Elementos Estructurales de La Cromatina en los Cromosomas Mitoticos.

Elementos estructurales de la cromatina en los cromosomas

mitóticos

Elementos estructurales de la Elementos estructurales de la cromatina en los cromosomas cromatina en los cromosomas

mitóticosmitóticos

Juan Manuel Juan Manuel Caravaca Caravaca GuaschGuasch

Departament de Bioquímica i Biologia Molecular Unitat de Ciències

Universitat Autònoma de Barcelona

Elementos estructurales de la cromatina en los cromosomas mitóticos

Memòria presentada per adquirir el grau de Doctor en Bioquímica i Biologia Molecular

per Juan Manuel Caravaca Guasch

Treball realitzat al Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular de la Facultat de Ciències de la Universitat Autònoma de Barcelona, sota la direcció del Dr. Joan-Ramón Daban Balañà. Juan Manuel Caravaca Guasch Dr. Joan-Ramon Daban Balañá

Bellaterra, 11 de juny de 2004

I

Índice Índice ................................................................................................................................ I Agradecimientos ........................................................................................................... VI Abreviaturas más comunes......................................................................................... VII 1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................1 1.1 El nucleosoma ........................................................................................................1 1.2 La fibra de cromatina ............................................................................................3 1.2.1 Dinámica de la cromatina ................................................................................3 1.2.1.1 Autoasociación de la cromatina..............................................................6 1.2.2 Modelos estructurales ......................................................................................7 1.2.2.1 Modelo de solenoide...............................................................................7 1.2.2.2 Modelo de superbead..............................................................................7 1.2.2.3 Modelos helicoidales de doble origen ....................................................8 1.2.3 Modelo de solenoide interdigitado compacto .................................................9 1.2.3.1 Electroforesis de cromatina en geles no desnaturalizantes de agarosa en presencia de MgCl2 1.7 mM ..............................................................9 1.2.3.2 Análisis de las fibras de cromatina por microscopía electrónica..........10 1.2.3.3 Modelo de solenoide propuesto por nuestro grupo ..............................11 1.3 El cromosoma .......................................................................................................13 1.3.1 Ciclo celular y mitosis ....................................................................................13 1.3.2 Modelos estructurales propuestos para el cromosoma metafásico ............15 1.3.2.1 Modelos basados en lazos de la fibra de cromatina anclados a un eje proteico ...........................................................................................16 1.3.2.2 Modelos basados en diferentes grados de plegamiento helicoidal .......18 1.3.2.3 Nuevos modelos ...................................................................................21 1.3.2.3.1 Modelos de plegamiento a través de cromómeros ................21 1.3.2.3.2 Modelo de estructura reticular..............................................23 1.3.2.3.3 Modelo Mixto.........................................................................24 1.3.3 Restricciones físicas de los diferentes niveles de plegamiento del DNA para la formación del cromosoma metafásico ............................................24 1.3.4 Proteínas involucradas en la estructura del cromosoma ...........................26 1.3.4.1 Histonas ...............................................................................................26 1.3.4.2 Topoisomerasa II .................................................................................27 1.3.4.3 Proteínas SMC (Condensinas y Cohesinas) ........................................28 1.4 Objetivos ................................................................................................................30

II

2. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................31 2.1 Cultivos celulares ................................................................................................31 2.1.1 Establecimiento de un cultivo de células HeLa............................................31 2.1.2 Mantenimiento de un cultivo celular de células HeLa ................................32 2.1.3 Recuento de células.........................................................................................33 2.1.4 Cultivo celular en presencia de colcemida ...................................................35 2.2 Obtención del material biológico ....................................................................36 2.2.1 Obtención de células......................................................................................36 2.2.2 Obtención de cromosomas en diversos medios ...........................................37 2.2.2.1 Cromosomas obtenidos en hexylene glycol ........................................37 2.2.2.2 Cromosomas obtenidos en presencia de poliaminas ...........................37 2.2.2.3 Cromosomas obtenidos en TeaKMC-MgCl2 5mM .............................38 2.2.2.3.1 Cromosomas obtenidos en medio hipotónico y TeaKMC-MgCl2 5 mM ...........................................................38 2.2.2.3.2 Cromosomas obtenidos directamente en TeaKMC-MgCl2 5 mM ..........................................................38 2.2.2.4 Cromosomas obtenidos en TeaBM-MgCl2 5 mM ...............................39 2.2.2.5 Aislamiento y purificación de cromosomas mediante un gradiente de sacarosa escalonado ......................................................................39 2.2.3 Procesamiento y observación del material biológico en el microscopio óptico..............................................................................................................43 2.2.3.1 Tinción con yoduro de propidio .........................................................43 2.2.3.2 Tinción con colorante Giemsa ...........................................................44 2.2.3.2.1 Fijación en metanol-ácido acético ......................................44 2.3.3.2.2 Aplicación del colorante Giemsa ........................................44 2.3 Microscopía electrónica de cromosomas .....................................................45 2.3.1 Eliminación de partículas contaminantes de los materiales y los medios empleados ........................................................................................................45 2.3.2 Preparación de rejillas para microscopía electrónica ................................47 2.3.3 Evaporador de carbón y carbón-platino .....................................................47 2.3.4 Activación de las rejillas................................................................................49 2.3.5 Extensión de los cromosomas sobre rejilla..................................................50 2.3.5.1Cromosomas obtenidos en poliaminas, TeaKMC, TeaBM o aislados a partir de un gradiente de sacarosa......................................................50 2.3.5.2 Cromosomas en metanol ácido-acético ...............................................51 2.3.5.3 Cromosomas obtenidos en hexylene glycol ........................................52 2.3.6 Cambios de medio en rejilla .........................................................................52 2.3.7 Digestiones con enzimas ................................................................................58 2.3.7.1 Digestión de cromosomas metafásicos con tripsina ............................58 2.3.7.2 Digestión de cromosomas metafásicos con RNAsa ............................59 2.3.7.3 Digestión de cromosomas metafásicos con nucleasa micrococal .......60

III

2.3.7.3.1 Determinación de la actividad de la nucleasa micrococal ...60 2.3.7.3.2 Digestión en solución ............................................................61 2.3.7.3.3 Digestión en rejilla ................................................................62 2.3.8 Fijación de los cromosomas para microscopía electrónica.........................64 2.3.8.1 Cromosomas aislados y purificados mediante un gradiente de sacarosa................................................................................................64 2.3.8.2 Cromosomas obtenidos en TeaKMC, poliaminas y TeaBM................65 2.3.8.3 Cromosomas en metanol-ácido acético ................................................66 2.3.8.4 Cromosomas obtenidos en hexylene glycol .........................................67 2.3.9 Platinación de las muestras...........................................................................67 2.3.9.1 Platinado rotacional ..............................................................................68 2.3.9.2 Platinado unidireccional .......................................................................68 2.3.10 Observación y fotografía de la muestra.....................................................69 2.4 Procesamiento de las imágenes de microscopía electrónica .................70 2.4.1 Realización de medidas ..................................................................................70 2.4.2 Medición de alturas ........................................................................................71 2.4.2.1 Determinación del ángulo de platinación (αap y αreal) ..........................71 2.4.2.2 Determinación del ángulo β del evaporador de carbón y carbón-platino.......................................................................................73 2.4.2.3 Determinación de la altura de una cromátida (hc y ho) .........................74 2.4.2.3.1 Cromátida de sección circular ..............................................74 2.4.2.3.2 Cromátida de sección en forma de óvalo ..............................76 2.4.2.3.3 Factores de corrección para hc y ho ......................................76 2.4.2.4 Determinación de la altura de una placa...............................................78 2.4.3 Tratamiento informático de las imágenes ...................................................80 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...............................................................................81 3.1 Obtención de células metafásicas .......................................................... 81 3.2 Obtención de cromosomas metafásicos................................................ 85 3.2.1 Cromosomas observados en el interior de las células metafásicas ............85 3.2.2 Cromosomas fijados con metanol-ácido acético ..........................................86 3.3.3 Cromosomas obtenidos en hexylene glycol ...................................................87 3.3.4 Cromosomas obtenidos en presencia de poliaminas ...................................88 3.3.5 Cromosomas purificados mediante gradiente de sacarosa.........................90 3.3.6 Observación de cromosomas digeridos mediante diferentes enzimas .......92 3.3.7 Resolución y contraste de cromosomas sin platinar....................................93 3.3.8 Características estructurales de los cromosomas obtenidos.......................94 3.3.8.1 Diámetro de las cromátida....................................................................94 3.3.8.2 Altura de las cromátidas .......................................................................98 3.3.8.3 Concentración local de DNA..............................................................102

IV

3.3 Estructura global de los cromosomas en diferentes medios.............. 104 3.3.1 Cromosomas compactos...............................................................................105 3.3.2 Cromosomas granulados..............................................................................108 3.3.3 Cromosomas fibrosos ...................................................................................119 3.4 Elementos estructurales del cromosoma: la placa .............................. 128 3.4.1 La placa en el cromosoma............................................................................128 3.4.2 Características estructurales de la placa ....................................................135 3.5 Elementos estructurales del cromosoma: el gránulo .......................... 142 3.5.1 Presencia del gránulo en el cromosoma......................................................142 3.5.2 Características estructurales del gránulo...................................................148 3.6 Elementos estructurales del cromosoma: la fibra ............................... 148 3.6.1 Fibras gruesas ...............................................................................................148 3.6.1.1 Formación de fibras ............................................................................148 3.6.1.2 Características estructurales ...............................................................157 3.6.2 Fibras delgadas .............................................................................................157 3.6.2.1 Presencia de las fibras delgadas en el cromosoma .............................157 3.6.2.2 Características estructurales de la fibra delgada.................................158 3.7 Relación entre los diferentes elementos............................................... 164 4. DISCUSIÓN GENERAL ........................................................................................170 4.1 Obtención de cromosomas metafásicos............................................... 170 4.1.1 Procedimiento estándar de obtención de cromosomas ............................170 4.1.2 Integridad física de los cromosomas obtenidos.........................................171 4.1.3 Relación entre los diferentes tipos de estructura cromosómica ..............172 4.2 Elementos estructurales del cromosoma ............................................. 174 4.2.1 La fibra .........................................................................................................174 4.2.2 El gránulo .....................................................................................................175 4.2.3 La placa ........................................................................................................177 4.3 Relaciones estructurales entre los diferentes elementos ................... 179 5. CONCLUSIONES ...................................................................................................182 5.1 Métodos de preparación e integridad de los cromosomas obtenidos ................................................................................................. 182

V

5.2 Estructura global de los cromosomas .................................................. 183 5.3 Estructura de la cromatina en el interior de los cromosomas metafásicos.............................................................................................. 184 6. BIBLIOGRAFÍA .....................................................................................................185

VI

Agradecimientos Esta tesis ha sido posible gracias a la disponibilidad y la dedicación de mi director de tesis, el Dr. Joan Ramón Daban. A él también le agradezco su paciencia y los esfuerzos que tan amablemente ha dedicado a la formación de mi persona durante estos años. Al Servei de Anàlisis i Fotodocumentació de la UAB (Salva Bartolomé) debo darle las gracias por su ayuda técnica e informática, y sobretodo por sus consejos en otros campos no científicos cono el ciclismo o el submarinismo. Al Servei de Microscopia de la UAB le agradezco su asesoramiento y asistencia, y también la amabilidad de todos sus miembros. A la Dra. Paqui García, por haberme introducido en el mundo de los cultivos celulares. Al Ministerio de Educación y Cultura por la concesión de una beca predoctoral FPI. También quiero expresar mi agradecimiento al los compañeros del grupo de cromatina y a los colegas del Departamento (especialmente a Carol, Carme y Jordi) por su inestimable compañía y paciencia durante todo este tiempo. Y sobretodo dedico esta tesis a mis padres, a mis hermanos, a mi tía Conchita y a todo el resto de mi familia.

VII

Abreviaturas más comunes A amperios Å angstroms ATP adenosina trifosfato cm centímetros cm2 centímetros cuadrados DNA ácido desoxirribonucleico EDTA etilendinitrilotetraacetato de sodio EGTA ácido etilen glycol-bis [β-aminoetil eter]-N, N, N�,N� -tetraacético. et. al. et alter, y colaboradores g fuerza centrífuga relativa g gramos h horas Kb kilobases Kv kilovoltios l litros M molar (moles/litro) mA miliamperios mbar milibares Medio de Carnoy metanol-ácido acético 3:1 mg miligramos ml mililitros mm milímetros mM milimolar nm nanómetros ºC grados centígrados p/v peso/volumen pb pares de bases Pipes piperazina-N, N� �bis [ácido 2-etanosulfonico] PME-MgCl2 5 mM tampón definido en la página 42 PMSF fluoruro fenilmetilsulfónico ppi puntos por pulgada RNA ácido ribonucleico RNAsa ribonucleasa rpm revoluciones por minuto SDS dodecilsulfato sódico TEA trietanolamina TEAB tampón trietanolamina 90 mM, ácido bórico 90 mM, pH 8.6 TeaBM-MgCl2 5 mM tampón definido en la página 39 TeaKMC-MgCl2 5 mM tampón definido en la página 38 Tris tris (hidroximetil)-aminometano v/v volumen/volumen µg microgramos µl microlitros

INTRODUCCIÓN

1

1 INTRODUCCIÓN

El DNA en la cromatina eucariótica está compactado en el núcleo a través de

diferentes niveles estructurales. Primero el DNA se enrolla formando dos vueltas

alrededor de un núcleo de proteínas que consiste en 8 moléculas de histonas, para

formar una unidad llamada partícula núcleo. El nucleosoma se completa cuando la

partícula núcleo incorpora la histona H1 y el DNA de unión. El siguiente nivel de

estructura esta formado por un empaquetamiento de los nucleosomas en una cadena en

forma de súper hélice llamada fibra de 30 nm. En este nivel, la histona H1, juega un

papel importante. El sistema mediante el cual la fibra de 30 nm se empaqueta hasta

llegar al nivel máximo de compactación, el cromosoma, es aún poco conocido (van

Holde, 1989).

1.1 El nucleosoma

Los resultados obtenidos a partir de la utilización de técnicas como la digestión

con nucleasa, la centrifugación analítica y la microscopía electrónica han demostrado

que la subunidad fundamental de la cromatina consiste en una estructura con una

precisa estequiometría de histonas y DNA, llamada nucleosoma (Wolffe, 1998). El

nucleosoma es el primer nivel de compactación de la cromatina y consiste en el

enrollamiento del DNA alrededor de un cuerpo central formado por 8 moléculas de

histona. Este octámero está formado por un tetrámero de histonas H3-H4 flanqueado

por dos dímeros de H2A-H2B. Las histonas son pequeñas proteínas básicas con una

región central altamente estructurada (denominada dominio de plegamiento de histona)

y las colas N y C terminales que no adoptan una estructura secundaria definida. Las

histonas se distribuyen en el octámero como una superhélice espiral de proteínas que

forma una rampa sobre la que se coloca el DNA (Arents et al., 1991; Arents y

Moudrianakis, 1993).

Cada octámero tiene aproximadamente 1.7 vueltas de DNA alrededor suyo y

cada nucleosoma es conectado al siguiente por un DNA de unión, la longitud del cual

varía dependiendo de la especie o incluso del tipo de célula. Diferentes nombres han

sido utilizados para diferentes tipos de estructura nucleosomal en función de la longitud

del DNA unido a éste. El octámero de histonas con 146 pb de DNA enrollado a su

INTRODUCCIÓN

2

alrededor tiene el nombre de partícula núcleo. La misma estructura con una molécula de

histona H1 (H5 en aves) unida al DNA en el punto donde éste entra y sale de la

partícula núcleo (aproximadamente 170 pb de DNA) es conocido como el

cromatosoma. La estructura completa, incluyendo el DNA de unión (aproximadamente

35 pb), la partícula núcleo y la histona H1/H5, forman el nucleosoma sensu stricto (ver

figura 1.1.1A). La formación de la fibra nucleosomal compacta el DNA 7 veces, y

produce una fibra de cromatina de 10 nm de diámetro correspondiente a lo observado

por microscopía electrónica cuando las muestras están preparadas a baja fuerza iónica

(Sumner, 2003).

La estructura del nucleosoma ha sido determinada a alta resolución, gracias a

estudios realizados mediante cristalografía de rayos X (Luger et al., 1997). La parte

central de las moléculas de histona forman el núcleo del nucleosoma, mientras que las

colas N y C terminales se extienden hacia fuera (ver figura 1.1.1B) (Rhodes, 1997). La

unión entre el DNA y las histonas es de naturaleza electroestática entre los grupos

cargados positivamente de las histonas y las cargas negativas de los fosfatos del DNA.

De esta manera, al aumentar la fuerza iónica del medio podemos provocar la disociación

de las histonas respecto el DNA (Burton et al., 1978).

Figura 1.1.1 Estructura de la partícula núcleo, cromatosoma y nucleosoma(Sumner, 2003) (A). Estructura del nucleosoma a una resolución de 2.8 Å (Rhodes,1997) (B).

A B

INTRODUCCIÓN

3

1.2 La fibra de cromatina

Mucha información a cerca de la organización de orden superior de la cadena de

nucleosomas se ha conseguido gracias a la visualización por microscopía electrónica de

fragmentos de cromatina preparados bajo diferentes condiciones (Thoma et al., 1979).

Estas observaciones mostraron que a muy baja fuerza iónica (0.2 mM EDTA, 1 mM

Trietanolamina-HCl) la cromatina aparecía como una cadena de nucleosomas en forma

de zig-zag (ver también Woodcoock et al., 1993; Leuba et al., 1994). Cuando se

incrementaba la fuerza iónica hacia niveles más fisiológicos (aproximadamente 100

mM) el zig-zag de nucleosomas se condensaba formando una fibra irregular de 30 nm

de diámetro. Esta fibra de 30 nm ha sido objeto de muchos estudios puesto que sus

dimensiones y apariencia general son muy similares a las fibras observadas en

cromatina obtenida a partir de núcleos interfásicos (Thoma et al., 1979).

1.2.1 Dinámica de la cromatina

Es conocido que la cromatina participa activamente en un gran número de

procesos celulares (e.g. transcripción y replicación), sin embargo, la función principal

que se le atribuye es la del plegamiento del DNA.

Los primeros estudios sobre la importancia de las histonas de unión en la

estructura de la fibra de 30 nm, revelaron que éstas tenían un papel esencial. Thoma y

Koller (1981), vieron que la ausencia de solamente el 10% de las histonas H1/H5

impedía el plegamiento de la cromatina en la estructura condensada de 30 nm. Sin

embargo, experimentos más recientes con Tetrahynema, demostraron que este

organismo podía crecer normalmente con la ausencia total de las histonas de unión

(Dasso et al., 1994; Wolffe et al., 1997). A pesar de esta observación, se pudo apreciar

que el tamaño del núcleo se incrementaba dos veces. Este incremento en el tamaño

sugiere una menor compactación de la cromatina debido a la ausencia de las histonas de

unión. Por tanto, parece ser que las fibras de cromatina formadas sin la presencia de

histonas de unión no presentan la misma estructura que las fibras de cromatina nativas.

Este hecho viene confirmado por estudios realizados en nuestro laboratorio (Bartolomé,

1994), en los cuales fibras de cromatina sin histonas H1 tienen un comportamiento

diferencial en geles de agarosa no desnaturalizados en presencia de 1.7 mM de Mg2+,

INTRODUCCIÓN

4

respecto a las fibras nativas. Otro elemento clave estructural para la fibra de cromatina

son las colas N y C terminales de las histonas. Experimentos realizados mediante

digestiones enzimáticas han demostrado que la integridad de dichas colas es

absolutamente esencial para la formación de la fibra de 30 nm (Fletcher y Hansen,

1996; Widom, 1998).

