Electroforesi sobre paper o acetat de cel.lulosa

En què consisteix?És un mètode analític molt senzill utilitzat per a separar tant aminoàcids com proteïnes. Les mostres a analitzar es col·loquen sobre un suport d'acetat de cel·lulosa humitejat amb tampó a un determinat pH, aplicant sobre aquest suport una diferència de potencial determinada entre el càtode i l'ànode ubicats en ambdós extrems de la tira de paper, les mostres amb aminoàcids o proteïnes a separar migraran cap a un pol o un altre del suport en funció de la seva càrrega, forma i tamany. El procés, un cop acabat, es fa visible utilitzant colorants.

Per què se separen?Tots els aminoàcids amb grup - amino i grup carboxil, a més dels que tenen elα grup R ionitzable es comporten com àcids i bases en funció del pH del medi on es trobin. Així doncs, un aminoàcid com l'alanina dissolt en aigua el trobem com a àcid i com a base:

Àcid

Base

Les substàncies que presenten aquesta propietat són amfotèriques. Un -α aminoàcid com l'alanina, quan està totalment protonat, en realitat és un àcid dipròtic; és a dir el seu grup amino i el seu grup carboxil han acceptat tots dos un protó:

I com a àcid diprótic podrà ionitzar-se per a donar dos protons.

Per tant ja podeu començar a intuir què en funció del pH del tampó utilitzat, els aminoàcids presentaran una càrrega elèctrica o una altra i que en aplicar un camp elèctric aquests migraran cap a un pol elèctric o cap a un altre. Així doncs, a pH àcid, el grup carboxil de l'alanina (àcid dipròtic) s'ionitzarà perdent un prtotó i a pH bàsic el seu grup amino perdrà un segon protó.

La figura següent mostra la corba de valoració de la forma dipròtica de l'alanina:

La representació mostra les dues fases de valoració existents, la primera per el grup

COOH i la segona per el grup NH3+ de l'alanina partint de la seva valoració a pH 1.0

amb una dissolució de NaOH i fins a pH 14.

Al començament de la valoració, a pH 1, l'alanina es presenta totalment protonada NH3

+CHRCOOH ( R= CH3). En el punt mig de la primera fase de la valoració en la que el grup carboxil de l'alanina perd el seu protó, les espècies presents que es troben en el medi a parts iguals són el protó donador i el protó acceptor ( NH3

+CHRCOOH i NH3

+CHRCOO-). Com que el pH del punt mig és 2,34, el grup carboxil de l'alanina té un pK' de 2,34.

Quan la valoració amb NaOH continua s'arriba a un altre punt important a pH 6,02 on s'ha completat l'eliminació del primer protó i comença a separar-se el segon protó, en aquest pH l'alanina es troba present en forma del su ió dipolar NH3

+CHRCOO-, forma de l'alanina que presenta una càrrega neta zero i que per tant a un tampó de pH 6,02 encara que se li apliqués un camp elèctric no s'aconseguiria moure-la cap a cap dels dos pols elèctrics. Aquest valor de pH característic és el punt isoelèctric de l'alanina.El punt isoelèctric equival a la mitjana aritmètica dels dos pK '.

La segona fase de la corba de valoració correspon a l'eliminació del protó del grup NH3

+. En el punt mig existeixen a igual concentració les formes NH3+CHRCOO- i

NH2CHRCOO- a un pH de 9,69 que equival al pK' del grup -NH3+ de l'alanina. La

valoració es completa a pH 12 on la forma predominant de l'alanina és NH2CHRCOO-

Activitat:

Sabent els punts isoelèctrics de l'albúmina (pH I 4.9) i el de les gamma globulines ( pH I 7,4) interpreta els resultats de l'electroforesi sobre actetat de cel.lulosa de les diferents proteïnes sèriques.

Proteïna Composició en sèrum

Albúmina 54-62%

- Globulina α 9-15%

- Globulina β 8-13 %

- Globulina γ 14-19%

Quin és el diagnòstic clínic del teu pacient? És normal? Presenta cap anomalia?Quina?

Bibliografia

Aminoàcids i proteïnes . ElectroforesiLehninger

Patrons proteïnes plasmàtiques en acetat de cel.lulosaProteïnes plasmàtiqueshttp://www.uv.es/jcastell/Proteinas_plasmaticas.pdf

Simulador d'electroforesi en acetat de cel.lulosahttp://www.biorom.uma.es/contenido/biomodel/lab/acetato/sericas.htm