
3 DISEÑO EXPERIMENTAL
3.1 Grupos experimentales
Los animales fueron divididos en tres grupos (n= 16 cada grupo, 8 donantes y 8
receptores), de acuerdo con los siguientes tratamientos antioxidantes:
Material y métodos
- 59 -
Sin tratamiento antioxidante: control
Melatonina, a la dosis de 10 mg/kg de peso corporal
AA: ácido ascórbico, a la dosis de 10 mg/kg de peso corporal
Melatonina y AA fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
En los donantes, melatonina o AA fueron administrados intravenosamente 30
minutos antes del clampaje vascular. En los receptores, melatonina o AA fueron
administrados intravenosamente 30 minutos antes y 30 minutos después de la
reperfusión vascular del injerto. Además, durante una semana después del TP, los
antioxidantes se administraron intravenosamente una vez al día a las 8 de la mañana.
Finalmente, en el lavado-perfusión ex situ del injerto y durante el almacenamiento frio,
se añadieron 5mM de melatonina o AA a la solución UW. La melatonina fue disuelta en
etanol absoluto y suero salino para los procedimientos in vivo o en la solución UW para
los procedimientos ex vivo (perfusión-lavado del injerto y almacenamiento frio). La
concentración de etanol fue de 2% (v/v) en la mezcla final. El AA se diluyó en suero
salino para su administración in vivo o en la solución UW para su administración ex
vivo. Todas las soluciones fueron inmediatamente preparadas antes de su uso.
3.2 Muestras de sangre
Se obtuvieron muestras de sangre (10 mL) en condiciones basales a través del catéter de
la vena yugular externa cada día después del TP para evaluar la función pancreática.
Esta se llevó a cabo mediante la determinación de las concentraciones séricas de
glucosa, insulina, c-péptido, lipasa y amilasa. Además, durante los cuatro primeros días
después del TP, se analizaron las concentraciones séricas de pig-major acute-phase
protein/inter-α-trypsin inhibitor heavy chain 4 (pMAP/ITIH4). Esta molécula es una
proteína de fase aguda interleucina 6 (IL-6)-dependiente que se toma como un indicador
Material y métodos
- 60 -
de inflamación y respuesta de fase aguda sistémica al estrés quirúrgico (140); así, sirve
como un biomarcador de RA en el alotrasplante de páncreas en el cerdo (141).
3.3 Muestras tisulares para estudio del estrés oxidativo
Se tomaron muestras de tejido (500 mg) del lóbulo izquierdo del páncreas para
monitorizar su estado en los momentos siguientes:
a) en el donante, inmediatamente antes del clampaje vascular;
b) en el injerto, inmediatamente después del lavado-perfusión ex situ (0 h de
isquemia fría);
c) en el injerto, después de 8 h de almacenamiento frío;
d) en el receptor, 30 minutos después de la reperfusión.
Estas muestras se homogeneizaron en tampón Tris-HCL 50 mm frío (pH 7,4) y se
midieron las concentraciones de malonildialdehido (MDA) + 4-hidroxialquenales (4-
HDA) en los homogeneizados. MDA y 4-HDA son productos finales de la
lipidoperoxidación y pueden ser utilizados para cuantificar la extensión de la
lipidoperoxidación debida al estrés oxidativo (142).
Asimismo, en los homogeneizados se midieron los restos carbonilo de las proteínas.
3.4 Muestras tisulares para estudio histopatológico
Cuando la glucemia excedió de 150 mg/dL en dos días consecutivos, los animales
receptores fueron anestesiados, se exploró el aloinjerto pancreaticoduodenal vía
laparotomía y se tomaron muestras para estudio histopatológico dirigido al diagnóstico
y gradación de RA de acuerdo con los criterios de Drachenberg et al (143). A
continuación, permaneciendo anestesiados, los animales fueron sacrificados.
Material y métodos
- 61 -
4 DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS
4.1 Estudio de la función pancreática
La concentración de glucosa se determinó por análisis enzimático con hexoquinasa, y
las concentraciones de amilasa y lipasa por técnicas enzimáticas colorimétricas,
realizadas todas ellas en un autoanalizador Roche/Hitachi Cobas c 711 (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). La insulina y el péptido-C se midieron por
técnicas de radioinmunoensayo (RIA) con kits comerciales (LINCO Research,
Missouri, USA).
Los injertos se consideraron funcionantes cuando se detectó normoglucemia al
menos los cinco primeros días del postoperatorio. Asimismo, se diagnosticó que un
animal estaba diabético cuando la glucosa sanguínea en ayunas era superior a 150
mg/dL en dos días consecutivos.
4.2 Medición de la concentración sérica de la pMAP/ITIH4
Las concentraciones séricas de la pMAP/ITIH4 se determinaron por inmunodifusión
radial con gel de agarosa al 1% que contenía el antisuero específico (144) y utilizando
un suero porcino como estándar secundario. La concentración de pMAP/ITIH4 en este
suero se determinó previamente por inmunodifusión radial usando la proteína purificada
como estándar referencia primaria.
5 ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO
5.1 Cuantificación de MDA+4-HDA
Se utilizó para la medición de la peroxidación lipídica un kit Calbiochem LPO-586.
Este protocolo consiste en un reactivo cromogénico que reacciona con el MDA y 4-
Material y métodos
- 62 -
HDA a 45° C para producir un cromóforo estable con una absorbancia máxima a 586
nm de longitud de onda. Se utilizó 1,1,3,3-tetrametoxipropano como estándar. Los
resultados se expresaron como nmol de MDA + 4-HDA por mg de proteínas totales. Las
concentraciones de proteínas se midieron por el método de Bradford (145) con albúmina
bovina como estándar
5.2 Cuantificación de los restos carbonilo de las proteínas
Este test se realizó en homogeneizados de los tejidos extraídos. El contenido de restos
carbonilo se valorará utilizando la metodología de Levine y cols. (146). Se trata de un
test espectrofotométrico que se lee a 350 nm. La concentración se expresará en nmol de
grupos carbonilo / mg de proteína.
6 EXAMEN HISTOPATOLÓGICO
Para el estudio histológico las muestras se fijaron en formaldehido tamponado al 10%
durante 36 horas y posteriormente fueron laminadas y procesadas para su inclusión en
parafina. Se realizaron secciones de 4 micras, que se tiñeron con técnica de la
hematoxilina-eosina para su visualización al microscopio. Las imágenes fueron captadas
con una cámara Olympus DP71 a través de un microscopio Olympus Provis. El
diagnóstico de RA y su gradación se realizó de acuerdo con el esquema de Banff (143,
147,148).
Definimos el fracaso del injerto por RA como el estado diabético (glucemia > 150
mg/dL) del receptor en ausencia de trombosis vascular (arterial o venosa) del injerto u
otras complicaciones técnicas en las reintervenciones y con demostración
histopatológica de signos de rechazo celular agudo en las biopsias.
Material y métodos
- 63 -
7 ANALISIS ESTADÍSTICO
Para controlar la homogeneidad de los grupos determinados por el tratamiento
antioxidante, se han utilizado distintos contrastes según la escala de medida de las
variables: para las categóricas se ha considerado el contraste de Chi-Cuadrado con la
corrección por continuidad de Yates o la prueba exacta de Fisher, en caso necesario.
Para las variables de tipo cuantitativo se ha examinado la normalidad de la distribución
mediante el contraste de Kolmogorov-Smirnov con la modificación de Lilliefors; si la
normalidad es asumible se ha aplicado el test de la t-Student, en caso contrario el test no
paramétrico de la U de Mann-Whitney.
El comportamiento de las determinaciones analíticas tras el trasplante se ha
evaluado utilizando el análisis de la varianza de medidas repetidas con un factor entre-
sujeto que es el tratamiento antioxidante utilizado, y un factor intra-sujeto que son las
determinaciones en los días posteriores a la operación; también se ha considerado la
interacción entre ambos. Para llevar a cabo estos análisis se han escogido contrastes
polinomiales, para así contrastar relaciones lineales y cuadráticas. Se ha escogido el
enfoque univariante debido a que las condiciones para el mismo se cumplían y siendo el
tamaño de muestra escaso, sus resultados tienen más potencia que el enfoque
multivariante. Para contrastar si la matriz de varianzas-covarianzas es similar en los
grupos (control, melatonina y AA) se utilizó la generalización multivariante del
contraste M de Box. Para contrastar que las varianzas de las variables creadas para los
contrastes polinomiales es la misma y su covarianza nula, se utilizó el test de esfericidad
de Mauchly; en caso de que esta última hipótesis no se cumpliera se han corregido los
grados de libertad de la F de los contrastes mediante la Epsilon de Huynh-Feldt.
Material y métodos
- 64 -
Para el análisis de la supervivencia, definida como días de normoglucemia, se ha
utilizado un conjunto de técnicas estadísticas denominadas “análisis de supervivencia”.
Estas técnicas son de tipo no paramétrico, ya que únicamente se pretende contrastar
cómo se modifica el riesgo de fallo por efecto de variables externas. En primer lugar, se
ha procedido a analizar la función de supervivencia y la función de riesgo acumulado
(estimador producto límite de Kaplan-Meier), contrastando si la función de riesgo
cambia dependiendo del tratamiento antioxidante utilizado. Para ello, se ha considerado
el estimador producto límite de Kaplan-Meier, haciendo el contraste de Mantel-
Haenszel (log-rank) entre los grupos.
P ≤ 0.05 fue considerado significativo. Los datos se expresan como media ± error
estándar.
Resultados
- 65 -
IV RESULTADOS
Resultados
- 66 -
1 PROCEDIMIENTO ANESTÉSICO
Después de la administración de la asociación tiletamina/zolazepam/medetomidina, en
menos de 5 minutos se produjo la inmovilización farmacológica de todos los animales,
permitiendo su manejo y manipulación. Además, a los 10 minutos después de
administrar la premedicación, se pudo intubar a todos los animales en condiciones
idóneas.
El tiempo medio de anestesia, desde la intubación e inicio de la anestesia con
sevoflurano hasta el cierre del vaporizador, fue de 234 31 minutos, siendo el tiempo
medio de cirugía, desde la primera incisión hasta el último punto de sutura, de 205 16
minutos.
La concentración en aire espirada de sevoflurano, necesario para obtener el plano
anestésico adecuado, fue próxima o igual a 0,75 veces la CAM. La dosis media de
fentanilo por infusión continua intravenosa para todos los animales, necesario para
mantener los requerimientos analgésicos intraoperatorios durante el TP, fue de 5,7 0,7
mcg/kg/hora (intervalo de confianza al 95 %: 5,2-6,1).
Hubo una disminución significativa (P = 0,0065) de la frecuencia cardiaca en el
minuto 60 en comparación con el inicio de la anestesia. Desde el minuto 120 hasta el
final de la anestesia, no se presentaron más diferencias en la misma.
La presión arterial media presentó medias significativamente menores desde el
minuto 120 hasta el final de la anestesia, siendo muy significativas, con respecto al
inicio de la anestesia, en los minutos 120 (P = 0,0047) y 180 (P = 0,0046).
La temperatura disminuyó significativamente, con respecto al inicio, desde el
minuto 60 hasta el final de la anestesia, siendo muy significativo el descenso de la
misma en los minutos 120 (P = 0,0057), 180 (P = 0,0043) y final (P = 0,009).
