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ELABORACIÓN DE PROTOCOLO
Condiciones para el análisis de ácido lipóico
En la tabla 2, se muestran las condiciones que la bibliografía señala y
que estas son las de mayor uso generalizado.22
Porcentaje de recuperación
Los criterios de aceptación se llevan a cabo mediante un análisis de
varianza, del porcentaje de recuperación ó del error relativo en porcentaje, para
determinar si hay o no hay diferencia significativa.22
El porcentaje de recuperación esperado para el análisis de ácido lipóico
es a 97% y 102% que es equivalente a + 2.7% del error relativo, que igual se
encuentra dentro de + 3 SD.22
Rango de flujo 0.01-10mL/min
Rango de presión 1-6000psi
Pulso de presión <1%
Fluorescencia 380nm (exitación)
510nm (emisión)
Columna 150mm x 4.6mm
Disolvente (gradiente de elusión) Agua/ACN (80:20)
Cmax plasma 2.23 + .9014nmol/mL
Inyectores 0.1 – 10µL
TABLA 2. Condiciones para el análisis de ácido lipóico en HPLC. Tomado
de: Kohen R. 2002.
Preparación de la muestra
El ácido lipóico se obtiene del plasma, su preparación de este compuesto
inicia desde la selección de pacientes, como son: personas sanas y pacientes
con diabetes mellitus tipo II.23
Como ya se describió anteriormente el cuerpo es capaz se producir ácido
lipóico pero en pequeñas cantidades, tanto que para el análisis es necesario
dosificar a los pacientes con tabletas de ácido lipóico.23
La muestra de sangre es recogida en tubos con anticoagulante, las
muestras son centrifugadas inmediatamente después de haber hecho la
extracción. El plasma es separado y transferido a tubos nuevos y guardados a -
80°C hasta analizarse.23
Derivatización pre-columna
La derivatización es un proceso en la que un compuesto es transformado
en otro con la finalidad de aumentar la respuesta del detector.19 Este paso es
fundamental en el análisis del ácido lipóico el agente derivatizante se prepara
en solución de ACN, agregándose a la muestra, e incubándose a 60°C por
espacio de 5min. Siguiendo con la adición de un compuesto de fluorescencia
para posteriormente incubar, en un tiempo más largo (30min.
aproximadamente).23
Se coloca la muestra a temperatura ambiente y se toman 10µL para ser
inyectados al sistema de HPLC.23
Protocolo de limpieza
Verificar la pureza de los disolventes mediante un gradiente: el agua se
puede controlar para su adecuabilidad en HPLC, bombeando de 20-30mL de
agua a través de una columna C18, seguida por un gradiente de hasta 100% de
un disolvente organico.24
El burbujeo de He ó N2 sirve para evitar la formación de peróxidos. Se
recomienda utilizar agua grado HPLC recientemente preparada para obtener el
máximo funcionamiento y prolongar el tiempo de vida del sistema HPLC,
especialmente para trabajos de gradiente de alta sensibilidad.24
El agua grado HPLC preparada en un sistema de purificación casero
deberá tener una etapa final sobre carbon activado seguida de filtración. Se
debe de tener cuidado de no introducir disolventes que no sean miscibles entre
si. Se deberá permitir suficiente tiempo para que la columna se limpie
completamente.24
La pureza de disolventes es importante para tomar ventajas de alta
sensibilidad de los detectores, la absorción de oxígeno causará ruido a corto y
largo plazo que dependerá de la temperatura. Este efecto puede acentuarse
cuando el disolvente es desgasificado por vacío y después utilizado en contacto
con la atmosfera.24
Los disolventes varian en viscosidad (resistencia al flujo). Este significa
que la presión cambiara conforme cambia el disolvente. Durante el gradiente la
presión sera mayor que con un disolvente puro.24
Esto es especialmente cierto para gradientes entre agua y disolventes
orgánicos tales como metanol, isopropanol o acetonitrilo, todos los buffers
deben ser filtrados despues de la preparación. No almacenar agua en
recipientes de plastico u otros contenedores que puedan liberar plastificantes u
otros contaminantes.24
Tiempos de retención
Según lo representado en figura 5 el ácido lipóico es separado de la
amina fluorescente usando una columna estándar con la elución isocrática
simple. (Reactivo fluorescente 5 A).22 La presencia de otros sulfhidrilos
endógenos tales como glutatión y cisteína no interfiere con la detección puesto
que su recuperación con el método de extracción aplicada con HPLC es
extremadamente baja.24
Fig. 5 Tiempos de retención del ácido lipóico.