El proceso de compactación de la cromatina es dependiente de la concentración

y de la naturaleza de los iones presentes en el medio. Así, se ha observado que la

concentración de iones monovalentes necesarios para provocar el plegamiento de la

cromatina es mayor que la de iones divalentes (Thoma et al., 1979; Ausió et al., 1984;

Widom, 1989; Hansen, 2002). Este efecto forma parte de un fenómeno más amplio que

implica que cuanto mayor es la valencia del ion, mayor es su capacidad estructurante,

siendo menor la concentración necesaria para plegar la cromatina (Koch et al., 1988).

Utilizando estas observaciones y la teoría de los polielectrolitos de Manning (1978),

Clark y Kimura (1990) realizaron un estudio que les permitió concluir que el

plegamiento de la cromatina es un proceso de naturaleza electroestática. En este mismo

sentido, Subirana (1992) postuló que el plegamiento de la cromatina podía ser producto

de la neutralización de las cargas del DNA. Así, al aumentar la fuerza iónica, la fibra de

cromatina se plegaría buscando la estructura con un mínimo de energía.

Sin embargo, los fenómenos de plegamiento-desplegamiento en la cromatina in

vivo debidos a una variación en la fuerza iónica, deben de ser diferentes respecto a lo

observado in vitro, puesto que las condiciones iónicas del núcleo celular son

suficientemente elevadas como para que la cromatina se encuentre empaquetada en

forma de fibra de 30 nm (Alberts et al., 2002). En la célula, muchos de los fenómenos

locales de condensación-descondensación se producen gracias a la unión de factores de

transcripción u otras proteínas en secuencias específicas iniciando la desestructuración

de una zona concreta del genoma (ver por ejemplo Adams y Workman, 1995;

Tsukiyama et al., 1995). Estas proteínas, incluso pueden modificar químicamente a las

histonas mediante procesos de acetilación (Marsmorstein y Roth, 2001), metilación

(Zhang y Rheinberg, 2001), fosforilación (Wolffe y Hayes, 1999), ubiquitinización y

ribosilación, ayudando así a la desestabilización de la fibra de 30 nm.

La fuerza iónica también juega un papel fundamental en la estructura de la

cromatina cuando se encuentra en su nivel más elevado de compactación. Diversos

autores han trabajado con cromosomas metafásicos, sometiéndolos a diferentes cambios

de concentración iónica (Maniotis et al., 1997; Bojanowski y Ingber, 1998; Poirier et

INTRODUCCIÓN

5

al., 2002). En estos experimentos se apreció como los cromosomas se condensaban y

descondensaban de forma reversible, confirmando que las interacciones electroestáticas

en la cromatina son esenciales en el mantenimiento de la estructura del cromosoma

metafásico. En el interior de la célula eucariota existe una gran cantidad de iones (tabla

1.2.1) que con toda probabilidad tienen un papel crucial en estas interacciones

electroestáticas, especialmente los iones monovalentes (Na+ y K+) y divalentes (Mg2+ y

Ca2+). Strick et al. (2001) investigaron la distribución tridimensional de estos iones en la

célula durante la interfase y la mitosis celular. Estos estudios realizados por microscopía

iónica de barrido han mostrado que los cationes Mg2+ y Ca2+ son específicamente

requeridos por la célula para la condensación de la cromatina en cromosomas mitóticos.

Composición iónica intracelular

Componente Concentración (mM)

Na+ 5-15a/b

K+ 140a/b

Mg2+ en núcleo interfásico 2-4c

Mg2+ en cromosoma metafásico (1) 12-22c

Ca2+ en núcleo interfásico 4-6c

Ca2+ en cromosoma metafásico (2) 20-32c

Cl- 4-15a/b

CO3H- 10b

Fosfato 11b

ATP 5-10b/c

Se indican sólo las concentraciones de los principales iones intracelulares. Los datos mostrados en esta tabla se han obtenido de las siguientes referencias: a Alberts et al., 2002. b Guyton y Hall, 2000. c Strick et al., 2001. (1) La distribución del Mg2+ es homogénea en el conjunto delcromosoma; (2) El Ca2+ se encuentra localizado en el eje central de las cromátidas. d Nicholls y Ferguson, 2002.

Tabla 1.2.1.

INTRODUCCIÓN

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1.2.1.1 Autoasociación de la cromatina

A diferencia de la enorme importancia de las histonas para conseguir un

plegamiento correcto de la fibra de cromatina, la continuidad del DNA entre los

diferentes nucleosomas no parece ser tan importante. Ruiz-Carrillo et al. (1980)

observaron que la digestión de la cromatina con nucleasa micrococal no afectaba a la

estructura de la fibra. Este resultado indica que las interacciones histona-histona e

histona-DNA son suficientes para mantener la estructura compacta de la cromatina.

Evidencias a favor de la autoasociación de la cromatina han sido encontradas por

diferentes grupos (Jorcano et al., 1980; Pérez-Grau et al.,1982). Más recientes son los

trabajos de Bartolomé et al. (1994) en los cuales, mediante técnicas electroforéticas y de

microscopía electrónica en condiciones estructurantes, se demostró que fragmentos de

cromatina de 3-4 nucleosomas podían autoasociarse formando estructuras muy similares

a las fibras nativas de cromatina.

Por otro lado, experimentos con microscopía de luz polarizada y con

criomicroscopía electrónica han mostrado pruebas a favor del apilamiento de

nucleosomas en columnas fuertemente empaquetadas formando hexámeros, en

presencia de poliaminas y NaCl 100 mM (Leforestier et al., 1999). También han sido

observadas otras estructuras autoorganizadas en forma bicapas, bajo condiciones

similares a las fisiológicas (Leforestier et al., 2001). Presumiblemente estos resultados

están directamente relacionados con otros trabajos previos procedentes de diferentes

laboratorios que muestran que partículas núcleo aisladas tienen una fuerte tendencia

para interactuar a través de sus caras formando arcos y hélices compactas (Finch et al.,

1977; Dubochet y Noll, 1978; Uberbacher y Bunich, 1985).

El apilamiento de partículas núcleo en estas estructuras podría ser debido a las

interacciones electroestáticas entre las histonas del octámero. De hecho, los estudios por

cristalografía de rayos X del nucleosoma (Luger et al., 1997) han mostrado que las colas

extendidas amino terminales de las histonas podrían interaccionar entre sí entre

nucleosomas adyacentes. A pesar de que las figuras autoasociadas observadas no se

parecen a las fibras de cromatina nativas, algunos autores han sugerido que las

interacciones cara-cara entre nucleosomas podrían ser la fuerza que llevara a la

formación de estructuras de orden superior en la cromatina (ver por ejemplo Leforestier

et al., 2001).

INTRODUCCIÓN

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1.2.2 Modelos estructurales

A diferencia de la fibra de cromatina no condensada, las imágenes de

microscopía electrónica obtenidas de la cromatina plegada no permiten ver la

colocación de los nucleosomas individuales, lo que hace muy difícil el estudio de su

estructura (Widom, 1989; Woodcock y Horowitz, 1995; van Holde y Zlatanova, 1995,

1996). Este hecho ha propiciado la búsqueda de pruebas indirectas para determinar la

colocación de los nucleosomas en la fibra de cromatina. A lo largo del tiempo, se han

acumulado una gran cantidad de resultados experimentales que en muchos casos han

conducido a interpretaciones contradictorias. El resultado ha sido la aparición de varios

modelos estructurales.

1.2.2.1 Modelo de solenoide

Finch y Klug (1976), usando técnicas de microscopía electrónica de transmisión

propusieron un modelo para la estructura de la fibra de 30 nm en la cual la cadena de

mononucleosomas es compactada por enrollamiento en una estructura simple de

solenoide. En este modelo habrían aproximadamente 6 nucleosomas por vuelta de hélice

y un paso de rosca de 11 nm (equivalente al diámetro de un nucleosoma) (ver figura

1.2.1A). Este paso de rosca se estableció gracias a la observación en microscopía

electrónica de estrías transversales separadas por 11 nm. Posteriormente, en estudios de

difracción de rayos X de fibras de cromatina parcialmente orientadas (Widom y Klug,

1985) se encontraron una mancha meridional correspondiente a un espaciado de 11 nm

que sugería la colocación radial de los nucleosomas con su eje de simetría perpendicular

al eje de la fibra e inclinados entre 20 y 30º. Otros autores, a partir de estudios de

dispersión de neutrones (Suau et al., 1979) y de dicroísmo eléctrico (Yabuki et al.,

1982; McGhee et al., 1983) han dado soporte al modelo solenoidal. En el modelo de

solenoide, para construir la hélice sencilla de nucleosomas, hace falta que el DNA de

unión entre nucleosomas se pliegue.

1.2.2.2 Modelo de superbead

En este modelo, los autores propusieron un plegamiento de la cromatina en el

cual se formaban agrupaciones discontinuas de nucleosomas llamados superbolas

INTRODUCCIÓN

8

(superbeads). Este modelo se planteó a partir de la observación en microscopio

electrónico de partículas esféricas con 12 nucleosomas por partícula y el mismo

diámetro que la fibra de 30 nm en muestras de cromatina digeridas con nucleasa

micrococal (Kiryanov et al., 1976; Franke et al., 1976).

1.2.2.3 Modelos helicoidales de doble origen

Son modelos en los cuales se propone que la fibra de cromatina se pliega

helicoidalmente a partir del zigzag de nucleosomas observado a baja fuerza iónica.

Woodcock et al. (1984), basándose en este tipo de modelo, propusieron que el

zigzag de nucleosomas se condensaría helicoidalmente formando una doble hélice en

las que el DNA de unión quedaría paralelo al eje de la fibra. Cada vuelta de la hélice

estaría formado por 18 nucleosomas, la fibra tendría 30 nm de diámetro y un agujero

central de 8 nm (ver figura 1.2.1B). Este modelo, llamado de cinta helicoidal, es más

compacto que otros modelos, ya que presenta 11.6 nucleosomas por cada 11 nm en vez

de los 6 nucleosomas por 11 nm del modelo solenoide. Diversos autores han aportado

datos a favor de este tipo de modelo (ver revisión crítica realizada por Woodcock y

Dimitrov, 2001).

Figura 1.2.1 Modelo solenoidal de la cromatina (A). (Figura adaptada de Widom yKlug, 1985). Modelo de la cinta helicoidal (B). (Figura adaptada de Woodcock et al.,1984).

INTRODUCCIÓN

9

Otra variante de los modelos helicoidales es el propuesto por Willams et al.

(1986) a partir de observaciones en las cuales el diámetro de las fibras plegadas

aumentaba al aumentar la longitud del DNA de unión (Williams y Langmore, 1991). En

este modelo el zigzag de nucleosomas se empaquetaría sobre su propio eje formando

una doble hélice con un paso de rosca de 26 nm y con un número de nucleosomas por

vuelta que dependería de la longitud del DNA de unión (Smith et al., 1990). Los

nucleosomas están conectados por el DNA de unión, que atravesaría la fibra por el

interior, de forma rectilínea con una trayectoria perpendicular respecto al eje de la fibra.

1.2.3 Modelo de solenoide interdigitado compacto

Nuestro grupo de investigación también ha sugerido un tipo de modelo para el

plegamiento de la cromatina en fibras de 30 nm. Los resultados que han permitido

sugerir este modelo se han obtenido a partir de estudios de electroforesis no

desnaturalizante en geles de agarosa y de microscopía electrónica (Bartolomé et al.,

1995; Daban y Bermúdez, 1998).

1.2.3.1 Electroforesis de cromatina en geles no desnaturalizantes de agarosa en

presencia de MgCl2 1.7 mM

Este tipo de electroforesis se ha utilizado por nuestro grupo para el estudio de la

estructura de la cromatina. Concretamente se ha podido constatar que al analizar

fragmentos de cromatina de eritrocitos de pollo de un tamaño de 6-50 nucleosomas se

produce una banda bien definida. Esta banda tiene prácticamente la misma movilidad

independientemente del peso molecular del fragmento. Este comportamiento no se

observa en geles con fuerzas iónicas más bajas. Cuando se analizaba la movilidad de los

fragmentos de entre 3-6 nucleosomas, se podían ver dos tipos de comportamiento

electroforético. Los fragmentos de 3-6 nucleosomas daban una banda amplia y de

movilidad electroforética creciente al disminuir el peso molecular, pero también se

producía la típica banda de los fragmentos de cromatina de tamaño molecular más

grande (a partir de ahora referida como banda retardada).

Cuando se analizó el contenido en histonas de estos fragmentos de 3-6

nucleosomas, se vio que los fragmentos que daban lugar a la banda retardada tenían un

contenido típico en histonas de unión (H1-H5), mientras que los fragmentos que daban

INTRODUCCIÓN

10

lugar a las otras bandas de movilidad superior tenían un bajo contenido de este tipo de

histonas (Bartolomé et al., 1995) (ver figura 1.2.2).

1.2.3.2 Análisis de las fibras de cromatina por microscopía electrónica

La cromatina extraída de la banda retrasada del gel de agarosa en presencia de

MgCl2 1.7 mM, entrecruzada con gluteraldehído y platinada en rotación en un ángulo de

7º, cuando era observada por microscopía electrónica, daba lugar a estructuras circulares

con una mayor acumulación de platino en la periferia que en el centro (Bartolomé et al.,

1995). Estas estructuras circulares tienen un diámetro constante (aproximadamente de

unos 33 nm) para fragmentos de cromatina entre 10 y 36 nucleosomas. La altura de

estas estructuras (medida cuando la platinación era unidireccional) aumentaba al

aumentar el número de nucleosomas.

Por tanto, estos resultados indican que se trata de estructuras cilíndricas que se

colocan verticalmente sobre la rejilla del microscopio. En las imágenes obtenidas,

también se observan otros elementos estructurales:

1) Una periferia helicoidal.

2) Un anillo de 11 nm de grosor con una serie de barras radiales

(aproximadamente seis) que podrían corresponder a nuclesomas.

3) Un agujero central de 7-12 nm.

En estudios de desnaturalización parcial (Bermúdez et al., 1998) se consiguió

generar lazos de DNA con longitudes correspondientes a 1, 2 o 3 nucleosomas

consecutivos desnaturalizados que salían radialmente de las fibras, hecho que demuestra

Figura 1.2.2 Electroforesis de agarosaal 0.5% (p/v) en tampón Tris 90 mM,Borato 90 mM con Mg2+ 1.7 mM. Lamuestra cargada es una distribución defragmentos de cromatina de 1 a 11nucleosomas (Cro) que se separaronen fracciones utilizando un aparatoPrep Cell 491 de Bio-RadLaboratories. Los pesos molecularesde los marcadores señalados estánindicados en kb (figura extraída deMartin, 1999).

INTRODUCCIÓN

11

una distribución radial de los nucleosomas. Otro punto que apoya la distribución radial

de los nucleosomas es la observación de que los puntos de entrada y salida del DNA de

los lazos correspondientes a dos nucleosomas consecutivos desnaturalizados están

relativamente cercanos. Esta observación sugiere que los nucleosomas consecutivos no

están en posiciones opuestas respecto el eje de la fibra.

Por lo que se refiere a los fragmentos de cromatina entre 3-6 nucleosomas que

presentan dos tipos diferentes de comportamiento electroforético, se ha visto que los

que generan la banda retardada (es decir, los que tienen un contenido normal de histonas

de unión) también forman estas típicas estructuras circulares compactas. Por el

contrario, la banda rápida no forma estas estructuras. Esto demuestra que los

nucleosomas poseen las propiedades necesarias para formar estructuras plegadas tan

estables que no requieren de la continuidad del DNA. Todas estas características

estructurales son consistentes con el modelo solenoidal pero las alturas medidas de las

fibras indican un grado de compactación mayor.

1.2.3.3 Modelo de solenoide propuesto por nuestro grupo

El conjunto de todos estos resultados ha permitido sugerir una familia de

modelos estructurales para el plegamiento de las fibras de cromatina de eritrocito de

pollo en presencia de MgCl2 1.7 mM.

Este tipo de modelos solenoidales empiezan con la formación de una hélice

primaria, formada por un número de nucleosomas por vuelta no entero e igual o inferior

a seis nuleosomas. La sucesiva formación de hélices primarias provoca la

interdigitación de los diferentes pisos, formando hélices secundarias, las cuales están

estabilizadas gracias a los contactos laterales entre las caras de los nucleosomas. El

sentido del giro de las hélices secundarias es el mismo que en las hélices primarias (ver

figura 1.2.3). La tendencia de los nucleosomas a interaccionar lateralmente formando

arcos y hélices ya ha sido descrita por otros laboratorios (recordar sección 1.2.1.1). El

hecho que las hélices primarias se intercalen entre si formando hélices secundarias,

provoca una mayor compactación de la fibra respecto a otros modelos solenoidales

típicos. Concretamente, el modelo de solenoide estándar produce una reducción de la

longitud del DNA de 40 veces, mientras que en nuestro modelo, la reducción es de 90

veces (Daban y Bermúdez, 1998).

INTRODUCCIÓN

12

Figura 1.2.4 Familiade modelos delsolenoide interdigitadocompacto. (A) Fibrade 2.8 nucleosomaspor vuelta, 2.35 nm depaso de rosca y conuna orientación de susnuclesomas conrespecto al eje de 20º.En (B), (C) y (D) elnúmero de nuclesomaspor vuelta es de 3.76,4.76 y 5.77, el paso derosca de 3.08, 3.84 y4.73 nm, y laorientación de 29, 40 y52º respectivamente.(Figura de Daban yBermúdez, 1998).

Figura 1.2.3 Modelo de solenoideinterdigitado compacto (C)comparado con el modelo delsolenoide normal (E). En ambosesquemas se representa ladistribución de 35 nucleosomascon 4.74 nucleosomas por vueltaen el solenoide interdigitado y 5en el solenoide normal. Tambiénse muestra la visión zenital (B yD) de las estructuras C y E. Amuestra la primera vueltacompleta de la hélice primaria yparte de la segunda vuelta. (Figurade Daban y Bermúdez, 1998).

INTRODUCCIÓN

13

Los diferentes modelos del solenoide interdigitado compacto se diferencian entre

si por el número de nucleosomas en cada vuelta de hélice primaria (ver figura 1.2.4). En

todos los casos el diámetro externo de las fibras es de 36 nm. En estos modelos se

desconoce la trayectoria del DNA de unión, pero en el caso de eritrocito de pollo (60-

64pb) se podría situar en el espacio dejado por el agujero central, sin ningún tipo de

impedimento estérico. Esta familia de modelos es válida tanto para hélices dextrógiras

como levógiras. De hecho, al observar las fibras por microscopía electrónica, se ha visto

que ambos tipos de hélices coexisten (Daban y Bermúdez, 1998).

1.3 El cromosoma

1.3.1 Ciclo celular y mitosis

Las células se reproducen duplicando su contenido y luego dividiéndose en dos.

El ciclo de división celular es el medio fundamental a través del cual todos los seres

vivos se propagan. En especies unicelulares como las bacterias y levaduras, cada

división de la célula produce un nuevo organismo. En especies pluricelulares se

requieren muchas secuencias de divisiones celulares para crear un nuevo organismo.