Resultados
- 67 -
La disminución de estos parámetros durante el mantenimiento de la anestesia no
tiene relevancia clínica, ya que se encuentran siempre dentro de los límites considerados
como normales. Además, las medias de la frecuencia cardiaca y de la presión arterial,
durante ningún momento de la anestesia, mostraron valores elevados, lo cual indica que
no se apreciaron signos clínicos de dolor durante el procedimiento anestésico-
quirúrgico.
En los 24 receptores intervenidos, no se presentó ninguna complicación grave
relacionada con el procedimiento anestésico. No hubo ningún animal que presentara
despertar intraoperatorio o movimientos durante la anestesia. En los 24 receptores se
pudo finalizar la intervención y efectuar el seguimiento postoperatorio del animal
trasplantado.
2 TIEMPOS DE ISQUEMIA
El tiempo de isquemia fría fue de 8 horas. El tiempo de isquemia caliente (desde la
substracción del injerto de la solución fría hasta su revascularización) varió de 30 a 60
minutos, siendo de 51,7 ± 3 minutos en el grupo control, de 48,7 ± 2 minutos en el
grupo melatonina y de 49,5 ± 1 minutos en el grupo AA (P=0,8).
3 PESO DE LOS INJERTOS
El peso de los injertos pancreático-duodenales, perfundidos y preservados con la
solución UW, se midió en tres momentos diferentes: inmediatamente después de la
extracción, tras la perfusión-lavado ex situ con la solución de preservación, y tras las 8
horas de preservación fría. En los tres grupos el peso de los injertos experimentó una
disminución significativa tras la perfusión-lavado y un descenso todavía más acusado
tras las 8 horas de almacenamiento hipotérmico (P <0,001). Entre los grupos no hubo
Resultados
- 68 -
diferencia estadística significativa en el peso de los injertos en los tres momentos
mencionados (P >0,8) (Tabla 2, Figura 42).
Tabla 2: peso del injerto pancreático-duodenal
Después de la
extracción
Después del
lavado ex situ
Después de 8 horas
de preservación fría
GC 141,3 ± 9 136,3 ± 8,2* 126,7 ± 8,4*†
GA 135,3 ± 6,9 129,9 ± 7* 121,3 ± 6,2*†
GM 136,5 ± 5,8 130,1 ± 5,3* 121,9 ± 5*†
Se muestran los resultados en gramos, como media ± error estándar. GC
(n = 8), grupo control; GA (n = 8), grupo ácido ascórbico; GM (n = 8),
grupo melatonina. *P < 0.001 vs el peso después de la extracción del
injerto. †P < 0.001 vs el peso después del lavado ex situ del injerto.
Weight
Extracted graft weight Washed graft weight Preserved graft weight110
120
130
140
150
160
ControlAscorbic acidMelatonin
Wei
ght (
g)
Fig. 42. Evolución del peso de los injertos pancreático-duodenales:
inmediatamente después de la extracción, tras el lavado-perfusión ex situ y
después de de 8 horas de almacenamiento hipotérmico con la solución UW
Resultados
- 69 -
4 SUPERVIVENCIA DEL INJERTO PANCREÁTICO
Inmediatamente después del trasplante los 24 aloinjertos funcionaron normalmente. El
RA del injerto, confirmado por estudio histopatológico, acabó sobreviniendo en todos
los TP. Los animales del grupo control rechazaron el aloinjerto pancreáticoduodenal
entre los día 7 y 12 postoperatorios (media de supervivencia de 8.1 ± 0.8 días). El grupo
AA fracasó sustancialmente en modificar el curso del RA y la supervivencia del injerto
(9.4 ± 1.6 días) fue similar a la del grupo control (P=0.457). El tratamiento con
melatonina difirió el comienzo del RA (25.1 ± 7.7 días) e incrementó significativamente
la supervivencia del aloinjerto (P=0.013 y P=0.049 vs aninales no tratados y con AA,
respectivamente) (Figuras 43 y 44). El 50% de los aloinjertos en el grupo melatonina
fueron normofuncionantes después del día 16 postrasplante, 37.5% después de 30 días,
y 25% después de 50 días. Ninguno de los injertos de los grupos control y AA alcanzó
16 días de normoglucemia, excepto uno del grupo AA que fue normofuncionante
durante 17 días.
Normoglycemie
Control Ascorbic acid Melatonin0
10
20
30
40
Norm
ogly
cem
ie (d
ays)
Figura 43. El tratamiento con melatonina incrementó significativamente la
supervivencia del aloinjerto pancreático respecto al grupo control
(P=0.013) y al grupo tratado con ácido ascórbico (P=0.049).
Resultados
- 70 -
Figura 44. Supervivencia, expresada como días de normoglucemia, de los
aloinjertos pancreático-duodenales. Todos los animales receptores del grupo control
sin tratamiento rechazaron el aloinjerto antes del día 12 postoperatorio. La terapia
con melatonina difirió el rechazo agudo y prolongó la supervivencia de los
aloinjertos. El tratamiento con ácido ascórbico no modificó significativamente el
curso del rechazo agudo.
5. FUNCIÓN ENDOCRINA DESPUES DEL TRASPLANTE DE
PÁNCREAS
La media de glucemia basal (preoperatoria) fue de 89.6 ± 2.6 mg/dL en el grupo control,
80.1 ± 4 mg/dL en el grupo melatonina y 86.3 ± 5.5 mg/dL en el grupo AA. La figura
45 ilustra los niveles de glucosa sérica observados los días 1-10 postoperatorios.
Durante los cinco primeros días los niveles de glucosa tendieron a estar más bajos que
Survival of Data 1:Survival proportions
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
ControlAscorbic acidMelatonin
Normoglycemie days
Perc
ent s
urvi
val
Días de normoglucemia
Resultados
- 72 -
brusco incremento después del TP, con pico el primer día donde el valor promedio fue
siete y cuatro veces respectivamente mayor que los valores basales (P < 0.05). Al
segundo día, ambos parámetros experimentaron un descenso gradual, aunque
permanecieron significativa y consistentemente más altos que los niveles basales (P <
0.05) a lo largo del periodo postoperatorio.
Figura 46. Niveles séricos de insulina basales y después del alotrasplante de
páncreas en el cerdo, sin inmunosupresión, con 8 horas de preservación fría
en solución UW. Grupo control (▲) y grupos de tratamiento con ácido
ascórbico (■) y melatonina (●) (n=8 cada grupo). Los datos se expresan como
media ± error estándar.
Día postoperatorio
Resultados
- 73 -
Figura 47. Niveles séricos de péptido-C basales y después del alotrasplante de páncreas
en el cerdo, sin inmunosupresión, con 8 horas de preservación fría en solución UW.
Grupo control (▲) y grupos de tratamiento con ácido ascórbico (■) y melatonina (●)
(n=8 cada grupo). Los datos se expresan como media ± error estándar.
6. FUNCIÓN EXOCRINA DESPUÉS DEL TRASPLANTE DE
PÁNCREAS
La media de las concentraciones séricas basales de amilasa (908 ± 4 UI/mL, 817 ± 7
UI/ mL y 857 ± 1 UI/mL, en los grupos control, melatonina y AA, respectivamente) y
las curvas de respuesta al TP fueron similares en los tres grupos. La amilasemia se
incrementó significativamente en el periodo postoperatorio inmediato, con pico máximo
el primer día postoperatorio de 8 veces los valoreas basales. Desde el 2º día la
amilasemia experimentó un descenso progresivo y, a partir del 5º, día los valores
fueron inferiores a los basales (Figura 48).
Día postoperatorio
Resultados
- 74 -
La lipasa sérica (valores basales de 8.2 ± 1.4 UI/mL, 8.3 ± 1.3 UI/mL y 6.3 ± 0.5
UI/mL, en los grupos control, melatonina y AA respectivamente) mostró una tendencia
similar a la amilasemia, aunque el incremento postoperatorio de la lipasemia fue más
acusado y prolongado (Figura 49). Si bien los picos de la lipasa sérica en los grupos
melatonina y AA fueron 40% más bajos que el de los controles, las diferencias entre los
grupos no fueron significativas.
Amilase
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
2000
4000
6000
8000
10000ControlAscorbic AcidMelatonin
Postoperative day
Amila
se (U
I/mL)
Figura 48. Niveles séricos de amilasa en el alotrasplante de páncreas en el cerdo,
sin inmunosupresión, con 8 horas de preservación fría en solución UW.
Día postoperatorio
Resultados
- 75 -
Lipase
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
200
400
600
800
1000
1200ControlAscorbic AcidMelatonin
Postoperative day
Lipa
se (U
I/mL)
Figura 49. Niveles séricos de lipasa basales y después del alotrasplante de
páncreas en el cerdo, sin inmunosupresión, con 8 horas de preservación fría
en solución UW.
7. CONCENTRACIONES DE MDA y 4-HDA EN LOS INJERTOS
PANCREÁTICOS
Se analizaron las concentraciones de MDA + 4-HDA para evaluar el estrés oxidativo
(Figura 50). Todos los homogeneizados de páncreas mostraron un incremento en las
concentraciones de MDA + 4-HDA a los 30 minutos de la reperfusión en comparación
a los niveles observados inmediatamente antes del clampaje vascular del injerto en el
donante y después de 0 h y 8 h de isquemia fría. Este incremento en la reperfusión fue
significativa en los grupos control y AA (P=0.010 y P=0.040, respectivamente), pero no
en los animales tratados con melatonina (P=0.060).
En general, la peroxidación lipídica en el grupo melatonina fue mucho menor que
en el control, tanto antes (P=0.001 inmediatamente antes del clampaje en el donante;
Día postoperatorio
Resultados
- 76 -
P=0.007 inmediatamente después de la perfusión-lavado ex situ del injerto; P=0.006
después de 8 h de isquemia fría) como después del trasplante (P=0.017 a los 30 minutos
tras la reperfusión). En contraste, la peroxidación lipídica en el grupo AA fue sólo
significativamente menor que en el grupo control después de la reperfusión (P =0.037).
Figura 50. Concentraciones de malonildialdehido (MDA) y 4-hidroxialquenales
(4-HDA) en los aloinjertos pancreáticos. Las concentraciones máximas se
detectaron en homogeneizados de páncreas después de 30 minutos de la
reperfusión. El tratamiento con melatonina (■) o ácido ascórbico (■) redujo
significativamente el estrés oxidadtivo durante la reperfusión en comparación con
el grupo control sin tratamiento (□) (44.13 y 25.92% respectivamente). Antes del
clampaje en el donante, o después de 0 y 8 horas de isquemia fría, sólo la
melatonina protegió contra la peroxidación lipídica (58.05, 56.88 y 48.58%,
respectivamente). Los datos se expresan como media ± error estándar (n= 8
trasplantes de páncreas por grupo). Se muestran las diferencias significativas (P≤
0.05); * denota vs grupo control, y ** vs grupo tratado con ácido ascórbico.
Resultados
- 78 -
9. RESPUESTA DE LA pMAP/ITIH4 AL TRASPLANTE DE
PÁNCREAS
La media basal (antes del trasplante) de los niveles séricos de pMAP/ITIH4 fueron 1.07
± 0.09 mg/mL en el grupo control, 0.82 ± 0.19 mg/mL en el grupo melatonina y 0.86 ±
0.15 mg/mL en el grupo AA (P> 0,05). Despues del TP se observó un acusado
incremento en la concentración sérica de la proteína en todos los grupos. El incremento
comenzó el día 1, donde fue cinco-seis veces los valores basales, y continuó hasta
alcanzar un pico el día 3. Este pico de la pMAP/ITIH4 alcanzó ocho-nueve veces el
nivel basal en el grupo control (8.72 ± 1.26 mg/mL) y en el grupo AA (9.95 ± 1.86
mg/mL), pero sólo alrededor de 5 veces el nivel basal en el grupo melatonina (5.39±
0.61 mg/mL). Así, en el día 3 postrasplante, la pMAP/ITIH4 en el grupo melatonina fue
significativamente inferior que en el grupo control (P=0.049) y el grupo AA (P=0.021).
