Elaboración de una bebida funcional a partir del ...

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Elaboración de una bebida funcional a partir del

aprovechamiento de la cáscara deshidratada del café

como alternativa de valorización de subproductos

Manuel Fernando Córdoba Porras1

Asesor: María Hernandez Carrión2

1 Universidad de los Andes, Departamento de Ingeniería Química y de Alimentos, Bogotá, Colombia 2 Universidad de los Andes, Profesor Asistente, Departamento de Ingeniería Química y de Alimentos, Bogotá, Colombia

Resumen— La cáscara de café es un subproducto de la cadena de

producción del café y su alto contenido en compuestos bioactivos lo convierte en un recurso aprovechable dentro de la industria

alimentaria. Con el objetivo de agregar valor a los subproductos de la

agroindustria del café, se analizan las propiedades antioxidantes de los

extractos hidrosolubles del epicarpio de café deshidratado. Siendo así, la extracción acuosa de la cáscara de café reveló un contenido de

polifenoles totales de 30.8 ± 2.3 mg de ácido gálico/ g muestra medido

a través del ensayo de Folin-Ciocalteu. La capacidad antioxidante

arrojó un valor de 116.4 ± 0.1 TEAC (µmol Trolox/g muestra) medida a través del ensayo de radicales libres DPPH. A partir del método

enzimático gravimétrico AOAC 993.19 – 991.42 se obtuvo una fibra

dietaria total de 31.2 ± 0.8 g/ 100 gramos de muestra. Finalmente, a

partir de UHPLC-ESI+-Orbitrap-MS se observó la presencia de los siguientes compuestos fenólicos: teobromina (26.5 mg/ kg), teofilina

(18.0 mg/kg), catequina (C)(1.8 mg/kg), epicatequina (EC)(6.0 mg/kg),

naringenina(0.5 mg/kg), pinocembrina (0.44 mg/kg), quercetina 3-

glucósido (0.9 mg/kg ) y cafeína (813.3 mg/kg).

Por otro lado, se prepararon 4 formulaciones de infusiones de cáscara

de café deshidratada y se sometieron a una evaluación sensorial

mediante una prueba hedónica de nueve puntos combinada con una

escala de punto ideal (JAR). Los datos obtenidos de la prueba se analizaron mediante ANOVA de un solo factor con prueba de

comparación múltiple de Tukey en el software Minitab 19. Así mismo,

se empleó un análisis de penalizaciones para observar la influencia de

la astringencia y el amargor sobre la aceptación global y la intención de compra del producto. Siendo así, se pudo organizar de forma

ascendente de aceptabilidad las formulaciones B4,B1,B3 y B2, siendo

B4 la bebida con menos aceptación y B2 la bebida con mayor

aceptación por parte de los panelistas. Además, se encontró que todas las formulaciones necesitan ser optimizadas, sin embargo, una mejora

en los atributos de astringencia y amargor en las formulaciones B2 y

B4 no tendría una incidencia significativa sobre la aceptabilidad

global y la intención de compra de estas. Mientras que una mejora de dichos atributos en las formulaciones B1 y B3, conllevaría a un

incremento positivo en la intención de compra y la aceptabilidad global

de estas dos formulaciones.

Palabras Clave— Pulpa, Café, Bioactivos, Fibra, Análisis

Sensorial.

I. INTRODUCCIÓN

El café es una planta tropical que pertenece al género Coffea de

la familia Rubiaceae. Pese a que hoy en día se reconocen 124

especies diferentes de café, el comercio mundial del mismo se

basa en dos especies principales Arábica (Coffea Arábica) que

comprende el 60% del café comercializado (además está

catalogada como el mejor café por sus particulares

características organolépticas) y Robusta (Coffea Canephora)

que constituye el 40% restante. Aquí, vale la pena señalar que el

café Libérica (Coffea Liberica) representa una tercera especie de

esta planta, la cual es cultivada en todo el mundo (se utiliza

como patrón de injerto para Arábica y Robusta) pero resulta un

baladí en términos comerciales [1].

Para el caso particular de Colombia, la gran mayoría de cultivos

de café en el territorio nacional pertenecen a la especie Arábica

y las variedades de este café que se siembran son Típica,

Borbón, Maragogipe, Tabí, Caturra, Castillo y Colombia,

caracterizadas por poseer frutos rojos o amarillos y un porte bajo

y medianamente alto de crecimiento. Por otro lado, la variedad

Castillo es una de las más sembradas debido a que resulta apta

para todos los ambientes donde se desarrolla la caficultura en

Colombia, permite la producción limpia del café, debido a que

no requiere de la aplicación de fungicidas contra el hongo

Hemileia Vastatrix (roya del cafeto) y por último contribuye a

la construcción de una caficultura sostenible y de calidad [2].

Siguiendo con lo antes expuesto, la actividad cafetera en

Colombia representa un sector muy importante en la economía

nacional. A pesar de las crisis en el precio representativo del

café, donde se han presentado altos costos de producción y bajos

niveles de cosecha, el café continúa siendo un eje articulador

significativo en términos del desarrollo rural del país [3]. Tanto

así que, hasta la fecha la Federación Nacional de Cafeteros

(FNC) ha reportado una participación de 560.000 fincas

dedicadas al cultivo de café, lo cual se traduce en más de

948.000 hectáreas sembradas con café de variedad arábica que

producen una bebida suave de alta aceptación en el mercado

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mundial por sus excepcionales características organolépticas

[4]. Así mismo, vale la pena resaltar que los cultivos de café

ocupan el 66% del área cultivada en el país, y se posiciona como

el producto con mayor participación económica entre los demás

cultivos registrados en el Instituto Colombiano Agropecuario

(ICA) [5], debido a que proporciona aproximadamente 785.000

empleos rurales de forma directa y 1.500.000 indirectos [6].

Además de lo anterior, el comercio del café en Colombia

constituye el 22% del Producto Interno Bruto (PIB) agrícola y

el 12% del PIB agropecuario [7]. En términos monetarios y

según cifras del Ministerio de Agricultura el café para el año

2020 aportó aproximadamente $9 billones a la economía del país

y se prevé que esta cifra aumente para los años posteriores, pues

desde 2019 la caficultura colombiana ha venido creciendo en

promedio 9.5% anual, lo que implica tres veces más que la

economía nacional, medida en términos del Producto Interno

Bruto (PIB) [8].

En cuanto a exportaciones, Colombia se consolida como mayor

productor mundial de café arábigo de suave lavado, produciendo

para la última cosecha registrada en 2020 13.9 millones de sacos

de 60 kilos de café verde. Esta cifra, teniendo en cuenta el

contexto pandémico producto del biológico Sars-Cov-2 resulta

alentadora, pues hubo una reducción mínima del 6% frente a la

cosecha de 2019 que dio lugar a la exportación de 14.7 millones

de sacos. Siendo así, Roberto Vélez Vallejo, Gerente General

de la Federación Nacional de Cafeteros (FNC) manifestó que el

café es y seguirá siendo motor de esperanza para la economía en

Colombia, los cafeteros continúan cumpliéndole al país y esto

se ve confirmado por el volumen de producción y el valor de la

cosecha alrededor de los 9$ billones de pesos, recursos que

movilizan y habilitan la dinámica económica de más de 600

municipios cafeteros [9].

Pese a la gran importancia económica de este producto para el

país, en las diferentes etapas del proceso productivo del café, se

generan alrededor de 784.000 toneladas/año de biomasa

residual, que se encuentra compuesta principalmente por la

pulpa, cascarilla y la borra [10]. Siendo así, se estima un

aprovechamiento del 5% del peso total del fruto para la

preparación de la bebida de café. Además, alrededor de 43.58%

del peso del fruto fresco es pulpa de café, lo que permite

manifestar que por cada millón de sacos de 60 kilogramos de

café almendra que Colombia exporta, se generan alrededor de

162900 toneladas de residuos de pulpa fresca [11]. Lo anterior

sugiere un problema de alta importancia, puesto que el gran

volumen de residuos puede llegar a constituir un problema

ambiental, partiendo del hecho que, en muchos casos esta

biomasa residual es arrojada a cuerpos de agua, lo que implica

un aumento de la demanda de oxígeno para su descomposición

y por ende una disminución en la cantidad de oxígeno disponible

que genera asfixia en la biota acuática [12]. Así mismo, es

común que estos residuos sean vertidos en el suelo de forma no

controlada, lo que conlleva a potenciales problemas

fitosanitarios y de contaminación cruzada [13].

De este modo, el procesamiento adecuado de los desechos y/o

subproductos de la cadena de recolección del café para ser

transformados en productos con un alto valor agregado, puede

mejorar significativamente la calidad de vida de los caficultores

[14]. Existen diferentes estrategias documentadas relacionadas

con el aprovechamiento de los subproductos del café, como lo

son el aprovechamiento de la pulpa de café para la obtención de

alimentos para animales [15], harina [16], biocombustibles [17],

absorbente para la remoción de metales pesados [18], sustrato

para cultivo hongos comestibles [19], abono orgánico [20], entre

otros.

Por otro lado, resulta importante destacar que la Organización

Mundial de la Salud [21] manifiesta que las enfermedades

crónicas no transmisibles, constituyen la primera causa de

muerte en todo el mundo y estás son potencialmente originadas

por la presencia de radicales libres, que, por su naturaleza

altamente oxidante, induce a diversas reacciones desfavorables

que alteran la estructura funcional de las células [22]. Aquí, es

necesario señalar que la pulpa además de poseer pectinas y

protopectinas, contiene también una serie de azúcares,

antocianinas, proantocianinas, cianuros, bioflavonoides,

taninos, cafeína y ácidos clorogénicos, los cuales son

compuestos bioactivos de alto interés en la prevención y/o

tratamiento de enfermedades causadas por estrés celular

oxidativo. Por tal razón, la pulpa de café se convierte en un

residuo aprovechable que tiene un alto potencial como materia

prima para la elaboración de una bebida funcional, como

estrategia para la valorización de subproductos del proceso de

producción del café [23].

Teniendo en cuenta lo anterior, han surgido empresas que le

otorgan un tratamiento a este subproducto de café como lo es

The Coffe Cherry Company quienes comercializan la harina de

la pulpa y/o cáscara de café desde el año 2015 y que han vendido

a la fecha más de 6 millones de libras de pulpa de cereza de café

convertida en harina. A lo anterior, es necesario añadir que

cuentan directamente con el apoyo de la Organización de las

Naciones Unidas (ONU) para la producción y/o manufactura de

este producto, ya que es considerado como sostenible y

mitigador del impacto ambiental [24]. De otro modo, Sanadores

Ambientales (Sanam Company) ubicados en Envigado,

Antioquia, han enfocado su directriz institucional a encontrar

maneras de aprovechar residuos del café, encontrando

alternativas de alto impacto como la elaboración de bebidas,

aderezos, granolas, insumos de repostería, miel y productos

cosméticos a partir del aprovechamiento de la pulpa del café

[25]. Así mismo, en el municipio de Andes, Antioquia, la

empresa Natucafé [26] y Naox [27], utilizan pulpa de café para

la obtención de bebidas con alto poder energético y antioxidante,

con el fin de generar una mayor rentabilidad en sus productos.

Pese a lo anterior, la mayoría de estos procesos de

transformación de la pulpa, resultan desconocidos para la

población campesina, quienes lo utilizan principalmente como

abono.

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Motivado por lo anterior, en el presente proyecto de grado se

evalúa la capacidad antioxidante de la pulpa de café

deshidratada de la especie arábica (Coffea Arábica L),

específicamente de la variedad Castillo. Así mismo, se

cuantifican los polifenoles totales y compuestos fenólicos, el

contenido en cafeína y fibra dietaria presentes en dicha muestra.

Para llevar a cabo esto, se utilizan técnicas de extracción sólido-

líquido tipo Soxhlet con metanol y agua como medio solvente,

para así tener los extractos que permiten determinar la capacidad

antioxidante, su contenido de polifenoles totales y compuestos

fenólicos, así como también el contenido en cafeína y fibra

dietaria total, mediante los métodos DPPH, Folin-Ciocalteu,

UHPLC-ESI+-Orbitrap-MS (Cromatografía Líquida de Ultra

Alta Resolución con detector de masas Orbitrap) y el método

enzimático gravimétrico de la AOAC 993.19 y 991.42,

respectivamente. Finalmente, se elabora una infusión y/o

aromática con diferentes porcentajes de cáscara de café y se

realiza un análisis sensorial con consumidores habituales de

café, quienes por medio de una encuesta, basada en una escala

hedónica, permiten establecer la cantidad idónea de cáscara para

la elaboración de la bebida. Así mismo, se emplea una escala

tipo JAR para determinar la influencia del amargor y la

astringencia en la aceptabilidad global y la intención de compra

de dicha bebida.