Este proceso también es necesario en el cuerpo adulto para remplazar las células

perdidas por desgaste, deterioro o por muerte programada. Los detalles del ciclo de

división celular pueden variar, pero existen algunos requerimientos universales. Lo

primero y principal para que se produzcan dos células hijas genéticamente idénticas es

que el DNA se replique exactamente y que los cromosomas replicados se segreguen en

dos células distintas (Alberts et al., 2002).

Tradicionalmente, el ciclo de división celular o ciclo celular se divide en cuatro

partes: La fase S es el periodo del ciclo donde se da la replicación del DNA del núcleo.

La fase M o mitosis es el proceso por el cual se da la división nuclear y finalmente la

división de la célula. El intervalo entre la consumación de la mitosis y el comienzo de la

síntesis del DNA se llama fase G1 y el intervalo entre el final de la síntesis del DNA y

el principio de la mitosis se denomina fase G2.

En la mayoría de las células, toda la fase M solo dura una hora

aproximadamente, lo cual es solo una pequeña fracción de la duración total del ciclo. El

INTRODUCCIÓN

14

periodo que transcurre entre una fase M y la siguiente es mucho más largo (suma de las

fases G1, S y G2) y se conoce como la interfase (ver figura 1.3.1). En este intervalo la

célula tiene una gran actividad, aumentando de tamaño y preparándose para la división

celular. Durante este periodo la estructura del cromosoma está posiblemente a nivel de

fibra de cromatina (ver sección 1.2), hecho que permitirá la correcta regulación de los

procesos de transcripción, replicación y recombinación que se dan durante la interfase

(Widom, 1997).

Clásicamente la mitosis se ha dividido en seis partes: Profase, prometafase,

metafase, anafase, telofase y citocinesis.

En la Profase la cromatina se condensa lentamente formando cromosomas bien

definidos, cuyo número exacto es característico de la especie en cuestión. Cada

cromosoma se ha duplicado durante la fase S precedente y ahora consta de dos

cromátidas hermanas. Cada una de las cromátidas contiene una secuencia de DNA

específica conocida como centrómero, necesaria para la correcta segregación del

cromosoma. Hacia el final de la profase empieza a formarse el huso mitótico.

La Prometafase se inicia bruscamente con la desintegración de la envoltura

nuclear, la cual se rompe formando vesículas membranosas. Los microtúbulos del huso,

que hasta el momento se hallaban fuera del núcleo, ahora pueden entrar en la región

nuclear. Simultáneamente los cromosomas continúan condensándose y en cada

centrómero aparecen unos complejos proteicos llamados cinetocoros. Parte de los

microtúbulos del huso se unirán a estas estructuras proteicas, con la finalidad de mover

los cromosomas hacia el centro de la célula.

En la Metafase los cromosomas llegan a su máximo grado de compactación,

mientras son alineados por los microtúbulos cinetocóricos en un plano situado en la

mitad de la célula.

Figura 1.3.1 Fasesdel ciclo celular(figura adaptada deAlberts et al., 2002).

INTRODUCCIÓN

15

La Anafase empieza cuando los cinetocoros apareados de cada cromosoma se

separan, permitiendo que cada cromátida (ahora denominada cromosoma) sea arrastrada

hacia un extremo de la célula.

En la Telofase, los cromosomas llegan a los polos de la célula y la envoltura

nuclear reaparece de nuevo. Entonces la cromatina condensada vuelve a expandirse.

Finalmente, en la Citocinesis, la célula se divide en dos nuevas células, cada una

de las cuales tendrá un número idéntico de cromosomas procedentes de la célula madre.

1.3.2 Modelos estructurales propuestos para el cromosoma metafásico

Durante la mitosis, la formación de cromosomas metafásicos requiere la

compactación del DNA en niveles superiores de empaquetamiento. Concretamente, la

longitud del DNA en el interior del cromosoma metafásico se encuentra reducida en un

factor de 104. Cada cromosoma contiene aproximadamente la misma proporción de

DNA, histonas y no histonas. Debido a las interacciones entre las histonas y el DNA,

este último se compacta sobre su longitud aproximadamente 40 veces para formar la

fibra de cromatina (Earnshaw, 1988). El mecanismo por el cual esta fibra de cromatina

se empaqueta las siguientes 250 veces hasta llegar al nivel máximo de compactación

durante la formación del cromosoma metafásico, ha sido objeto de muchos estudios.

Se han propuesto diferentes modelos para explicar la condensación de la

cromatina en cromosomas. Resultados obtenidos a partir de difracción de rayos X y

microscopía electrónica sugieren que la fibra de 30-40 nm es la unidad básica en el

plegamiento de la cromatina para formar cromosomas (ver por ejemplo Sedat y

Manuelidis, 1978; Rattner y Lin, 1985). A partir de este punto, los diferentes modelos

se diversifican en sus propuestas para justificar el empaquetamiento de las fibras de 30-

40 nm hasta su máxima condensación.

Tradicionalmente los modelos se han dividido en dos grandes corrientes. La

primera corriente sugiere una organización de la fibra de cromatina en forma de lazos,

los cuales estarían radialmente unidos a un eje proteico en el interior de cada cromátida

(Paulson y Laemmli, 1977). La segunda corriente propone un plegamiento helicoidal

sucesivo de la fibra de 30-40 nm hasta formar la cromátida metafásica. (Sedat y

Manuelidis, 1978).

INTRODUCCIÓN

16

1.3.2.1 Modelos basados en lazos de la fibra de cromatina anclados a un eje

proteico

En esta corriente la formación de lazos a partir de la fibra de cromatina sería la

unidad base a partir de la cual se daría el plegamiento. Estos lazos contendrían entre 50

y 100 kb de DNA y formarían fibras gruesas de 250 nm. En este modelo los lazos de

DNA estarían anclados en un esqueleto proteico. Finalmente, la fibra de 200-300 nm

acabaría plegándose helicoidalmente hasta formar las cromátidas metafásicas. Dentro de

esta corriente destacaría sobretodo, el modelo clásico de Laemmli y colaboradores

(Paulson y Laemmli, 1977; Boy de la Tour y Laemmli, 1988; Saitoh y Laemmli, 1994)

basado en la visualización al microscopio electrónico de fibras de cromatina formando

lazos alrededor de un cuerpo cromosómico rico en proteínas (figura 1.3.2). Según este

modelo, la fibra de cromatina se une al eje proteico por regiones de DNA concretas

ricas en los pares de bases A+T (SARs), que interaccionan específicamente con la

topoisomerasa II, proteína mayoritaria del esqueleto proteico (revisado en Saitoh y

Laemmli, 1993). Este modelo basado en un eje central proteico se ha visto reforzado

gracias a los trabajos más recientes de este grupo. Maeshima y Laemmli (2003),

mediante técnicas de inmunofluorescencia han mostrado la presencia de la

topoisomerasa II y de la condensina (uno de los complejos proteicos mas abundantes del

cromosoma, ver más adelante sección 1.3.4.3) localizados radialmente a lo largo del eje

central de ambas cromátidas metafásicas.

Figura 1.3.2 Micrografíaelectrónica de uncromosoma metafásico,mostrando lazos decromatina queprotuberan a partir de uneje proteicocromosómico (Earnshawy Laemmli, 1983).

INTRODUCCIÓN

17

Otro modelo interesante dentro de esta corriente sería el de minibandas de Pienta

y Coffy (1984). En este caso, en base a un estudio de la organización del DNA y su

interacción con la matriz nuclear en el cromosoma IV humano, se sugirió que 18 lazos

de 60 kb podrían distribuirse radialmente alrededor del esqueleto proteico,

constituyendo una nueva unidad estructural, que los autores denominaron minibanda.

106 de estas minibandas ordenadas radialmente constituirían la cromátida de dicho

cromosoma (ver figura 1.3.3).

La evidencia de que la fibra de cromatina se organiza en forma de lazos anclados

a un eje proteico central ha venido a partir de diferentes aproximaciones experimentales.

Por ejemplo, observaciones al microscopio electrónico de los cromosomas lampbrush

en oocitos de anfibio, muestran claramente una sucesión de lazos emergiendo de un eje

central cromosómico (Callan, 1986).

Benyajati y Worcel (1976) realizaron una serie de digestiones con DNasa I en

cromosomas interfásicos de Drosophila. Al analizar el tamaño de los fragmentos

obtenidos, vieron que en su mayoría eran de unas 85 kb de DNA unido a proteína. Esto

sugirió que la fibra de cromatina estaba organizada en dominios de unos 100 kb de

DNA.

Las evidencias más importantes han venido a través del estudio de cromosomas

por microscopía electrónica. En estos estudios, a partir de cromosomas desprovistos de

Figura 1.3.3 Diagramaesquemático de lacondensación del DNAhasta llegar alcromosoma metafásico,según el modelopropuesto por Pienta yCoffey (1984).

INTRODUCCIÓN

18

histonas por tratamiento a altas concentraciones salinas, se pudo estimar el tamaño de

los lazos entre 40 y 90 kb de DNA (Paulson y Laemmli, 1977).

Otros experimentos han utilizado la presencia de nucleasas endógenas de baja

especificidad, cuya activación se puede dar bajo condiciones controladas (añadiendo

Ca2+ o Mg2+ en el núcleo), para digerir la cromatina. Para poder interpretar estos

trabajos fue imprescindible el desarrollo de la técnica de la electroforesis en campo

pulsante (Schwartz y Cantor, 1984). Se observaron sitios de corte separados entre sí por

50-300 kb (Filipski et al., 1990). Estos resultados fueron corroborados por una segunda

aproximación experimental, en la cual se utilizaron inhibidores de la topoisomerasa II.

Esta enzima introduce roturas en el DNA doble cadena que pueden ser estabilizadas

mediante inhibidores.

Un análisis más detenido de los fragmentos obtenidos en ambos experimentos,

reveló que los intermediarios de 300 kb se producían anteriormente a los de 50 kb. Esto

sugiere que los fragmentos de 50 kb corresponderían al primer nivel de organización de

la fibra de cromatina en lazos, mientras que los fragmentos de 300 kb representarían el

siguiente nivel de organización (Filipski et al., 1990).

Todos estos trabajos parecen indicar que el primer nivel de organización de la

fibra de cromatina sería en forma de largos e independientes lazos de entre 50 y 100 kb

de DNA, los cuales estarían unidos a un esqueleto proteico.

Pese a recibir muchas críticas (en especial la presencia de un eje proteico

central) esta corriente es la más aceptada por la bibliografía (ver por ejemplo Sumner,

2003 o Alberts et al., 2002).

1.3.2.2 Modelos basados en diferentes grados de plegamiento helicoidal

En la segunda corriente los modelos propuestos también parten de la fibra de 30

nm como unidad básica de plegamiento. En estos modelos la fibra de 30 nm no formaría

lazos ni estaría anclada en ningún eje proteico y gracias a un plegamiento helicoidal

darían a lugar al siguiente elemento estructural: la fibra de 150-300 nm. Una vez

formadas estas fibras, también se condensarían helicoidalmente hasta formar la

cromátida metafásica (ver por ejemplo Bak et al., 1977).

Ya en 1965, Ohnuki pudo observar a través del microscopio óptico, que en

ciertas condiciones los cromosomas claramente adoptaban una forma helicoidal. Sin

embargo, la primeras evidencias claras a favor de esta segunda corriente vinieron a

INTRODUCCIÓN

19

partir de la obtención de imágenes mediante diferentes técnicas de microscopía óptica y

electrónica (Sedat y Manuelidis, 1978). Estos autores mostraron la existencia de tubos

de 200 nm plegados helicoidalmente, que a su vez se volvían a plegar para formar

cromátidas de 600 nm. Más tarde, este grupo examinó cromosomas mitóticos de

Droshophila, observando una jerarquía en los patrones de plegamiento de la fibra de 30

nm en estructuras de orden superior. Se pudo observar claramente intermediarios de 50,

100 y 130 nm de diámetro. Aunque en ciertas circunstancias algunas fibras de 30-50 nm

de diámetro fueron detectadas en forma de lazos, aparentemente no se encontró ninguna

evidencia a favor de un eje central proteico (Belmont et al., 1987, 1989). Estos

resultados han sido observados también en células de mamíferos (Belmont y Bruce,

1994).

Uno de los primeros modelos de esta corriente, sería el formulado por Taniguchi

y Takayama en 1986. Estos dos autores observaron a partir de cromosomas de hámster

chino y por microscopía electrónica de barrido, fibras de 200 nm unidas

perpendicularmente al eje cromosómico. Esto les valió para proponer un modelo en el

cual la fibra de 30 nm se pliega helicoidalmente para formar la fibra de 200 nm, la cual

a su vez vuelve a plegarse helicoidalmente para formar la cromátida del cromosoma

metafásico (ver figura 1.3.4).

Una herramienta muy eficaz para el estudio de la estructura del cromosoma, ha

sido la utilización del microscopio de fluorescencia. En los últimos años la proteína de

fluorescencia verde (GFP) ha revolucionado este tipo de microscopía. Para poder

estudiar el plegamiento del cromosoma, se introdujo en cada uno de éstos, repeticiones

Figura 1.3.4 Modelo dela estructuración de lacromatina para laformación de loscromosomas metafásicos propuestopor Taniguchi yTakayama (1986).

INTRODUCCIÓN

20

(256) del operón lac. Este segmento de DNA (10.1 kb) puede ser detectado utilizando

una fusión de la proteína represora del operón lac con una GFP (Robinett et al., 1996).

En el momento en que la GFP puede ser detectada in vivo en el interior del cromosoma,

entonces es posible seguir la dinámica de condensación cromosómica directamente bajo

condiciones fisiológicas.

Esta técnica ha permitido observar la presencia de fibras de aproximadamente

150 nm durante los últimas fases de la formación del cromosoma metafásico. También

se ha podido observar que el patrón de condensación de estas fibras era inconsistente

con la presencia de un hipotético eje proteico (Dietzel y Belmont, 2001). Utilizando

estos mismos métodos, en experimentos más recientes, se ha conseguido introducir en

cromosomas de ovarios de hámster chino, secuencias con alto contenido de regiones AT

unidas al operón Lac (Strukov et al., 2003). La presencia de estas zonas ricas en

secuencias SARS (ver sección 1.3.2.1) no alteró el patrón de plegamiento ni la

estructura de los cromosomas modificados tal y como sería de prever si los cromosomas

siguieran el modelo de plegamiento planteado por Laemmli y colaboradores (sección

1.3.2.1). En este mismo trabajo también se pudo observar la formación de

inetrmediarios de 250 nm de diámetro que se condensaban de forma helicoidal.

También se han realizado experimentos con topoisomerasa II fusionada con

GFP. Estos trabajos han dado resultados contradictorios. Tavormina et al. (2002) a

partir de células a las cuales se substituyó la topoisomerasa II endógena por

topoisomerasa II fusionada a GFP pudo comprobar que esta proteína se encontraba

mayoritariamente distribuida en un eje lineal a lo largo de los brazos cromosómicos. Por

otro lado, Christensen et al. (2002) en estudios similares en topoisomerasa IIα y β

fusionadas con GFP, pudo constatar que la isoforma α se encuentra unida al cromosoma

metafásico de manera uniforme sin formar ningún eje, mientras que la isoforma β solo

se encuentra durante el periodo interfásico.

Sin embargo, en estos dos artículos, también se estudió la dinámica de la

topoisomerasa II durante el ciclo celular y ambos trabajos han coincidido que esta

dinámica, durante la metafase, es demasiado rápida como para considerar la

topoisomerasa II como un componente estructural inamovible en un hipotético eje

central proteico.

Todos estos resultados no son contrarios con la existencia de una serie de

proteínas no histona en las cuales se anclarían los lazos de la fibra de cromatina u otro

INTRODUCCIÓN

21

tipo de dominio estructural cromatínico. No obstante, sí son contrarios con la idea de

que estas proteínas formen un eje central ininterrumpido. A favor de este concepto

estarían una serie de experimentos con inmunoflorescencia en los cuales anticuerpos

contra la topoisomerasa II estaban distribuidos en dominios separados entre si por 120-

200 nm (Di Nardo et al., 1984) (ver sin embargo el trabajo de Maeshima y Laemmli,

2003, comentado en la sección 1.3.2.1).

1.3.2.3 Nuevos modelos

1.3.2.3.1 Modelos de plegamiento a través de cromómeros. Muchos estudios

sobre la estructura del cromosoma mitótico han sido hechos por técnicas de microscopía

electrónica. Estas técnicas tienen la ventaja de tener un poder de resolución lo

suficientemente elevado como para poder observar los elementos estructurales de los

cuales se compone el cromosoma. Desgraciadamente, no está muy claro si las

estructuras vistas por microscopía electrónica son representativas de la estructura del

cromosoma mitótico in vivo. La microscopía electrónica requiere una elaborada

preparación de las muestras que implica la fijación, deshidratación y tinción de los

cromosomas para poder ser observados al vacío. Sin embargo en los últimos años han

aparecido nuevos tipos de microscopio, como por ejemplo el microscopio de fuerza de

barrido. Este tipo de microscopía ha permitido obtener imágenes de cromosomas

intactos en soluciones líquidas sin ningún paso previo de fijación, deshidratación ni

tinción. Estas imágenes han revelado la existencia de una superficie en forma de

gránulos de 200 nm de diámetro sobre cromosomas premetafásicos (Schaper et al.,

2000).

Anteriormente, gracias a la reconstrucción tridimensional de una serie de

micrografías de cromosomas humanos, ya se había observado la existencia de

estructuras de 200 nm de diámetro en las cuales había empaquetados diversos lazos de

la fibra de cromatina de forma desorientada (Borland et al., 1988). Estructuras similares

también han sido descritas durante el proceso de condensación de la cromatina en

núcleos profásicos tempranos (El-Alfy et al., 1994). Todos estos datos han planteado la

posibilidad de que el cromosoma metafásico llegue a su máxima condensación a través

de la formación de estos nuevos elementos estructurales, llamados cromómeros.

Así por ejemplo, Cook (1995) plantea un modelo en el cual los lazos de la fibra

de cromatina formarían radios a partir de factorías de transcripción, las cuales estarían

INTRODUCCIÓN

22

agrupadas en forma de cromómeros. Éstos, a su vez, se fusionarían entre si

constituyendo un eje irregular central que sería la base de una cromátida cilíndrica. Este

modelo, no obstante, tiene algunas objeciones. Sus detractores opinan que si el eje

cromosómico está formado por factores de transcripción, entonces deberíamos encontrar

gran cantidad de RNA polimerasa. Esta enzima, sin embargo, no se encuentra apenas

presente en cromosomas mitóticos (Sumner, 2003).

Figura 1.3.5 Mecanismo de compactación de la cromatina en el cromosomametafásico propuesto por Wanner y Formanek (2000) (a y b). Agrupaciones de unos50 lazos formarían un cromómero de 200 nm de diámetro (c).

INTRODUCCIÓN

23

Un modelo más consistente es el propuesto por Wanner y Formanek (2000).

Estos autores, basados en estudios de microscopía de barrido de alta resolución en

combinación con tinciones diferenciales de DNA y proteína, proponen que el

cromosoma metafásico estaría principalmente compuesto de DNA empaquetado en

estructuras de 200 nm (cromómeros) y de una matriz dinámica formada por fibras

paralelas de proteína. En este modelo la condensación del DNA formaría la fibrilla

elemental de 10 nm (cadena de nucleosomas) la cual se plegaría de forma solenoidal

para formar la fibra de 30 nm. Esta fibra se uniría en forma de lazos a la matriz de fibras

proteicas mediante proteínas de unión. Durante la condensación de la matriz, se

formarían los cromómeros gracias a proteínas que estabilizarían los lazos de la fibra de

30 nm (ver figura 1.3.5a). La compactación del cromosoma empezaría en el centrómero

y finalizaría en los telómeros. Durante esta compactación el cromosoma se volvería

muy corto y grueso a medida que se fueran formando los cromómeros (figura 1.3.5b).