La figura 52 ilustra los niveles de pMAP/ITIH4.
Día postoperatorio
Resultados
- 79 -
Figura 52. Concentraciones séricas de la pig-major acute-phase protein/inter--
trypsin inhibitor heavy chain 4 (pMAP/ITIH4) basales y en los cuatro primeros días
después del alotrasplante de páncreas en el cerdo, sin inmunosupresión, con 8 horas
de preservación fría en solución UW. Grupo control (▲) y grupos de tratamiento con
melatonina (●) y ácido ascórbico (■) (n=8 cada grupo). Los datos se expresan como
media ± error estándar. *Denota diferencias estadísticamente significativas (P≤ 0.05)
vs animales controles y animales tratados con ácido ascórbico.
10 ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO
En las reintervenciones de los receptores, realizadas cuando la glucemia era mayor de
150 mg/dL durante dos días consecutivos, los hallazgos fueron constantes: el injerto
pancreático se encontraba endurecido, aumentado de grosor dos-tres veces lo normal, de
color rosa-grisáceo, sin trombosis arterial ni venosa; la anastomosis duodeno-ileal era
normal y sin fugas, pero el duodeno estaba adelgazado y de coloración rosa-purpúrea.
El aloinjerto pancreático-duodenal estaba fuertemente adherido a estructuras vecinas y a
asas intestinales que lo circundaban.
El estudio histopatológico mostró en todos los aloinjertos hallazgos acordes con
rechazo celular agudo, mayoritariamente de grado severo (grado III en la clasificación
con esquema de Banff) (143), con áreas de grado moderado (grado II): inflamación
acinar difusa, con pérdida de estructuras acinares secundarias a necrosis confluente y
fibrosis resolutiva, permeación linfocitaria del epitelio ductal (Figuras 53 y 54), y signos
de arteritis severa, con afectación de capas intimal, medial, y adventicial (Figuras 55 y
56), sin llegar a configurar un cuadro de arteritis necrotizante.
Resultados
- 80 -
Figura 53. Rechazo celular agudo de acuerdo con el esquema de Banff en
aloinjerto de páncreas porcino, sin inmunosupresión, con 8 horas de
preservación fría en solución UW. Pérdida del parénquima exocrino con
infiltrado linfoide y atrofia acinar (hematoxilina-eosina, 400x).
Resultados
- 81 -
Figura 54. Rechazo celular agudo de acuerdo con el esquema de Banff en
aloinjerto de páncreas porcino, sin inmunosupresión, con 8 horas de
preservación fría en solución UW. Infiltrado linfoide ductal y cambios
reactivos asociados (hematoxilina-eosina, 400x).
Resultados
- 82 -
Figura 55. Rechazo celular agudo grado III de acuerdo con el esquema de
Banff en aloinjerto de páncreas porcino, sin inmunosupresión, con 8 horas
de preservación fría en solución UW. Infiltrado linfoide de la pared vascular
reflejando arteritis (hematoxilina-eosina, 400x).
Resultados
- 83 -
Figura 56. Rechazo celular agudo grado III de acuerdo con el esquema de
Banff en aloinjerto de páncreas porcino, sin inmunosupresión, con 8 horas de
preservación fría en solución UW. Detalle de la vasculitis de la capa intima y
medial de un mismo vaso (hematoxilina-eosina, 400x).
Resultados individualizados
- 84 -
V
RESULTADOS INDIVIDUALIZADOS
DE LOS
ALOTRASPLANTES DE PÁNCREAS
EN EL CERDO
Resultados individualizados
- 85 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (1)
Antioxidante Tiempo
preservación Solución
preservación Isquemia caliente
Melatonina 8 horas Viaspan 45 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
119,3 g 112,8 g 105,5 g Muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,4 1,6 2,1 2 LI; 2-3LD 11
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 93 62 59 72 78 84 93 99 101 113 112
Amilasas 849 4279 2941 1337 685 724 635 547 570 560 543
Lipasas 13,8 604,9 397,5 80,2 25,7 14,2 9,4 9,6 8,4 7,4 5,1
Insulina 1,75 15,4 11,9 3,5 3,5 3,6 3,2 2,9 2,6 2,2 1,75
C-péptido 0,1
0,61
0,42 0,23 0,25 0,27 0,27 0,29 0,25 0,23 0,21
PIG-MAP 0,82 2,88 3,17 2,88
Parámetro Día 11 Día 12
Glucemia 148 289
Amilasas 480 439
Lipasas 5 4,7
Insulina 1,70 1,75
C-péptido 0,19 0,11
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,428 0,225 0,364 0,551 Carbonilos 8,864 9,790 10,820 11,385
Resultados individualizados
- 86 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (2)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Melatonina Viaspan 8 horas 55 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
144 g 137,7 g 128,8 g bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
0,90 1,4 1,5 1,5 2-3 LI; 1-2 LD 10
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 87 78 57 51 61 69 97 93 96 112 116
Amilasas 924 8673 5143 2729 1700 1083 814 763 719 619 600
Lipasas 8 470 370,5 258,2 149 81,9 51,4 43 19,8 15,6 11,3
Insulina 1,75 10 4,8 6,5 11,75 2,5 2,3 4 3,9 2,6 1,75
C-péptido 0,1 0,12 0,13 0,28 0,28 0,28 0,29 0,34 0,31 0,3 0,28
PIG-MAP 0,59 5,3 8,19 7,81 4,44
Parámetro Día 11 Día 12
Glucemia 252 318
Amilasas 543 433
Lipasas 10,2 9,6
Insulina 1,75 1,75
C-péptido 0,12 0,14
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,192 0,290 0,158 Carbonilos 6,009 8,207 7,973 6,340
Resultados individualizados
- 87 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (3)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Melatonina Viaspan 8 horas 50 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
106,6 g 100,9 g 97 g Excelente
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,10 1,3 1,75 2 2 LI; 1-2 LD 5
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
Glucemia 76 62 50 68 61 62 195 298
Amilasas 989 8147 2996 1556 763 628 784 627
Lipasas 7,4 444,5 134,5 41,2 15 11,2 10,9 6,9
Insulina 1,75 10,1 2,3 5,5 2,6 5,3 6,3 1,75
C-péptido 0,1 0,29 0,17 0,31 0,18 0,26 0,4 0,1
PIG-MAP 1,08 4,27 6,6 6,8
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MD A + 4HDA 0,206 0,183 0,328 0,593 Carbonilos 8,004 9,583 11,366 9,321
Resultados individualizados
- 88 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (4)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Melatonina Viaspan 8 horas 45 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
115,9 g 112,3 g 105,8 g Excelente
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1 1,4 1,5 1,9 3 LI; 3 LD 30
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 92 64 55 56 78 70 61 69 71 81 81
Amilasas 726 5706 4515 1654 858 582 446 402 379 417 436
Lipasas 14,5 356,6 283,3 85,8 43,5 24 12,3 8,4 6,5 5,6 5,9
Insulina 1,75 12 8,3 4,6 22 6,6 5,1 2,4 4,8 4,6 3,5
C-péptido 0,1 0,24 0,4 0,48 0,85 0,46 0,35 0,4 0,25 0,23 0,15
PIG-MAP 0,55 3,79 4,95 4,44 5,48
Parámetro Día 11 Día 12 Día 13 Día14 Día 15 Día 23 Día 29 Día 30
Glucemia 83 86 104 115 121 110 179 235
Amilasas 440 426 430 437 443 389 350 364
Lipasas 5,7 5,1 5,4 5 5,2 4,7 4,3 4,5
Insulina 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,13 0,37 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,1
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,121 0,126 0,135 0,171 Carbonilos 8,373 11,227 9,482 10,191
Resultados individualizados
- 89 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (5)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Melatonina Viaspan 8 horas 50 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
99,5 g 96,7 g 92,3 g Bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,5 1,7 2 2 LI; 2-3LD 16
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 68 47 48 62 78 85 88 94 97 98 96
Amilasas 433 5818 2696 1491 521 3383 345 386 460 396 384
Lipasas 5,2 271,2 217 151,7 87,7 48,4 32,8 15,1 24,1 29,6 21,8
Insulina 1,75 12,1 8,4 4,7 3,2 6.5 5,5 6,5 3,8 5,1 3,8
C-péptido 0,1 0,51 0,4 0,29 0,22 0,31 0,34 0,39 0,29 0,41 0,27
PIG-MAP 7,4 6,03
Parámetro Día 11 Día 12 Día 13 Día14 Día 15 Día 16 Día 17 Día 18 Día 19
Glucemia 93 110 122 132 99 123 212 259 233
Amilasas 374 383 356 341 315 267 252 212 193
Lipasas 9,5 9,7 8,9 8,6 4,3 4,7 5,1 3,6 3,7
Insulina 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,19 0,16 0,17 0,25 0,16 0,16 0,27 0,1 0,11
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,080 0,068 0,076 0,227 Carbonilos 12,457 11,199 11,378 9,625
Resultados individualizados
- 90 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (6)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Melatonina Viaspan 8 horas 45 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
166,2 g 159 g 148,3 g Excelente
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,8 1,8 2 2-3 LI; 1-2 LD 12
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 68 65 61 73 81 80 89 99 96 87 90
Amilasas 692 7642 3927 955 700 576 505 459 479 493 469
Lipasas 6,9 493,8 250,9 32,1 11,9 7,1 4,7 5,3 4,8 5,2 4,8
Insulina 11,75 16,8 10,5 8,5 4,3 3,3 9,8 10,5 8,6 8,7 8
C-péptido 0,1 0,69 0,4 0,4 0,3 0,21 0,48 0,5 0,66 0,47 0,4
PIG-MAP 1,79 6,03 7 4,44 3.95
Parámetro Día 11 Día 12 Día 13 Día14 Día 15
Glucemia 72 120 201 196 250
Amilasas 452 408 387 394 377
Lipasas 5,2 5,8 7,4 7,1 4,9
Insulina 4,8 5,6 4,4 1,6 1,75
C-péptido 0,31 0,35 0,27 0,21 0,1
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,292 0,311 0,330 0,430 Carbonilos 5,293 6,012 6,469 7,378
Resultados individualizados
- 91 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (7)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Melatonina Viaspan 8 horas 45 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
129,8 g 122,4 g 115,6 g estupendo
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,6 1,6 1,8 1-2 LI; 1 LD 57
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 68 62 61 81 82 86 86 85 82 62 83
Amilasas 865 1647 1226 805 756 712 686 781 863 895 886
Lipasas 5,4 162,7 68,2 18,3 8 6,3 5,1 5,1 5 4,8 4,9
Insulina 1,75 15,5 5,4 12,1 9,1 5,2 7,5 8,3 3 6 4,1
C-péptido 0,1 0,57 0,3 0,66 0,55 0,38 0,52 0,54 0,33 0,35 0,4
PIG-MAP 0,6 4,27 5,85 4,52 3,17
Parámetro Día 11 Día 12 Día 15 Día 30 Día 55 Día 57 Día 58 Día 59
Glucemia 83 71 80 95 147 149 193 234
Amilasas 956 892 851 874 438 457 416 409
Lipasas 4,9 4,9 4,5 4,8 4.9 4,1 4,3 4,1
Insulina 16 8,9 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,81 0,55 0,24 0,27 0,18 0,2 0,11 0,1
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,301 0,263 0,283 Carbonilos 2,492 2,122 2,661 2,843
Resultados individualizados
- 92 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTERICA
EN EL CERDO (8)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Melatonina Viaspan 8 horas 55 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto post-reperfusión
150,2 g 138,9 g 130 g Excelente
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,4 1,8 1,3 1-2 LI; 1 LD 60
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 89 67 66 61 54 42 88 85 84 76 78