II. METODOLOGÍA

A. Formulación y análisis sensorial de la bebida funcional

Ingredientes y materiales

Para la preparación de la infusión y/o aromática a base de la pulpa seca de café arábico tipo Castillo, se utilizaron los siguientes ingredientes: agua caliente a 100 °C y pulpa o cáscara de café deshidratada, la cual fue recolectada de la finca Buenos Aires, ubicada en la zona veredal del municipio del Socorro, Santander ( 6°28´4´Ń , 73°15´35´Ó, 1300 msnm) y fue secada a temperatura ambiente en el mismo lugar con una temperatura promedio ambiental de 23 °C y humedad relativa promedio de 65%. Lo anterior con el fin de evitar la posible degradación de la materia vegetal durante el transporte y almacenamiento de estas.

El fruto de la planta es recolectado y de inmediato se somete a un proceso de despulpado con máquina en beneficio húmedo de la cual se obtiene la cáscara de interés. El funcionamiento de este artefacto se fundamenta en arrastrar la pulpa del café haciéndola pasar en medio de dos superficies, una dentada y otra lisa esto garantiza que la presión ejercida sobre el grano expulse la piel o pulpa que las contiene. Por último, la máquina expulsa de forma separada los granos del café y la pulpa, donde ésta última es sometida de forma inmediata a secado natural. Vale la pena señalar, que, debido al proceso efectuado por la máquina, la pulpa sale de la máquina, con ciertas trazas de capa gelatinosa, la cual se denomina mucílago y que también aporta cantidades significativas de compuestos bioactivos como polifenoles [28].

Finalmente, para las pruebas sensoriales, se empleó agua Cristal de la empresa Postobón y galletas de soda Saltín Noel. Así mismo, se utilizaron implementos como balanzas, termómetros, teteras de vidrio, vasos de plástico, recipientes para pesar, palas, marcador y bolsas de polietileno de baja densidad con sello

hermético, metálicas y con válvula desgasificadora dónde se almacenaron las muestras de cáscara de café deshidratada.

Preparación de infusión con cáscara deshidratada de café

Para elaborar la infusión, inicialmente se pesan las cantidades de cáscara de acuerdo con las cantidades consignadas en la Tabla 1. Posterior a ello se vierte un volumen de 90 mL de agua caliente en una tetera de vidrio de baja emisividad (ATR) y se agrega la cáscara deshidratada. Finalmente se deja reposar durante un minuto con el fin de extraer los componentes solubles en agua de la cáscara a una temperatura promedio de 92 °C y así mismo eliminar la presencia de microorganismos no deseados [29].

Por otro lado, vale la pena mencionar que se mantiene una cantidad de agua constante en cada una de las muestras, equivalente aproximadamente a 90 mL, la cual corresponde a la presentación usual de venta comercial de aromáticas en Colombia [30] . Siendo así, la cantidad de cáscara agregada se convierte en el único factor que presenta variación y por ende afecta directamente la concentración de las muestras. Finalmente, el agua utilizada, proviene del proceso de filtración de tres etapas de agua potable mediante un filtro de agua Renaware Aqua Nano CTU-300 [31].

Tabla 1. Ingredientes para la elaboración de la infusión

Análisis sensorial de la infusión con cáscara de café

Se realiza una prueba sensorial mediante la aplicación de una escala hedónica de nueve puntos combinada con una escala de punto ideal o Just-About-Right (JAR). Esta prueba se ejecutó en el mes de Marzo de 2021 en el horario de 10:00 a 11:00 am y de 9:00 a 10:00 am en las instalaciones del Servicio Nacional de Aprendizaje (SENA) en el Socorro, Santander (Colombia) con coordenadas 6°28´4´Ń , 73°15´35´Ó y una altitud de 1300 msnm.

Se evaluaron las preferencias y aceptación de 50 consumidores habituales de café, no entrenados, cuya información demográfica se encuentra consignada en la Tabla 2 . De otro modo, para facilitar la ejecución del estudio se realizaron las evaluaciones en dos horarios. El primer grupo de 27 participantes evaluó las muestras en el horario de 9:00 a 10:00 am y el segundo grupo de 23 panelistas lo hizo en el horario de 10:00 a 11:00 am.

Tabla 2. Información demográfica de los encuestados

Variable

N°

Panelistas

(n = 50)

Porcentaje

de

Panelistas

(%)

Sexo Hombre 26 52

Mujer 24 48

Número de Muestra

Cantidad de Cáscara (gramos)

Cantidad de Agua Caliente (mL)

1 5 90

2 10 90

3 15 90

4 20 90

4

Frecuencia

de

consumo

Diariamente 31 62

Semanalmente 11 22

Mensualmente 1 2

Esporádicamente 7 14

Nunca 0 0

Edad Entre 20 – 55 años

De la tabla anterior es válido señalar que el 48% de los encuestados son mujeres y el 52% de los encuestados son hombres que en su mayoría habitualmente consumen café. Así mismo, se puede decir que en la región donde se realiza el estudio existe una alta tendencia de consumo de café, pues el 62% de los panelistas manifiestan consumir diariamente café.

Presentación de las muestras

Las cuatro muestras destinadas a evaluación sensorial se codifican con 3 dígitos aleatorios de acuerdo con la tabla presentada en el Anexo 1 y se presentan al panelista en una bandeja de aluminio en la que se colocan 4 vasos de plástico de 3.3 Oz con su respectivo contenido de infusión. Así mismo, se cuidó que todas las muestras se consumieran de uno en uno en forma aleatoria, esto con el fin de evitar el error por ordenamiento y así garantizar el cumplimiento del supuesto de independencia de errores. Así mismo, estas bebidas fueron servidas a una temperatura entre 70 a 80 °C.

Por último, el análisis sensorial se realiza de forma individual (de acuerdo con cada codificación para encuestado), utilizando para ello la hoja de cata facilitada en el Anexo 2 . Aquí vale la pena señalar que entre muestra y muestra, se le solicita al panelista enjuagar la boca con agua mineral y comer una porción de galleta de soda con el fin de eliminar y/o mitigar el retrogusto.

Análisis e interpretación de los resultados obtenidos en la prueba sensorial.

Se requiere analizar la apreciación de los panelistas sobre la aceptación, intención de compra y ciertas características organolépticas de las bebidas con el fin de inferir estadísticamente, acerca de cuál es la muestra con mayor aceptación por parte de la población. Siendo así, una vez se codifican estos atributos, se procede a plantear un diseño experimental que cuenta con un factor, 5 variables de respuesta y 4 niveles o tratamientos con tamaños de muestreo iguales (mismo número de respuestas por cada tratamiento).

Teniendo en cuenta lo anterior , se analizan los datos mediante el análisis de varianza de un solo factor (ANOVA) junto con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Siendo así, los resultados son expresados como promedio y desviación estándar (DE). Esta última y el coeficiente de variación entre diferentes atributos fueron analizados con un intervalo de confianza del 95% usando el software de análisis estadístico Minitab 19 ®. Aquí vale la pena señalar que para el modelo seleccionado se considera que los datos satisfacen el supuesto de homocedasticidad, normalidad e independencia de residuos.

Ahora, la prueba de Tukey para comparaciones múltiples agrupa las medias en diferentes familias para compararlas entre sí, con el fin de identificar si una de estas muestras difiere significativamente de las otras. Así mismo, se hace la salvedad

de que todos los tratamientos tienen el mismo número de repeticiones. Esta prueba se utiliza, con el fin de determinar cómo se relacionan las medias de las formulaciones y poder decidir acerca de cuál muestra es la que posee mayor aceptabilidad por parte de los panelistas. La prueba de Tukey se caracteriza por manejar de forma adecuada los errores α y β. A modo de aclaración el error α o erro tipo I es aquel error que se da cuándo se produce un falso positivo, es decir cuando se rechaza una hipótesis nula, asegurando que hay alguna diferencia en las medias, pero no es así. Lo opuesto, es el error β o error tipo II (falso negativo), que ocurre cuando se aprueba la hipótesis nula pero realmente sí existe una diferencia entre las medias [32].

Finalmente, se combinan la escala hedónica de 9 puntos junto con la escala de punto ideal o Just-About-Right (JAR) de 5 puntos con el fin de generar un criterio de optimización y desarrollo de la infusión y/o bebida funcional. Siendo así, a partir de esta escala se busca determinar cómo influyen el amargor y la astringencia en la aceptabilidad global del producto y la intención de compra de este. Lo anterior permite determinar si los atributos (astringencia y amargor) se encuentran bien optimizados o si sería necesario combinarlos con los datos de la aceptación global del producto, puesto que podría darse el caso de que los panelistas hayan dicho que el producto les parece muy amargo, pero en la aceptación global hayan asignado un 8 (“Me gusta mucho”). Esta situación indiciaría que el amargor no se constituye como un atributo clave en la aceptación del producto y que una mejora en este no conllevaría a un aumento importante en la aceptación de este. El análisis de penalizaciones es una herramienta muy útil que es implementada con el fin de evaluar el aspecto anteriormente mencionado, pues con esta se puede ver si los jueces que han catalogado un atributo por encima o por debajo del punto ideal, han dado una menor puntuación en la aceptación global que aquellos que afirmaron que el atributo estaba en su punto ideal. Dicho de otra forma, se puede ver si el hecho de que un atributo situado por debajo de JAR o por encima, ha tenido cierta influencia o ha penalizado en la puntuación de aceptación global [33].

B. Extracción y determinación de compuestos bioactivos en

la cáscara de café

Una vez se encuentran las muestras en el laboratorio, se procede

a separar cualquier impureza que no tenga que ver con el

epicarpio del café de manera manual y se introducen en una

cámara de calor y secado (Binder Series FD 115 Avantgarde.

Line) durante 30 minutos a 50 °C para eliminar cualquier

fracción de humedad adquirida durante el proceso de transporte

y/o almacenamiento.

Luego, tras seleccionar y tratar la cáscara de café deshidratada,

se toman 5 gramos de esta y se añaden 25 mL de etanol al 96%

y se homogeneiza con ultraturrax durante 3 minutos. La muestra

homogeneizada se deja en centrifugadora (Rotofix 32ª de

Sigma-Aldrich) durante 20 minutos a 14500 rpm y 4°C. Se toma

el sobrenadante en un matraz aforado y con el precipitado

nuevamente se procede a adicionar etanol y realizar la

extracción. Finalmente, con la segunda extracción se afora a 100

mL con etanol 96% . El extracto obtenido se almacena en una

botella cubierta con aluminio con cierre hermético y es puesta

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en la nevera para las cuantificaciones y/o determinaciones

siguientes.

Cuantificación de cafeína en cáscara de café mediante

cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).

La cafeína es una sustancia muy soluble en agua y su solubilidad

aumenta conforme la temperatura lo hace. Siendo así, para la

cuantificación de su contenido por cromatografía, es necesario

emplear un adecuado proceso de extracción de cafeína que

permita separar el principio activo de la matriz y extraer así la

mayor cantidad posible del compuesto de interés. Es por ello,

que la temperatura idónea para la extracción se encuentra en el

rango de 80 a 100 °C. Además, se emplea óxido de magnesio

(MgO) o ferrocianuro de zinc durante la extracción con el fin de

eliminar determinadas sustancias como el ácido clorogénico, el

cual puede interferir directamente sobre las mediciones

posteriores de la cantidad de cafeína [34].

Teniendo en cuenta lo anterior, se pesan 0.5 gramos de cáscara

de café deshidratado y se introduce la muestra en un matraz de

erlenmeyer al cual se le añaden 0.5 g de MgO y 20 mL de agua

destilada, se agita y se lleva a un baño a 90 °C con agitación

suave durante 25 minutos. Una vez pasa este tiempo, se

centrifuga la muestra y se filtra, obteniendo como resultado el

extracto para el análisis. Así mismo, para la preparación de las

disoluciones patrón , se parte de una disolución de cafeína con

una concentración de 1000 mg de cafeína por litro, a partir de la

cual se obtienen una serie de disoluciones patrón que se utilizan

para la elaboración de la recta de calibrado. Las disoluciones de

cafeína obtenidas a partir de esta solución madre son 3, 6, 12, 25

y 50 ppm de cafeína ( mg de cafeína / L disolución).