1.3.2.3.2 Modelo de estructura reticular. Una prometedora aproximación para el

estudio de la estructura de los cromosomas ha sido el desarrollo de técnicas biofísicas

capaces de cuantificar las propiedades elásticas de los cromosomas (Houchmandzadeh

et al., 1997). Concretamente, estos métodos combinados con técnicas de

micromanipulación, han permitido aplicar una tensión constante sobre cromosomas

individuales. De esta manera ha sido posible monitorizar los posibles cambios en la

estructura de los cromosomas cuando estos se ven sometidos a diferentes condiciones.

Poirier et al. (2002) utilizando estos métodos observaron que los cromosomas se

podían hipercondensar y descondensar rápidamente y de forma reversible variando

únicamente las condiciones iónicas. Estos resultados indican que las interacciones

electroestáticas de la cromatina en el interior de la cromátida mitótica juegan un papel

muy importante en el mantenimiento de la estructura del cromosoma mitótico (ver

también Maniotis et al., 1997; Bojanowski y Ingber, 1998).

Este grupo de investigadores realizó a continuación nuevos estudios con la

misma metodología en la que se sometió a cromosomas de tritón a digestiones con

nucleasa micrococal y enzimas de restricción (Poirier y Marko, 2002). La digestión con

nucleasa micrococal provocó en primer lugar, la pérdida de la respuesta elástica de los

cromosomas, seguido finalmente de su completa desestructuración. Esto respaldaría la

idea de que la integridad mecánica de los cromosomas es debida principalmente a la

propia cromatina a la vez que descartaría la presencia de un eje central proteico

INTRODUCCIÓN

24

continuo y bien definido. Las digestiones realizadas con diversos enzimas de restricción

indicaron que los posibles elementos entrecruzadores (probablemente proteicos) dentro

de la estructura cromosómica están separados aproximadamente 15 kb de DNA.

La unión de todos estos resultados ha hecho proponer a este grupo de

investigadores un modelo estructural. En este modelo, el cromosoma mitótico tendría

una estructura reticular estabilizada por interacciones electroestáticas de la propia

cromatina y por una serie de elementos entrecruzadores proteicos separados entre si por

aproximadamente 15 kb de DNA (ver figura 1.3.6).

1.3.2.3.3 Modelo Mixto. Este modelo propuesto por Houchmandzadeh y

Dimitrov (1999) y revisado por Woodcock y Dimitrov (2001) incorpora elementos de

los modelos tradicionales basados en un eje central proteico (sección 1.3.2.1), junto con

elementos del modelo más reciente de Poirier et al. (2002) (ver figura 1.3.6). Basado en

el estudio de las propiedades elásticas de cromosomas formados a partir de extractos de

Xenopus (Houchmandzadeh y Dimitrov, 1999), los autores proponen un modelo en el

cual el cromosoma mitótico estaría constituido en base a un delgado eje proteico (20

nm) elástico y deformable alrededor del cual estaría anclada de forma suave y flexible la

cromatina. Las propiedades elásticas del eje, serían similares a las de una proteína típica

del tejido muscular llamada titina. De hecho, se ha podido constatar en Drosophila que

mutaciones en genes homólogos a la titina inhiben la condensación y la consiguiente

segregación de los cromosomas metafásicos (Machado y Andrew, 2000).

Figura 1.3.6 Modelopara la estructuraciónde la cromatina en elcromosoma metafásicopropuesto por Poirieret al. (2002).

INTRODUCCIÓN

25

1.3.3 Restricciones físicas de los diferentes niveles de plegamiento del DNA para la formación del cromosoma metafásico

Las longitudes de las moléculas de DNA son mucho más grandes que la

dimensiones de los cromosomas metafásicos donde están contenidas durante la mitosis.

La bibliografía ha utilizado la razón de empaquetamiento lineal como medida del grado

de compactación del DNA, definida como la relación entre la longitud del DNA

extendido y la longitud de la estructura que contiene el DNA (Lewin, 2000). Sin

embargo, para considerar las restricciones físicas que tienen las estructuras cromatínicas

propuestas por los diferentes autores para llegar a los cromosomas metafásicos, es mejor

considerar como medida de compactación, la concentración local del DNA. Esta se

define como la masa de DNA por unidad de volumen de las estructura biológica que

contiene este DNA.

La concentración local de DNA en los cromosoma metafásicos ha sido

determinada por diversos tipos de células en diferentes laboratorios, utilizando diversas

técnicas de microscopía (Bennett et al., 1983; Bohrmann et al., 1993; Heslop-Harrison

et al., 1989; Fritzsche y Henderson, 1996). La media de estos valores obtenidos es de

0.17 g/ml (Daban, 2000).

Sin embargo, los diferentes niveles de plegamiento planteados por los diferentes

autores tienen una serie de restricciones físicas que impiden en muchos casos alcanzar

la concentración local de DNA determinada para el cromosoma metafásico.

En la partícula núcleo del cromosoma, el DNA está enrollado sobre el octámero

de histonas y en consecuencia solo ocupa la parte externa de la estructura. Esto hace que

la concentración local de DNA estimada para estas estructuras sea baja (0.32-0.39 g/ml

para nucleosomas con 20-80pb de DNA de unión) (Daban, 2000). Por tanto, todas las

estructuras que se constituyan a partir de nucleosomas, la concentración local de DNA

estará limitada a un valor máximo de 0.3-0.4 g/ml.

Las concentraciones locales de DNA estimadas para las tres modelos

representativos de la fibra de 30-40 nm son las siguientes:

Modelo de zig-zag irregular (sección 1.2.2.3): 0.04-0.14 g/ml,

dependiendo de las condiciones iónicas),

Modelo de solenoide (sección 1.2.2.1): 0.15 g/ml

Modelo de solenoide interdigitado (sección 1.2.3.3): 0.27 g/ml.

INTRODUCCIÓN

26

Así pues, en todos los modelos propuestos la concentración local de DNA en las

fibras de 30-40 nm es inferior a la correspondiente a los nucleosomas aislados. Esto es

debido a que la concentración de DNA está limitada por la disposición en el espacio de

los nucleosomas en cada uno de los modelos.

A partir de la fibra de 30-40 nm, la cromatina se pliega en una serie progresiva

de niveles hasta llegar al cromosoma metafásico. Han sido diversos los modelos

propuestos para explicar este proceso de condensación (ver sección 1.3.2). Pero sea el

modelo que fuere, hay que tener en cuenta que las estructuras que se empaquetan no

pueden ocupar todo el espacio y que por tanto se va a producir en cada nivel de

empaquetamiento una reducción de la concentración local de DNA.

Además, en muchos de los modelos planteados se sugiere la existencia de un

agujero central a lo largo de todo el eje longitudinal de la cromátida, que representa una

gran perdida de eficiencia en la ocupación del espacio por parte de las fibras de la

cromatina.

Daban (2000) efectuó un estudio a partir de los modelos estructurales más

importantes del cromosoma metafásico propuestos hasta el momento, para determinar la

disminución de la concentración local cuando la fibra de cromatina de 30-40 nm se

pliega hasta formar la cromátida condensada. El promedio de los valores obtenidos para

los diversos modelos corresponde a una reducción de la concentración del 40%.

Si se aplica esta reducción del 40% a cada una de las concentraciones de DNA

local estimadas para los tres modelos básicos propuestos para la fibra de cromatina, se

observa, que únicamente en el modelo de solenoide interdigitado se obtiene un valor de

la concentración local (0.16 g/ml) similar al estimado para el cromosoma metafásico por

métodos experimentales (0.17 g/ml).

1.3.4 Proteínas involucradas en la estructura del cromosoma

En estos últimos capítulos se ha descrito ampliamente el plegamiento de la

cromatina para formar los cromosomas metafásicos. Sin embargo prácticamente no se

ha comentado nada a cerca del papel estructural de las proteínas en los cromosomas

mitóticos. Tradicionalmente existen tres tipos de proteínas implicadas en esta función:

Las histonas, la topoisomerasa II y las proteínas SMC (Stability and Maintenance of

Chromosomes).

INTRODUCCIÓN

27

1.3.4.1 Histonas

Además de las consideraciones básicas sobre las histonas en la cromatina

presentadas anteriormente, hay otros aspectos que cabe destacar.

El papel de fosforilación de la histona de unión H1 en el cromosoma mitótico,

está todavía poco claro. Tradicionalmente se ha creído que la función de esta

modificación post-traduccional per se, ha sido la de dirigir la condensación

cromosómica. Sin embargo, los resultados más recientes van contra esta posibilidad (ver

por ejemplo, Guo et al., 1995). Algunos estudios han sugerido que la fosforilación de la

histona H1 podría provocar la activación de la fosforilación de la histona H3, la cual si

tiene un claro papel a favor de la condensación mitótica. También cabría la posibilidad

de que la propia fosforilación provocara la separación de la histona H1 con la

cromatina, favoreciendo de este modo el acceso de otros factores de condensación

(Hirano, 2000).

La histona H3 es fosforilada en la serina-10 durante la mitosis. Esta

modificación está estrechamente unida temporal y espacialmente a la condensación

cromosómica. Se han planteado dos posibles alternativas para explicar el papel de la

fosforilación de la histona H3 en la condensación de los cromosomas mitóticos. En la

primera alternativa, la histona H3 fosforilada actuaría como un receptor directo,

reclutando factores de condensación. En la segunda posibilidad (al igual que uno de los

dos posibles modelos para la histona H1) la fosforilación reduciría la afinidad de la

histona H3 por el DNA, permitiendo la unión de factores de condensación a la

cromatina (Hirano, 2000).

1.3.4.2 Topoisomerasa II

La proteína encontrada en el cromosoma mitótico de forma más abundante es la

topoisomerasa II (Earnshaw et al., 1985; Gasser et al., 1986). La actividad de esta

enzima consiste en pasar DNA doble cadena a través de otro DNA doble cadena, por

tanto una de sus funciones sería la de resolver los entrecruzamientos de la fibra de

cromatina durante la condensación y la segregación del cromosoma.

Debido a su amplia distribución en las cromátidas se ha hipotetizado que la

topoisomerasa II podría tener también una función estructural en el cromosoma

mitótico. Saiatoh y Laemmli en 1993 indicaron la posibilidad de que la topoisomerasa II

INTRODUCCIÓN

28

actuara como punto de anclaje de los lazos de DNA (ver sección 1.3.2.1). Sin embargo,

experimentos a partir de cromátidas reasociadas in vitro y sin la presencia de la

topoisomerasa II, sugirieron que ésta no era exclusivamente necesaria para el

mantenimiento de la estructura cromosómica (Hirano y Mitchison, 1993). Por otro lado

Bojanowski et al. (1998) mostraron que la topoisomerasa II podía provocar una

morfología compactada en cromosomas descondensados después de un tratamiento con

proteasas, sugiriendo de esta forma una posible función de condensación de la

cromatina por parte de la topoisomerasa II.

Si bien el rol estructural de la topoisomerasa II ha sido ampliamente discutido,

su localización exacta en el cromosoma no ha quedado aclarada. Diversos trabajos de

microscopía de inmunofluorescencia han mostrado una distribución de la topoisomerasa

II a lo largo del eje longitudinal de la cromátida (Earnshaw y Heck, 1985; Maeshima y

Laemmli, 2003; Tavormina et al., 2002). Sin embargo otros estudios realizados con

técnicas similares (Christensen et al., 2002) han localizado la topoisomerasa II

distribuida de forma más uniforme en el brazo cromosómico. Una distribución similar

fue encontrada en experimentos realizados a partir de cromátidas reasociadas en

extractos de Xenopus (Hirano y Mitchison, 1993) o en estudios en células de insectos a

las cuales se les inyectó topoisomerasa II marcada con rodamina (Swedlow et al., 1993).

Finalmente diversos grupos que han trabajado con técnicas de inmunomarcaje han

detectado esta enzima en altas concentraciones en el cinetocoro (Rattner et al., 1996;

Summer et al., 1996).

1.3.4.3 Proteínas SMC (Condensinas y Cohesinas)

En los últimos años ha sido posible el estudio de la constitución de cromosomas

in vitro. Esto se ha logrado gracias a extractos de huevos de Xenopus. A partir de estos

extractos, se ha podido convertir la cromatina del esperma de Xenopus en núcleos

interfásicos o cromosomas metafásicos (Smythe y Newport, 1991). Este sistema ha

permitido identificar a proteínas indispensables para la organización del cromosoma

mitótico. El ejemplo más notable ha sido el hallazgo de la condensina y la cohesina,

ambas pertenecientes a la familia de las SMC.

El complejo de la condensina ha sido identificado en el cromosoma mitótico

(Strunnikov et al., 1993). Este complejo esta formado por cinco subunidades proteicas,

tres de las cuales no pertenecen a la familia de las SMC. El núcleo de la condensina

INTRODUCCIÓN

29

consiste en un heterodímero formado por las proteínas SMC2 y SMC4 (Hirano, 1998).

La versión de estas dos proteínas en Xenopus se denomina XCAP-E y XCAP-C

respectivamente. Ambas proteínas tienen dos dominios helicoidales antiparalelos

conectados entre si por una región bisagra. Los extremos N y C del heterodímero son

globulares e interaccionan con el DNA mediante un proceso en el cual se produce la

hidrólisis de ATP (ver figura 1.3.7).

La estructura global de la condensina sugiere un papel en el plegamiento de la

fibra de 30 nm. Una combinación de estudios genéticos en levadura y bioquímicos en

huevos de Xenopus, han mostrado que la función de este complejo es la del

mantenimiento de la estructura del cromosoma mitótico (Hirano, 2000). Sin embargo,

el mecanismo por el cual la condensina desempeña esta función, es todavía

desconocido.

El complejo de la cohesina es otro reciente descubrimiento en el cromosoma

mitótico. Esta compuesto por las proteínas SMC1 y SMC3. Este complejo proteico es

necesario para mantener unidas las cromátidas humanas después de que los cromosomas

se hayan duplicado durante la fase S (Hirano, 2000).

Figura 1.3.7 Estructuradel heterodímero SMC2-SMC4 del complejo de lacondensina. En la figurase puede apreciar eldominio helicoidalantiparalelo, la regiónbisagra y los dominiosglobulares de unión alDNA e hidrólisis de ATP(figura adaptada deAlberts et al., 2002) .

INTRODUCCIÓN

30

1.4 Objetivos

Nuestro grupo ha estudiado la estructura de la cromatina de núcleos de

eritrocitos de pollo (Bartolomé et al., 1994; Bartolomé et al., 1995; Bermúdez et al.,

1998). La consecuencia de estos estudios ha sido la elaboración de un modelo para el

plegamiento de la fibra de cromatina con una elevada concentración local del DNA

(Daban y Bermúdez, 1998; Daban, 2000). Sin embargo, el nivel máximo de

condensación en la cromatina, se encuentra en el interior de los cromosomas

metafásicos. Aunque la bibliografía ha planteado diferentes modelos para el

plegamiento de la cromatina en el interior de éstos, tal como se ha descrito en la

introducción, existe un conocimiento muy escaso acerca de la estructura molecular de la

cromatina en los cromosomas condensados.

En base a estos precedentes, los objetivos del presente trabajo han sido:

- La puesta a punto de técnicas de preparación de cromosomas a partir de células

HeLa en cultivo paradas en metafase. Estas técnicas habrán de permitir la obtención de

cromosomas en buen estado y en cantidades suficientes para posteriores estudios

bioquímicos y estructurales con microscopía óptica y electrónica.

- Provocar una desnaturalización parcial de los cromosomas metafásicos con el

fin de intentar poner de manifiesto elementos o propiedades estructurales que de otra

forma pudieran permanecer ocultos en las cromátidas condensadas. Para conseguir este

objetivo se desarrollarán métodos de desnaturalización parcial mediante tratamientos

con medios poco estructurantes y mediante digestiones enzimáticas.

- El objetivo final de la tesis ha sido la caracterización estructural de los

diferentes elementos observados a partir de la denaturalización parcial de los

cromosomas metafásicos y el estudio de las posibles relaciones estucturales entre dichos

elementos.

MATERIALES Y MÉTODOS

31

2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Cultivos celulares

Cuando se trabaja con cultivos celulares, se requieren condiciones de esterilidad

para evitar la contaminación de los cultivos en cuestión, y en caso de las células HeLa

(línea de origen tumoral), también para la protección del investigador. Por esta razón

muchos de los procesos fueron realizados en una cabina de flujo laminar vertical (Faster

Bio 48 Cultek) y, en los pocos pasos en que ésto no fue posible, se trabajó cuidadosamente

para evitar la contaminación. Todo el material utilizado en las técnicas de cultivo fue

previamente autoclavado.

2.1.1 Establecimiento de un cultivo de células HeLa

Se partió de un vial que contenía aproximadamente un millón de células de la línea

celular humana HeLa, el cual estaba congelado en N2 líquido en presencia de medio de

congelación [suero fetal bovino y dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%, que actúa como

criprotector (Gibco)]. Este vial se descongelaba durante un minuto a 37ºC en un baño

Maria. Seguidamente se resuspendía en un tubo cónico de 15 ml al que previamente se le

había añadido 10 ml de medio de cultivo [Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)

con Glutamax-1 y glucosa 4500 mg/l, suero fetal bovino al 10% y penicilina-streptomicina

al 1%, pH 7.3 (Gibco)]. Previamente, el tubo cónico había sido enfriado en hielo, ya que a

partir de 4ºC el DMSO empieza a ser tóxico para las células. Esta resuspensión en medio de

cultivo, permite que el crioprotector salga de la célula hacia el medio por ósmosis.

Seguidamente se centrifugó en el rotor 8160 de la centrífuga Megafuge 2.R (Heraeus) a 4ºC

y 400g durante 10 minutos. El sobrenadante que contenía el DMSO era eliminado mediante

una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío. El pelet resultante se resuspendía en 15

ml de medio DMEM y luego se trasvasaba a un frasco de cultivo de 75 cm2 (Becton

Dickinson), dejándolo resbalar cuidadosamente por la pared del recipiente.

Una vez las células estaban en el frasco, se observaban al microscopio óptico

Lobovat (Leitz) a 40 aumentos para ver su estado. Las células en buen estado tenían un


32

aspecto refringente y redondo. Finalmente las células se dejaban creciendo en un incubador

de CO2 con camisa de agua (Forma Scientific) a 37 ºC, 90% de humedad y 10% de CO2.

2.1.2 Mantenimiento de un cultivo celular de células HeLa

Cada 24-48 horas se iba controlando el estado del medio de cultivo. Cuando éste

cambiaba su color rosa fuerte hacia un color amarillo anaranjado era indicativo de que el

medio se había agotado. Entonces se procedía al cambio de este medio mediante la

aspiración con una pipeta Pasteur, con el suficiente cuidado como para no tocar la

monocapa de células. A continuación, con ayuda de una pipeta conectada a un aspirador

Pipetboy Plus (Cultek) se introducía medio fresco por la parte del frasco donde no había

células. El volumen de medio introducido dependía del tipo de frasco con que estuviéramos

trabajando. Así, los volúmenes de trabajo oscilaban entre los 15 ml para frascos de 75 cm2

y 48 ml para frascos de 225 cm2 (Cultek).