Amilasas 1058 12819 5661 2641 1354 878 845 825 778 670 650
Lipasas 5,4 2189,9 611,6 164,9 33,8 18,7 11 8,3 5,7 4,9 4,8
Insulina 1,75 9,3 10,8 11,6 8,6 4,8 3,6 3,9 3,8 3,5 3,6
C-péptido 0,15 0,6 0,6 0,62 0,54 0,33 0,32 0,27 0,34 0,37 0,42
PIG-MAP 0,3 4,77 5,37 4,81 3,85
Parámetro Día 16 Día 17 Día 18 Día19 Día 20 Día 30 Día 50 Día 56 Día 59 Día 60 Día 62
Glucemia 61 90 86 88 89 130 126 102 124 165 175 Amilasas 899 774 821 769 977 1035 1013 788 745 763 756 Lipasas 4,4 4,6 4,6 4,7 4,7 4,6 4 6,2 4,4 4,3 4,1 Insulina 1,75 5,6 1,75 2,2 3 1,75 4 7,1 2,5 4 11 C-péptido 0,47 0,56 0,23 0,34 0,31 0,35 0,28 0,28 0,28 0,28 0,73
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,22 0,203 0,191 0,289 Carbonilos 3,157 4,847 4,068 1,427
Resultados individualizados
- 93 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (9)
Solución preservación
Tiempo preservación Antioxidante
Isquemia caliente
Viaspan 8 horas Ac. ascórbico 55 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
193,3 g 188,3 g 176,3 Bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
- - - - 2 LI; 2-3LD 10
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 74 36 57 49 53 60 86 93 98 116 127
Amilasas 1641 1969 2239 1898 1020 713 654 554 517 487 434
Lipasas 5,9 993 402,3 250,6 127,5 51 34,4 21,6 15 10,4 7,2
Insulina 1,75 14,8 18,4 10,2 4 3,2 2,4 3,9 3,2 2,5 1,75
C-péptido 0,1 0,85 0,96 0,81 0,4 0,44 0,34 0,5 0,51 0,3 0,21
PIG-MAP 1,52 4,73 15,97 16,75 10,41
Parámetro Día 11 Día 12
Glucemia 216 224
Amilasas 389 376
Lipasas 5,4 4,9
Insulina 1,75 1,75
C-péptido 0,11 0,11
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,313 0,324 0,424 0,284 Carbonilos 10,217
11,584
14,534
15,027
Resultados individualizados
- 94 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (10)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 45 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
172,8 g - 148,5 g Muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,3 1,9 1,9 3 LI; 1 LD 15
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 90 36 44 62 66 68 77 75 66 59 80
Amilasas 1067 12.470 7.519 2818 971 679 748 758 708 482 653
Lipasas 4,5 1083,5 437,5 102,8 80,8 73 69 77,4 44 30 20
Insulina 1,75 14,3 9,8 2,9 8 7 10,2 14,5 6,4 13,4 8
C-péptido 0,11 0,44 0,38 0,23 0,38 0,48 0,59 0,47 0,46 0,64 0,64
PIG-MAP 1,29 2,53 7,42 9,04 6,49
Parámetro Día 11 Día 12 Día 13 Día14 Día 15 Día 16 Día 17
Glucemia 78 98 109 114 119 212 280
Amilasas 662 687 729 634 575 537 462
Lipasas 12,8 8,7 6,8 6,5 6,2 5,6 4,1
Insulina 6,5 7,5 13,6 5,4 4,3 2,3 2,2
C-péptido 0,68 0,58 0,38 0,24 0,17 0,11 0,11
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,473 0,445 0,572 0,591 Carbonilos 8,603
9,855
11,891
9,854
Resultados individualizados
- 95 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (11)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 50 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
126 g - 108,6 g Bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,3 1,4 2,1 2,2 4 5
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 85 73 46 59 82 92 156 179 196 199 247
Amilasas 731 7377 4610 3146 2038 1425 846 716 669 393 350
Lipasas 6,4 183,7 423 99,3 58,6 29 18,4 11,5 8 6,3 4,4
Insulina 11,75 14,1 9,6 2,8 8,3 2,5 3 1,75 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,12 0,49 0,28 0,18 0,48 0,36 0,22 0,13 0,1 0,1 0,1
PIG-MAP 0,99 3,65 9,7 4,73
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,361 0,204 0,201 0,455 Carbonilos 8,285
7,196
6,686
5,883
Resultados individualizados
- 96 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (12)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 48 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
125,5 g 121 g 114,9 g Muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1 1,5 1,2 1,7 1 10
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 96 61 58 53 55 67 87 81 79 74 74
Amilasas 609 6004 3.600 1981 1065 744 605 490 462 417 397
Lipasas 5,9 292,1 132,8 50 29 10 6,4 5,3 5,5 5,2 4,5
Insulina 1,75 20,4 24,1 10,7 10,9 7,8 11,2 5,3 6 8,7 5,3
C-péptido 0,1 0,58 0,76 0,45 0,45 0,45 0,45 0,35 0,37 0,37 0,28
PIG-MAP 0,9 6,18 8,95 5,33
Parámetro Día 11 Día 12
Glucemia 216 372
Amilasas 382 348
Lipasas 3,8 4,2
Insulina 6,7 1,75
C-péptido 0,42 0,12
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,440 0,276 0,354 0,441 Carbonilos 0,865
7,381
10,435
8,866
Resultados individualizados
- 97 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (13)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 48 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
85,5 g 80,5 g 74,9 g Muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,3 1,4 2 1,9 3-4 LI; 1 LD 6
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 76 60 46 43 47 68 103 218 238 252 254
Amilasas 609 5586 3831 1823 898 627 803 710 663 625 666
Lipasas 9,2 1011,1 488,9 148 51,8 26 22,3 10,2 7 8 9
Insulina 1,75 8,9 2,3 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,1 0,35 0,14 0,19 0,2 0,16 0,1 0,1 0,1 0,1 0,13
PIG-MAP 0,83 3,3 3,85 2,78
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,106 0,224 0,272 0,435 Carbonilos 9,728
11,160
10,406
10,869
Resultados individualizados
- 98 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (14)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 45 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
122,4 g 115,4 g 105,4 g Bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,3 1,5 1,5 3 LI; 3 LD 5
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 68 63 69 72 74 95 219 239 260
Amilasas 460 5979 2812 1562 368 193 176 191 201
Lipasas 6,7 567,2 193,3 87,3 22,4 11 7,4 5,3 4,7
Insulina 1,75 7,9 3,7 5,7 4,7 1,75 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,1 0,31 0,28 0,26 0,26 0,11 0,1 9,1 0,1
PIG-MAP 0,33 4,91 7,67 5,34
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,197 0,158 0,207 0,408 Carbonilos 6,563
7,468
8,802
1,724
Resultados individualizados
- 99 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (15)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 55 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
128 g 124,2 g 118,8 g Bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,2 1,7 1,9 2 3 LI; 2 LD 7
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 118 40 40 19 54 57 64 87 151 178 204
Amilasas 815 17670 11043 3162 1934 1441 1322 1120 1046 986 780
Lipasas 6,9 950 579 137,8 70 78,2 52 32,7 22,8 15,9 11,1
Insulina 1,75 7,5 3,6 8,7 7,8 3,6 2,5 2,6 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,13 0,21 0,38 0,54 0,55 0,29 0,41 0,41 0,38 0,16 0,1
PIG-MAP 0,47 6,18 8,93
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,271 0,321 0,227 0,342 Carbonilos 4,960
1,872
5,735
4,727
Resultados individualizados
- 100 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (16)
Solución preservación
Tiempo preservación Antioxidante
Isquemia caliente
Viaspan 8 horas Ac. ascórbico 50 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
138,4 g 132,8 g 123,6 g Muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,4 1,45 1,55 2-3 LI; 1-2 LD 17
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 84 22 66 58 73 73 68 64 50 67 68
Amilasas 924 1674 1380 1004 825 768 704 596 649 612 546
Lipasas 5,2 112,5 62 29,8 17,3 27,9 18,8 11,8 12,6 8,8 6,1
Insulina 1,75 29,9 14 5,9 2,5 8,9 4,6 3,5 1,75 2,3 2,1
C-péptido 0,1 1 0,51 0,43 0,4 0,56 0,52 0,35 0,18 0,18 0,18
PIG-MAP 0,53 4,27 8,65 5,08
Parámetro Día 11 Día 15 Día 16 Día17 Día 18 Día 19
Glucemia 68 132 149 145 160 224
Amilasas 536 561 543 490 460 457
Lipasas 7,4 5,8 5,3 5,9 4,7 4,6
Insulina 1,75 2,9 1,75 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,18 0,26 0,11 0,1 0,1 0,1
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,154 0,210 0,260 0,428 Carbonilos
Resultados individualizados
- 101 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (17)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
No Viaspan 8 horas 45 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
143,6 g 143,1 g 131,8 g Muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
0,9 1,5 1,6 2,4 4 LI; 1 LD 11
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 92 46
47 50 53 65 67 71 70 68 89
Amilasas 788 9749 3588 1708 1229 799 696 507 580 453 335
Lipasas 4,6 2084 503,9 154 100,2 50 50 50,1 42 26,2 19,8
Insulina 1,75 6,3 9,2 7,3 5,4 5,8 6,3 6,4 6,4 6,5 5,4
C-péptido 0,11 0,38 0,4 0,4 0,4 0,44 0,36 0,5 0,51 0,55 0,31
PIG-MAP 1,16 4,75 8,86 9,29 7,25
Parámetro Día 11 Día 12 Día 13
Glucemia 125 189 204
Amilasas 339 326 343
Lipasas 9,3 6,4 5,7
Insulina 4,3 1,75 1,75
C-péptido 0,21 0,11 0,11
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA Carbonilos
Resultados individualizados
- 102 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (18)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
No Viaspan 8 horas 40 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
123,3 g 118 g 109,2g muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,2 1,4 1,4 1,4 1 LI; 1 LD 6
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9
Glucemia 85 61 63 78 84 81 80 203 203 272
Amilasas 980 2572 1527 1060 755 705 750 774 631 527
Lipasas 5,7 226,1 92,6 48,1 26,7 18,5 71 51 14 6,2
Insulina 1,75 14,2 5,8 8,9 10,4 6,7 8,1 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,1 0,83 0,38 0,5 0,54 0,41 0,46 0,16 0,1 0,1
PIG-MAP 0,68 3,29 5,5 5,57 4,15
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA Carbonilos
Resultados individualizados
- 103 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (19)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación No Viaspan 8 horas
Isquemia caliente
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
50 min 125 g 118 g 99,3 g Bueno, gran edema
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,5 2,1 2,3 4 LI; 4 LD 12
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 80 75 62 62 84 80 77 86 84 66 51
Amilasas 1.005 11.481 6350 2283 731 529 836 847 750 860 677
Lipasas 5,9 748,2 415,9 85,1 33,3 19 25,4 24,4 23,3 66,6 72,9
Insulina 1,75 20,4 5,3 1,75 6,2 5,2 4,2 8,5 5,1 6 5,3
C-péptido 0,12 0,85 0,42 0,28 0,34 0,38 0,47 0,48 0,38 0,55 0,31
PIG-MAP 1,45 10,69 14,12 13,23 5,42
Parámetro Día 11 Día 12 Día 13
Glucemia 99 135 210
Amilasas 534 576 497
Lipasas 23,2 8,3 5,5
Insulina 4,6 4 3,8
C-péptido 0,34 0,11 0,11
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA Carbonilos
Resultados individualizados
- 104 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (20)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