Ahora, el extracto de cáscara de café deshidratada es analizados

mediante cromatografía líquida de alta resolución, usando un

cromatógrafo (Dionex Ultimate 3000, Thermo Scientific)

controlado por el software Chromeleon 7.2, equipado con una

columna (Agilent Eclipse XDB-C18 150mm*2.1mm*5µ). El

volumen de inyección es de 20 µL, la fase móvil A es metanol

al 85% y la fase móvil B es agua destilada. El modo de elución

es isocrático con metanol al 25% como medio disolvente.

Siendo así, se inyectan al equipo las disoluciones preparadas, tal

y como se menciona con antelación y se procede a identificar la

sustancia de interés, comparando el tiempo de retención (𝑡𝑅 )

correspondiente al pico observado en las disoluciones de los

patrones con el 𝑡𝑅 de los picos obtenidos en el cromatograma de

las muestras.

Una vez se identifica la cafeína, se procede a su cuantificación

y para ello se utiliza el método del estándar externo. Para ello,

se inyectan en el equipo cromatográfico las disoluciones de

cafeína obtenidas de la solución madre. A partir de los

cromatogramas registrados en el equipo, se puede calcular el

área correspondiente para cada concentración. Una vez se tienen

estos datos, se construye la recta de calibrado a partir de la

representación del área de cada uno de los picos frente a su

concentración en el patrón. Así mismo, los cromatogramas de

las muestras permiten obtener el área del pico identificado como

cafeína y a partir de la ecuación de la recta de calibración, se

calcula la concentración de la cafeína en el extracto de la

muestra de cáscara de café deshidratada [35].

Determinación del contenido de polifenoles totales

El contenido en polifenoles totales del extracto de la cáscara de

café es determinado mediante el ensayo de Folin-Ciocalteu [36].

El reactivo de Folin-Ciocalteu es una mezcla de ácidos

fosfotungstico (𝐻3𝑃𝑊12𝑂40) y fosfomolíbdico (𝐻3𝑃𝑀𝑜12𝑂40),

el cual durante la oxidación fenólica produce óxidos azules de

tungsteno ( 𝑊8𝑂23) y molibdeno (𝑀𝑜8𝑂23). La reacción ocurre

en condiciones de alcalinidad otorgadas por la presencia de

carbonato de sodio. Así mismo, la intensidad del color azul se

encuentra directamente relacionada con la cantidad de

compuestos polifenólicos que pueden ser cuantificados

mediante el uso de un espectrofotómetro y una curva patrón de

calibración [37]. Esta última se construye empleando ácido

gálico como estándar y contenido total de polifenoles se expresa

como mg/g equivalentes de ácido gálico (EGA).

Siendo así, se prepara una disolución patrón de ácido gálico de

0.1 g/L para lo cual se pesan 25 mg de ácido gálico, se colocan

en un matraz aforado de 25 ml y se llevan a volumen con agua

destilada, en seguida se prepara una dilución 1:10 con agua

destilada (se recomienda usar siempre la solución recién

preparada). De la misma forma, se prepara una disolución de

carbonato de sodio al 20% pesando 5 g de carbonato de sodio en

un matraz aforado de 25 ml, inicialmente se disuelve en 15 ml y

se lleva a vortex (agitación) hasta su completa disolución,

finalmente se lleva a su volumen de aforo con agua destilada.

Por otro lado, se prepara una disolución 1 N del reactivo de Folin

Ciocalteu, por medio de una dilución 1:2 del reactivo en agua

destilada. Este último se protege de la luz y se coloca en

refrigeración hasta su posterior uso.

A partir de la disolución patrón de ácido gálico, en viales

protegidos de la luz, se hacen las diluciones necesarias con agua

destilada para obtener concentraciones de 0.2 mg/mL, 0.4 mg/L

, 0.8 mg/mL , 1.2 mg/mL y 1.6 mg/mL para la preparación de la

curva de calibración. Lo anterior se realiza tomando

respectivamente 20 µL , 40 µL, 60 µL, 80 µL y 100 µL de la

disolución patrón de ácido gálico de 0.1 g/L en viales ámbar de

3 mL, luego se adiciona a cada vial 250 µL de reactivo Folin-

Ciocalteu 1 N, se somete a agitación durante 5 minutos en un

baño ultrasónico, posteriormente se adicionan 1250 µL de la

disolución de carbonato de sodio al 20% a cada vial. Finalmente

se lleva a un volumen final de 2 mL con agua destilada y se deja

reposar por 2 horas. Así mismo, resulta necesario preparar un

blanco con todos los componentes anteriormente mencionados,

exceptuando el ácido gálico. Por último, se mide la absorbancia

a 765 nm en el espectrofotómetro GenesysTM 10S UV-VIS de la

marca Thermo ScientificTM [38].

Ahora, para determinar el contenido fenólico total en el extracto,

se toman 2 mL de extracto y se colocan en un matraz

6

erlenmeyer, luego se agregan 50 ml de agua destilada y se agita.

En seguida se toman 0.5 ml de esta disolución y se mezclan con

0.75 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu dejando en reposo a

temperatura ambiente por 5 minutos, después de lo cual se

agregan 0.75 ml de carbonato de sodio al 20%. Se agita

fuertemente para luego, dejar reposar durante 90 minutos a

temperatura ambiente. Luego de ese tiempo, se mide la

absorbancia a 765 nm. Este procedimiento se realiza por

triplicado y se toman los valores ponderados. Luego de obtener

los valores de absorbancia tanto de la muestra como de la recta

de calibrado, resulta posible determinar el contenido de fenoles

del extracto de la pulpa del café, el cual es expresado en mg/g

de peso seco del epicarpio del café, basándose en la curva de

calibración del material de referencia de ácido gálico, de ahí que

se utilice el término “unidades de ácido gálico equivalentes por

cada gramo de extracto o materia vegetal seca”.

Cuantificación de compuestos fenólicos por UHPLC-ESI+-

Orbitrap-MS.

La preparación de las muestras analizadas se realiza disolviendo

la cáscara de café deshidratada en una mezcla de metanol:agua

al 0.2% en ácido fórmico (1:1), vórtex (5 min) y sonicación (5

min) y posterior inyección al equipo cromatográfico. Como

estándares de referencia se utilizaron el conjunto de sustancias

presentados en la Tabla 3 junto con su respectiva codificación

de etiquetado y tamaño de presentación. Aquí, es necesario

manifestar que todos los estándares son fabricados por la

empresa Sigma-Aldrich con excepción de la Quercetina 3-

Glucósido la cual es fabricada por Phytolab.

Tabla 3. Estándares de Referencia

Grupo Sustancias SKU – Pack Size*

Xantinas Cafeína C8960-250G

Teobromina T4500-25G

Teofilina T1633-25G

Catequinas

Catequina (C) C1788- 500MG

Epigalocateqina galato

(EGCG) E4143-50MG

Epicatequina (EC) E1753-1G

Epicatequina galato

(ECG) E3893-10MG

Epigalocateqina (EGC) E3768-5MG

Flavonoides

Ácido cafeico C0625

Ácido p-cumárico C9008 Ácido rosmarínico 536954-5G

Quercetina Q4951-10G

Naringenina N5893-1G

Luteolina L9283-10MG Kaempferol K0133-50MG

Pinocembrina P5239

Apigenina A3145-25MG

Antocianinas

Cianidina 3-Rutinosido G36428

Pelargonidina 3-

Glucósido 53489

Quercetina 3-Glucósido 89230

* SKU-Pack Size : Código de etiquetado de la sustancia química – Cantidad de sustancia o tamaño de empaquetado de esta.

Por otro lado, el extracto acuoso de la cáscara de café

deshidratada se analiza en un cromatógrafo líquido de ultra-alta

resolución (UHPLC) (Dionex Ultimate 3000, Thermo

Scientific), equipado con una bomba binaria de gradiente (HP

G3400RS), un inyector automático de muestras (WPS 300TRS)

y una unidad termostada para la columna (TCC 3000). La

interfaz utilizada para el LC-MS (cromatografía líquida –

espectrometría de masas) es la electronebulización (ESI) y el

espectrómetro de masas a utilizar es de alta resolución con un

sistema de detección de corrientes de iones Orbitrap. La

separación cromatográfica se realiza en una columna Hypersil

GOLD Aq (Thermo Scientific; 100 x 2.1 mm, 1.9 μm de tamaño

de partícula) a 30° C. La fase móvil A corresponde a una

solución acuosa de 0.2% de formiato de amonio y B corresponde

a acetonitrilo con 0.2% de formiato de amonio. La condición

inicial de gradiente fue de 100% A, cambiando linealmente

hasta 100% B de los 0 a 8 minutos, manteniéndose allí durante

4 minutos. Finalmente, retorna a las condiciones iniciales (100%

A – 0% B) en 1 minuto. Siendo así, el tiempo total de corrida

fue de 13 minutos con 3 minutos adicionales para efectos de

post-corrida.

Además de lo anterior, el espectrómetro de masas Orbitrap

(Exactive Plus, Thermo Scientific) conectado por la interfaz de

electronebulización (HESI), opera en modo positivo con un

voltaje de capilar de 4.5 kV y se usa nitrógeno como gas secante.

Los espectros de masas se adquieren en el rango de masas m/z

60-900. El detector de masas Orbitrap es calibrado con las

soluciones de referencia certificadas: UltramarkTM 1621 Mass

Spec. (AB172435, ABCR GmbH & Co. KG); dodecilsulfato de

sodio (L4509, Sigma-Aldrich); taurocolato de sodio hidratado

(T4009, Sigma-Aldrich). Finalmente, la identificación de los

compuestos presentes en la muestra se realiza usando el modo

de adquisición full scan combinado con extracción de iones

(EIC) de los compuestos de interés, el cual mediante un barrido

de comparación entre de dos masas ( masa muestral y sustancias

estándar certificadas de referencia) con una exactitud y precisión

Δppm < 0.001, permite obtener una información total del

contenido fenólico en la muestra de análisis.

C. Determinación de la capacidad antioxidante en la cáscara

de café.

A partir del método de los radicales libres de la solución 2,2-

difenil-1-picryl-hidrazil-hidrato o DPPH, se cuantifica la

capacidad antioxidante en la cáscara de café deshidratada. Para

lograr lo anterior, inicialmente, se prepara la solución de DPPH,

agregando 100 ml de metanol al 99% a 4 mg de DPPH (D9132-

1G , Sigma-Aldrich) en un balón aforado de 100 ml y se agita

manualmente hasta que la solución tome un color violeta.

Posterior a ello, dada la fotosensibilidad de la solución, es

necesario cubrir el recipiente con aluminio e incubarla a

temperatura ambiente.

Ahora, para la construcción de la curva de calibración o curva

patrón se toman 10 mg de Trolox y se diluyen en 10 mL de

metanol al 100%. Luego , se hacen los estándares de 0.1 mg/L ,

0.2 mg/L, 0.5 mg/L , 0.7 mg/L y 1 mg/L. Para ello se toman 125

7

μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL y 1000 µL del stock a cada estándar

y se agregan 900 μL , 800 μL, 600 μL, 200 μL de metanol al

90% de forma respectiva. Siguiendo con lo anterior, se preparan

0.01mg/L , 0.02 mg/L , 0.05 mg/L , 0.07 mg/L y 0.1 mg/L

tomando 100 μL de cada uno de los estándares anteriormente

preparados y diluyéndolos con 900 µL de metanol. Finalmente,

se construye la curva de calibración midiendo la absorbancia de

cada una de las muestras patrón (eje Y) y este valor se compara

con la concentración de trolox (eje X). De la ecuación que

modela la curva de calibración se obtiene un valor expresado en

μmol de trolox / mL muestra y para convertir este valor a μmol

de trolox /g muestra se usa la ecuación (1).

𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑇𝑟𝑜𝑙𝑜𝑥

𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=

𝐶 . 𝑉

𝑀 ( 1)

Donde:

✓ C : Concentración en μmol de trolox / mL muestra

✓ V: Volumen utilizado para la extracción de las muestras

(mL)

✓ M : Masa de muestra, utilizada para la extracción (g)

Por otro lado, se disponen 100 mL de extracto de cáscara de café

en un vaso precipitado del cual se extraen diferentes volúmenes

(1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL y 5 mL). Estas son puestas por

separado en balones aforados de 10 mL, se llevan a aforo con

metanol al 99% y se agitan manualmente. Una vez se tiene estas

soluciones, se toman 1 mL de cada una de ellas y se disponen en

balones aforados de 10 mL para posteriormente agregarles 3 mL

de solución de DPPH y aforar con metanol al 99%. Por último,

se mantienen las muestras en la oscuridad durante 30 minutos

[39]. Por último, se realiza la prueba de espectrofotometría, para

ello se establece como blanco y/o control al metanol al 99% y se

mide la absorbancia para cada una de las muestras anteriormente

mencionadas, a una longitud de onda de 517 nm [40]. Una vez

se hace el respectivo tratamiento de los datos, haciendo uso de

la curva de muestras estándar, se determina el resultado de la

capacidad antioxidante en la muestra de interés como capacidad

antioxidante equivalente a trolox (TEAC).

D. Determinación de la fibra dietaria total en la cáscara de

café.

Se lleva a cabo según el método de Prosky [41], el cual consiste

en un método enzimático-gravimétrico de determinación de

fibra alimentaria que se fundamenta en la digestión de las

muestras con α-amilasa, proteasa y amiloglucosidasa con el

objetivo de eliminar la proteína y el almidón presentes en las

mismas. Así mismo, este método sugiere que el contenido en

fibra dietaria total (FDT) puede ser calculado como la suma

simple entre el contenido de fibra dietaria soluble (FDS) e

insoluble (FDI). Por último, este método ha sido adoptado por

la AOAC (Association of Official Analytical Chemist) y se

utiliza para determinar por separado la fibra dietaria insoluble

(FDI) y la fibra dietaria soluble (FDS) bajo el códex de métodos

de análisis 991.42 (AOAC, 1995a) y 993.19 (AOAC,1995b).

Teniendo en cuenta lo anterior y siguiendo los lineamientos de

la AOAC, se realizó el siguiente esquema experimental:

- Aislamiento del residuo de fibra presente en la cáscara

deshidratada de café.

Se pesan 0.5 gramos de muestra de epicarpio seco de café y

vierten en un erlenmeyer de 500 mL. Luego, se añaden 50 mL

de tampón fosfato a un pH ácido (pH=6) , se monitorea este

valor, mediante un multiparámetro (SevenMultiTM , METTLER

TOLEDO) y se realizan ajustes de ser necesario. A

continuación, se añaden 0.1 mL de α-amilasa, se agita

manualmente y se cubre el recipiente con papel aluminio para

luego introducirlo en baño de agua a ebullición con agitación

constante (Bath Shaker, OVAN) durante 30 minutos. Luego, se

enfría a temperatura ambiente y se añade hidróxido sódico

𝑁𝑎𝑂𝐻 0.3 M con el fin de ajustar el pH a 7.5 ± 0.1. Ahora, se

añaden 5 mg de proteasa, se agita y se incuba a 60 °C durante

30 minutos con agitación constante (Incubadora Shaker,

ThermoFisher). Luego se deja enfriar a temperatura ambiente y

se añaden 10 mL de ácido clorhídrico HCl 0.3 M y se mide el

pH , el cual debería oscilar entre 4.5±0.2. Finalmente, se añaden

0.1 mL de amiloglucosidasa, se agita y se incuba de nuevo a 60

°C durante 30 minutos con agitación constante.

-Determinación Fibra Dietaria Insoluble (FDI)

Se emplea un crisol de vidrio de placa filtrante (porosidad N°2)

con el fin de filtrar el líquido que contiene la fibra aislada.

Siendo así, antes de filtrar, se le agregan 0.5 gramos de celite

(06858, Sigma-Aldrich) y se somete a incineración. Así mismo,

se añade agua destilada y se aplica vacío con el fin de humedecer

y distribuir de forma homogénea la capa de celite. Una vez

efectuada la filtración a vacío, se lava el residuo con dos

porciones de 10 mL de agua destilada y el líquido filtrado tantos

los lavados se almacenan para luego determinar la fibra soluble

(FDS). Finalmente, el residuo restante se lava con dos porciones

de 10 mL de etanol al 95% y otras dos porciones de 10 mL de

acetona. Por último, los crisoles se secan en horno de

convección forzada (UN450Plus , Memmert) a 105 °C durante

6 a 8 horas. Luego se enfrían a temperatura ambiente en

desecador y se pesan. Obteniendo así, el comúnmente

denominado residuo insoluble (RI).

-Determinación de Fibra Dietaria Soluble (FDS)

El material filtrado, obteniendo previamente, se vierte en un

erlenmeyer de 500 mL y se le añade etanol al 95% en un

volumen equivalente a 4 veces el volumen de filtrado y se deja

reposar por 8 horas. Pasado este tiempo, los líquidos se filtran

en un crisol (porosidad N°2) con 0.5 gramos de celite

previamente pesado e incinerado. Antes de filtrar, se distribuye

la capa de celite con etanol al 78%, aplicando vacío para secarla

y homogeneizarla. Finalmente, el residuo obtenido tras la

filtración a vacío se lava con tres porciones de 20 mL de etanol

al 78%, dos porciones de 10 mL de etanol al 96% y dos

8

porciones de 10 mL de acetona. Acto seguido, el crisol se seca

en un horno de convección forzada (UN450Plus, Memmert) a

105 °C durante 6 a 8 horas. Por último, se enfría a temperatura

ambiente en desecador y se pesa, obteniendo así el comúnmente

llamao residuo soluble (RS).

-Determinación Fibra Dietaria Total (FDT)

Una vez se tienen los residuos secos solubles (RS) e insolubles

(RI) determinados anteriormente, estos se ponen una vez más en

un desecador durante 50 minutos, se pesan y cada uno de ellos

se somete a un análisis de ceniza en una mufla a 550 °C durante

4 horas según el método AOAC 923.03 y a un análisis de

proteínas según el método AOAC 920.87.

El método AOAC 923.03 se fundamenta en la pérdida por

ignición de todos los componentes orgánicos hasta conseguir la

obtención de un residuo mineral. Para lograr lo anterior, resulta

necesario colocar el crisol (sin la muestra) a 103 °C en el horno

(UN450Plus, Memmert) por 60 minutos y luego se pasa a un

desecador en el cual se le permite reposar durante 50 minutos.

Acto seguido, se pesa el crisol solo y luego se pesa el crisol con

la muestra y/o residuos anteriormente determinados. Posterior

a ello, se pasa el crisol con la muestra a una mufla en la cual es

sometida a un calentamiento de 300 °C, 350 °C y 550 °C durante

15, 60 y 240 minutos, respectivamente. Finalmente se saca de la

mufla y se deja enfriar a temperatura ambiente para luego

colocarla en un desecador por 50 minutos y pesar el crisol con

la ceniza. Siendo así, para hallar el contenido en ceniza, se utiliza

la ecuación (2).

%𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎 =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎∗ 100 (2)

Para llevar a cabo el protocolo AOAC 920.87 basado en el

método de Kjeldahl, se pesa la muestra y/o residuos

anteriormente cuantificados y se introducen en una unidad de

digestión ( KjelDigester K-446 , BÜCHI) , a la cual se agrega

una placa catalizadora Kjeldahl y 20 mL de ácido sulfúrico

(𝐻2𝑆𝑂4) al 98%. Acto seguido, se programa la temperatura por

1 hora en el nivel 4 del digestor para luego incrementarla a la

máxima temperatura de operación del equipo, hasta que la

muestra se torne en un color verde brillante. Posterior a ello, se

deja enfriar el tubo anteriormente introducido al digestor y se le

agrega 50 mL de agua destilada. De forma paralela en un matraz

erlenmeyer de 250 mL se agregan 50 mL de ácido bórico

(𝐻3𝐵𝑂4) al 2% p/v y 3 gotas de indicador mixto ( Part N° 318728-20 mL , Sigma-Aldrich). Luego, se coloca el tubo con el

agua destilada en el destilador (KjelFlex K-360, BÜCHI) y se le

agregan 150 mL de hidróxido sódico (𝑁𝑎𝑂𝐻). El destilado se

dispone en el erlenmeyer que contiene el ácido bórico hasta que

su volumen sea aproximadamente igual a 200 mL. Esta última,

se titula con ácido clorhídrico (𝐻𝐶𝑙) con una concentración de

0.1 N hasta que su viraje sea de verde a color purpura.

Finalmente, a partir de la ecuación (3) se calcula el contenido en

nitrógeno en la muestra a partir de la cantidad de amoniaco

(𝑁𝐻3) producido. Así mismo, para relacionar el contenido de

nitrógeno del residuo con el contenido de proteína en este, se

empleó un factor de conversión de 6.25 [42] .

%𝑁𝑖𝑡𝑟ó𝑔𝑒𝑛𝑜 =𝑉𝐻𝐶𝑙 ∗ 𝑁𝐻𝐶𝑙 ∗ 14

1000 ∗ 𝑊𝑚∗ 100 (3)

Donde:

✓ 𝑉𝐻𝐶𝑙 : Volumen de 𝐻𝐶𝑙 gastado en la titulación (mL)

✓ 𝑁𝐻𝐶𝑙 : Normalidad del 𝐻𝐶𝑙 (0.1 N)

✓ 𝑊𝑚 : Peso de la muestra (g)

El porcentaje de proteína se calcula entonces como la

multiplicación simple del porcentaje de nitrógeno y el factor de

conversión de 6.25. Una vez se conocen todas estas variables

provenientes de los protocolos AOAC 923.03 y AOAC 920.87,

se procede a calcular el porcentaje de fibra dietaria soluble

(FDS) y fibra dietaria insoluble (FDI) presentes en la muestra

de estudio, según las ecuaciones (4) y (5). Aquí, vale la pena

señalar que estudios hechos por Prosky muestran que el

contenido total de fibra dietaria (FDT) puede calcularse como

la suma del contenido en FDI y FDS [41].

% 𝐹𝐷𝐼 =𝑅𝐼 − 𝑃 − 𝐶

𝑀∗ 100 (4)

% 𝐹𝐷𝑆 =𝑅𝑆 − 𝑃 − 𝐶

𝑀∗ 100 (5)

Donde:

✓ 𝑅𝐼 y 𝑅𝑆 : Residuo insoluble y Residuo soluble (g)

✓ 𝑃: Contenido en proteína (g)

✓ 𝐶: Contenido en cenizas (g)

✓ 𝑀: Peso de la muestra (g)

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A. Análisis e interpretación de los resultados de la prueba

sensorial

A los 50 panelistas se les solicitó indicar cuanto les agradaba

cada muestra, asignando de esta forma un valor a cada atributo

según la categoría reportada en la escala del Anexo 2, la cual se

asignó desde “me disgusta mucho” hasta “me gusta mucho” para

la escala hedónica de 9 puntos y desde “muy poco astringente o

amargo” hasta “muy amargo o astringente” para la escala JAR

de 5 puntos. Los encuestados, tomaron de 4 diferentes bebidas

funcionales preparadas según las concentraciones de la Tabla 1

y la información demográfica de los encuestados se presenta en

la Tabla 2.

Los resultados presentados en la anterior tabla se encuentran

relacionados con la cultura de consumo de café en la región de

Santander, el cual es uno de los departamentos que presentan un

9

mayor consumo de este preciado grano en Colombia, seguido

por los departamentos de Cundinamarca y Boyacá [43]. Así

mismo, vale la pena señalar que la cuarentena por la pandemia a

cauda del biológico Sars-Cov-2 trajo consigo un aumento de casi

el 80% del consumo del café en el país [44]. Partiendo de lo

anterior, se puede afirmar con certeza que el café se ha

convertido en parte de la dieta diaria de los colombianos y su

consumo total diario en el país corresponde a aproximadamente

21.6 millones de tazas de café, según los últimos reportes de la

Federación Nacional de Cafeteros [45] , lo que equivaldría a 2.1

kilogramos de café per cápita por año con una tendencia a

aumentar su consumo en los próximos años [46].