Por otro lado, con la frecuencia indicada en el párrafo anterior, se comprobaba el

estado de confluencia del cultivo (observación por microscopio óptico). Cuando las células

estaban cerca del 100% de confluencia se procedía a la tripsinización de éstas. Gracias a la

tripsinización podíamos separar las células largas y estrelladas pegadas a la superficie del

frasco, recuperarlas, y volverlas a sembrar en el mismo frasco, pero en una concentración

inferior. De esta manera las células podían seguir creciendo hasta llegar de nuevo al 100%

de confluencia.

Para la tripsinización de los frascos de cultivo, primero se extraía el medio de

cultivo con ayuda de una pipeta Pasteur. Después se realizaba un lavado del frasco con

tampón fosfato Dulbecco´s (PBS) (Gibco), sin magnesio, calcio ni bicarbonato sódico, con

un volumen en función del frasco con que estuviéramos trabajando. Así, en un frasco de

cultivo de 75 cm2, poníamos 2-3 ml de PBS. La función del PBS era eliminar proteínas y

restos de medio que podrían unirse a la tripsina e impedir su correcta actuación.

Seguidamente se añadía la tripsina (solución comercial que contenía tripsina porcina 5 g/l y

EDTA 2 g/l, y que diluíamos 10 veces con PBS) (Gibco). El volumen de tripsina era el

mismo que el que habíamos añadido de PBS anteriormente. El frasco era introducido en el

incubador durante 1 minuto y luego se sacaba y se golpeaba para ayudar a las células a


33

despegarse de la superficie. Para comprobar que las células se habían despegado se

observaban al microscopio óptico. Las células despegadas flotaban y tenían un aspecto

redondo, mientras que las células aún unidas a la superficie, eran largas y estrelladas.

Rápidamente se procedía a añadir medio de cultivo (igual volumen que la disolución de

tripsina que habíamos puesto) para inactivar a la tripsina. Se recuperaba todo el medio y se

pasaba a un tubo cónico.

Este tubo se centrifugaba en un rotor H-400 de la centrífuga Sorvall TC6 (Dupont)

a 200g y temperatura ambiente durante 8 minutos. Eliminábamos el sobrenadante (donde

teníamos los restos de la tripsina) y resuspendíamos el pelet en un volumen pequeño. Según

la cantidad que queríamos sembrar, sólo añadíamos una parte del volumen resuspendido en

el frasco de cultivo. Finalmente añadíamos medio de cultivo fresco, hasta el volumen

máximo que nos permitía el frasco con el que trabajábamos, y lo dejábamos en el

incubador.

En algunas ocasiones nos interesaba aumentar en gran cantidad el número de células

en nuestro cultivo. Entonces, a partir de un frasco sembrábamos en otros de mayor

superficie. Para realizar este proceso el volumen obtenido en el párrafo anterior se repartía

por igual en los diferentes frascos de cultivo en los cuales queríamos sembrar.

2.1.3 Recuento de células

En determinados pasos nos interesaba hacer un recuento de las células. Para hacer el

recuento, se extraía una alícuota a partir del pelet resuspendido en medio de cultivo y se

diluía 1:2 o 1:10 (en función del pelet obtenido) con el colorante Trypan blue (Sigma) al

0.4%. Este colorante penetra dentro de las células muertas, de tal manera que las células

refringentes son las vivas. Una vez preparada la dilución, se introducía una gota dentro de

la cámara de Neubauer, y se realizaba el recuento de los cuatro campos de la cámara, tal

como se detalla en la figura 2.1.1.

Luego se hacía la media de los cuatro campos y se multiplicaba por el factor de

dilución y por 10 (factor que tiene en cuenta el volumen real de la cámara).

Células/µ l = X × 10 × Factor de dilución.


34

Donde, X ⇒ Media de los cuatro campos.

Esto nos indicaba el número de células por microlitro. Para saber el número total de

células, sólo había que multiplicar por el volumen de medio que teníamos en el tubo, del

cual habíamos extraído la pequeña alícuota para hacer el recuento.

En algunas ocasiones era necesario determinar la viabilidad de las células del

cultivo. Para este fin se aplicaba la siguiente fórmula:

Viabilidad = X/(X+Y) × 100

Donde,

X⇒ Media de los cuatro campos de las células vivas.

Y⇒ Media de los cuatro campos de las células muertas.

Figura 2.1.1 Diagrama dela cámara de Neubauer (A).El círculo indica el áreaaproximada cubierta por unamagnificación de 100x almicroscopio óptico.Ampliación de uno de loscampos para el recuento decélulas (B). En el recuentose incluían todas las célulasque estaban dentro delcuadrante (o), excepto lasque tocaban el bordeizquierdo e inferior (ø).


35

2.1.4 Cultivo celular en presencia de colcemida

El objetivo del crecimiento de la células HeLa en presencia de colcemida era

obtener grandes cantidades de células paradas en metafase, para luego obtener sus

cromosomas. La colcemida es una droga que provoca despolimerización de los

microtúbulos durante la división celular.

Al necesitar grandes cantidades de células metafásicas frecuentemente el cultivo se

realizaba en 5 frascos grandes de 225 cm2. El cultivo se iniciaba la semana anterior a la

realización del experimento. A partir de un vial congelado (sección 2.1.1) o a partir de otro

cultivo de células HeLa ya existente (sección 2.1.2), se sembraba directamente sobre un

frasco de 225 cm2. Cuando las células llegaban a la confluencia, estas eran tripsinizadas y

repartidas por igual (sección 2.1.2) en los 5 frascos de 225 cm2. A continuación debíamos

esperar a que el cultivo llegara a un 80-90% de confluencia. Durante este tiempo (2 o 3

días) era muy importante controlar que las células no agotaran el medio de cultivo (sección

2.1.2).

Cuando finalmente llegábamos a la confluencia deseada, se añadía la suficiente

colcemida (Gibco), como para conseguir que las células crecieran a una concentración de

0.1 µg/ml. Antes de añadir esta droga, estimábamos visualmente el número de células que

se estaban dividiendo en ese momento (células redondas, refringentes y flotantes), que solía

ser aproximadamente el 30%. Las células se dejaban crecer en presencia de colcemida

durante 12 horas. Este procedimiento fue adaptado a partir de Adolph (1980).

Al día siguiente, se observaban las células al microscopio óptico para ver su estado,

el cual solía ser de un 80-90% de células en división. Finalmente se procedía a la extracción

de dichas células. (ver más adelante sección 2.2.1).

Ocasionalmente los experimentos no requerían de cantidades tan grandes de células

HeLa, por lo que el cultivo celular se realizaba a partir de un frasco de 225 cm2. En estas

ocasiones el cultivo podía iniciarse la misma semana del experimento ya que el tiempo

requerido para que este llegara a una confluencia del 80-90% era sólo de 2-3 días.


36

2.2 Obtención del material biológico

2.2.1 Obtención de células

Doce horas después de haber añadido la colcemida, se procedía a la extracción de

las células HeLa de los 5 frascos mediante la técnica de sacudida brusca (shake-off)

(Narayansumi y Hamkalo, 1987), es decir, dando un par de sacudidas para que se acaben de

despegar las células que se están dividiendo. Para evitar que durante este acto se formase

espuma, con anterioridad sacábamos el medio de cultivo de los frascos y lo transferíamos a

una serie de tubos cónicos. Seguidamente se añadían unos 8 ml de PBS por frasco de

cultivo y entonces se procedía a la extracción por sacudida brusca. A medida que íbamos

sacudiendo los frascos, se transferían los 8 ml de PBS en los mismos tubos cónicos donde

teníamos el medio de cultivo, hasta rellenar por completo el volumen de cada tubo. Era

importante no sacudir demasiado fuerte, ya que así evitábamos arrastrar células que no

estuvieran en metafase. A continuación centrifugábamos los tubos cónicos en el rotor H-

400 a temperatura ambiente y 200g durante 10 minutos y el sobrenadante lo aspirábamos

con una pipeta Pasteur en la cámara de flujo laminar.

Los sedimentos resultantes de cada tubo eran resuspendidos en PBS y transferidos a

un solo tubo cónico en un volumen final de 10 ml. En este punto se extraía una alícuota de

100 µl y se preparaba una dilución 1/2 o 1/10 con el colorante Trypan blue al 0.4% en

función de la cantidad de sedimento obtenido. Una vez preparada la dilución adecuada se

realizaba un recuento de células, tal como se detalla en la sección 2.1.3.

El tubo cónico con los 10 ml finales de células HeLa, era centrifugado de nuevo en

el rotor H-400 a temperatura ambiente y 200g durante 10 minutos. Finalmente, el

sobrenadante obtenido se eliminaba mediante una pipeta Pasteur y el sedimento con las

células HeLa se resuspendía en el medio adecuado, en función del experimento a realizar.

Cuando trabajábamos con un solo frasco de cultivo, el proceso de obtención de

células era el mismo que el detallado en esta sección, pero más simplificado debido a las

cantidades de medio inferiores utilizadas. En estos experimentos no nos interesaba saber el

número de células existentes por lo que no era necesario tampoco hacer un recuento de

células.


37

2.2.2 Obtención de cromosomas en diversos medios

2.2.2.1 Cromosomas obtenidos en hexylene glycol

El cultivo celular se realizaba en un frasco de 225 cm2. Una vez obtenidas las

células del cultivo, antes de eliminar el sobrenadante de PBS, dejábamos reposar las células

durante 30 minutos a 4ºC. A continuación centrifugábamos en el rotor JA-20 a 200g a 4ºC

durante 8 minutos. Eliminábamos el sobrenadante de PBS, y las células sedimentadas eran

resuspendidas en 5 ml del medio de aislamiento de cromosomas filtrado (filtro de 0.22 µm,

Millipore) (Hexylene glycol 1 M, CaCl2 5×10-4 M, Pipes 0.1 mM pH 6.5) y se mantenía a

4ºC. De nuevo volvíamos a centrifugar a 200g y 4ºC durante 8 minutos para acabar de

eliminar los posibles restos de PBS. Después de volver a resuspender las células en 5 ml de

medio de aislamiento, éstas se dejaban incubando a 37ºC durante 10-15 minutos.

El siguiente paso consistía en la rotura de las membranas celulares con el fin de

liberar los cromosomas al medio de aislamiento. Colocábamos las células resuspendidas en

el medio de hexylene glycol en una jeringuilla de 5 ml y las hacíamos pasar a través de una

aguja de 22 gauge de diámetro. Para comprobar que el proceso de rotura tenía éxito, se

extraían alícuotas de la muestra para su observación al microscopio óptico (ver más

adelante sección 2.2.3).

Llegados a este punto, se centrifugaba la solución en el rotor JA-20 a 100g y 4ºC

durante 3 minutos para eliminar las células que no se habían roto, posibles núcleos de

células interfásicas y restos celulares no cromosómicos. El sobrenadante obtenido de esta

centrifugación se volvía a centrifugar, pero esta vez a 1500g, con el objetivo de sedimentar

los cromosomas. Esta centrifugación se realizaba a 4ºC durante 5 minutos. Finalmente los

cromosomas sedimentados se resuspendían en un mililitro de tampón de aislamiento.

Método modificado a partir de Stublifield y Wray (1971).

2.2.2.2 Cromosomas obtenidos en presencia de poliaminas

El sedimento obtenido a partir de un cultivo celular realizado en un frasco de 225

cm2 (sección 2.2.1) era resuspendido en 5 ml de KCl 75 mM durante 10 minutos a 37ºC. La


38

función de este medio hipotónico era la de inflar las células para facilitar más tarde la rotura

de sus membranas celulares. A continuación trasvasábamos la solución de células HeLa

turgentes a un tubo de 15 ml corex y se centrifugaba en el rotor de ángulo fijo de la

centrífuga Jouan MR 18.12 a 300g durante 8 minutos a temperatura ambiente. Después de

eliminar el sobrenadante, las células HeLa se resuspendían en 4.5 ml de un medio de

poliaminas (TEA-HCl 7.5 mM pH 7.5, KCl 40 mM, EDTA-KOH 1 mM pH 7.4, espermina

0.1 mM, espermidina 0.25 mM, thiodiglycol al 1%, PMSF 0.1 mM) a 4ºC.

Una vez teníamos las células en este medio, se procedía a la rotura de las

membranas celulares. Gracias a las poliaminas, cuando las células se rompían y liberaban

los cromosomas al medio, éstos quedaban estabilizados sin sufrir distorsiones en su

estructura física. Para romper las membranas celulares, la suspensión de células HeLa se

homogeneizaba pasando 10-12 veces el pistón de un Dounce de 5 ml (proceso realizado

también a 4ºC). Una vez homogeneizada la solución, ésta se centrifugaba en un rotor JA-20

a 200g y 4ºC durante 5 minutos, para eliminar posibles núcleos interfásicos, restos celulares

y células que hubiesen resistido la homogeneización. Finalmente, recuperábamos el

sobrenadante con los cromosomas y los manteníamos a 4ºC para su posterior estudio

Método adaptado de Gasser y Laemmli, 1987.

2.2.2.3 Cromosomas obtenidos en TeaKMC-MgCl2 5mM

Los cromosomas en TeaKMC-MgCl2 5 mM (TEA-HCl 50 mM pH 7.5, CaCl2 1

mM, KCl 25 mM, MgCl2 5 mM, PMSF 0.1 mM) se podían obtener de dos formas. En

ambas, el cultivo celular era siempre de 225 cm2.

2.2.2.3.1 Cromosomas obtenidos en medio hipotónico y TeaKMC-MgCl2 5 mM. El

procedimiento para la obtención de estos cromosomas era exactamente igual al detallado en

la sección 2.2.2.2, pero con la salvedad de utilizar el medio TeaKMC-MgCl2 5 mM en lugar

del medio de poliaminas, en el paso anterior a la rotura de las células.

2.2.2.3.2 Cromosomas obtenidos directamente en TeaKMC-MgCl2 5 mM. En estos

experimentos, el sedimento de células procedente del cultivo celular se resuspendía

directamente en TeaKMC-MgCl2 5 mM (3-5 ml dependiendo de la cantidad de células). En

algún caso también se resupendieron células directamente en TeaKMC-MgCl2 1.7 mM. A


39

continuación se dejaba reposar la solución un cierto tiempo (0-6h) según el tipo de

experimento a 4ºC o a temperatura ambiente (también según el tipo de experimento) y se

procedía a la rotura de las membranas celulares, homogeneizando la suspensión de células

10-12 veces en un homogenizador Dounce de 5 ml. La solución obtenida se mantenía a 4ºC

para su posterior observación y estudio por microscopía electrónica.

En ocasiones, antes de la rotura de las células se efectuaba un cambio de medio en

TeaKMC-MgCl2 1.7 mM. Para este proceso las células resuspendidas en TeaKMC-MgCl2 5

mM, después de una hora a 4ºC en dicho medio, se centrifugaba a 500g en el rotor JA-20 a

4ºC durante 5 minutos. El pelet resultante de esta centrifugación se resuspendía en 2 ml del

tampón TeaKMC-MgCl2 1.7 mM. Después de un cierto tiempo de incubación (0-6h) se

realizaba la rotura de las células con el mismo procedimiento detallado en el párrafo

anterior.

2.2.2.4 Cromosomas obtenidos en TeaBM-MgCl2 5 mM

Los cromosomas obtenidos en TeaBM-MgCl2 5 mM (TEAB 90 mM pH 8.6, MgCl2

5 mM, PMSF 0.1 mM) se obtenían directamente sin pasar por el medio hipotónico. Es

decir, resuspendiendo el pelet del cultivo celular este tampón acabado de describir. A partir

de aquí el protocolo seguido era exactamente igual al detallado en la sección anterior.

En estos experimentos también se podía realizar un cambio de medio. En esta

ocasión el medio escogido era el TeaBM-MgCl2 1.7 mM y el protocolo era idéntico al

utilizado en la sección 2.2.2.3 para cambios de medio.

2.2.2.5 Aislamiento y purificación de cromosomas mediante un gradiente de

sacarosa escalonado

En los métodos de obtención de cromosomas descritos hasta el momento en la tesis,

se han aplicado algunos sistemas para intentar separar los cromosomas del resto de

componentes celulares (ver secciones 2.2.2.1, 2.2.2.2, 2.2.2.3 y 2.2.2.4). Para lograr todavía

una mayor purificación en la muestra de cromosomas, se decidió aplicar un gradiente

escalonado de sacarosa.


40

Al aplicar una fuerza centrífuga sobre los diversos componentes de la muestra a

purificar, éstos se distribuyen a través del gradiente escalonado según su tamaño y

densidad. De este modo los cromosomas se concentran en una determinada zona del

gradiente separándose del resto de estructuras celulares.

El inconveniente de esta técnica es la pérdida de rendimiento en la obtención de

cromosomas. Para solventar este problema, en estos experimentos se utilizaban 5 frascos de

cultivo de 225 cm2.

El sedimento resultante del cultivo celular era resuspendido en un medio hipotónico

de KCl 75 mM hasta obtener una concentración de 2x106 células/ml. Entonces las células se

incubaban a 37ºC durante 10 minutos. Este paso se realizaba en un tubo cónico de 50 ml. A

continuación repartíamos la solución de células en 4 tubos de 15 ml corex

y se centrifugaban en el rotor de ángulo fijo de la centrífuga Jouan MR 18.12 a 275g y

temperatura ambiente durante 5 minutos. Al acabar la operación eliminábamos el

sobrenadante con ayuda de una pipeta automática y el sedimento se resuspendía con un

medio a 4ºC, que contenía poliaminas (TEA-HCl 15 mM pH 7.5, NaCl 20 mM, KCl 80

mM, EDTA-KOH 2 mM pH 7.4, espermina 0.2 mM, espermidina 0.5 mM, EGTA 0.5 mM)

y digitonina (Sigma) a una concentración de 1 mg/ml. La digitonina es un detergente que

ayuda a disgregar las membranas celulares. Esta solución se preparaba el mismo día del

experimento y debía pasar previamente por una incubación a 37ºC durante 15-20 minutos y

finalmente era filtrada a través de una membrana de 0.22 µm de diámetro de poro

(Millipore). La concentración final de las células en este medio debía de ser de 1×107

células/ml.

El siguiente paso consistía en transferir las células en un Dounce en 5 ml, y pasar 15

veces el pistón sobre la solución de células para provocar la rotura de sus membranas y la

consiguiente liberación de los cromosomas al medio. Frecuentemente, para ayudar a

romper las membranas celulares, la solución también era agitada a través de un vórtex. El

homogenado resultante volvía a ser transferido a un tubo de 15 ml corex para ser

posteriormente centrifugado en el rotor JA-20 a 200g y 4ºC durante 10 minutos. Después

de la centrifugación, recuperábamos el sobrenadante con los cromosomas y los

manteníamos a 4ºC, mientras que el sedimento con los restos celulares, núcleos y las

células que no se habían disgregado, se volvía a resuspender con un mililitro de la solución


41

poliaminas-digitonina para repetir de nuevo la homogenización y acabar de romper las

células que aún no estaban disgregadas. Acabada la segunda centrifugación a 200g el

sobrenadante obtenido se añadía al anterior y se mantenía a 4ºC.

Una vez llagados a este punto se procedía a la preparación del gradiente escalonado

de sacarosa. Se depositaban sobre un tubo de 7 ml (Nalgene centrifuge, Sigma) 4

soluciones cuyas composiciones variaban entre si únicamente en el % (p/v) de sacarosa. En

el fondo del tubo colocábamos 1.3 ml de una solución al 60% de sacarosa, a continuación

0.87 ml de la misma solución al 50%, después 0.87 ml al 40% y finalmente 0.87 ml de la

solución al 30% de sacarosa (ver figura 2.2.1). Para cada experimento se preparaban cuatro

gradientes.