no Viaspan 8 horas 60 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
152 g 147,2 g 141,1 g Bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1 1,8 1,7 1,5 4 LI; 0 LD 9
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 81 58 48 39 40 44 50 67 95 120 210
Amilasas 988 7821 3239 1836 899 699 613 643 651 529 391
Lipasas 5,7 775,4 264,7 138,1 54,4 43,7 20,5 20,9 20,8 21,1 16
Insulina 1,75 10,1 25,1 1,75 3,4 5,1 9,5 4,1 4,1 3,1 2,5
C-péptido 0,3 0,39 0,71 0,1 0,23 0,22 0,42 0,31 0,3 0,23 0,21
PIG-MAP 0,91 9,89 12,36 14,57 10,29
Parámetro Día 11
Glucemia 234
Amilasas 374
Lipasas 7,4
Insulina 1,75
C-péptido 0,1
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,297 0,343 0,329 0,406 Carbonilos 8,674
8,350
8,368
8,220
Resultados individualizados
- 105 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (21)
Solución preservación
Tiempo preservación Antioxidante
Isquemia caliente
Viaspan 8 horas No 55 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
101,2 g 99 g 94,1 g Muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
- - - - 2 LI; 2-3LD 6
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9
Glucemia 91 68 61 67 73 85 124 203 240 267
Amilasas 746 3766 1774 913 768 556 496 430 380 405
Lipasas 13,3 651,6 287,7 108,7 61,8 35 21 19,6 15,9 13,4
Insulina 1,75 11,8 5,9 6,6 5 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,11 0,4 0,27 0,41 0,34 0,38 0,16 0,1 0,13 0,11
0,1PIG-MAP 1,02 4,91 9,5 5,41 4,73
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA Carbonilos
Resultados individualizados
- 106 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (22)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
No Viaspan 8 horas 54 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
124,3 g 122,4 g 114,8 g Muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1 1,5 1,3 1,8 1 LI; 1 LD 7
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 101 71 71 76 72 79 87 118 277 281 282
Amilasas 1081 8340 6025 2983 1275 872 711 836 727 778 575
Lipasas 7,5 1035,8 905,1 534,6 118,8 71,8 81,3 69 69 20,3 14,8
Insulina 1,75 28 5,1 10,5 8 2,1 5,6 6,3 3,5 1,9 1,75
C-péptido 0,12 0,25 0,17 0,36 0,43 0,34 0,41 0,68 0,38 0,16 0,1
PIG-MAP 0,83 4,33 4,98 6,41 4,98
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,492 0,528 0,528 0,701 Carbonilos 8,280
8,701
8,085
7,971
Resultados individualizados
- 107 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (23)
Solución preservación
Tiempo preservación Antioxidante
Isquemia caliente
Viaspan 8 horas No 40 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
184,8 g 175,1 g 166,2 g Muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,5 1,2 1,9 1,8 2-3 LI; 2-3LD 8
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
Glucemia 96 32 62 71 79 79 82 71 93 218 228
Amilasas 867 9268 5165 1702 879 561 499 413 393 444 484
Lipasas 15,6 1851,8 857,2 139,6 41,3 16 11,6 8 6,3 6 4,9
Insulina 1,75 4,6 31,6 7 8,6 5,9 6,2 7,3 5,3 3,3 2,6
C-péptido 0,12 0,28 0,95 0,35 0,42 0,34 0,34 0,59 0,32 0,26 0,16
PIG-MAP 1,37 5,5 8,39 9,24
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,468 0,220 0,386 0,582 Carbonilos 6,714
6,883
11,120
7,401
Resultados individualizados
- 108 -
ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA
EN EL CERDO (24)
Antioxidante Solución
preservación Tiempo
preservación Isquemia caliente
No Viaspan 8 horas 60 min
Peso injerto tras extrac.
Peso injerto tras lavado
Peso injerto tras preserv
Aspecto injerto postreperfusión
167,4 g 157,6 g 147,2 g muy bueno
LI (cm) ant-post donante
LD (cm) ant-post donante
LI ant-post post-reperfusión
LD ant-post post-reperfusión
Grado edema 0, 1, 2, 3, 4
Días normogluc.
1,1 1,4 1,5 1,8 2 LI; 2 LD 6
Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8
Glucemia 91 57 72 70 66 85 135 277 322
Amilasas 814 1808 1303 819 499 358 352 344 313
Lipasas 7,2 664,8 421,6 118,3 32 24,6 17,8 8,3 7,4
Insulina 1,75 7,6 23,7 7,8 9,8 9,7 1,75 1,75 1,75
C-péptido 0,18 0,52 0,85 0,61 0,56 0,57 0,16 0,23 0,21
PIG-MAP 1,13 5,22 5,22 6,07 4,89
Parámetro
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,508 0,449 0,445 0,593 Carbonilos 10,394
9,779
8,867
10,280
Discusión
- 109 -
VI DISCUSIÓN
Discusión
- 110 -
MODELO QUIRÚRGICO EXPERIMENTAL
1. Animal de experimentación
Hemos empleado el cerdo en nuestro modelo experimental de alotrasplante pancreático-
duodenal con derivación entérica de la secreción exocrina y drenaje venoso sistémico.
El empleo de un animal de experimentación de especie grande, por su mayor simi-
litud con la especie humana, permite que los resultados obtenidos en el laboratorio estén
más próximos a ser extrapolables a la clínica.
La mayoría de los TP experimentales en grandes animales han sido realizados en
perros y en cerdos. Desde el primer trasplante experimental funcionante realizado en
1957 por Lichtenstein y Barschak (149) hasta el año 1990 el modelo canino ha sido el
más ampliamente utilizado (8). Luego, al menos en los paises occidentales, el modelo
porcino ha adquirido una mayor preponderancia por razones anatómicas, fisiológicas y
prácticas.
El cerdo ofrece numerosas ventajas. Es un animal de cómodo manejo, fácil de
obtener en granjas autorizadas a un precio asequible, su aporte nutritivo es simple pues
está habituado a los piensos comerciales y alcanza un peso óptimo en breve plazo de
tiempo. Muchos órganos y sistemas de esta especie, así como las respuestas fisiológicas
y fisiopatológicas, se asemejan a la especie humana. La anestesia no ofrece grandes
dificultades. El catéter de la yugular externa, que sistemáticamente colocamos, puede
mantenerse durante un periodo prolongado, lo que facilita las extracciones sanguíneas y
la administración de fármacos.
El páncreas es compacto, de estructura bien definida; su anatomía y las relaciones
con otras vísceras guardan cierta semejanza a las del hombre y, presentando como en
éste alguna complejidad, permite adquirir y mantener una buena destreza quirúrgica.
Discusión
- 111 -
Por último, debido a que la diabetes mellitus tipo 1-like espontánea es muy rara en
los cerdos, la diabetes debe ser inducida quirúrgica o químicamente (150); en el cerdo la
pancreatectomía total para inducir la diabetes nos parece el procedimiento más eficaz y
puede efectuarse conservando el duodeno y su irrigación (33, 141, 151, 152).
2. Procedimiento quirúrgico
Nuestro modelo experimental se asemeja al tipo de TP clínicamente más utilizado en la
actualidad. La técnica que empleamos tiene varias fases bien definidas:
1. Extraemos en el animal donante un injerto que incluye la totalidad del páncreas,
un segmento de duodeno donde desembocan los conductos pancreáticos, un
pedículo arterial constituido por un parche aorta que incluye el TC y la AMS, y
un pedículo venoso con las venas mesentérica superior, esplénica y porta.
El 99% de los TP clínicos se realizan actualmente con un injerto total de
páncreas y un segmento duodenal (2ª-3ª porciones) donde drenan los conductos
pancréaticos (1). El injerto segmentario, que comprende el cuerpo y la cola de
páncreas vascularizados por los vasos esplénicos, prácticamente no se utiliza en
la clínica humana salvo en el trasplante de donante vivo, que sólo representa el
1% de todos los TP (1, 48).
2. Efectuamos “ex situ” la perfusión-lavado del injerto con la solución fría de
preservación. En este estudio, el tiempo de almacenamiento frío ha estado en
torno a las 8 horas y la solución de preservación utilizada ha sido la de la
Universidad de Wisconsin (UW).
El páncreas, por su peculiar microarquitectura, es particularmente lábil a las
maniobras de extracción y perfusión. El edema se desarrolla rápidamente incluso
después de una manipulación quirúrgica menor. El flujo sanguíneo a través del
Discusión
- 112 -
parénquima es bajo y una elevación en la presión de perfusión durante el lavado
puede causar edema y disrupción del endotelio vascular. El tejido exocrino
parece ser más susceptible a la lesión de preservación que el tejido endocrino.
Tanto experimental como clínicamente, la perfusión del injerto pancreático-
duodenal con la solución fría de preservación puede realizarse in situ, que es lo
habitual en una extracción multiorgánica de un donante en muerte encefálica, o
bien ex situ una vez extraído el injerto y colocado en un recipiente estéril, como
se hace en caso de trasplante de donante vivo.
En la extracción aislada del páncreas en el cerdo nos parece mejor la
perfusión ex situ del injerto y así procedemos en nuestro modelo experimental.
La perfusión se efectúa a través del TC y de la AMS con la solución de
preservación a 4ºC, infundida por la acción de la gravedad a una altura de 80-
100 cm y con un volumen suficiente (150-200 cc) hasta que el líquido que drena
a través de la vena porta sale completamente limpio. Con la perfusión ex situ se
puede observar la velocidad del goteo, el inmediato retorno por la vena porta y el
limpio aspecto del líquido frío de preservación y la decoloración del páncreas
(153).
La perfusión y el almacenamiento frío los hemos realizado con la solución
de preservación UW que es la estándar y universalmente aceptada en la
preservación de órganos abdominales. Descrita en 1986 por Folkert O. Belzer y
James H. Southard en la Universidad de Wisconsin (154), fue diseñada
inicialmente para la preservación experimental del páncreas canino,
consiguiendo una supervivencia del 100% de los animales con 72 horas de
isquemia fría (155). La solución UW es el paradigma de las “soluciones
intracelulares” así denominadas por poseer una composición electrolítica
Discusión
- 113 -
parecida a la que existe en el interior de las células, con una elevada
concentración de potasio y baja en sodio. La solución UW fue formulada para
contrarrestrar los efectos perjudiciales clásicamente descritos del almacena-
miento frio y de la reperfusión: edema celular, expansión del espacio intersticial,
acidosis intracelular, reducción del metabolismo energético celular y generación
de RL derrivados del oxígeno (156). Así, contiene lactobionato y rafinosa para la
prevención del edema celular, hidroxietil-almidón para luchar contra la
expansión del espacio intersticial, fosfato potásico como sustancia tampón
(buffer) para contrarrestar la acidosis intracelular, glutation y alopurinol para la
prevención del daño por RL de oxígeno, y adenosina para proporcionar sustratos
en la regeneración de los fosfatos de alta energía (157).