Ahora, para determinar la influencia de los atributos evaluados

sobre la percepción sensorial de las panelistas en las diferentes

formulaciones, se realiza un análisis de varianza de un solo

factor (ANOVA) con comparación múltiple de Tukey haciendo

uso del software Minitab 19 con un intervalo de confianza del

95%. Siendo así se define el tipo de formulación como único

factor de estudio y se plantea un diseño experimental con cinco

variables de respuesta que corresponden a los atributos

sensoriales evaluados y cuatro tratamientos o niveles del factor,

relacionados con cada una de las formulaciones y/o bebidas

preparadas. Aquí, vale la pena señalar que se trata de un diseño

experimental balanceado, lo cual implica que el tamaño de las

muestras es igual en cada tratamiento. Dicho de otra forma, se

tiene un número de observaciones que resulta igual para todas

las combinaciones posibles de los niveles del factor evaluado

[47].

Teniendo en cuenta lo anterior, la hipótesis nula plantea que no

hay diferencia significativa entre las medias de cada una de las

formulaciones y/o tratamientos por cada atributo sensorial

evaluado y la hipótesis alternativa sugiere que al menos uno de

los atributos difiere significativamente de los demás en al menos

uno de los parámetros evaluados. Finalmente, se introducen los

datos en Minitab 19, se hace el respectivo tratamiento de estos y

se obtienen los resultados estadísticos que se presentan en la

Tabla 4.

Tabla 4. Resultados Estadísticos (Método Tuckey_Minitab 19)

para diferentes atributos comparando las cuatro bebidas **.

FORMULACIONES

AT

RIB

UT

OS

*

B1 B2 B3 B4

M1 4.8(2.6)b 7.2(1.6)a 4.8(2.0)b 2.7(1.4)c

M2 4.4(2.2)b 7.1(1.5)a 4.7(1.9)b 2.6(1.6)c

M3 4.4(2.5)b 6.8(1.6)a 4.4(1.9)b 2.8(1.9)c

M4 4.2(2.5)b 7.0(1.8)a 4.1(2.0)b 2.7(1.7)c

M5 2.8(1.2)b 4.1(0.8)a 2.9(1.1)b 1.7(0.9)c

*Las medias que no comparten una letra indican que hay

diferencias significativas con un 95% de confianza entre las

cuatro bebidas para cada atributo evaluado. Media (DE).

**Las formulaciones como los atributos están codificados

según el Anexo 1 y los resultados de las pruebas ANOVA en el

Anexo 3.

Al realizar la prueba de Tukey se puede observar que la bebida

con mayor aceptación es la B2, ya que posee un mayor criterio

de aceptación dentro de los puntos establecidos por la escala

hedónica. Esto implica que la media promedio de los atributos

evaluados para la formulación B2 es significativamente mayor a

las demás formulaciones. Aquí vale la pena señalar que, según

los resultados obtenidos, existe suficiente evidencia estadística

para manifestar que con un intervalo de 95% de confianza, las

formulaciones B1 y B3 no son significativamente diferentes en

todos sus atributos (aceptabilidad global, intención de compra,

color, sabor y aroma). Mientras que, para las demás

formulaciones, se puede concluir que existe una diferencia

estadística significativa entre cada uno de los atributos

evaluados en las diferentes formulaciones. Así mismo, con los

resultados obtenidos se puede establecer una escala de

aceptabilidad en orden ascendente como B4,B1,B3 y B2 siendo

B4 la bebida con menos aceptación y B2 la bebida con mayor

aceptación por parte de los panelistas.

Análisis e interpretación de las escalas JAR (amargor y

astringencia) .

El uso de escalas de punto ideal o Just About Right (JAR)

constituye una técnica de análisis sensorial que resulta bastante

útil durante la optimización y desarrollo de un producto

alimenticio. Siendo así, esta metodología ha permitido que la

industria alimenticia se adapte a las fluctuaciones del mercado y

las necesidades del consumidor, pues permiten evaluar la

adecuación de la intensidad de los atributos sensoriales de un

producto [48].

Una vez se determina la bebida de mayor aceptabilidad por parte

de los panelistas (formulación B2) se procede a realizar un

análisis mediante escala JAR, evaluando la optimización de los

atributos de amargor y astringencia en dicha bebida. Siendo así,

se utiliza una escala JAR de 5 puntos, donde el valor 3 es un

atributo que representa lo “Lo justo” mientras que los valores 1

y 2, representan los niveles que se encuentran a la derecha de

“Lo justo” y los valores 4 y 5, representan los niveles que se

encuentran a la izquierda de este último. Por ejemplo, para la

astringencia, el valor 1 sería “Muy poco astringente” y el valor

2 sería “Poco astringente” mientras que el valor 4 sería “Un poco

astringente” y el valor 5 sería “Muy astringente”.

Siguiendo con lo anterior, para realizar los cálculos y gráficas

que permiten analizar los resultados de la astringencia y el

amargor en la percepción sensorial de los panelistas, una técnica

comúnmente utilizada es la de combinar los dos niveles que

están por debajo de lo ideal (valores 1 y 2) y los dos que se

encuentran por encima de lo ideal (valores 4 y 5), obteniéndose

así la figura 1 (“Demasiado bajo” equivale a puntuaciones 1 y

2; “JAR” equivale a puntuación 3 y “Demasiado alto” equivale

a la puntuación 4 y 5). Tras realizar la gráfica de JAR que indica

la escala de punto ideal para los encuestados en función de la

astringencia (figura 1A) y el amargor (figura 1B) es posible

observar que las formulaciones B1, B2, B3 y B4 deberían ser

optimizadas, siendo B1, B2 y B3 aquellas con un alto porcentaje

de jueces que considera que el producto tiene una astringencia

10

demasiado baja, mientras que B4 muestra todo lo contrario, con

una alta cantidad de jueces que considera que la astringencia es

muy alta. Así mismo, la formulación B3 permite ver que existe

una cantidad superior a 20 % por ambos lados de JAR, lo cual

indica en principio que se tienen grupos de consumidores con

gustos significativamente diferentes.

Ahora, para el caso del amargor se observa que en las

formulaciones B4 y B3 este atributo presenta una percepción

mayoritaria por parte de panelistas que lo cataloga como

demasiado alto, mientras que para las formulaciones B1 y B2, la

percepción de este atributo es catalogada por la mayoría de los

panelistas como demasiada baja, siendo la formulación B1 como

aquella donde se ve más pronunciado este intributo de baja

intensidad del amargor, seguido de la formulación B2. De este

modo, se puede concluir que las cuatro formulaciones deberían

ser revisadas, pues en ninguna de estas el porcentaje de jueces

que marcaron JAR o “Lo ideal” es mayor o igual al 75% , por lo

tanto, ambos atributos deberían ser optimizados en cada una de

las formulaciones. Pese a lo anterior, vale la pena resaltar que la

formulación B3 es aquella que presenta un mejor nivel de

idealidad en la astringencia y la formulación B2 es aquella que

presenta un mejor nivel de idealidad en amargor en comparación

con las demás formulaciones.

Figura 1. Porcentajes para escala JAR de 3 niveles para la

astringencia (A) y el amargor (B).

De este modo, pese a que con los anteriores datos es posible

deducir la existencia de atributos que evidentemente no se

encuentran bien optimizados, resulta necesario combinarlos con

los datos de aceptabilidad global y la intención de compra del

producto, pues podría generarse el caso en que los panelistas

hayan dicho que el producto les parece un poco amargo, pero en

la aceptación global hayan asignado un 9 (“Me gusta mucho”) y

en la intención de compra hayan puesto un 5 (“Seguro que si”).

Esta situación indicaría de inmediato que el amargor no es un

atributo clave en la aceptación del producto y la intención de

compra de este, lo que significaría que una mejora en el amargor

no conllevaría un aumento importante en la aceptación de este.

Siendo así, se emplea el análisis de penalizaciones, para ver este

aspecto.

Siguiendo con lo anterior, para el análisis de penalizaciones se

puede considerar que el efecto del atributo de astringencia y

amargor en la aceptación global del producto y la intención de

compra resulta poco importante, cuando la penalización es

inferior a 1 y cuando el porcentaje de jueces con puntuaciones

diferentes de JAR es inferior al 20% . Se puede observar

entonces en la Tabla 5 que para la formulación B1, el amargor

y la astringencia son atributos que influyen significativamente

sobre la aceptabilidad global y la intención de compra de esta

bebida, pues se tiene un alto valor de penalización (>1) y un alto

porcentaje de jueces (>80%) . Siendo así, se deben centrar los

esfuerzos en mejorar la astringencia y el amargor (aumentar la

percepción sensorial de los atributos) si se quiere aumentar la

aceptación y la intención de compra de esta formulación. Ahora,

para la formulación B2, se puede apreciar que, aunque el sabor

amargo y astringente han sido seleccionados como “Demasiado

bajo” por un gran porcentaje de panelistas (>40%), esto apenas

ha penalizado a la hora de valorar la aceptación global y la

intención de compra. Así mismo, pese a que la astringencia,

seleccionada como “Demasiada alta”, tiene un alto valor de

penalización (>1), escasamente ha logrado penalizar la

aceptabilidad global e intención de compra, pues un bajo

porcentaje de jueces hizo esta elección (<20%). Ahora, el

parámetro restante ha obtenido valores de penalización bajos

(<1) y porcentaje de jueces bajos (<20%). Finalmente, se puede

concluir que mejorar los parámetros de amargor y astringencia

en esta formulación no posee una relevancia significativa sobre

la intención de compra y aceptabilidad global de esta. Lo

anterior resulta meritorio, pues la formulación B2 coincide con

el producto mayormente aceptado por los panelistas, según el

análisis estadístico dispuesto en la Tabla 4, siendo así, se puede

decir que pese a que no se encuentra optimizada la formulación

con mayor grado de aceptabilidad (según el análisis JAR), una

mejora en los atributos de amargor y astringencia no incide

significativamente sobre la aceptabilidad global y la intención

de compra de esta.

Así mismo, para la formulación B3, se puede observar que el

sabor amargo y astringente, seleccionado como “Demasiado

bajo” resulta poco significativo tanto en la aceptación global del

producto como en la intención de compra, pues poseen valores

bajos de penalización (<1) y en el caso del amargor bajo

porcentaje de jueces (<20%). Por otro lado, los altos porcentajes

en jueces (>20%) y valores altos en penalización (>1) para la

astringencia y amargor catalogados como “Demasiado alto”

11

convierten a estos atributos en aquellos que se deben mejorar

(reducir la percepción sensorial de astringencia y amargor) con

el fin de mejorar la aceptabilidad global y aumentar la intención

de compra de esta formulación. Finalmente, en la formulación

B4 se puede apreciar que, el sabor amargo y astringente tanto en

su nivel “Demasiado alto” como “Demasiado bajo” no influye

significativamente sobre la aceptabilidad global y la intención

de compra de esta formulación. Lo anterior debido a que, en

general todos los atributos poseen niveles bajos de penalización

(<1), además para los atributos de demasiado amargo y

astringente, pese a que se tiene un alto porcentaje de jueces

(>20%), esto apenas ha penalizado al momento de valorar la

aceptación global y la intención de compra.

En síntesis, todas las formulaciones necesitan ser optimizadas

según el análisis JAR, sin embargo, una mejora en los atributos

de astringencia y amargor en las formulaciones B2 y B4 no

tendría una incidencia significativa sobre la aceptabilidad global

y la intención de compra de estas. Mientras que una mejora de

dichos atributos en las formulaciones B1 (aumentar amargor y

astringencia) y B3 (disminuir amargor y astringencia)

conllevaría a un incremento positivo en la intención de compra

y la aceptabilidad global de estas dos formulaciones. De este

modo, resulta importante destacar que para el caso concreto de

la formulación con mayor aceptabilidad global (B2) , no sería

necesario mejorar los atributos de astringencia y amargor, pues

estos no tuvieron una relevancia significativa sobre la

aceptabilidad global e intención de compra de la bebida.

Tabla 5 . Porcentaje de jueces en cada grupo y penalizaciones

para cada atributo **.

Grupo Atributo Nivel %Jueces MDG* MDI*

B1

Astringencia Demasiado bajo 88 2.8 1.2

Demasiado alto 0 - -

Amargor Demasiado bajo 88 3.6 1.5

Demasiado alto 0 - -

B2

Astringencia Demasiado bajo 66 -0.8 0

Demasiado alto 2 3.8 2.1



B3

Astringencia Demasiado bajo 44 -0.1 -0.3




B4

Astringencia Demasiado bajo 4 1.1 0.9


Amargor Demasiado bajo 0 - -

Demasiado alto 96 -0.9 0.3

*Penalizaciones o Mean Drops para la aceptabilidad global (MDG) y

la intención de compra del producto (MDI).