La composición de las soluciones de sacarosa podía ser de varios tipos en función

del tipo del experimento (ver tabla 2.2.1).

Figura 2.2.1. Gradienteescalonado de sacarosa.Una vez centifugada lamuestra, los cromosomasquedaban concentradosen la interfase 40-50% y50-60%.


42

Composición de los diferentes medios de sacarosa

Medio

Composición

Fosfato Fosfato 10 mM pH 7.5, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 5 mM

Monovalentesa Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM

Monovalentes-Mga Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 20 mM

Poliaminas TEA-HCl 15 mM pH 7.5, NaCl 20 mM, KCl 80 mM, EDTA-KOH 2 mM pH 7.4, espermina 0.2 mM, espermidina 0.5 mM, EGTA 0.5 mM,

PME-MgCl2 5 mM Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 5 mM

PME-MgCl2 1.25 mM Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 1.25 mM

Terminada la preparación de los 4 gradientes se aplicaba la muestra de cromosomas

depositándolos con mucho cuidado encima de cada gradiente. Esta operación se hacía con

la ayuda de una pipeta automática dejando resbalar la muestra gota a gota por una de las

paredes del tubo. La muestra con los cromosomas se repartía por igual entre los 4

gradientes.

Una vez cargados los gradientes, éstos se centrifugaban en el rotor basculante JS-

13.1 a 4000g y 4ºC durante 15 minutos y con el freno de parada de la centrífuga al mínimo.

En estas condiciones los cromosomas se concentraban sobre las interfases 40-50% y 50-

60% de sacarosa (ver figura 2.2.1) formando un material con aspecto de pequeños flóculos

blancos. Si se observaba el gradiente al trasluz este material blanquecino se apreciaba

mejor, lo cual facilitaba su aspiración mediante una pipeta Pasteur de 230 mm. Finalmente

a La obtención de cromosomas para este tipo de gradientes era diferente al detallado en esta sección. Esta diferencia residía exclusivamente en la composición de los tampones utilizados: Tampón monovalentes-Mg hipotónico: Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 10 mM, KCl 55 mM, MgCl2 5 mM. Tampón monovalentes hipotónico: Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 10 mM, KCl 55 mM. Tampón de lisis monovalentes: Digitonina 1 mg/ml disuelto en tampón monovalente hipotónico. Tampón de lisis monovalentes-Mg: Digitonina 1 mg/ml disuelto en tampón monovalente-Mg hipotónico

Tabla 2.2.1


43

los cromosomas purificados se mantenían a 4ºC o se congelaban a –80ºC a la espera de

posteriores experimentos. Este método se adaptó de Craig (1999).

2.2.3 Procesamiento y observación del material biológico en el microscopio óptico

En ciertos experimentos se requería la extracción de alícuotas de las diferentes

muestras para su observación al microscopio óptico. Estas alícuotas habían de ser teñidas

para lograr una correcta observación de la muestra. En función del tipo de observación

requerido se escogió entre la tinción con yoduro de propidio o la tinción con Giemsa.

2.2.3.1 Tinción con yoduro de propidio

Debido a la capacidad de este colorante fluorescente para interaccionar con la

cromatina y los cromosomas, fue utilizado para la observación de las células metafásicas,

células interfásicas, núcleos, cromosomas y fibras cromosómicas. La ventaja más

importante de esta técnica era la simplicidad y rapidez con la cual se efectuaba la tinción.

Este hecho, lo hacía idóneo para experimentos en los cuales se monitorizaba al microscopio

óptico el proceso de rotura de las membranas celulares y la liberación de los cromosomas al

medio, así como su consiguiente desestructuración.

Para la tinción con yoduro de propidio, cada alícuota extraída se diluía ½, con una

solución 1/100 del colorante preparado en el medio en el cual estaba disuelta la muestra. La

solución concentrada del yoduro de propidio estaba a una concentración de 1 mg/ml en

agua milliQ que se preparaba el mismo día de su utilización. Este colorante fluorescente

tiene un máximo de absorción a 538 nm y un máximo de emisión a 613 nm.

Una vez preparadas las muestras, se depositaba 25 µl de cada una sobre un

portaobjetos y se cubría con un cubreobjetos cuidadosamente, evitando la formación de

burbujas.

La observación final de las muestras se realizaba en un microscopio óptico DMRB

(Leica) por contraste de fases y fluorescencia. Las imágenes fueron adquiridas con una


44

cámara de video C5310 Hamamatsu o con una cámara Leica DC 200 conectadas al

microscopio.

2.2.3.2 Tinción con colorante Giemsa

Este tipo de tinciones requieren la fijación previa de las células en un medio de

metanol-ácido acético 3:1 (medio de Carnoy). En los métodos convencionales para la

fijación con Carnoy es habitual resuspender las células obtenidas del cultivo celular en un

medio hipotónico (KCl 75 mM) durante 15 minutos a 37ºC (ver por ejemplo Barch, 1991).

Sin embargo en este trabajo también se realizaron fijaciones a partir de células

resuspendidas en los diversos medios empleados para la obtención de cromosomas (sección

2.2.2). Una vez fijadas las células se procedía a la aplicación del colorante.

2.2.3.2.1 Fijación en metanol-ácido acético. El medio de metanol ácido acético se

preparaba el mismo día del experimento y se mantenía a 4ºC. Para que el proceso de

fijación se realice correctamente, el medio en el cual se encuentra la célula debe de ser

substituido gradualmente por el medio de Carnoy. Con este fin añadíamos un volumen

pequeño del medio de fijación. (1/14 respecto el volumen total) sobre la muestra y

centrifugábamos a 200g en el rotor JA.20 a 4ºC. A continuación extraíamos el sobrenadante

poco a poco y con la ayuda de una pipeta Pasteur, pero dejando como volumen residual 1/7

del volumen del sobrenadante obtenido.

Sobre el sobrenadante residual se añadía una cantidad igual de medio de fijación

gota a gota utilizando una pipeta Pasteur, mezclando las dos soluciones con la ayuda de un

vórtex. Seguidamente añadíamos el resto del medio de Carnoy, hasta alcanzar el volumen

inicial de muestra que teníamos previamente.

A partir de este punto, el proceso acabado de describir se repetía 3-4 veces, según si

la prioridad era obtener un elevado rendimiento de células metafásicas, o obtener una buena

calidad en la tinción.

Una vez fijadas las células, estas podían teñirse con el colorante Giemsa o podían

ser guardadas a – 20ºC (Craig, 1999).

2.3.3.2.2 Aplicación del colorante Giemsa. Con la ayuda de una pipeta Pasteur se

dejaban caer 1 o 2 gotas de la muestra de cromosomas fijadas sobre un portaobjetos desde


45

una altura de 25 cm. Cuando se secaban las gotas, se cubría el portaobjetos con una

solución de colorante Giemsa al 0.4% (v/v) (Sigma) durante 2 minutos. A continuación se

introducía lateralmente el portaobjetos en un recipiente especial para la contención de

portaobjetos, el cual a su vez, se sumergía en agua otros 2 minutos. Una vez pasado este

tiempo el portaobjetos era lavado con agua corriente para eliminar el exceso de colorante

durante 5 minutos. Finalmente, una vez seco el portaobjetos se depositaba un gota de DPX

(Neutral Mounting Medium, Aldrich) sobre la gota seca de muestra y se cubría

cuidadosamente evitando la formación de burbujas, con un cubreobjetos (Mc Donald,

1994).

La observación final de la muestra se realizaba en un microscopio óptico DMRB

(Leica) por contraste de fases y por campo claro. Las imágenes fueron adquiridas con una

cámara Leica DC 200 conectada al microscopio.

2.3 Microscopía electrónica de cromosomas

2.3.1 Eliminación de partículas contaminantes de los materiales y los medios empleados

Cuando se trabaja en el campo de la microscopía electrónica se requiere unas

condiciones de limpieza y esterilidad para minimizar al máximo la cantidad de partículas

contaminantes que pudieran depositarse sobre las rejillas de microscopía. En este sentido, la

manipulación de rejillas siempre se realizaba en una zona limpia y provistos de una

máscara quirúrgica.

Un foco posible de contaminación podía venir a través de los medios en los cuales

estaba la muestra disuelta. Para evitarlo, todos los tampones que iban a estar en contacto

con ésta eran filtrados a través de dispositivos de filtración estériles. La utilización de estas

unidades de filtración garantizaba la eliminación de microorganismos, partículas,

precipitados y polvos insolubles cuyas dimensiones sobrepasaran el tamaño de los poros de

las membranas (0.22 µm). Según el volumen de medio preparado se utilizaban tres tipos

diferentes de dispositivos (indicados en la tabla 2.3.1).


46

Volumen filtrado

Tipo de unidad de filtración a

0-10 ml b Millex®, con membrana ME-MilliporeTM

10-50 ml SteriflipTM, con membrana Millipore ExpressTM PLUS 50-250ml c StericupTM de 250 ml, con membrana Millipore GP Express

En la manipulación de las rejillas era imprescindible la utilización de pinzas de

precisión (Sigma #5 y #7). Estas pinzas debían de estar totalmente limpias para evitar

contaminar las rejillas con algún tipo de partícula o microorganismo. Previamente, antes de

manipular las rejillas, las pinzas eran sonicadas en un aparato de ultrasonidos Bronson

1510, durante 10 minutos. La sonicación se realizaba en una solución que contenía SDS al

0.1% en agua corriente. Finalizados los 10 minutos, las pinzas se lavaban con abundante

agua destilada.

Durante la realización de un experimento de microscopía electrónica la

manipulación de rejillas se daba con elevada frecuencia, por lo que el número de pinzas

disponible no era suficiente como para poder efectuar todas estas manipulaciones. Para

solucionar este problema se reutilizaban las pinzas, las cuales se lavaban previamente para

evitar la contaminación cruzada. El lavado consistía en dejarlas en agitación en una

solución al 2% de SDS en agua destilada, durante 5 minutos. Pasado este tiempo, las pinzas

se aclaraban con abundante agua destilada.

Sin embargo, en algunas ocasiones no disponíamos del suficiente tiempo para

efectuar esta operación. Entonces se optó por la utilización de pinzas de plástico para

microscopía electrónica (Ted Pella, Inc) de un solo uso. La desventaja de la utilización de

este tipo de pinzas era la perdida de precisión en el manejo de las rejillas de microscopía.

a Las membranas utilizadas en los tres dispositivos tenían un tamaño de poro de 0.22 µm. b Para realizar la filtración con la unidad Millex®, previamente se aspiraba el medio a filtrar conuna jeringuilla de 10 ml. A continuación se colocaba la unidad de filtración en la boca de lajeringuilla y finalmente, presionando con los dedos el émbolo, se hacía pasar la solución a travésdel filtro colocado hacia un recipiente estéril. c Para la filtración de volúmenes superiores a 250 ml se utilizaban tantos StericupTM como fuerannecesarios.

Tabla 2.3.1


47

2.3.2 Preparación de rejillas para microscopía electrónica

Las muestras a analizar en el microscopio se depositaban sobre rejillas de cobre de 3

mm de diámetro (400 mesh, Balzers Union o Sigma Chemical). Sobre la cara mate de las

rejillas (cara superior) se depositaba previamente una fina capa de carbón. La manipulación

de las rejillas se efectuó con pinzas de precisión. Durante todo el proceso de manipulación,

se trabajó con máscaras quirúrgicas para evitar la contaminación de las rejillas.

Antes de depositar la capa de carbón, las rejillas eran lavadas con acetona analítica

sumergiéndolas en una cápsula de Petri durante 2-3 minutos. Después de secarlas con papel

Wathman se dejaban cinco minutos sobre papel de filtro dentro de otra cápsula de Petri.

Una vez acabadas de secar, las rejillas se colocaban sobre un soporte formado por un anillo

de PVC (3 cm de diámetro interior y 4.5 cm de diámetro exterior) y una malla de nylon de

80 µm de diámetro de poro. Todo el conjunto estaba en el interior de una cápsula de Petri y

sumergido con agua milliQ. La malla de nylon se encontraba tensa, de manera que se

evitaba que las rejillas se movieran cuando se manipulaba con las pinzas.

El siguiente paso consistía en depositar la capa de carbón sobre las rejillas. La capa

de carbón se había preparado previamente mediante evaporación de carbón sobre mica

acabada de exfoliar hasta conseguir 2 nm de grosor (ver en la siguiente sección). Al

introducir la mica en la placa de Petri donde teníamos las rejillas sumergidas en agua, la

capa de carbón se desprendía y quedaba flotando sobre la superficie del agua. Este proceso

se realizaba con mucho cuidado, introduciendo lentamente la mica en un ángulo inferior a

45º respecto la superficie del agua. Entonces el agua de la cápsula de Petri se aspiraba

lentamente, con la ayuda de una pipeta Pasteur conectada a una trompa de vacío, hasta que

la capa de carbón se depositaba sobre las rejillas y sobre el soporte. El soporte con las

rejillas se secaba dentro de un desecador conectado a una trompa de agua (al menos 12

horas) y se guardaba dentro de una cápsula de Petri sellada con Parafilm.

2.3.3 Evaporador de carbón y carbón-platino

El evaporador (Bal-Tec) es un sistema modular formado por los aparatos QSG 060,

EUM 030, MED 020 y EK 030. Es un sistema que provoca una vacío elevado que permite


48

que un cañón de electrones caliente una barra de carbón o carbón-platino hasta que

empiezan a evaporarse partículas. Estas partículas se depositan sobre el objeto que

queremos recubrir y, a la vez, sobre una pieza de cuarzo que mide el grosor de la capa

depositada.

Este dispositivo tiene dos cañones: uno evapora carbón y el otro una mezcla de

carbón y platino. Estos materiales se encuentran en forma de barra dentro del cañón. La

barra es el ánodo (potencial tierra) y a su alrededor está situado el cátodo en forma de

espiral (potencial negativo). El cátodo se calienta provocando que se desprendan electrones,

que son acelerados por la diferencia de potencial hasta el ánodo. La barra recibe los

impactos de los electrones transformando la energía cinética de éstos en calor que provoca

la evaporación del material de la barra. El flujo de partículas evaporadas llega hasta el

soporte que contiene las rejillas o la mica acabada de exfoliar. Este soporte es un disco que

puede rotar opcionalmente a diversas velocidades.

El ángulo de incidencia de las partículas evaporadas sobre las rejillas o sobre la

mica, está compuesto por la suma de dos ángulos diferentes. En primer lugar, hay que tener

en cuenta la desviación de los cañones del evaporador respecto al eje vertical (ángulo β), y

en segundo lugar, el ángulo de inclinación (αinclinación) del disco soporte respecto a la misma

vertical. El ángulo β tiene un valor constante (8.9º ± 2.6º) que se determinó de manera

experimental (ver sección 2.4.2.1). El ángulo αinclinación es una variable que nosotros

cambiábamos según el tipo de evaporación realizado (ver tabla 2.3.2).

Para evaporar carbón, previamente se debía conseguir un vacío en la cámara del

evaporador de por lo menos 2.10-3 mbar (30 minutos). En cambio, si se quería evaporar

carbón-platino sobre rejillas con muestra fijada, el vacío necesario era como mínimo de

6.10-3 mbar (3 horas). Una vez hecho el vacío se seleccionaba el cañón del carbón o del

carbón y platino, y se especificaba la diferencia de potencial y la intensidad al aparato que

controla el cañón (ver tabla 2.3.2).

Para llevar un control visual de la evaporación, en cada experimento se introdujo un

papel de filtro en el soporte donde teníamos la mica o las rejillas.


49

Tipo de evaporación

βa

αinclinación

b

Voltaje

Intensidad

Carbón

8.9º

90º

1.8 kv

80 mA

Carbón-platino rotacional 8.9º 6º 1.6 kv 60 mA Carbón-platino unidireccional 8.9º 5-25º 1.6 kv 60 mA

2.3.4 Activación de las rejillas

Las muestras con cromosomas se extendían sobre las rejillas que contenían una

película de carbón. Esta capa de carbón se preparaba tal como se describe en la sección

2.3.2. Una vez habíamos depositada dicha capa, las rejillas se activaban para que éstas

adquiriesen cargas positivas que ayudaran a los cromosomas a unirse con más afinidad.

La activación se realizaba utilizando el colorante Alcian blue (Fluka). Se pesaba 1

mg del colorante y se disolvía con 0.5 ml de ácido acético al 3% (v/v) para tener una

concentración final de 2 mg/ml. De esta solución se extraía 50 µl y se disolvía en 4.95 ml

de agua milliQ. A continuación, 500 µl de esta última solución, se depositaban en un

cubreobjetos, que a su vez estaba sobre una lámina de Parafilm. El carácter hidrofóbico

del Parafilm evitaba que el volumen depositado de la solución de Alcian blue pudiera

desparramarse fuera del cubreobjetos. Seguidamente colocábamos las rejillas con la cara

carbonatada tocando la superficie de la solución, con cuidado de no estropear el film de

carbón. Al cabo de 5 minutos se sacaban las rejillas de la solución de Alcian blue y se

situaban con la misma orientación en otro cubreobjetos donde en esta ocasión teníamos 500

µl de agua milliQ. De esta manera eliminábamos los restos del colorante durante 5 minutos.

Pasado este tiempo, las rejillas estaban preparadas para recibir la muestra.

a Ángulo existente entre los cañones del evaporador y el eje de la vertical. b Ángulo existente ente el disco soporte de las rejillas o la mica y el eje de la vertical.

Tabla 2.3.2


50

2.3.5 Extensión de los cromosomas sobre rejilla

2.3.5.1 Cromosomas obtenidos en poliaminas, TeaKMC, TeaBM o aislados a partir

de un gradiente de sacarosa

La técnica utilizada para la extensión de la muestra sobre las rejillas es un

procedimiento adaptado del método de Miller y Beatty (1969). Esta técnica consiste en

extender los cromosomas sobre las rejillas de microscopía por centrifugación. Esta

centrifugación era necesaria para aumentar el rendimiento de depositación de la muestra

sobre la rejilla.

Para evitar que durante la centrifugación las rejillas quedaran dañadas era

imprescindible que éstas estuvieran sobre una superficie plana. Con esta finalidad, se

preparaban una serie de tubos eppendorf (tantos tubos como rejillas se utilizaban) que

contenían en el fondo un taco de agarosa solidificado. La agarosa se preparaba al 3% (p/v)

disuelta en el mismo medio en el cual se encontraban los cromosomas aislados. Se

preparaban en tubos eppendorfs de 1 o 0.5 ml, dependiendo de la cantidad de muestra

disponible.

En caso de las muestra purificada por gradiente, era necesario además preparar los

tacos de agarosa con un 50% de sacarosa. De esta manera evitábamos que la densa solución

en la cual se encontraba la muestra penetrara a través de los tacos.

Una vez preparados los tubos eppendorf con el soporte de agarosa, se añadía un

volumen de 100-200 µl (según el recipiente fuera de 0.5 o 1 ml, respectivamente) de la

muestra con los cromosomas sobre la superficie de los tacos. A continuación, con la ayuda

de unas pinzas de precisión, se introducía una rejilla activada (sección 2.3.4)

perpendicularmente a la superficie de la solución y con mucho cuidado de no estropear el

film de carbón. Ésta última, debía quedar depositada sobre la superficie de la agarosa con

su cara carbonatada orientada a la solución (ver figura 2.3.1).