3. Revascularizamos el alotrasplante pancreático-duodenal anastomosando el TC y
la AMS con parche aórtico de Carrel del injerto a la aorta infrarrenal del
receptor.
Experimentalmente en el cerdo es mucho mejor efectuar la anastomosis entre el
pedículo arterial del injerto y la aorta infrarrenal del receptor que con la arteria
iliaca. Las arteria ilíacas porcinas son de poco diámetro y por tanto el riesgo de
trombosis es muy alto si la anastomosis arterial se realizara con cualquiera de
ellas. Preferimos utilizar el tramo infrarrenal de la aorta receptora por buena
ubicación, gran amplitud de la luz de la anastomosis y muy buen aporte
sanguíneo. De esta manera, en este estudio no se ha presentado caso alguno de
trombosis arterial del injerto.
4. Realizamos el drenaje venoso en la circulación sistémica, practicando la
anastomosis de la porta del injerto con la cava infrarrenal del receptor.
Discusión
- 114 -
En la mayoría de los TP realizados en el mundo los injertos se han colocado
heterotópicamente en la pelvis con anastomosis de los vasos del injerto a la
arteria y a la vena iliaca receptora, por tanto, con aflujo venoso en la circulación
sistémica.
En nuestro modelo experimental el drenaje venoso también ha sido efectuado en
la circulación sistémica, pero practicando la anastomosis de la porta del injerto
en la cava infrarrenal del receptor en lugar de realizarlo en la vena iliaca que es
con la que habitualmente se efectúa. Preferimos realizar la anastomosis en la
cava infrarrenal receptora porque se confecciona de manera más sencilla, el
injerto queda mejor ubicado en la cavidad peritoneal, con menos compromiso de
espacio, es más fácil su manipulación, se obtiene gran amplitud de anastomosis
y muy buen drenaje venoso. Así, no hemos observado caso alguno de trombosis
venosa del injerto en nuestro modelo.
En la clínica, los TP con derivación de la secreción exocrina a vejiga urinaria se
realizan con drenaje venoso sistémico, mientras que los TP con derivación
entérica pueden realizarse con drenaje venoso sistémico o portal. La tasa de
drenaje venoso portal se ha incrementado del 6% en 1995 al 18% en 2001, pero
sólo supone todavía el 24% de los TP con drenaje entérico (32, 158).
5. El drenaje entérico de la secreción exocrina del páncreas lo efectuamos mediante
anastomosis látero-lateral del duodeno del injerto a un asa ileal del receptor.
El TP tiene la particularidad de que la masa insular, fundamento del trasplante,
sólo supone menos del 5 % de la glándula pancreática. El objetivo del trasplante
no radica en el tejido exocrino del injerto y, sin embargo, es causa de
importantes complicaciones después del mismo. Se han realizado grandes
esfuerzos en el manejo quirúrgico del componente exocrino del injerto.
Discusión
- 115 -
En nuestro modelo actual de TP en el cerdo hemos empleado el drenaje entérico
de la secreción exocrina mediante la anastomosis látero-lateral del duodeno del
injerto a un asa ileal del receptor. La elección de este procedimiento se justifica
por ser un procedimiento sencillo, relativamente fisiológico, que no ocasiona
problemas en nuestra experiencia experimental y que se adapta a la tendencia
más extendida en la época actual.
Además de los beneficios antes señalados, el drenaje entérico en el TP porcino
tiene la ventaja añadida de que se vierten los fermentos pancreáticos al intestino,
con lo que no se requiere el aporte oral de los mismos para compensar la
insuficiencia pancreática exocrina provocada por la exéresis del páncreas nativo
del receptor, que sistemáticamente realizamos con objeto de que la secreción de
insulina dependa exclusivamente de la función del injerto.
6. Efectuamos en el animal receptor una pancreatectomía total con conservación
del duodeno para que la única fuente de insulina sea la proporcionada por el
aloinjerto de páncreas.
La pancreatectomía del órgano nativo es la mejor forma de inducir la diabetes y,
dadas las características anatómicas del páncreas y duodeno porcinos, se puede
extirpar la totalidad de la glándula pancreática respetando la integridad del
duodeno y su vascularización. Requiere el procedimiento cierta meticulosidad
pero es perfectamente factible (151). En nuestra experiencia y en el presente
estudio, la pancreatectomía para inducir la diabetes no se ha seguido de
complicación alguna permaneciendo el duodeno del receptor perfectamente
viable a lo largo de todo el seguimiento.
Discusión
- 116 -
3. Procedimiento anestésico
Como hemos mencionado en líneas anteriores, en la actualidad la mayoría de los TP
experimentales en grandes animales se realizan en cerdos (152); muchos órganos y
sistemas de esta especie, así como las respuestas fisiológicas y fisiopatológicas, se
asemejan a los del hombre. Sin embargo, el empleo del cerdo en investigación
biomédica es costoso en personal, espacio y equipamiento técnico. Por otra parte, el TP
en el cerdo puede requerir bastante tiempo, de 3 a 4 horas. En consecuencia, se requiere
un procedimiento anestésico seguro y eficaz, que evite muertes intraoperatorias o en el
postoperatorio inmediato que supondrían un gasto improductivo y una pérdida de los
objetivos de los distintos estudios (159-161).
El cerdo se considera difícil de inmovilizar y anestesiar comparado con otras
especies animales. La falta de cooperación en la inmovilización física del cerdo hace
necesaria la administración de fármacos que proporcionen la sedación adecuada para el
manejo del mismo (162). Para obtener este propósito, en estudios anteriores se ha
empleado la asociación tiletamina/zolazepam (Zoletil) junto a otro antagonista alfa-2-
adrenérgico, como la xilacina (162, 163), pero en pocos estudios se ha asociado
tiletamina/zolazepam con medetomidina (Domtor) (164).
Los resultados obtenidos en nuestro modelo demuestran la gran eficacia y
seguridad de la técnica anestésica practicada, aunque los descensos observados en la
presión arterial y la temperatura sugieren que la misma puede mejorarse.
La premedicación intramuscular asociando tiletamina/zolazepam/medetomidina
consigue la inconsciencia del animal en 1-2 minutos, manteniéndola el tiempo necesario
para efectuar la intubación endotraqueal y la cateterización intravenosa (162, 163, 165).
Esta asociación permite cierto grado de analgesia por el efecto de la tiletamina, fármaco
disociativo de la familia de las fenciclidinas, a la que pertenece también la ketamina, por
Discusión
- 117 -
antagonización de los receptores del ácido N-metil-D-aspártico (NMDA). Además, su
administración conjunta con el zolazepam, de la familia de las benzodiazepinas, permite
una relajación muscular adecuada (1162, 163) con una duración de efecto mayor que
otras similares como el midazolam o el diazepam, sin necesidad de emplear agentes
bloqueantes neuromusculres durante el periodo postoperatorio. La asociación de
tiletamina/zolazepam/medetomidina (Zoletil® + Domtor®) potencia la inmovilidad y
contención del animal para acceder a una IV sin movimientos. La medetomidina posee
efecto analgésico al ser un antagonista alfa-2-adrenérgico (166-170), potenciando la
acción de los anestésicos inhalatorios, como el empleado en nuestro método, el
sevoflurano. Esto aporta una disminución de la dosis de sevoflurano espirada (2,0-
2,1%), necesaria para el mantenimiento anestésico seguro y eficaz, y reduce de un 20 a
un 25% su concentración alveolar mínima, que en la especie porcina es 2,66% (171,
172). De esta forma, evitamos el riesgo de sobredosificación de anestésico, además de
disminuir la aparición de efectos adversos y, por tanto, de complicaciones. Por otra
parte, la medetomidina cuenta con antagonista, el atipamezol, que se puede administrar
en caso de aparición de efectos adversos, como una bradicardia intensa.
La dosis de propofol, como agente anestésico intravenoso inductor, hubiera sido de
3-10 mg/kg, pero ha sido evitada o reducida al mínimo, gracias al empleo inicial de la
premedicación, permitiendo una pérdida de consciencia rápida en el animal y unas
condiciones óptimas para la intubación endotraqueal.
Al contrario que en otros modelos (173), no ha sido preciso el empleo de agentes
bloqueantes neuromusculares durante la anestesia, ni mayor grado de profundidad de la
misma, para realizar la intubación, favorecido por la administración de la premedicación
anestésica.
Discusión
- 118 -
El mantenimiento anestésico, asociando sevoflurano por vía inhalatoria y fentanilo
en perfusión continua, como analgesia intraoperatoria, ha conseguido mantener al
animal cardiaca y hemodinamicamente dentro de los límites considerados como
normales en todo momento, con ausencia de dolor y una relajación aceptable a lo largo
de la intervención, a pesar de no administrar agentes bloqueantes neuromusculares, y
adaptándose a la ventilación mecánica, necesaria para mantener la normocapnia durante
el procedimiento.
La frecuencia cardiaca disminuyó puntualmente en el minuto 60, sólo explicable
por reflejo de un estímulo vagal intenso en la primera hora de cirugía.
La disminución de la presión arterial a partir del minuto 120 indica que el descenso
de la misma es debido, más que a la acción sinérgica de los fármacos anestésicos
empleados, al fin del efecto de la atropina (duración de la acción de 60 a 90 minutos)
administrada en la premedicación (174). Por otra parte, también sugiere que se pueda
reducir las dosis tanto de sevoflurano como de fentanilo durante el mantenimiento
anestésico. Así, se puede evitar ese descenso significativo de la presión arterial. Futuros
trabajos son necesarios para contrastar esta hipótesis.
También, a pesar de disponer de un medio para preservar la temperatura corporal,
como una manta térmica, se aprecia que en anestesias de larga duración, en este estudio,
disminuyó la temperatura a partir del minuto 60, aunque dentro de los rangos clínicos,
hasta el final de la misma, pero que después recuperó sus valores basales durante el
periodo postoperatorio inmediato.
Al finalizar la anestesia con el cierre del vaporizador de sevoflurano y el cese de la
infusión de fentanilo, los animales recuperaron de forma progresiva los reflejos y
función respiratoria, levantándose a las 2-3 horas. La farmacocinética particular del
sevoflurano, con un mínimo metabolismo hepático (3%) y una una baja solubilidad en
Discusión
- 119 -
sangre (0,68) (172), favorece una rápida eliminación por vía inhalatoria, que permite
una rápida y suave educción anestésica. Esto contrasta con experiencias previas con
otros agentes anestésicos, como el isoflurano, en las que los animales presentaban de
forma casi sistemática agitación importante al despertar.
El ritmo de infusión del fentanilo (5,7 mcg/kg/hora), durante el periodo
intraoperatorio, ha sido inferior al que hubiéramos necesitado para obtener los mínimos
requerimientos analgésicos en una intervención de TP. En ausencia de premedicación
anestésica, la dosis de infusión de fentanilo podría haber alcanzado los 25 mcg/kg/hora
(175). Esto es debido a que se ha empleado, en conjunto, un método de analgesia
multimodal o polimodal al asociar tiletamina, medetomidina (estos fármacos como
analgesia previa o anticipada) y fentanilo, con diferentes mecanismos de acción que
sinergian sus acciones. Por ello, obtenemos el beneficio de reducir la dosificación del
fentanilo y, por tanto, disminuimos el riesgo de aparición de efectos adversos debidos al
mismo.