**Los gráficos de penalizaciones pueden encontrar en el Anexo

4 del presente documento.

B. Análisis del contenido en compuestos fenólicos en la

cáscara de café

La identificación de los compuestos se confirmó utilizando el

modo cromatograma de iones extraídos (EIC), la medición de

masas exactas con un intervalo de sensibilidad ∆𝑝𝑝𝑚 < 0.001

y usando una solución estándar de los compuestos fenólicos.

Para la cuantificación en las muestras, se empleó la técnica de

estandarización externa. Siendo así, se utilizó el factor de

respuesta (𝑅𝑓) establecido del análisis de las soluciones estándar

en diferentes concentraciones.

Siguiendo con lo anterior, en la Tabla 6 se reportan los tiempos

de retención 𝑡𝑅 de los ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido p-

hidroxibenzoico, ácido vanílico, ácido felúrico, ácido caféico,

ácido p-cumárico, ácido rosmarínico y ácido carnósico),

catequinas (C,EGCG,EC,ECG,EGC), xantinas (cafeína,

teobromina y teofilina), flavonoides (quercetina, naringenina,

luteolina, kaempferol, pinocembrina, apigenina) y antocianinas

(cianidina 3-rutinosido, pelargodina 3-glucósido, quercetina 3-

glucósido) obtenidos por UHPLC-ESI+-Orbitrap-MS.

Tabla 6. Listado de tiempos de retención (𝑡𝑅) para los

diferentes compuestos de las soluciones estándar.

Grupo Sustancias 𝑡𝑅[𝑚𝑖𝑛] [M+M]+

(m/z)

Xantinas Cafeína 4.8 195.1

Teobromina 3.2 181.1

Teofilina 4.0 181.1

Catequinas

Catequina (C) 4.1 291.1

Epigalocateqina

galato (EGCG) 4.8 459.1

Epicatequina (EC) 4.9 291.1

Epicatequina

galato (ECG) 5.6 443.1

Epigalocateqina (EGC)

4.0 307.1

Flavonoides

Ácido cafeico 4.9 181.0 Ácido p-cumárico 5.8 165.0

Ácido rosmarínico 6.9 361.1

Ácido p-

hidroxibenzoico 4.2 139.0

Naringenina 8.1 273.1

Ácido felúrico 6.1 195.1

Ácido vanílico 4.8 169.0

Pinocembrina 9.5 257.1 Apigenina 9.1 271.1

Ácido carnósico 10.8 333.2

Ácido ursólico 14.1 457.4

Antocianinas

Pelargonidina 7.4 271.1

Pelargonidina 3-

Glucósido 5.4 433.1

Quercetina 3-

Glucósido 6.8 465.1

A partir de las soluciones estándar anteriores, se determina la

presencia de determinados compuestos químicos pertenecientes

a la familia de las xantinas, catequinas, flavonoides y

12

antocianinas en la muestra de interés (extracto acuoso de cáscara

de café deshidratada). Una vez se tienen los fragmentogramas

de masas (Ver Anexo 5) de los compuestos de interés, se

procede a comparar con los espectros patrones de las sustancias

tabuladas en la Tabla 6. Posterior a ello, se logran identificar las

sustancias separadas por cromatografía liquida (UHPLC-ESI+-

Orbitrap-MS). Siendo así, en la Tabla 7 se reportan los

compuestos identificados por la técnica anteriormente

mencionada con un nivel mínimo de cuantificación de

0.01 𝑚𝑔/𝑘𝑔.

Tabla 7. Compuestos determinados (sustancias presentes en la

mezcla de referencia) por UHPLC-ESI+-Orbitrap-MS.

Compuesto NMC*

[mg·Kg-1]

Concentración en las muestras

[mg·Kg-1]

Teobromina 0.01 26.5

Teofilina 0.01 18.0

Cafeína 0.01 813.3

Epicatequina (EC) 0.01 6.0

Catequina (C) 0.01 1.8

Naringenina 0.01 0.51

Pinocembrina 0.01 0.44

Quercetina 3-glucósido 0.01 90.9

NMC, Nivel mínimo de cuantificación.

A partir de la Tabla 7 se puede observar que el 89.6% de los

compuestos fenólicos detectados por UHPLC-ESI+-Orbitrap-

MS se encuentra representado por derivados del grupo químico

de las xantinas: cafeína (84.9 %), teobromina (2.8 %) y teofilina

(1.9%). De este modo, las antocianinas representadas por la

quercetenia-3-glucósido representan el 9.5% de los compuestos

cuantificados por la técnica mencionada anteriormente.

Finalmente, las catequinas ( epicatequina (EC) y catequina (C))

y las flavanonas ( naringenina y pinocembrina) representan el

0.81% y el 0.1 % respectivamente del contenido total de

compuestos fenólicos detectados. Es importante señalar que las

antocianinas, las catequinas y las flavanonas, se clasifican

dentro del grupo de los flavonoides y por tal razón, se puede

manifestar que este grupo químico ocupa el 14.6% de los

compuestos fenólicos detectados por UHPLC-ESI+-Orbitrap-

MS [49].

Por otro lado, con el fin de tener un punto de referencia

comparativo entre dos técnicas de muestreo diferentes, se

determinó el contenido en cafeína mediante cromatografía

liquida de alta resolución acoplada con espectrometría UV – VIS

(HPLC-UV) ( Ver Anexo 6). Siendo así, mediante esta técnica se

obtuvo un contenido de 6.8 ± 0.1 mg/g muestra de cafeína, el

cual posee una significativa diferencia con el hallado mediante

la técnica UHPLC-ESI+-Orbitrap-MS obteniendo de este último

un valor de 0.8 ± 0.0 mg/g muestra. Lo anterior se debe

principalmente a que para la primera técnica existe la posibilidad

de que además de cafeína se esté determinando otro compuesto

perteneciente a las metilxantinas y que pueda absorber una

longitud de onda similar a la del compuesto de interés. Así

mismo, se ha demostrado que el uso del sistema UHPLC-

MS/MS para separar compuestos fenólicos permite un análisis

más sensible y rápido que el HPLC-UV convencional, logrando

demostrar que el detector UV del sistema HPLC usualmente

presenta una sobreestimación para el ácido clorogénico [50]. Lo

anterior, puede explicarse por la coelución del ácido clorogénico

con un compuesto menor que absorbe UV desconocido como se

mencionó anteriormente. Así mismo, el valor de cafeína

reportado en la literatura para la cáscara deshidratada de café

variedad arábica, se encuentra alrededor de 1.4 mg/g muestra

[51] lo que implica un error experimental de aproximadamente

43% asociado a la técnica de UHPLC-ESI+-Orbitrap-MS.

Siendo así, se puede afirmar que resulta más fiable el valor

arrojado por este último método de cuantificación de

compuestos fenólicos.

En lo que concierne a los resultados encontrados, es necesario

manifestar que actualmente la información disponible en la

literatura a cerca de la caracterización fisicoquímica de la pulpa

de café deshidratada lista para preparar infusiones es escasa,

pues la mayoría de las investigaciones centran sus esfuerzos en

el análisis de esta pulpa ya sea fresca y/o fermentada. Pese a lo

anterior, los resultados asociados al análisis de la pulpa fresca

permiten dimensionar la magnitud de los valores hallados

experimentalmente con los reportados en la literatura. Se ha

demostrado que, en una pulpa de café de variedad arábica, a la

cual se le ha permitido secar a condiciones ambiente durante tres

días, el contenido fenólico disminuye considerablemente en un

rango aproximado de 14% en comparación con la pulpa fresca

[52]. Teniendo en cuenta lo anterior, se puede manifestar que los

resultados encontrados tras la experimentación coinciden con lo

encontrado en la literatura para la cáscara de café lista para

preparar infusiones y/o bebidas aromáticas, pues mediante

técnicas similares de cuantificación o determinación, se ha

encontrado que la cáscara de café se encuentra constituida

principalmente por xantinas y flavonoides, con un contenido

mayor de la primera especie química en comparación con la

segunda [53].

Ahora, los derivados naturales de las xantinas se constituyen

como compuestos purínicos que se sintetizan de forma natural

en las plantas como mecanismo de defensa contra patógenos y

depredadores. Estos derivados son caracterizados

principalmente por sus propiedades de inhibición no específica

de las enzimas fosfodiesterasas y tienen una amplia variedad de

aplicaciones terapéuticas tales como antagonistas del receptor de

adenosina, inductores de la actividad de histona desacetilasa,

actividad antitumoral, antiasmática y psicoestimulante, entre

otras [54]. No obstante, una dosis elevada de estos componentes

en el organismo puede producir también ansiedad y disforia, así

como también trastornos del sueño. Así mismo, las xantinas

como la cafeína y la teofilina incrementan la frecuencia cardiaca

y la presión arterial de forma transitoria lo cual debe ser tenido

cuenta por consumidores con patologías como la hipertensión o

enfermedades cardiovasculares [55].

Siguiendo con lo anterior, vale la pena señalar que los granos

de café poseen un contenido mucho mayor de flavonoides y

xantinas en comparación con la cáscara o pulpa de este [56].

13

Pese a ello, aunque los extractos acuosos del grano se consideren

superiores en estas características fisicoquímicas, se puede

afirmar que los resultados obtenidos a partir del extracto acuoso

de la cáscara resultan significativos y de alto potencial en

beneficio de la salud del consumidor, lo que hace aprovechable

este subproducto del procesamiento del café para la elaboración

de bebidas aromáticas con características funcionales. Siendo sí,

el contenido en metilxantinas (teofilina, teobromina y cafeína)

resulta bajo en comparación a los valores normales reportados

para bebidas aromáticas preparadas a partir de las hojas del té

negras (32.8 mg/g de cafeína) y verdes (36.6 mg/g de cafeína) y

té Formosa Oolong (23.8 mg/g de cafeína), los cuales a su vez

tienen un contenido de 1.65 mg/g , 0 mg/g y 0.65 mg/g de

teobromina respectivamente [57]. Lo anterior, se constituye

como elemento clave de valorización del producto en estudio

(aromática de pulpa de café) pues su bajo contenido en xantinas

hace que poblaciones sensibles a estos componentes, puedan

acceder al consumo de una bebida con propiedades

antioxidantes (como la elaborada a partir del grano del café) sin

preocupaciones.

De igual forma, los flavonoides son los responsables del

pigmento rojo de la cáscara madura de café variedad arábica.

Estos a su vez se encuentran involucrados en la filtración

ultravioleta, la fijación simbiótica de nitrógeno y actúan como

mensajeros químicos, reguladores fisiológicos e inhibidores del

ciclo celular y de organismos patogénicos [58]. El organismo

humano, no produce estas sustancias químicas de acción

protectora, por lo cual es necesario que las obtenga de su

alimentación o a través de suplementos de origen nutraceútico.

Las excelentes propiedades de quelación del hierro y otros

metales de transición confieren a este grupo químico una gran

capacidad antioxidante y por ende previenen el daño oxidativo

en el organismo y generan un efecto terapéutico en múltiples

patologías como la cardiopatía isquémica, la aterosclerosis o

inclusive el cáncer. El mecanismo de acción antirradicales libres

se dirige hacia los radicales hidroxilo y superóxido, especies

implicadas en el inicio de peroxidación lipídica y además se ha

demostrado su capacidad de transformar e interferir en la síntesis

de eicosanoides (lo que otorga respuestas anti-prostanoide y

anti-inflamatoria), prevenir la agregación plaquetaria (

respuestas antitrombóticas) y proteger a las lipoproteínas de baja

densidad de la oxidación [59]. Además de estos efectos

antioxidantes, estudios recientes han mostrado que los

flavonoides juegan un rol fundamental en los sistemas

enzimáticos y receptores del cerebro, generando efectos

significativos sobre el sistema nervioso central, como la

prevención de enfermedades neurodegenerativas con la

esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la enfermedad de

Parkinson [58].

Adicionalmente a los efectos sobre la salud anteriormente

mencionados, los compuestos polifenólicos contienen una

acción directa sobre la calidad de los alimentos que los

contienen, pues interfieren en la percepción sensorial de estos.