51

Finalizada la colocación de las rejillas en los eppendorfs, éstos eran centrifugados a

1500g en el rotor basculante JS-13.1 a 4ºC durante 10 minutos (cuando las muestras

procedían de un gradiente de sacarosa) o 5 minutos (en el resto de las muestras). Acabada

esta operación, de nuevo con pinzas de precisión, se sacaban las rejillas cuidadosamente

para mantener intacta la cara carbonatada.

Paralelamente a la preparación de las rejillas muestra, también se preparaban rejillas

blanco. Éstas se preparaban de forma idéntica a las rejillas muestra pero con 100-200 µl del

medio de interés sin la presencia de cromosomas.

Una vez llegados a este punto, las rejillas muestra y las rejillas blanco eran fijadas

con gluteraldehido (ver más adelante sección 2.3.8) o previamente a este proceso, podían

someterse a otros tratamientos (secciones 2.3.6 y 2.3.7).

2.3.5.2 Cromosomas en metanol ácido-acético

Las células resuspendidas en metanol-ácido acético (sección 2.2.3.2.1) no sólo se

estudiaron por microscopía óptica, sino que también se prepararon para su observación por

microscopía electrónica.

En este caso la extensión de la muestra se realizaba tirando una gota de la solución

de cromosomas en metanol-ácido acético, sobre una rejilla de microscopía previamente

activada (sección 2.3.4), la cual a su vez, se encontraba sobre un portaobjetos. La gota se

dejaba caer desde una altura de 30 cm con la ayuda de una pipeta Pasteur. La muestra se

Figura 2.3.1 Extensión de cromosomassobre una rejilla demicroscopía electrónica. Laextensión se efectuaba sobreun soporte de agarosa al 3%(p/v) en el interior de un tuboeppendorf.


52

dejaba secar y después se procedía a efectuar la fijación de la muestra (ver más adelante

sección 2.3.8.3). También en esta ocasión se preparaban rejillas blanco.


Para los cromosomas obtenidos en presencia de hexylene glycol (sección 2.2.2.1) se

escogió un método muy sencillo para extender la muestra sobre las rejillas. Este consistía

en depositar 10 µl del tampón de aislamiento con los cromosomas sobre una rejilla

previamente activada con Alcian blue (sección 2.3.4) durante un minuto. Pasado este

tiempo, la rejilla era introducida unos segundos en el interior de un pequeño recipiente

(tapón de polipropileno de un tubo de 5 ml) que contenía un pequeño volumen de tampón

de aislamiento. De esta manera conseguíamos eliminar el exceso de muestra. Como en la

sección anterior también se preparaba paralelamente una rejilla blanco. Después se

procedía a su fijación (ver más adelante sección 2.3.8.4).

2.3.6 Cambios de medio en rejilla

De acuerdo con los objetivos de esta tesis (sección 1.4) se procedió a la observación

de los cromosomas bajo diferentes medios y condiciones que provocan su desestructuración

parcial. Con este propósito, los cromosomas fueron sometidos a diferentes cambios de

medio. Estos cambios de medio se realizaban con los cromosomas ya extendidos sobre las

rejillas (ver sección anterior), para evitar que la estructura de éstos no se viera demasiado

desmoronada al utilizar condiciones poco estructurantes antes de la extensión.

Para realizar el cambio de medio, se diseñó un dispositivo que consistía en

enganchar sobre una bandeja de acero una lámina de Parafilm. Encima de esta lámina se

colocaban tantos cubreobjetos como medios se iban a utilizar. A continuación añadimos a

los diferentes cubreobjetos 500 µl del medio de interés correspondiente.

Una vez preparado el dispositivo, éste se colocaba en un baño para que los medios

se equilibraran a 37ºC. Más tarde, con la ayuda de una pinzas, se colocaban las rejillas con

la muestra extendida, sobre cada cubreobjetos con los 500 µl de medio correspondiente. La

rejilla se colocaba de manera que la cara carbonatada, en la cual se encontraba la muestra,


53

quedara flotando en el medio de interés orientada hacia abajo (ver figura 2.3.2). El cambio

de medio solía durar entre 10 y 60 minutos, dependiendo del tipo del experimento. Algunas

de las rejillas blanco preparadas en la sección anterior eran destinadas a realizar cambios de

medio, de forma paralela.

Los cambios de medio en rejilla se hicieron sólo con cromosomas aislados a partir

de un gradiente de sacarosa. Los medios y tiempos utilizados se especifican en la tabla

2.3.3.

Figura 2.3.2. Dispositivo diseñado para realizar cambios de medio en cromosomas yaextendidos sobre rejillas de microscopía electrónica. Para más detalles ver sección 2.3.6.


54

Cambios de medio utilizados

Experimento Medio del

gradiente de sacarosa

Tiempo (minutos)

Medio final

1.0 PME-MgCl2 5 mMa 10 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 1.7 mM, sacarosa 50%.

1.1 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 0.5 mM, sacarosa 50%.

1.2 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, EDTA 5 mM, sacarosa 50%.

1.3 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, citrato sódico 26 mM, sacarosa 50%.

2.0 PME-MgCl2 5 mM 20 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 5 mM, sacarosa 50%.

2.1 PME-MgCl2 5 mM 20 TEAB 90 mM pH 8.6, NaCl 80 mM, sacarosa 50%.

2.2 TEAB 90 mM pH 8.6, NaCl 80 mM.

3.0 PME-MgCl2 5 mM 30 H2O.

3.1 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, EDTA 10 mM, sacarosa 50%.

3.2 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 0.5 mM, sacarosa 50%.

3.3 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 5 mM, sacarosa 50%.




Tabla 2.3.3.


55

4.0 (1)

PME-MgCl2 5 mM 10 TEAB 90 mM pH 8.6, MgCl2 1.7 mM.

4.1 (1) 5 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM.

4.2 (1)

5 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 5 mM.

5.0 PME-MgCl2 5 mM 35 Pipes 0.1 mM pH 7.2.

5.1 Pipes 0.1 mM pH 7.2, MgCl2 0.1 mM.

5.2 Pipes 0.1 mM pH 7.2, EDTA 10 mM.

5.3 Citrato sódico 26 mM pH 7.8.

5.4 Acetato sódico 55 mM, KCl 55 mM (0.8:4) pH 7.2.

5.5 Fosfato 10 mM pH 7.4, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 10 mM.



6.0 PME-MgCl2 5 mM 30 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM.

6.1 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 1.7 mM.

6.2 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 10 mM.



6.5 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 20 mM, CaCl2 20 mM.

6.6 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, CaCl2 20 mM.

7.0 Poliaminas b 30 Poliaminas diluidas 1/2 en H2O.

7.1 Poliaminas diluidas 1/10 en H2O.


56

7.2 Poliaminas diluidas 1/100 en H2O.

7.3 H2O.

8.0 (1)

PME-MgCl2 5 mM 10 Pipes 5 mM pH 7.2, espermina 0.1 mM, espermidina 0.25 mM.

8.1 (1) Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM espermina 0.1 mM, espermidina 0.25 mM.

8.2 (1) Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM.

9.0 Monovalente c 30 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 20 mM.

9.1 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, CaCl2 20 mM.

9.0 Fosfatod 30 Fosfato 10 mM pH 7.5, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 1.7 mM.




10.0 (2) PME-MgCl2 5 mM 60 Fosfato 10 mM pH 7.5, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 5 mM.

10.1 Fosfato 5 mM pH 7.5, ATP 5 mM, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 1.7 mM.

10.2

Fosfato 5 mM pH 7.5, ATP 5 mM, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 5 mM.

10.3 Fosfato 5 mM pH 7.5, ATP 5 mM, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 10 mM.

10.4 Fosfato 5 mM pH 7.5, ATP 5 mM, KCl 120 mM, NaCl 20 mM, MgCl2 20 mM.


11.0 PME-MgCl2 5 mM 40 Fosfato 5 mM pH 7.5, ATP 5 mM, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 3 mM.


57










12.0 PME-MgCl2 5 mM 35 H2O.

12.1 Pipes 0.1 mM pH 7.2.

12.2 Pipes 5 mM pH 7.2.

12.3 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 0.5 mM.

12.4 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 1.7 mM.

12.5 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 5 mM.

12.6 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 10 mM.

13.0 PME-MgCl2 5 mM 60 Pipes 0.1 mM pH 7.2.

13.1 Pipes 0.1 mM pH 7.2, EDTA 10 mM.

13.2 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, EDTA 10 mM.



58


2.3.7 Digestiones con enzimas

Los cromosomas metafásicos aislados y purificados mediante un gradiente de

sacarosa de PME-MgCl2 5 mM (ver sección 2.2.2.5) eran tratados con diversas enzimas con

el fin de provocar su desestructuración parcial y poder observar su estructura interna en el

microscopio electrónico. A continuación se describen estas digestiones, así como las

enzimas utilizadas.

2.3.7.1 Digestión de cromosomas metafásicos con tripsina

Se preparaba una solución de tripsina de 1 mg/ml disuelta en PME-MgCl2 5 mM y

sacarosa al 50% (tampón en el cual se encontraban los cromosomas después de ser

purificados mediante el gradiente de sacarosa). A partir de esta solución concentrada se

elaboraba un banco de diluciones en el mismo tampón, de tal manera que la concentración

final de tripsina fuera de 1 mg/ml (dilución 1/1), 0.5 mg/ml (dilución 1/2), 0.2 mg/ml

(dilución 1/5) y 0.1 mg/ml (dilución 1/10). La preparación de este banco de diluciones

debía realizarse inmediatamente antes de iniciar las digestiones de las muestras, para evitar

que la tripsina se autodigiriera.

Al igual que en la sección anterior, las digestiones se realizaban con los

cromosomas extendidos sobre las rejillas de microscopía. De esta manera, evitábamos la

desmoronación total de su estructura.

El procedimiento utilizado era muy similar al detallado en la sección 2.3.6. En una

bandeja de acero enganchábamos una lamina de Parafilm sobre la cual colocábamos 4

a PME-MgCl2 5 mM. Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 5 mM. b Poliaminas. TEA-HCl 15 mM pH 7.5, NaCl 20 mM, KCl 80 mM, EDTA-KOH 2 mM pH 7.4, espermina 0.2mM, espermidina 0.5 mM, EGTA 0.5 mM. c Monovalentes. Pipes 5 mM pH 7.5, NaCl 20 mM, KCl 120 mM. d Fosfato. Fosfato 10 mM pH 7.5, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 5 mM. (1). La incubación en estos experimentos se efectuó a temperatura ambiente. (2). En el experimento 10.0, la muestra a continuación fue sometida a otro cambio de medio en agua durante40 minutos.


59

cubreobjetos (uno por cada dilución preparada). En cada cubreobjetos depositábamos 500

µl de la dilución de tripsina correspondiente y dejábamos todo el sistema en el baño para

que se equilibraran las soluciones a 37ºC. A continuación, las rejillas con la muestra se

colocaban flotando con la cara carbonatada hacia abajo, durante 10 minutos. También en

esta ocasión se preparaban paralelamente rejillas blanco sin cromosomas, para someterlas a

las mismas condiciones de digestión que las rejillas con muestra.

2.3.7.2 Digestión de cromosomas metafásicos con RNAsa

Las digestiones con RNAsa se realizaron también sobre cromosomas ya extendidos

en rejillas de microscopía (sección 2.3.5.1). Durante la digestión, estos cromosomas

también eran sometidos a la vez a cambios de medio.

Se prepararon un total de tres concentraciones de RNAsa disueltas en los diversos

medios de interés en un volumen final de 0.5 ml. Los medios en los cuales se efectuaron las

digestiones así como las concentraciones de RNAsa utilizadas, están indicadas en la tabla

2.3.4.

El proceso de digestión y cambio de medio simultaneo se perpetro mediante el

mismo sistema de bandeja de acero descrito en el último apartado. El tiempo empleado fue

de 30 minutos en el primer experimento, mientras que en el segundo fue de 60 minutos. Sin

embargo, en este último experimento, la RNAsa no se añadió hasta pasados 30 minutos.

Paralelamente también se digirieron rejillas blanco sin muestra


60

Digestión con RNAsa

Experimento

Medio utilizado en la digestión RNAsa (µg/ml)

1.0 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 1.7 mM. 1 1.1 20 1.2 100 2.0 Pipes 0.1 mM pH 7.2. 100 2.1 Pipes 0.1 mM pH 7.2, EDTA 10 mM. 100 2.2 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, EDTA 10 mM. 100 2.3 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 20 mM. 100 2.4 Fosfato 10 mM pH 7.5, NaCl 20 mM, KCl 120 mM,

MgCl2 10 mM. 100

2.3.7.3 Digestión de cromosomas metafásicos con nucleasa micrococal

Las digestiones efectuadas con nucleasa micrococal se efectuaron mediante dos

sistemas diferentes: digestión en solución o digestión en rejilla. En ambos sistemas era

necesario determinar previamente la actividad de la enzima.

2.3.7.3.1 Determinación de la actividad de la nucleasa micrococal. La solución

concentrada de nucleasa micrococal se preparaba disolviendo 1.8 mg de proteína (de un

vial Sigma guardado a – 20ºC ) en 1 ml de agua destilada. Después de ser preparada, esta

solución se podía guardar a 4ºC durante un máximo de un año.

Previamente a cada experimento se realizaba un ensayo de actividad para asegurar

que la enzima estaba en buenas condiciones. Este ensayo se llevaba a cabo midiendo la

hipercromicidad creciente a 260 nm provocado por el enzima sobre el DNA doble cadena

de timo de ternera (Cuatrecasas et al., 1967). El DNA de timo de ternera del ensayo se

encontraba disuelto en Tris-HCl 10 mM pH 8.8, EDTA 0.2 M, a una concentración de 50

µg/ml guardado a 4ºC y condiciones estériles. La determinación de la actividad se

realizaba con 1 ml de DNA, 10 µl de CaCl2 y 5 µl de una dilución 1:100 del enzima

disuelto en agua destilada. La hipercromicidad creciente era seguida gracias a la

Tabla 2.3.4


61

programación de una cinética de 3 minutos en el espectrofotómetro CECIL 3000. El

proceso se repetía con 10 y 15 µl de la solución 1:100 del enzima. Para calcular la actividad

expresada en unidades arbitrarias, en la zona donde la absorbancia aumentaba linealmente

en función del tiempo, se aplicaba la siguiente fórmula:

Actividad = ( Amax – Amin) / t × V Amax ⇒ Absorbancia máxima a 260 nm en el intervalo escogido. Amin ⇒ Absorbancia mínima a 260 nm en el intervalo escogido. t ⇒ Tiempo (minutos) del intervalo escogido. V ⇒ Volumen ( µl ) de la nucleasa micrococal añadida. Se consideraba que la enzima estaba en buenas condiciones, cuando su actividad era

igual o superior a las 2×10-4 unidades/µl.

2.3.7.3.2 Digestión en solución. La digestión se efectuó en tubos eppendorf de 0.5

ml en los cuales añadimos 100 µl de muestra procedente del material purificado a partir de

un gradiente en PME-MgCl2 5 mM (sección 2.2.2.5). Se efectuaron diferentes digestiones

con diferentes concentraciones de nucleasa micrococal. Concretamente se preparó una

batería de tubos en los que se añadió enzima hasta alcanzar una concentración final que

osciló entre 2.7.10-2 y 7.9.10-6 µg/µl. A continuación se colocaban los tubos flotando en un

baño a 37ºC y se llevaba a cabo la digestión durante 30-50 minutos dependiendo del

experimento.

Aunque nuestro grupo, en experimentos anteriores, determinó que la nucleasa

micrococal tenía una actividad importante en presencia únicamente de iones Mg2+, se

decidió realizar una variación en este tipo de experimentos. Se mezclaron 50 µl de muestra

en 50 µl de Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, CaCl2 5 mM. El objetivo de esta variación era

obtener una concentración final de iones calcio de 2.5 mM en el medio donde se efectuaba

la digestión. De esta manera garantizábamos una mayor actividad de la enzima.

La tabla 2.3.5 detalla las condiciones finales en las que se realizaron las digestiones,

el tiempo invertido y las concentraciones de nucleasa micrococal utilizadas para cada

experimento de digestión en solución.


62

Digestión con nucleasa micrococal en solución

Experimento Tiempo (minutos)

Condición Concentración (µg/µl)

1.0

30

Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 5 mM, sacarosa 50%.

2.7.10-2

1.1 2.7.10-3 1.2 2.7.10-4 1.3 2.7.10-5 2.0 50 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 5

mM, sacarosa 25%. 7.9.10-2

2.1 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 2.5 mM, CaCl2 2.5 mM, sacarosa 25%.

7.9.10-3


7.9.10-3

2.3 7.9.10-4 2.4 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2

2.5 mM, CaCl2 2.5 mM, sacarosa 25%. 7.9.10-4

2.5 7.9.10-5 2.6 7.9.10-6

2.3.7.3.3 Digestión en rejilla. En este caso se procedió a aplicar la técnica ya

detallada en los apartados 2.3.7.1 y 2.3.7.2 es decir, a la digestión de los cromosomas

cuando éstos ya están extendidos sobre las rejillas. Al igual que en la sección 2.3.7.2, la

muestra eran sometida a cambios de medio de forma paralela al proceso de digestión.

Se prepararon un total de seis concentraciones de nucleasa micrococal disueltas en

los diferentes medios en donde se iba a perpetrar la digestión, en un volumen final de 300

µl. Estos medios, así como el tiempo empleado y las concentraciones utilizadas en la

digestión, están indicadas en la tabla 2.3.6, para cada uno de los experimentos realizados.

Tabla 2.3.5


63

Digestión con nucleasa micrococal en rejilla Experimento Tiempo

(minutos) Condición Concentración (µg/µl)

1.0

30

Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM, MgCl2 5 mM.

2.4.10-2

1.1 2.4.10-3 1.2 2.4.10-4 1.3 2.4.10-5 1.4 2.4.10-6 2.0 50 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM,

MgCl2 2.5 mM, CaCl2 2.5 mM. 7.9.10-2

2.1 7.9.10-3 2.2 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM,

MgCl2 5 mM. 7.9.10-3

2.3 7.9.10-4 2.4 Pipes 5 mM pH 7.2, NaCl 5 mM,

MgCl2 2.5 mM, CaCl2 2.5 mM. 7.9.10-4

3.0 35 Fosfato 10 mM pH 7.4, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 1.7 mM.

7.9.10-3


7.9.10-3


7.9.10-3


7.9.10-3


7.9.10-3

4.0 60 Fosfato 10 mM pH 7.4, NaCl 20 mM, KCl 120 mM, MgCl2 5 mM.

7.9.10-3

4.1a 7.9.10-3

a La muestra posteriormente fue sometida a un cambio de medio en agua durante 40 minutos a 37ºC.

Tabla 2.3.6


64

El método utilizado para la digestión fue el mismo que el detallado en la sección

2.3.7.1. En el experimento 4, la nucleasa no se añadió hasta pasados 30 minutos.

Paralelamente a cada uno de estos experimentos, se efectuaron tratamientos de digestión en

rejillas blanco sin muestra.

Finalizados los tiempos de digestión, las rejillas se lavaban durante 5 minutos en sus

respectivos tampones para finalizar la reacción.