Los cromatogramas que demuestran los derivados fluorescentes de la
amida del LA se muestran en la figura 5 A ( tR=6.12 ), después de la extracción
del plasma el cromatograma señala el LA en la figura 5 B con (
tR=6.26 ) y su la de su forma reducida DHLA con ( tR=9.02 ), con el estándar
interno ácido decanal ( tR=13.44 ).
Tomado de: Abdullah I. Haj-Yehia. 2000.
Fig. 5 Tiempos de retención del ácido lipóico.
Los cromatogramas que demuestran los derivados fluorescentes de la
amida del LA se muestran en la figura 5 A ( tR=6.12 ), después de la extracción
del plasma el cromatograma señala el LA en la figura 5 B con (
tR=6.26 ) y su la de su forma reducida DHLA con ( tR=9.02 ), con el estándar
interno ácido decanal ( tR=13.44 ).
Tomado de: Abdullah I. Haj-Yehia. 2000.
Fig. 5 Tiempos de retención del ácido lipóico.
Los cromatogramas que demuestran los derivados fluorescentes de la
amida del LA se muestran en la figura 5 A ( tR=6.12 ), después de la extracción
del plasma el cromatograma señala el LA en la figura 5 B con (
tR=6.26 ) y su la de su forma reducida DHLA con ( tR=9.02 ), con el estándar
interno ácido decanal ( tR=13.44 ).
Tomado de: Abdullah I. Haj-Yehia. 2000.
Valores aceptables
Los valores aceptables para el análisis de ácido lipóico y otros
antioxidantes se muestran en la tabla 3.25
Típicamente la desviación estándar es menos de 2 SD (región de
cuidado) según lo que se determine en las medidas de las muestras del control
de calidad preparadas en concentraciones bajas, medias y altas dentro de la
gama de las curvas de calibración, uno de tres o dos de seis muestras de
control de calidad podrían estar fuera del valor de + 3 SD. (región de control).25
La selectividad es mediante plasma u orina en blanco del control, con los
estándares de referencia también como varias muestras de pruebas que se
obtienen de pacientes deteriorados. El análisis de los estándares de referencia
auténticos del LA y algunos de sus metabolitos es necesario para identificar los
tiempos de retención.25
La reproducibilidad y la exactitud son calculadas analizando muestras del
control de calidad en el nivel de concentración baja, media y alta según el
número de repeticiones. La reproducibilidad para el ácido lipóico es de 97.4%.26
El control de calidad del plasma u orina son medidos en partes alícuotas
y almacenados bajo mismas condiciones.26
El método para el análisis cuantitativo del ácido lipóico posee
sensibilidad adecuada, selectividad y exactitud. Por lo tanto, es bien aplicable
para la farmacocinética y sus metabolitos importantes.27
Elemento Vol. Mínimo
(óptimo) en
mL
Material Rango normal Unidades Método
Ácido
lipóico
1.0-2.0 Plasma <10 µg/L HPLC
B1
(tiamina)
1.0-2.0 Sangre
EDTA
20-100 ng/mL HPLC
VIT. C 1.0-2.0 Plasma
EDTA
-- mg/L HPLC
VIT. D 1.0-2-0 Sangre
EDTA
20-100 ng/mL HPLC
VIT. E 1.0-2.0 Suero 5.0-18.0 µg/L HPLC
TABLA 3. Valores aceptables.Tomado de: www.synlab.com. 2009.
Los métodos para la determinación de ácido lipóico poseen excelente
especificidad para dicha determinación. Al igual que su estabilidad ya que no se
guardaba la muestra solamente para su transporte.27
Estudios demuestran que el volumen mínimo es de 1.0 a 2.0mL que
pueden ser introducidos al sistema de HPLC, con un rango normal de menos de
10µg/L utilizando el método de HPLC.28
Comparación con diabetes mellitus tipo II
Hasta el día de hoy, las comparaciones que existen en personas sanas
con las personas diabéticas se ha hecho a discreción por la razón que en las
personas sanas es muy pequeña la producción de ácido lipóico y en pacientes
diabéticos es casi indetectable.29
Por tal motivo hay que dosificar ambos pacientes sanos y diabéticos para
poder obtener un mejor análisis.29
Estudios recientes demuestran que se pueden obtener comparaciones
en tres tipos de pacientes como son: sanos, diabéticos con una dieta pobre en
antioxidantes y rico en grasas, y por ultimo diabéticos con una dieta rico en
antioxidantes.30
Los resultados son notorios, retomando el tema de los trastornos
producidos por las personas con diabetes mellitus tipo II, la neuropatía diabética
siendo la más común produciendo dolores musculares, los diabéticos que en su
dieta la complementan con ácido lipóico y así mismo hacer un ejercicio diario
adquieren una mayor calidad de vida.30