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DNA Topoisomerasas
Izquierda Derecha
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Enzimas de restricciónClasificadas en 3 tipos, donde la mayoría pertenece al grupo II (proteínas monoméricas, poseen simetria rotacional y generalmente requieren Mg2+
Secuencias palindrómicas
Isosquisomeros: Varias enzimas diferentes que reconocen la misma secuencia, donde, algunas cortan sec blanco en diferentes posiciones.Sma I / Xma I
Secuencias metiladas:A*: N6-metiladeninaC*: 5-metilcitosina : Hpa II y Msp IReconocen la secuencia CC*GGHpa II: no digiere DNA metiladoMsp I: Digiere met o no-metilado*90% de las metilaciones en genomas ocurren en 5.metilcitosina en C*G
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Desfosforilación de vectores(para evitar asociación intramolecular)
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DNA Ligasa
68 kDa
Actividad se mide en Unidase Weiss (Weiss, 1968)
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Ligación de extremos cohesivos
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Fabricación de replicas en Nitrocelulosa e hibridación in situ (en placa)
Screening: Rastreo, Escrutinio
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Fago Lambda como vector de clonamiento
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Clonamiento de DNA en plasmidos
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Clonamiento de DNA en plasmidos
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Clonamiento de DNA en plasmidos
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Denaturación y Renaturación del DNA
Construcción de bibliotecas de secuencias únicas
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Southern y Northern blot
Southern, E. M. (1975) J.Mol. Biol. 98, 503-517
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Eliminación de fragmentos de Okazaki
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Eliminación de fragmentos de Okazaki
(Reacción de Nicktranslation)
Alternativamente: Marcaje por random Primer o incorporación en reacción de PCR
DNA pol I (E. coli) Holoenzima(monómerica) de 109 kDa.5’ 3’ Polimerasa5’ 3’ exonucleasa3’ 5’ exonucleasa
+ Mg2+
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SINTESIS de DNA in vitro
Reacción de polimerización en cadena =polymerase chain reaccion (PCR)
- Un fragmento de DNA (copia de una parte del DNA templado)- Múltiples copias (de una molécula templado 1 millon de copias)- DNA polimerasa (termoestable, de Termophilus aquaticus, Taq Pol)- Partidores, un par (los partidores dan la especificidad de la reacción)- dNTPs- Tampón (Mg2+, tampón) 30 ciclos de amplificacion: denaturacion 94ºC, 30seg
apareamiento, 40-60ºC, 30segextensión, 72ºC, 30seg
ESPECIFICIDADVELOCIDAD SENSIBILIDAD
CONTROLES!
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SINTESIS DE DNA in vitro PCR
- Iniciacion, elongacion, terminacion
- par de partidores sentido y antisentido secuencia especifica
- in vitro
- multiples veces un fragmento de DNA
- DNA polimerasa termoestable TaqPol (Thermophylus aquaticus)
-ciclos de denaturacion, apareamiento, extension
INICIACION cuando y donde
ELONGACION
TERMINACION
-Extension final y guardar a 4ºC
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PCR
Taq DNA pol (Thermusaquaticus) MW 65 kDa
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GATCGGATAACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGGTA
PCR de MICROSATELITES
GTGGACTATAGACCAT ACACACACACACACAC GCTGTGATGGTCTAC
3’
MICROSATELITE
5’
3’ 5’
CGACACTACCAGATGCACCTGATATCTGGTA TGTGTGTGTGTGTGTG
CACCTGATATCTGGTA 3’5’
Partidor 2
llllllllllllllll
5´3’ GCTGTGATGGTCTAC
Partidor 1
lll111111111111
Marcadores genéticos: Identidad, medico legal, paternidad, etc
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120
130
140
150
160
170
180
190200210
pb1 2 3 4 5 6 7
120 – 140 HTG4
170 – 188 HMS7
Análisis de microsatélites de caballos
140
150
160
170
180
190
200210220230
pb1 2 3 4 5 6 7
149 – 172 HMS3
218 – 238 HMS2240250
Sistema manual en geles de poliacrilamida modificada, Spreadex® en geles de 10 cm y tinción con bromuro de etidio.
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Microscopía Electrónica, Tinción Negativa
Metodología alternativa: Ensayos de digestion con nucleasa S1, Degrada preferencialmente ssDNA o RNA. También para generar extremos romos y apertura del hairpin generado en la segunda hebra del cDNA
R-Loops
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Replicación Viral: Circulo rodante y desplazamiento de hebra. (MET)
Tinción negativa
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Denaturación y Renaturación del DNA
Construcción de bibliotecas de secuencias únicas
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Denaturación del DNA e Hipercromicidad
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Secuenciación de DNA(Sanger,1977)
35-100 nt/seg>7600 ntTaq DNA pol
300 nt/seg2000-3000 ntSequenasa
45 nt/seg10-50 ntFrag. Klenow
(DNA pol I)
Velocidad de Polimerización
ProcesividadEnzima/
Propiedades
Klenow: MW 76 kDa, carece de actividad 5’ 3’exonucleasa por remoción proteolítica (Klenow, 1970).
Sequenasa: DNA pol T7 modificada químicamente (sin activ. 3’ 5’ exonucleasa)
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Secuenciación de DNA (Sanger,1977)
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Secuenciación Automatizada de DNA
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DNA Fingerprinting
•AFLPAmplified Fragment polymorphism
•RFLPRestriction Fragment Length polymorphism
•RAPDRandom Amplified polymorphic DNA
•DAFDNA Amplification Fingerprinting
•SSCPSingle Strand Confirmational polymorphism
•Microsatellite
AFLP
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Análisis de Microarreglos de DNA
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Síntesis in situ y análisis in silico
Microarreglos de DNA
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Expresión Génica Temporal por
microarreglos de DNA