Como analgesia en el postoperatorio inmediato hemos empleado buprenorfina,
primera dosis administrada por vía intramuscular y seguida de la liberación continua a
partir de un parche transdérmico (Transtec® 35 mcg/hora), que revierte el efecto
depresor respiratorio no deseado del fentanilo, sin modificar e incluso potenciando los
efectos analgésicos. Esto es debido a que al ser agonista parcial, compite por los
receptores mu, al igual que el fentanilo como opioide agonista puro, pero a su vez, se
une a los receptores kappa como antagonista, proporcionando una analgesia de efecto
prolongado, y evitando los efectos adversos del fentanilo (160-161), de los cuales es la
depresión respiratoria la más indeseable.
En conclusión, la asociación tiletamina/zolazepam/medetomidina, como
premedicación de cerdos sometidos a cirugía de TP, permite reducir, de forma segura y
Discusión
- 120 -
eficaz, los requerimientos necesarios de sevoflurano y fentanilo durante la anestesia
general. Aunque la presión arterial y la temperatura disminuyeron durante el
mantenimiento anestésico, todos los parámetros se mantuvieron dentro de los límites
considerados como normales.
INFLUENCIA DE LA MELATONINA EN LA EVOLUCIÓN DEL
ALOTRASPLANTE DE PANCREAS EN EL CERDO
Durante la última década se han realizado grandes progresos en el campo del trasplante
de órganos sólidos. Sin embargo, el daño por IR sigue siendo uno de los principales
obstáculos. Durante el procedimiento del trasplante el injerto sufre las consecuencias
deletéreas de la IR, fenómeno por el cual el daño celular en un órgano hipóxico se
acentúa tras la restauración del flujo sanguíneo y el aporte de oxígeno (176).
Numerosos trabajos recientes han demostrado el efecto protector de la melatonina
en diferentes condiciones experimentales de IR y en varios órganos como riñón (177-
179), páncreas (112, 113), corazón (180, 181), hígado (102, 103 182) e intestino (100,
183). El páncreas endocrino es especialmente vulnerable a los efectos deletéreos de las
EROs porque recibe un alto caudal de sangre y oxígeno comparado con otros tipos de
tejido (184) y porque las células beta no poseen una fuerte defensa antioxidante (185).
El trasplante de páncreas presenta mayor tasa de complicaciones denominadas técnicas
que cualquier otro tipo de trasplante (186). Dos estudios recientes establecieron que la
melatonina proporciona una protección eficiente frente a la pancreatitis y a la necrosis
inducida por el clampaje de la arteria esplénica seguida de reperfusión (112, 113).
Además, la melatonina mostró efectos protectores en al menos dos modelos ex vivo. El
primero fue en corazones aislados de ratas Wistar donde la melatonina mejoró la
Discusión
- 121 -
recuperación de la función cardiaca y la respuesta vasodilatadora coronaria (187). El
segundo fue en hígados esteatósicos y no esteatósicos de ratas Zucher, donde la
melatonina redujo la actividad de la alanino y la aspartato aminotransferasa en los
fluidos excretados, aumentó el débito biliar y redujo las resistencias vasculares (188).
Estos modelos experimentales in vivo de isquemia (oclusión arterial y posterior
reperfusión) y los sistemas ex vivo que permiten la recolección de los fluidos efluentes
de un órgano son útiles para predecir la lesión del órgano y comprobar el valor potencial
de las moléculas antioxidantes y los fármacos en la prevención del daño de IR. Hay, sin
embargo, una crítica a estos modelos porque reproducen pocos paradigmas
experimentales. Esto limita las conclusiones basadas en estos modelos comparados con
los obtenidos en el más amplio contexto experimental del trasplante de órganos.
En nuestro estudio hemos encontrado en la evolución postrasplante que todos los
receptores del aloinjerto pancreático mostraron una tendencia a la hipoglucemia en los
primeros días del postoperatorio. Esto se acompañó de una pronunciada elevación de los
niveles sérivos de insulina, c-péptido, amilasa y lipasa en el primer día postperatorio
seguido de una reducción posterior. La hipoglucemia inicial con hiperinsulinemia es
típica en el TP con drenaje venoso del injerto en la circulación sistémica (189-192) y se
atribuye principalmente a la pérdida del primer paso hepático en el aclaramiento de la
insulina (190). En condiciones fisiológicas, la insulina secretada por los islotes de
Langerhans se libera en la circulación portal y alcanza directamente el hígado que
extrae alrededor del 50% de la insulina en este primer paso hepático. En el TP con
drenaje venoso del injerto en la circulación sistémica falta este primer paso hepático de
la insulina lo que conduce a hiperinsulinemia periférica, incremento de la captación de
glucosa por el músculo, descenso de la gluconeogénesis hepática y liberación de
glucosa (190), efectos responsables de la tendencia a la hipoglucemia observada en los
Discusión
- 122 -
primeros días después del trasplante. La elevación precoz de la amilasa y lipasa séricas
se atribuye a los efectos de la IR y a la manipulación del páncreas en el donante y
receptor (152, 193, 194]. Aunque no hubo diferencias significativas en los picos de
lipasa sérica, la melatonina redujo los niveles de esta enzima en un 40% cuando se
comparó con el grupo control.
El principal hallazgo de este estudio ha sido que en el grupo de animales a los que
se administro melatonina, pero no AA, tanto antes como diariamente durante una
semana postrasplante, mantuvieron la normoglucemia durante un periodo de tiempo tres
veces mayor que el grupo control. Así, la melatonina prolongó la supervivencia del
trasplante y retrasó la aparición del RA. Estos datos coinciden con los presentados por
Lin y col. (195) quienes demostraron que la administración de melatonina prolongaba la
supervivencia del injerto de islotes en ratones diabéticos no obesos. Nuestros resultados
están de acuerdo también con otro estudio que documentó que la melatonina prolongaba
la supervivencia del aloinjerto cardíaco en ratas (135). En estos estudios el tratamiento
con melatonina modificó las vías de respuesta inmune celular y humoral, al inhibir la
proliferación de linfocitos T helper y reducir la síntesis de inmunoglobulinas
aloespecíficas.
Los resultados de nuestro estudio plantean la cuestión de por qué el tratamiento con
melatonina durante un corto periodo de tiempo puede retrasar el RA y mejorar la
evolución del injerto a largo plazo. Aunque el impacto de los factores no inmunológicos
en el desarrollo del rechazo no está resuelto, hay creciente evidencia de que la IR puede
aumentar la inmunogenicidad del injerto y llevar a una lesión del mismo más allá del
período de reperfusión (196). El daño del aloinjerto por las EROs y ERNs durante la
reperfusión post-isquémica activa la respuesta inmune innata del receptor que puede
iniciar e inducir la respuesta adaptativa aloinmune con activación de las células T y
Discusión
- 123 -
llevar al desarrollo del RA (56). La melatonina, capaz de proteger el aloinjerto
pancreático contra la IRI por su potente acción antioxidante y barredora de RL, podría
atenuar la respuesta innata del receptor, retrasar el desarrollo del RA y prolongar la
supervivencia del injerto.
Hay consenso acerca de que las lesiones por IR constituyen uno de los principales
problemas del TP. Aunque la patogenia de estas lesiones incluye un gran número de
mecanismos complejos, los RL juegan un papel clave (57, 61, 197). En este estudio
demostramos que la melatonina reduce los niveles acumulados de MDA + 4-HDA y
previene peroxidación lipídica en los homogenados de los aloinjertos pancreáticos. Del
mismo modo, estudios previos mostraron que la melatonina disminuye la formación de
MDA tras el trasplante autólogo intraperitoneal de ovario en ratas sin isquemia fría; este
efecto fue aun más eficiente que con la oxitetraciclina (198). Resultados similares
también han sido descritos en el trasplante de pulmón (138) y riñón (139) en ratas.
Numerosos estudios en una amplia variedad de modelos bioquímicos y
toxicológicos han desvelado los mecanismos moleculares de las propiedades
antioxidantes de la melatonina. En primer lugar, la melatonina es un “barredor” de RL
que funciona a través de la donación de electrones para detoxificar los radicales
hidroxilo y peroxilo (97, 98). Segundo, la melatonina estimula varias enzimas
relacionadas con el sistema de defensa antioxidante (199) e inhibe otras enzimas
involucradas en la producción de RL (200). Tercero, la indolamina estabiliza la
membrana celular y mitocondrial contra la peroxidación lipídica inducida por el estrés
oxidativo (201). Finalmente, se ha descrito que la melatonina incrementa la eficiencia
de la fosforilación oxidativa al mejorar la actividad de los complejos mitocondriales I y
IV y, por tanto, fomentando la síntesis de ATP y reduciendo la formación de EROs
(202).
Discusión
- 124 -
En las condiciones experimentales de nuestro modelo de TP, la melatonina fue más
potente que el AA en la reducción de la peroxidación lipídica. La melatonina redujo de
forma significativa las concentraciones de MDA + 4-HDA en comparación con el grupo
control durante la obtención del injerto, alamacenamiento hipotérmico e implante. Por
el contrario, comparado con el efecto antioxidante de la melatonina, el AA sólo limitó
de forma parcial la peroxidación lipídica durante el implante del injerto. Esta
observación coincide con otros trabajos que describen cómo la melatonina fue más
potente que el AA en la protección contra las arritmias cardiacas inducidas por la IR al
disminuir la gravedad y reducir tanto la incidencia como la duración (203). Una
potencial base molecular para estas observaciones es que la actividad protectora de la
melatonina puede ser debida a la molécula en sí y a sus metabolitos. Así, la capacidad
de la melatonina para reducir el daño oxidativo se ve reforzada por los metabolitos
producidos durante el proceso de depuración de los RL (204).
También hemos evaluado el daño oxidativo a las proteínas. Estas constituyen
aproximadamente el 68% del peso seco de las células y tejidos (205), siendo por lo
tanto un blanco importante para el daño oxidativo. Los RL atacan a las proteínas
produciendo cambios en su estructura química que conllevan una disminución de su
actividad e incluso la pérdida total de su función. Las alteraciones bioquímicas que
producen los RL en las proteínas incluyen oxidaciones de las cadenas laterales, ruptura
de la secuencia de aminoácidos, formación de enlaces cruzados, cambios de
conformación, alteración de la hidrofobicidad y adquisición de otros grupos reactivos
como por ejemplo la 3,4-dihidroxifenilalanina, los hidroperóxidos y los carbonilos
(206-209).
En nuestro trabajo se ha cuantificado la aparición de los grupos carbonilos como
indicador bioquímico de la oxidación de las proteínas de la membrana celular. Para ello,
Discusión
- 125 -
se han utilizado las muestras tisulares pancreáticas obtenidas basalmente antes del
clampaje en el donante, después de la perfusión-lavado del injerto, tras 8 horas de
preservación hipotérmica pancreática y a los 30 minutos de la revascularización del
injerto. Hemos observado que los restos carbonilos de las proteínas experimentan una
moderada elevación después del lavado-perfusión del injerto y tras el tiempo de
preservación de 8 horas, por tanto, durante el periodo de isquemia fría. Sin embargo, no
se ha podido demostrar un incremento de los restos carbonilos después de la
revascularización del injerto pancreático.