Ejemplos muy puntuales de dicha interferencia en la percepción

sensorial, se puede ver en las antocianinas las cuales son

pigmentos responsables de color rojo de la pulpa del café

madura y de muchas frutas como las fresas, uvas, ciruelas, entre

otras. Las f1avanonas son responsables del sabor amargo de

algunos cítricos como por ejemplo la naringenina en el pomelo

o la neohesperidina en la naranja. Otros polifenoles como los

taninos y los ácidos hidroxicinámicos y sus derivados, confieren

astringencia a algunas frutas y dan lugar a frutos de color pardo,

respectivamente [60].

Teniendo en cuenta lo antes expuesto, la cáscara de café

deshidratada lista para preparar infusiones, puede considerarse

como una fuente rica en flavonoides, con un contenido de

aproximadamente 0.1 mg/g de flavonoides. Este valor resulta

significativo en comparación con los valores normales

reportados para la leche y el chocolate (1.2 mg/g), café de grano

( 0.2 mg/g), vino blanco ( 2.4 mg/g), cacao en polvo diluido en

agua (1.3 mg/g), jugo de frutas tropicales (1.2 mg/g), cerveza

regular (0.5 mg/g), champaña (0.3 mg/g), semillas de frijol (0.1

mg/g), habas (0.9 mg/g), conservas de uva (0.08 mg/g) y

guayaba (0.3 mg/g) y el té helado de limón (0.08 mg/g) [61].

Nótese entonces que la bebida aromática elaborada a partir de la

cáscara deshidratada del café brinda un contenido similar en

flavonoides que la bebida elaborada a partir de su fruto o grano.

Siendo así, el consumidor puede disfrutar de una bebida

funcional con propiedades antioxidantes y antiinflamatorias,

con un contenido menor de metilxantinas como la cafeína, si se

compara con una taza de café de grano. Así mismo, el consumo

de esta aromática contribuye a la ingesta recomendada diaria de

flavonoides, la cual oscila alrededor de 23 mg/día [62] .

C. Análisis del contenido en polifenoles totales en la cáscara

de café

Los polifenoles totales son responsables de las propiedades

antioxidantes en frutas, verduras, granos enteros y otros

materiales de origen vegetal [63]. El análisis de estos

compuestos es de gran importancia debido a la amplia variedad

biológica que presentan, siendo considerados de esta forma

como uno de los fitoquímicos más importantes por su

contribución al mantenimiento de la salud humana. De este

modo, existen numerosos estudios que indican una correlación

negativa entre la ingesta de compuestos fenólicos y el riesgo de

padecer patologías relacionadas con el estrés oxidativo,

incluyendo enfermedades cardiovasculares, cáncer, enfermedad

de Alzheimer, cataratas y otras disfunciones relacionadas con el

envejecimiento celular. Adicionalmente, se ha demostrado

también su efecto antiinflamatorio y su efecto preventivo en el

tratamiento del asma. Siguiendo con lo anterior, los efectos

anteriores ocurren debido a que la actividad biológica de los

polifenoles se encuentra ligada con su habilidad para quelar

metales e inhibir la actividad de la enzima lipooxigenasa y

actuar de esta forma como atrapadores de radicales libres y/o

agente antioxidante [60].

Teniendo en cuenta la importancia de los polifenoles en las

propiedades sensoriales y fitoquímicas de las frutas y su

contribución positiva a la salud humana, resulta necesario

cuantificar los polifenoles totales de la muestra de estudio. De

14

tal modo, mediante el ensayo de Folin-Ciocalteu (cuyo resultado

se expresa en equivalentes de ácido gálico (EAG) por gramos de

la muestra) se obtiene que la cáscara deshidratada de café

variedad arábica tipo Castillo presenta un contenido de 30.8 ±

2.3 mg EAG/ g muestra de polifenoles totales (Ver Anexo 7) .

Aquí es necesario destacar que se utiliza el ácido gálico como

sustancia patrón o estándar de medición, debido a su adecuada

estabilidad, alta solubilidad en agua y su bajo costo.

En otro orden de ideas, los compuestos fenólicos determinados

de forma individual en la muestra de estudio se encuentran

consignados en la Tabla 7 y la concentración total de estos

debería coincidir con el contenido total de polifenoles en la

muestra. Sin embargo, lo anterior no se satisface pues no se

tuvieron en cuenta algunos compuestos polifenólicos tales como

la cianidina 3-rutinósido, la cianidina, rutina, kaempferol 3-

glucósido, quercetina, luteolina, ácido protocatéquico, ácido

3,4-dicafeoilquínico, ácido 3,5-dicafeoilquínico, ácido 4,5-

dicafeoilquínico, ácido 5-feruloilquinico, entre otros. Esto

debido a que no se contó con disponibilidad de estos en el

laboratorio, para la elaboración del mix-estándar, por tal razón

se considera que los resultados obtenidos son coherentes pese a

no cumplir con la igualdad anteriormente mencionada.

Finalmente, es necesario destacar el hecho de que la cáscara de

café posee un contenido mucho mayor en polifenoles totales que

el grano de café convencional (8.3 mg EAG/g muestra) y que el

grano de café orgánico (8.9 mg EAG/ g muestra) recién tostado

[64]. Lo anterior coincide con lo encontrado en la literatura, pues

la cáscara de café variedad arábica fresca (recién recolectada) ,

generalmente exhibe un contenido mucho mayor de polifenoles

totales (21.1 mg EAG/g) en comparación con el contenido de

estas especies químicas en el grano o fruto de la planta. Ahora,

nótese que el valor hallado de forma experimental difiere en un

31.5% del reportado en literatura y esto se debe a que la cáscara

tratada en el presente trabajo se sometió a un proceso de secado

natural y se ha demostrado que un aumento en la temperatura

incide de forma proporcional en el contenido de polifenoles,

debido a que estos compuestos son altamente termolábiles y

además se descomponen fácilmente bajo el efecto de la

temperatura [65]. De este modo, se puede concluir que el valor

encontrado tras la experimentación resulta confiable, pues posee

una desviación ligera del valor reportado por la literatura.

Además de esto, vale la pena señalar que dicho valor es similar

al contenido en polifenoles totales de bebidas como el jugo de

manzana, el chocolate caliente, la cerveza y el té rojo [66].

D. Análisis de la capacidad antioxidante en la cáscara de

café.

La oxidación de biomoléculas como los lípidos, proteínas, ADN

se encuentra relacionada con el envejecimiento celular que da

lugar a patologías como enfermedades cardiovasculares, cáncer

y artritis reumatoide. Antioxidantes como los polifenoles son

moléculas altamente estables capaces de donar un electrón a un

radical libre e inhibir su capacidad de daño celular, lo cual

disminuye o previene el daño oxidativo reduciendo o retrasando

la incidencia de las enfermedades y patologías relacionadas con

el paso progresivo de los años [67].

Existen diferentes métodos documentados en la literatura para

la estimación de la actividad o capacidad antioxidante, y se

encuentran clasificados de acuerdo con el mecanismo del agente

antioxidante. Ejemplos de esto, es el mecanismo HAT

(transferencia de átomos de hidrógeno) que se basa en la

transferencia de un átomo hidrógeno y cuyo comportamiento se

evalúa a partir de técnicas como ORAC (capacidad de

absorbancia de radicales de oxígeno) y el mecanismo SET

(transferencia de un solo electrón) que consiste en la

transferencia de un electrón a un radical libre y resulta mediable

mediante técnicas como DPPH, ABTS y FRAP [68]. Para el

presente estudio se utilizó la técnica DPPH cuyo mecanismo se

basa en la reducción del reactivo 2.2 difenil-1-picrilhidrazil

(DPPH) y la medición de la disminución de la absorbancia,

producto de esta reducción. De este modo, se evidenció que la

capacidad antioxidante de la cáscara de café deshidratada se

debe a las acciones sinérgicas de los compuestos fenólicos y

otros compuestos bioactivos presentes en ella. Esta capacidad

antioxidante se expresa en comparación con la capacidad de

absorción de radicales de oxígeno o capacidad antioxidante

equivalente a Trolox, la cual está dada en µM Trolox

equivalente / g. p. f y se utiliza con mucha frecuencia en las

determinaciones de muestras biológicas in vitro.

De acuerdo con los resultados del Anexo 8 se observa que

mediante el ensayo DPPH se obtuvo una capacidad antioxidante

para la cáscara de café de 116.4 ± 0.1 TEAC ( µmol Trolox/g

muestra). Este valor coincide con los reportes en literatura, los

cuales ponen de manifiesto una capacidad antioxidante

equivalente a Trolox de aproximadamente 102.3 ± 0.6 µmol

Trolox/g muestra para una pulpa de café variedad arábica

sometida a secado natural [69]. Siendo así, se puede afirmar que

los resultados obtenidos resultan coherentes con lo reportado en

la literatura y por ende el resultado experimental llevado a cabo

en el presente estudio resulta confiable con un error

experimental de aproximadamente 14% . Por otro lado, según

reportes de literatura, el grano de café variedad arábica ha

reportado una capacidad antioxidante que oscila entre 83 a 131

µmol Trolox/g muestra y además se ha demostrado una

correlación positiva entre la capacidad antioxidante y el grado

de tostión de los granos, lo cual coincide con el carácter de los

compuestos fenólicos y su versatilidad de descomposición por

exposición térmica [70].

Vale la pena señalar que la capacidad antioxidante determinada

resulta significativa pues su valor resulta similar a los reportados

para vegetales considerados como fuente esencial de agentes

antioxidantes como el tomate (220 µM T/g) , brebajes del grano

del café (163 µM T/g) , manzanas (278 µM T/g) y peras (215

µM T/g) [71]. Por consiguiente, se puede asegurar que la pulpa

de café posee un contenido antioxidante significativo que le

permite ser aprovechada como un aditivo y/o ingrediente dentro

de la industria alimenticia y farmacéutica.

15

E. Análisis del contenido en fibra dietaria total en la cáscara

de café.

La ingesta de fibra dietética (FD) en la dieta de los seres humano

contribuye a la prevención y el tratamiento de algunas patologías

crónicas como la hipercolesterolemia, la hipertensión, el cáncer

colorrectal, enfermedad cardiovascular y mejora el control de la

diabetes mellitus tipo II. A pesar de que la literatura reporta

diferentes mecanismos de acción de la fibra dietaria sobre el

organismo humano, aún no existe un consenso determinante,

pero si está bien establecido que la ingesta de aproximadamente

21 a 25 gramos al día en mujeres y 30 a 38 gramos al día en

hombre, puede favorecer sustancialmente la preservación de la

salud [72].

La fibra dietaria hace parte de un complejo molecular que

constituyen a los polisacáridos no digeribles por el organismo

humano y juega un rol fundamental en la salud nutricional del

mismo [73]. La principal ventaja de la FD en los subproductos

naturales del agro consiste en que estos usualmente exhiben una

porción mucho mayor de fibra dietaria soluble (FDS) en

comparación con otras fuentes como los cereales. Siendo así, la

pulpa de café no es ajena a este fenómeno y se caracteriza por

un alto nivel de FD acompañada con un alto contenido de

compuestos polifenólicos, lo cual otorga beneficios adicionales

a la salud del consumidor en comparación a si solo tuviese un

alto contenido en fibra.

Existen diversos métodos para la cuantificación del contenido

en fibra dietaria total, pese a ello, en el presente estudio se

adoptó la metodología del método enzimático-gravimétrico

según los protocolos de la AOAC 993.19 y 991.42. Siendo así,

se obtuvo para la muestra de estudio un contenido de 31.2 ± 0.8

g/100 g muestra de fibra dietaria total (FDT), la cual se calculó

como la suma de la fibra dietaria soluble (FDS : 21.3 ± 0.9

g/100 g muestra) y la fibra dietaria insoluble (FDI : 9.9 ± 0.7

g/100 g muestra). Lo anterior coincide con los resultados

reportados en la literatura donde se reportan 28 ± 0.7 mg/100 g

de FDT , 18 ± 0.9 mg/100 g de FDS y 10±0.8 mg/100 g de FDI

[74]. Siendo así, el valor hallado experimentalmente difiere en

un 11.4% del valor reportado en la literatura, lo cual puede

considerarse poco significativo debido a las variabilidades y

errores sistemáticos asociados a la experimentación.

Por otro lado, el valor de la fibra dietaria total (FDT) hallado

tras la experimentación puede considerarse significativo si se

compara con el contenido en fibra dietaria de algunos alimentos

considerados como fuentes ricas en dicha fibra como lo es la

avena (10.3 g/100 g) , la soya (15.0 g/100 g), el arroz (1.3 g/100

g), la semilla de lino (22.3 g/100 g) , las almendras (11.20 g/100

g) entre otras [75]. Por último, es necesario mencionar que

además de las funciones terapéuticas ya mencionadas, el

consumo adecuada de fibra dietara provoca la regulación de la

ingesta energética y la saciedad, lo cual contribuye en la

disminución de los casos de obesidad a nivel global [76] .

En general, se puede asegurar que la pulpa de café contribuye de

forma sustancial en la promoción y conservación de la salud

humana, pues su alto contenido en compuestos bioactivos le

otorga propiedades nutricionales importantes para el

mantenimiento de la salud y la prevención de patologías

asociadas al paso de la edad. Así mismo, su alto contenido en

fibra dietaria (FD) le concede propiedades terapéuticas

importantes en el tratamiento de enfermedades como la diabetes

mellitus tipo II, trastornos digestivos, entre otras enfermedades

no correlacionadas con el envejecimiento celular. Siendo así, la

cáscara de café deshidratada resulta en un subproducto de alto

valor para la industria alimenticia y en el presente estudio se

utiliza para la elaboración de un producto de alto impacto como

lo es una aromática y/o bebida con características funcionales.

IV. CONCLUSIONES

El café es una de las bebidas más consumidas alrededor del

mundo por millones de personas. Sin embargo, el procesamiento

del fruto de la planta hasta la obtención del grano listo para

preparar tan apetecida bebida implica la descarga de millones de

toneladas de pulpa de cereza de café al medio ambiente, lo cual

acarrea problemas fitosanitarios sino se les da el adecuado

tratamiento a estos desechos. Debido a su alto contenido en

fitoquímicos bioactivos, la pulpa de café puede ser aprovechada

dentro de la cadena de valor mediante la extracción de estos

compuestos valiosos para su posterior uso en la industria

alimentaria.

Siguiendo con lo anterior, la extracción de compuestos

funcionales y bioactivos en medio acuosos y la posterior

determinación del contenido fenólico, la capacidad antioxidante

y la fibra dietaria total en la pulpa de café, permitió realizar una

evaluación comparativa con otros estudios. Partiendo de los

resultados experimentales se observa que el protocolo utilizado

permitió corroborar las concentraciones ya reportadas. Siendo

así, en este trabajo se obtuvo que existe una mayor

concentración de xantinas que de flavonoides en la cáscara de

café, siendo la cafeína, el compuesto más abundante dentro de

los detectados mediante la técnica UHPLC-ESI+-Orbitrap-MS

con una concentración de 0.8 ± 0.0 mg/g muestra , así mismo se

obtuvo para el contenido fenólico total una concentración de

30.8 ± 2.3 mg EAG/ g muestra y para la capacidad antioxidante

una concentración de 116.4 ± 0.1 TEAC (µmol Trolox / g

muestra). Aquí, es necesario destacar que se omitió el contenido

en cafeína determinado por HPLC-UV-VIS (6.8 ± 0.1 mg/g

muestra) debido a la alta sensibilidad del método UHPLC-ESI+-

Orbitrap-MS y los reportes en literatura asociados a la

cuantificación de esta metilxantina. Por último, se determinó un

contenido de fibra dietaria total de 31.2 ± 0.8 g/100 g muestra.

Los anteriores valores, indican que la cáscara de café puede ser

utilizada y/o aprovechada en la industria alimentaria para la

preparación de alimentos funcionales, pues se constituye como

una fuente natural de agentes antioxidantes involucrados en la

disminución y prevención de enfermedades como el cáncer y

patologías relacionadas con el envejecimiento celular. Por lo

tanto, la bebida formulada (infusión y/o aromática) constituye

16

una alternativa prometedora para el mercado de bebidas, dado el

contenido significativo de constituyentes fenólicos derivados de

la cáscara del café. Así mismo, se obtendría una bebida con alto

contenido en fibra dietaria que tendría efectos terapéuticos sobre

trastornos digestivos, la hipercolesterolemia, la diabetes , entre

otras muchas enfermedades que no se encuentran directamente

relacionadas con el envejecimiento o la edad.

Las herramientas de análisis sensorial permitieron evaluar la

aceptabilidad por parte de 50 panelistas frente a cuatro

formulaciones de infusiones con diferente concentración de

cáscara deshidratada de café. La interpretación de los resultados

obtenidos tras este análisis sensorial permitió concluir que la

formulación con mayor aceptación es aquella que posee 10

gramos de cáscara de café con 90 mL de agua caliente (B2). Así

mismo, gracias a la escala JAR se pudo evidenciar que todos los

atributos deben ser optimizados, no obstante, el análisis de

penalización permitió inferir que una mejora en la astringencia

y el amargor para las formulaciones B2 y B4 no tiene una

incidencia significativa sobre la aceptabilidad global y la

intención de compra de estas dos formulaciones. Mientras que

una mejora de estos dos atributos en la formulación B1

(aumentar astringencia y amargor) y B3 (disminuir astringencia

y amargor) conllevaría a un incremento positivo en la intención

de compra y la aceptabilidad global de estas. De este modo,

resulta destacable que para el caso de la formulación con mayor

aceptabilidad global (B2), no sería necesario mejorar los

atributos de astringencia y amargor, pues estos no tuvieron una

relevancia significativa sobre la aceptabilidad global e intención

de compra de la bebida.

A modo de sugerencia, para trabajos posteriores se recomienda

realizar un análisis similar al presente estudio variando los

métodos de extracción solido-líquido de los compuestos

bioactivos y la variedad de café. Lo anterior con el fin de evaluar

qué método resulta más eficiente para la extracción de los

compuestos y cuál variedad de café ofrece un mayor

rendimiento o cantidad de compuestos polifenólicos. Así

mismo, se recomienda variar los mecanismos de cuantificación

de la capacidad antioxidante (HAT o SET) con el fin de discernir

a cerca de cuál mecanismo resulta más sensible al momento de

determinar la capacidad antioxidante en la pulpa de café

deshidratada. Por último, se recomienda realizar un análisis

bromatológico sobre la cáscara de café deshidratada con el

objetivo de realizar un análisis integral que incluya los perfiles

fisicoquímicos, nutritivos e higiénicos que permitan garantizar

al consumidor un correcto tratamiento y conservación del

producto final que para este caso corresponde a la cáscara de

café deshidratada lista para preparar infusiones.

AGRADECIMIENTOS

El agradecimiento de este proyecto va dirigido primero a Dios ya que sin su bendición y su amor todo hubiese sido un total fracaso, también para mis padres, mis hermanos, mi esposa y mi hijo quienes han estado ahí siendo apoyo incesante en cada uno de los retos y decisiones que he tomado a lo largo de mi vida. Así mismo, agradezco a mi docente tutor María Hernández Carrión por su conocimiento y ayuda para el desarrollo de este proyecto

y exhorto su humanidad y su calidez como ser humano. Además, agradezco a mi compañero de batallas académicas por su constante apoyo.

Finalmente, manifiesto mi gratitud a la Universidad de los Andes por las excelentes enseñanzas que me ha brindado y al Ministerio de Educación Nacional por haberme permitido hacer parte de una de las universidades más prestigiosas de mi tan adorado país.

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20

ANEXOS

Anexo 1. Codificación para análisis e interpretación de los

resultados obtenidos en la prueba sensorial

Anexo 3. Resultados ANOVA unidireccional con prueba de

comparación múltiple de Tukey en Minitab 19 ®

Anexo 3.1.Medias (izquierda) y comparación en parejas de

Tukey (derecha) para la aceptabilidad global.

Anexo 2. Hoja de cata de infusiones (se rellena para cada

una de las cuatro infusiones preparadas)


Tukey (derecha) para el color.


Tukey (derecha) para el aroma.


Tukey (derecha) para el sabor.


Tukey (derecha) para la intención de compra.

Anexo 4. Gráficos de penalizaciones de la incidencia de la

astringencia y el amargor sobre la aceptabilidad global y la

intención de compra.

21

Anexo 4.1. Gráfico de penalizaciones para B1 (Penalización

vs % Jueces). El color azul corresponde a “Demasiado bajo”

y el color rojo a “Demasiado alto”.










Anexo 5. Fragmentogramas de masas obtenidos por UHPLC-

ESI+-Orbitrap-MS

22

Anexo 5.1. Fragmentograma (Abundancia vs Tiempo de

Retención) de Teobromina y Teofilina. (A) Muestra , (B)

Mix-Estándar.


Retención) de Epigalocateqina (A) Muestra , (B) Mix-

Estándar.


Retención) de Epicatequina y Catequina. (A) Muestra , (B)

Mix-Estándar.


Retención) de Ácido p-Hidroxibenzoico . (A) Muestra, (B)

Mix-Estándar.

A

B

Teofilina

Teobromina

Teobromina

Epigalocateqina

A

B

A

B

Compuesto

Desconocido

Ácido p-

Hidroxibenzoico Compuesto

Desconocido

Teofilina

No detectables

Epicatequina

Catequina

Epicatequina

Catequina

A

B

23


Retención) de Cafeína. (A) Muestra , (B) Mix-Estándar.


Retención) de Ácido Cafeico. (A) Muestra, (B) Mix-Estándar.


Retención) de Ácido Vanílico. (A) Muestra, (B) Mix-

Estándar.


Retención) de Epigalo Catequina Galato (EGCG). (A)

Muestra, (B) Mix-Estándar.

A

B

Cafeína

Cafeína

A

B

No Detectables

Ácido

Cafeico

A

A

B

Compuestos

Desconocido

s

B

Compuesto

Desconocido

Ácido

Vanílico

No Detectables

EGCG

24


Retención) del Ácido p-Cumárico. (A) Muestra, (B) Mix-

Estándar


Retención) del Epicatequina galato (ECG). (A) Muestra, (B)

Mix – Estándar.


Retención) del Ácido Felúrico. (A) Muestra, (B) Mix-

Estándar.


Retención) del Ácido Rosmarínico. (A) Muestra , (B) Mix-

Estándar.

Ácido p-

Cumárico

Compuestos

Desconocidos

A

B

No

Detectables

A

B

No

Detectables

A

B

Epicatequina

galato (ECG)

A

Compuestos

Desconocidos

Ácido

Felúrico

Ácido

Rosmarínico

(ECG)

B

25


Retención) de la Naringenina. (A) Muestra , (B) Mix-

Estándar.


Retención) de la Apigenina.(A) Muestra , (B) Mix - Estándar.


Retención) de la Pinocembrina. (A) Muestra , (B) Mix-

Estándar.


Retención) del Ácido Carnósico. (A) Muestra , (B) Mix-

Estándar.

A

B

No

Detectables

Apigenina

A

B

Compuesto

Desconocido

B B

A

B

Naringenina

Naringenina

Compuesto

Desconocido

A

Pinocembrina

Compuesto

Desconocido

Pinocembrina

Ácido

Carnósico Compuesto

Desconocido

26


Retención) del Ácido Ursólico.(A) Muestra , (B) Mix -

Estándar.


Retención)de la Pelargonidina 3-glucósido.(A) Muestra , (B)

Mix - Estándar.


Retención) de la Quercetina 3-glucósido.(A) Muestra, (B)

Mix - Estándar


Retención) de la Pelargonidina. (A) Muestra, (B) Mix-

Estándar.

A

B

No

Detectables

Pelargonidina

3-glucósido

A

B

A

No

Detectables

Pelargonidina

B

B

A

Compuesto

Desconocido

Ácido

Ursólico

Quercetina 3-

glucósido

Quercetina 3-

glucósido

Compuesto

Desconocido

27

Anexo 6. Resultados experimentales de la cuantificación del

contenido en cafeína mediante la técnica de cromatografía

líquida de alta resolución acoplada con espectrometría UV-

VIS (HPLC-UV-VIS).

Anexo 7. Resultados experimentales de la cuantificación del

contenido total de polifenoles mediante la técnica de Folin-

Ciocalteu acoplada con espectrometría UV-VIS.

Anexo 8. Resultados experimentales de la determinación de

la capacidad antioxidante mediante el mecanismo SET

(Single Electron Transference) a través del ensayo DPPH.

Elaboración de una bebida funcional a partir del ...

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