La variedad de reacciones que se pueden generar en el estrés oxidativo es muy
elevada debido a que las proteínas son estructuras muy grandes y complejas,
compuestas por un gran número de aminoácidos. Aunque los RL pueden reaccionar con
otras macromoléculas celulares in vitro, los ácidos grasos poiinsaturados de los lípidos
parece ser la diana preferida in vivo durante la reperfusión post-isquémica (210). En
nuestro estudio, a pesar de la evidencia de la peroxidación lipídica en la isquemia fría y
reperfusión del injerto pancreático, las proteínas no muestran aumento en el contenido
de carbonilos tras la reperfusión.
RESPUESTA DE FASE AGUDA EN EL ALOTRASPLANTE DE
PÁNCREAS EN EL CERDO EVALUADA POR LAS CONCEN-
TRACIONES SÉRICAS DE LA pMAP/ITIH4. INFLUENCIA DEL
TRATAMIENTO CON MELATONINA
La respuesta de fase aguda (RFA) es una reacción generalizada y compleja de un
organismo frente a la inflamación, las infecciones y/o el daño tisular. Un rasgo
destacado de esta respuesta es el aumento en la síntesis hepática de las denominadas
proteínas de fase aguda (PFA), término utilizado para designar las proteínas que
Discusión
- 126 -
modifican su concentración plasmática en un 25 por ciento o más como consecuencia de
estímulos inflamatorios (211). Las PFA son biomarcadores inespecíficos pero muy
sensibles, cuya concentración plasmática se modifica incluso antes de la aparición de
los primeros síntomas clínicos. Por esta razón, además de reflejar fielmente la evolución
de los procesos patológicos, pueden servir también como marcadores precoces de los
mismos (212-214).
La 2 globulina pMAP (pig-Major Acute-phase Protein) es una PFA principal en la
especie porcina (144), cuya concentración aumenta entre 10-30 veces en cerdos con
inflamación inducida por trementina o sometidos a un trauma quirúrgico (215). Esta
proteína es homóloga a la humana P-120 (Plasma kallikrein-sensitive protein) (215,
216), y está también presente en otras especies animales (217, 218). Todas estas
proteínas presentan homología con las cadenas pesadas H1, H2, H3 de los inhibidores
de tripsina inter (ITI). Por esta razón, esta nueva proteína plasmática ha recibido el
nombre de ITIH4, es decir cadena pesada H4 de los ITI (219). La pMAP/ITIH4 es una
PFA dependiente de la IL-6 (tipo II), como se ha demostrado en estudios con cultivos
primarios de hepatocitos (140). La IL-6 es una potente citocina proinflamatoria que
activa el eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal y regula la síntesis de proteínas de fase
aguda en el hígado (220). Estudios recientes sugieren que la ITIH4 humana puede
actuar como una proteína antiinflamatoria, ya que se ha demostrado que inhibe la
polimerización de la actina y la fagocitosis de las células polimorfonucleadas (221).
El trasplante de órganos es extremadamente agresivo para el organismo receptor y
desencadena una RFA similar a la producida en la inflamación pero de mayor duración
(222-224). Algunos estudios han sugerido que la determinación de las PFA en
trasplantes de órganos podría ser de utilidad para el seguimiento de la función del
injerto y la detección temprana del RA. Entre las PFA que se han propuesto como
Discusión
- 127 -
marcadores en trasplantes realizados en humanos están: la 1-glicoproteína ácida, 1-
antitripsina, haptoglobina, proteína C-reactiva (PCR) y preabúmina en el trasplante
hepático (223-225), amiloide A sérico en el trasplante renal (222) y la PCR en el
trasplante simultáneo de riñón y páncreas (47), entre otras. En estudios previos
propusimos el uso de pMAP/ITIH4 como biomarcador de RA tras el TP en cerdos
(141).
Nuestros resultados actuales demuestran que la concentración de pMAP/ITIH4
aumenta en los días 2-3 postrasplante y que en el grupo melatonina se produjo una
reducción significativa de los niveles de esta PFA. Esto sugiere que el daño a los
tejidos, que es uno de los factores que inducen la RFA, se habría reducido en los
animales tratados con melatonina. Por el contrario, los niveles de pMAP/ITIH4 en el
grupo del AA fueron similares a los observados en el grupo control. En sintonía con
nuestros datos, un estudio previo demostró que el tratamiento con melatonina provocó
una reducción de la IL-6 en neonatos humanos después de cirugía abdominal (226).
Wullstein et al (47) subrayan que el pico de los niveles séricos de la PCR dentro de
las 72 horas después del trasplante clínico de páncreas-riñón es un buen parámetro para
evaluar el grado de lesión tisular pancreática precoz. En nuestro modelo de TP en el
cerdo, la concentración sérica de la pMAP/ITIH4 en los tres primeros días también se
ha mostrado como un buen parámetro predictivo de la evolución del trasplante; niveles
más bajos, como sucede en el grupo melatonina, se correspondieron con una mayor
supervivencia del injerto.
OTRAS PROPIEDADES DE LA MELATONINA QUE JUSTIFICAN
SU APLICACIÓN EN EL TRASPLANTE DE ÓRGANOS
Discusión
- 128 -
Aparte de la eficacia de la melatonina en reducir el daño de IR mediado por el EO y su
capacidad para disminuir las citokinas proinflamatorias, esta indolamina tiene otras
características que podrían proporcionar beneficios adiccionales antes, durante y
después del trasplante. Primero, varios ensayos clínicos randomizados han demostrado
que la administración preoperatoria de la melatonina reduce la ansiedad preoperatoria
(227); en pacientes que se van a someter a una prostatectomía, la premedicación con
melatonina disminuye el dolor y mejora la calidad del sueño y los niveles de sedación
en el postoperatorio (228). Segundo, estudios previos describen la actividad
antibacteriana y antiviral que posee la melatonina (229, 230). Las infecciones virales y
bacterianas son una causa importante de morbilidad tras el trasplante de órganos (137).
La melatonina disminuye el daño oxidativo del liposacarido bacteriano y ha sido
propuesta para combatir el shock endotoxico (231, 232).
Una consideración final es la seguridad de la melatonina en el uso clínico. En
estudios experimentales, dosis de melatonina de hasta 800 mg/Kg no provocaron
fallecimiento en ratones; además, la dosis letal para el 50% de ratones (LD50) no ha
podido ser determinada aun a pesar de los intentos para conseguirlo (233, 234).
Tampoco se observó toxicidad con dosis altas de melatonina (200 mg/Kg)
administradas a ratas embarazadas (235). Incluso la administración intravenosa de
melatonina durante cirugía vascular no provocó cambios en los parámetros
hemodinámicos, como la presión arterial o el pulso (236). Parece, por tanto, seguro
asumir que la administración de melatonina podría ser protectora en la IR y podría tener
un uso terapéutico en el manejo clínico del TP.
Conclusiones
- 129 -
VII CONCLUSIONES
Conclusiones
- 130 -
1. Nuestro modelo quirúrgico de alotrasplante pancreático-duodenal con derivación
entérica de la secreción exocrina y drenaje venoso sistémico en el cerdo y el
procedimiento anestésico, con premedicación mediante la asociación de
tiletamina/zolazepam/medetomidina, son de gran eficacia y seguridad. Presentan
una escasa incidencia de complicaciones técnicas, ausencia de pérdida de animales
donantes y receptores por problemas intraoperatorios, es especialmente útil para
estudios de isquemia-reperfusión y preservación de órganos, y se asemeja a los
procedimientos de trasplante clínico de páncreas más empleados en la actualidad.
2. La respuesta endocrina-metabólica en nuestro modelo de alotrasplante de páncreas
en el cerdo, sin inmunosupresión, se ha caracterizado en el postoperatorio
inmediato por una tendencia a la hipoglucemia y por elevadas concentraciones
plasmáticas de insulina y c-péptido. También es típica y universal la gran elevación
de los niveles séricos de enzimas pancreáticos, amilasa y lipasa, con pico el primer
día y ulterior tendencia a la normalización.
3. El tratamiento con melatonina ha demostrado un efecto muy favorable en la
evolución del alotrasplante de páncreas en el cerdo. Se ha comportado de forma
eficaz y segura y, de manera primordial, ha prolongado significativamente la
supervivencia del aloinjerto y ha retrasado la aparición del rechazo agudo. El ácido
ascórbico, otro antioxidante bien conocido, fracasó en la prolongación de la
supervivencia del aloinjerto pancreático.
4. La mayor supervivencia del injerto pancreático puede explicarse por la capacidad
de la melatonina para neutralizar radicales libres y la peroxidación lipídica; también
por sus propiedades antiinflamatorias atenuando el daño tisular, como se desprende
Conclusiones
- 131 -
de la reducción observada en las concentraciones séricas de pMAP/ITIH4, una
proteína de fase aguda positiva IL-6 dependiente.
5. La concentración sérica de la pMAP/ITIH4 en los tres primeros días del
alostrasplante pancreático en el cerdo puede ser un parámetro predictivo de la
evolución del trasplante; niveles más bajos se corresponderían con mejor evolución
del injerto.
6. Basándonos en nuestras observaciones y en artículos previos, en los efectos
positivos de la administración de melatonina en procedimientos quirúrgicos
mayores y en la ausencia de efectos secundarios, podemos considerar a la
melatonina como una valiosa terapia coadyuvante en el trasplante de órganos. Hay
que continuar con los estudios, especialmente en ensayos clínicos, para completar
el ciclo de la llamada Medicina Traslacional dirigida a amortizar en beneficio social
(médico y económico) todo el ingente esfuerzo dedicado a la investigación básica
preclínica.
Conclusiones
- 132 -
VII CONCLUSIONS
Conclusiones
- 133 -
1. Our surgical model of pancreatic-duodenal allotransplant with enteric derivation of
the exocrine secretion and systemic venous drainage and the anaesthetic protocol
with premedication with tiletamine/zolazepam/medetomidine, is a safe and
effective model. There is a low rate of technical complications, no lost of donor or
recipient animals due to intraoperative complications. It is especially useful for
ischemia- reperfusion injury studies, organ preservation and is pretty similar to the
clinical procedure used at present.
2. The endocrine-metabolic response in our model of pancreas allotransplant in pigs
without immunosuppression is characterized by a tendency toward hypoglycaemia
and a high plasmatic concentration of insulin and c-peptide in the early
postoperative period. It is also typical and generalized the great elevation of the
pancreatic enzymes, such as amylase and lipase, with the peak during the first day
and a posterior normalization.
3. The addition of melatonin has showed a positive effect in the outcome of the
pancreatic allotransplant in pigs. It has been safe and effective and basically has
prolonged the survival rate of the graft and delayed the onset of the acute rejection.
4. The increase of the pancreatic graft survival might be due to free radical and lipid
peroxidation scavenger capacity of melatonin. Also because of some anti-
inflammatory properties, with the reduction of the plasmatic concentrations of
pMAP/ITIH4, an acute-phase protein related with Interluekin-6.
5. The serum concentration of pMAP/ITIH4 during the first three days could have a
predictive value in the outcome of the transplant, where lower levels are related
with a better evolution of the graft.
Conclusiones
- 134 -
6. Based on these observations and on previous papers, the positive effects of
melatonin administration in major surgical procedures and the lack of side effects
suggest that melatonin could be a valuable co-adjuvant therapy in organ
transplantation. More studies are needed, specially clinical trials, to complete cycle
of the so-called Translational Medicine, the process of turning appropriate
biological discoveries into drugs and medical devices that can be used in the
treatment of patients.
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