2.3.8 Fijación de los cromosomas para microscopía electrónica

Una vez extendida la muestra sobre las rejillas de microscopía electrónica y

finalizadas (en caso de haberlos realizado) los procesos de cambio de medio y/o digestión,

la cromatina procedente de los cromosomas y los propios cromosomas, eran sometidos a un

proceso de fijación. El objetivo de la fijación en microscopía electrónica es el de proteger y

preservar la estructura de la muestra durante los procesos de deshidratación y platinación y

su posterior exposición al haz de electrones.

En este trabajo, la fijación de los cromosomas se daba por entrecruzamiento con

gluteraldehido. Esta molécula es un agente entrecruzador que reacciona con los grupos

amino primarios de las histonas adyacentes, quedando de esta manera la estructura de la

muestra preservada (Sommerville y Scheer, 1987; Bozzola y Rusell, 1992).

2.3.8.1 Cromosomas aislados y purificados mediante un gradiente de sacarosa

Los cromosomas obtenidos mediante un gradiente de sacarosa (sección 2.2.2.5) se

extendían sobre rejillas de microscopía (sección 2.3.5.1), y se sometían a cambios de medio

(sección 2.3.6) y/o a digestiones enzimáticas (sección 2.3.7). En ambos casos, el

entrecruzamiento con gluteraldehido se efectuaba en el mismo tampón en el cual se habían

dado estos procesos.

Algunas de la rejillas con cromosomas extendidos se fijaban directamente (sin

pasar por las operaciones antes mencionadas), con el propósito de estudiar la forma y la

estructura de los cromosomas inmediatamente después de ser purificados. Estas rejillas se

preparaban en todos los experimentos en los que se hiciera uso de un gradiente escalonado


65

de sacarosa y tenían la función de mostrar el nivel de integridad de los cromosomas antes

de someterlos a cualquier tratamiento posterior. Estos controles se entrecruzaban en el

medio con el cual se había preparado el gradiente de sacarosa, manteniendo la misma

proporción de sacarosa que la fracción del gradiente donde quedaban concentrados los

cromosomas (interfase 40-50% y 50-60%, ver sección 2.2.2.5).

Dado que el gluteraldehido es una sustancia muy tóxica el entrecruzamiento se

efectuaba con mucha precaución. En esta operación era necesaria la utilización de

mascarilla y guantes de látex.

En una superficie plana se extendía una lámina de Parafilm sobre la cual se

colocaban una serie de cubreobjetos. En cada cubreobjetos se depositaban 500 µl del medio

en el cual se iba a desarrollar la fijación, con una concentración final de gluteraldehido del

2.5%. En el caso de gradientes con poliaminas, si los cromosomas no eran sometidos a

cambios de medio, la concentración de agente entrecruzador era del 13.5%. Este exceso era

necesario para contrarrestar la gran cantidad de grupos amina existentes en el medio de

poliaminas. El gluteraldehido se añadía pocos segundos antes de iniciar la reacción.

A continuación colocábamos las rejillas flotando cara abajo sobre los 500 µl de cada

uno de los cubreobjetos, durante 10 minutos. Pasado este tiempo, el exceso de

gluteraldehido se eliminaba repitiendo esta operación, pero en este caso colocando las

rejillas sobre cubreobjetos que contenían gotas de agua milliQ, durante 5 minutos. Para

evitar contaminación cruzada, en una misma gota de agua, no podían coincidir dos o más

rejillas que tuvieran muestra de diferente procedencia.

Finalmente cada una de las rejillas se deshidrataba durante 2-3 segundos en etanol

absoluto y se dejaban secar sobre papel de filtro un mínimo de 2 minutos. Una vez secas las

rejillas, éstas se guardaban en un portarejillas donde quedaban debidamente identificadas.

2.3.8.2 Cromosomas obtenidos en TeaKMC, poliaminas y TeaBM

Los cromosomas obtenidos en estos medios (sección 2.2.2.2, 2.2.2.3 y 2.2.2.4), se

extendían en rejillas (sección 2.3.5.1) y a continuación se entrecruzaban en gluteraldehido

siguiendo un proceso idéntico al explicado en el punto anterior. El gluteraldehido se añadía

al mismo tampón en el cual estaban los cromosomas durante su extensión, hasta llegar a


66

una concentración final del 2.5%. La concentración de gluteraldehido en los cromosomas

obtenidos en presencia de poliaminas era del 13.5%.

2.3.8.3 Cromosomas en metanol-ácido acético

La fijación de los cromosomas en el medio de Carnoy para su observación al

microscopio electrónico era un proceso complicado, en el cual además, se efectuaron

algunas variaciones.

Terminada la extensión de los cromosomas sobre la rejilla (sección 2.3.5.2), éstas

eran fijadas colocando las rejillas en cuestión en el interior de un tapón de polipropileno de

un tubo de 10 ml, el cual contenía fosfato 0.1 M pH 7.4 con una concentración final de

gluteraldheido del 2% (v/v), durante 15 minutos. Pasado este tiempo, las rejillas eran

lavadas durante 5 minutos en el mismo tampón. En una de las variaciones de este

protocolo, las rejillas directamente sin pasar por el proceso de lavado, eran sumergidas

además, durante 10 minutos en fosfato 0.1 M pH 7.4, tetróxido de osmio 1%. También en

este caso el tratamiento se llevaba a cabo en tapones de tubos de 10 ml.

El tetróxido de osmio se utiliza habitualmente como fijador secundario de la

estructura celular. Este metal pesado resulta reducido confiriendo densidad y contraste al

tejido biológico (Bozzola y Rusell, 1992). Debido a la toxicidad de los vapores

desprendidos, todos los procesos realizados en presencia de este producto se efectuaron en

una campana de extracción de gases. También se evitó el contacto directo, utilizando

guantes de látex.

Las muestras que habían estado en contacto con el tetróxido de osmio, antes de

pasar por el proceso de deshidratación, debían pasar por tres lavados consecutivos en agua

durante 5 minutos.

Para la deshidratación de las muestras, era necesario pasar las rejillas por un

gradiente de acetona escalonado (30, 60, 90, y 100% (v/v) en agua). Las rejillas se

colocaban en el interior de un tapón de tubo de 10 ml para cada una de las sucesivas

concentraciones ascendentes de acetona. El tiempo empleado para cada concentración era

de 3 minutos.


67

Si queríamos realizar una deshidratación de forma más cuidadosa, después de pasar

las muestras por el gradiente de acetona, éstas podían deshidratarse por la técnica de

Crytical Point Drying (Bozzola y Rusell, 1992).

Este método se aplicaba introduciendo las rejillas en el interior de un recipiente

especial con acetona fría (recipiente para gases comprimidos). Después de sellar este

compartimento, el agente deshidratante (acetona) era desplazado por un fluido de transición

presurizado (dióxido de carbono líquido). A continuación la temperatura de este fluido era

lentamente elevada por aplicación de calor. Como respuesta a este calor, la presión en el

interior del recipiente se iba incrementando, hasta llegar a un punto crítico (crytical point)

en el cual la densidad de la fase líquida se igualaba con la densidad de la fase vapor.

Entonces se producía la transición del dióxido de carbono líquido a gas.

Debido a la complejidad de la técnica, todos estos pasos se realizaban de forma

semiautomática por un aparato EMITECH K-850. El éxito de esta técnica reside en que la

muestra durante el punto crítico está totalmente inmersa en una fase de vapor densa,

evitando así la formación de artefactos debidos a la interfase líquido/aire.


Las muestras obtenidas en hexylene glycol (sección 2.2.2.1) después de ser

extendidas sobre rejilla (sección 2.3.5.3) no requerían de entrecruzamiento con

gluteraldehido. Sin embargo el proceso de deshidratación de la muestra era más complejo

que en los casos anteriores. Este consistía en sumergir sucesivamente las rejillas con

muestra unos 30 segundos en un gradiente escalonado de etanol absoluto en agua [40, 85 y

100% (v/v)] y a continuación en un gradiente escalonado de amyl acetato en etanol [10, 40

y 70% (v/v)]. Este proceso gradual de deshidratación, junto al efecto anticolapsante del

hexylene glycol, garantizaban que la estructura de la muestra no se viera afectada

previamente y durante su observación al microscopio electrónico.


68

2.3.9 Platinación de las muestras

El microscopio electrónico de transmisión genera las imágenes debido a la

incidencia de un haz de electrones sobre la muestra. Los electrones que chocan con la

muestra son desviados en función de la densidad local de ésta. Para solucionar el problema

de la baja densidad de las muestras biológicas se realiza una tinción con metales pesados.

Estos metales pesados aumentan la densidad local, incrementando el contraste de la imagen

(Bozzola y Rusell, 1992). En nuestro caso, se escogió efectuar la tinción con una mezcla de

carbón-platino.

2.3.9.1 Platinado rotacional

Una vez cargada la muestra sobre las rejillas con la película de carbón, se procedía a

la platinación en el evaporador de carbón y carbón-platino. Las rejillas se colocaban en

cuidadoso orden sobre el soporte del evaporador, el cual se inclinaba para que el ángulo de

inclinación fuera de 6º (ver tabla 2.3.2). Finalmente se hacían girar las muestras a unas 100

rpm aproximadamente y se realizaba la platinación hasta conseguir un grosor de

aproximadamente 1 nm en la capa de carbón-platino.

El material evaporado se condensa en finas partículas al chocar contra un objeto y

las superficies encaradas al cañón reciben una cantidad de partículas superior a las zonas

escondidas, generando así un contraste diferencial necesario para obtener imágenes

(Bartolomé et al., 1994; Bartolomé et al., 1995; Bermúdez, 1997).

Figura 2.3.2. La figuraes un esquema de esteproceso de platinaciónpara fibras cortas decromatina de 30-40 nmde diámetro. Sudisposición vertical yel ángulo deplatinación hace que elplatino se acumulemayoritariamente en lacara lateral del cilindroque representa la fibra(figura adaptada deMartín, 1999).


69

2.3.9.2 Platinado unidireccional

En el platinado unidireccional la plataforma en la que se depositaban las rejillas se

dejaba inmóvil durante el proceso de evaporación de platino. Con ésto se conseguía que los

átomos de platino se depositasen sobre la muestra siempre desde el mismo sentido, hecho

que provocaba que detrás de cada partícula se generara una zona totalmente inaccesible al

metal. La altura de un determinado cuerpo se puede conocer midiendo la longitud de la

sombra que ha generado (ver sección 2.4.2).

Según el tamaño de los cuerpos, era conveniente obtener sombras más o menos

largas. Para este fin, se variaba el ángulo de inclinación de la plataforma en más o menos

grado.

2.3.10 Observación y fotografía de la muestra

Las muestras platinadas se observaban en un microscopio electrónico H7000

(Hitachi) a 100 Kv. Los aumentos utilizados oscilaban entre los 5000 y los 30000 en

función del tamaño del cuerpo observado. Así por ejemplo, para la visualización idónea de

un cromosoma íntegro se trabajaba a 10000 aumentos. Para facilitar la observación en la

pantalla fosforescente del microscopio, se utilizaba una lupa que aumentaba 10 veces la

imagen.

Los aumentos del microscopio eran calibrados cada experimento con unas rejillas de

54000 líneas por pulgada (Bal-Tec). En la determinación de medidas se consideró las

diversas magnificaciones del microscopio (5000, 10000 y 30000) como correctas ya que la

desviación estándar de las medidas observadas en la rejilla de calibración, y en cada

experimento era muy pequeña (ver tabla 2.3.7).

La aplicación de un factor de corrección a estas magnificaciones se descartó

definitivamente, al comprobar que los valores de las medidas determinados por nosotros de

las rejillas de calibración, eran muy parecidas a las medidas establecidas por el fabricante

(ver tabla 2.3.7).


70

La impresión del negativo requería de un tiempo de exposición de 1.5 segundos,

aunque ocasionalmente, este tiempo se incrementaba hasta 12 segundos con el fin de

vislumbrar parte de la estructura interna de algunos cuerpos de gran densidad.

El número total de micrografías realizadas en esta tesis fue de 4410. Estas

micrografías proceden de 552 rejillas de microscopía electrónica obtenidas durante la

realización de los diferentes experimentos de este trabajo.

Medidas en rejillas de calibración

Valores medios y desviaciones estándar (nm)a

Desviaciones respecto a la magnificaciónb

Experimento 5×103 10×103 30×103 ∆5% ∆10% ∆30%1 465 ± 12 (2.5) 460 ± 12 (2.6) 0.4 -0.6 2 481 ± 9 (1.8) 467 ± 3 (0.6) 3.9 0.9 3 471 ± 7 (1.6) 457 ± 7 (1.6) 1.7 -1.2 4 484 ± 7 (1.4) 460 ± 9 (1.9) 4.5 -0.6 5 446 ± 10 (2.1) 454 ± 8 (1.9) 435 ± 5 (1.2) -3.7 -1.9 -5.9 6 460 ± 5 (1.0) 447 ± 11 (2.5) -0.6 -3.3 7 464 ± 13 (2.7) 465 ± 11 (2.3) 0.2 0.4 8 470 ± 11 (2.3) 463 ± 5 (1.0) 1.5 0.0 9 456 ± 16 (3.4) 460 ± 7 (1.4) -1.5 -0.6 10 476 ± 8 (1.8) 480 ± 12 (2.4) -2.8 3.7 11 469 ± 17 (3.5) 1.3 12 456 ± 18 (4.0) 458 ± 4 (0.9) -1.5 -1.1 13 468 ± 14 (3.0) 463 ± 8 (1.8) 1.1 0.0 14 438 ± 6 (1.4) 450 ± 0 (0.0) -5.4 -2.8 15 464 ± 8 (1.8) 457 ± 11 (2.4) 0.2 -1.4 16 470 ± 12 (2.4) 455 ± 9 (2.0) 1.5 -1.7 17 477 ± 12 (2.4) 452 ± 12 (2.6) 1.3 -2.5 18 471.5± 8 (1.7) 451 ± 13 (2.8) 1.9 -2.5 19 472 ± 7 (1.4) 453 ± 9 (2.0) 1.9 -2.0 20 458 ± 6 (1.4) 451 ± 12 (2.8) -1.1 -2.5

a Valores medios y desviaciones estándar obtenidas a partir de 10 medidas del espaciado entre líneas de unarejilla de calibración a 5000, 10000 y 30000 aumentos. Entre paréntesis se encuentran los valores de ladesviación porcentuada respecto a la media. b Diferencia expresada en % entre el valor medio indicado anteriormente y el valor de esta misma medidaestablecida por el fabricante (463 nm).

Tabla 2.3.7


71

2.4 Procesamiento de las imágenes de microscopía electrónica

2.4.1 Realización de medidas

Uno de los objetivos de este estudio era conocer las dimensiones de los cromosomas

y de las partículas cromatínicas desprendidas de éstos. Con este fin los negativos de las

fotografías se colocaban sobre un transiluminador VaryQuest 100 (Photodyne) y se

efectuaban las medidas de interés con una lente de 10 aumentos graduada (Peak) en caso de

partículas pequeñas, o con una regla graduada en caso de objetos grandes.

2.4.2 Medición de alturas

Para la determinación de la altura de un cuerpo se aplicó la técnica del platinado

unidireccional (Bozzola y Rusell, 1992; Bartolomé et al., 1994; Bermúdez, 1997). En esta

técnica, el platino proveniente de una sola dirección provoca que las diferentes partículas de

la muestra proyecten una sombra que es proporcional a la altura de dichas partículas.

h = tgα × L (1) Donde, h ⇒ Altura de un cuerpo determinado. tgα ⇒ Tangente ángulo de platinación. L ⇒ Longitud de la sombra. Por tanto, para realizar este cálculo se debía conocer con precisión el ángulo de

platinado (α).

2.4.2.1 Determinación del ángulo de platinación (αap y αreal)

El cálculo exacto de este ángulo se efectuó a partir de unas partículas de látex

esféricas con un diámetro conocido (diámetro promedio de 91 nm, Balzers Union). Estas


72

bolas se añadían sobre las rejillas con muestra una vez finalizado el proceso de fijación

(sección 2.3.8). Este paso consistía en depositar 10 µl de una solución a una concentración

de 5 × 109 bolas/ml sobre la rejilla durante 5 minutos. Finalizado este tiempo las rejillas se

lavaban con agua y se secaban en etanol, de la forma habitual (sección 2.3.8).

Al ser las bolas de látex una esfera (Bermúdez, 1997), resulta que su diámetro es

igual a su altura (ver figura 2.4.1A). El cálculo del ángulo de platinado se realizó midiendo

el diámetro de la esfera (φ) y la longitud de la sombra desde el centro de la bola (AB):

tgα = AC/AB = φ / L (2) Donde, tgα ⇒ Tangente del ángulo de platinación. AC = φ ⇒ Altura y diámetro de la bola de látex platinada, respectivamente. AB = L ⇒ Longitud de la sombra.

Figura 2.4.1. Representación gráfica dela recta tangente aparentey real a una esfera (A) o aun óvalo (B).


73

Sin embargo, si nos fijamos en la figura 2.4.1A podemos ver que el ángulo de

platinación calculado a partir del diámetro (φ) y por tanto de la altura (AC) [ángulo de

platinación aparente (αap)] es inferior al ángulo de platinación real (αreal). Esto es debido a

que la recta tangente a la bola de látex determinada por el haz de platino (FB) no coincide

con la superficie de la bola en el mismo punto que la altura (AC) o diámetro de dicha bola

(φ).

En el caso de un cuerpo esférico, αap sería el ángulo correcto para el cálculo de la

altura (AC), puesto que si se utilizara αreal estaríamos calculando una altura superior (AF).

Para evitar problemas relacionados con la posición de la rejilla respecto a la fuente

de platino o irregularidades en la superficie del carbón, la medición de la altura de los

cuerpos de interés se realizaba calculando αap a partir de bolas de látex presentes en el

mismo campo fotográfico.

2.4.2.2 Determinación del ángulo β del evaporador de carbón y carbón-platino

En el evaporador de carbón y carbón-platino, los dos cañones evaporadores tienen

una cierta desviación respecto a la vertical. Esta desviación forma un ángulo que nosotros

denominamos β. El valor de este ángulo se calculó de forma experimental, restando el

ángulo de inclinación del soporte de las rejillas en el momento de la platinación, al ángulo

aparente calculado en diversas micrografías (β = αap - αinclinación) (ver tabla 2.4.1). El ángulo

aparente de cada micrografía se calculó a partir de las diversas bolas de látex existentes en

la micrografía en cuestión.

Micrografía

αap

a

αinclinaciónb

β c

3466 26.9º 20º 6.9º 3467 29.9º 20º 9.9º 3468 27.7º 20º 7.7º 3469 27.2º 20º 7.2º 3514 18.3º 10º 8.3º 3517 17.5º 10º 7.5º 3520 18.7º 10º 8.7º 3549 24.9º 20º 4.9º

Tabla 2.4.1


74

3556 27.2º 20º 7.2º 3558 34.9º 20º 14.9º 3559 32.2º 20º 12.2º 3561 29.9º 20º 9.9º 3562 31.8º 20º 11.8º 3752 18.9º 10º 8.9º 3573 17.3º 10º 7.3º 3576 16.4º 10º 6.4º 3579 28.2º 20º 8.2º 3582 33.9º 20º 13.9º

β = αap - αinclinación = 8.9º ± 2.6º

2.4.2.3 Determinación de la altura de una cromátida (hc y ho)

2.4.2.3.1 Cromátida de sección circular. Si consideramos la sección de las

cromátidas como una sección circular (figura 2.4.1A), entonces la altura de este cuerpo se

podría determinar fácilmente aplicando la siguiente expresión:

hc = tgαap × L0 (3) O si miramos la figura 2.4.1A:

AC = tgαap × AB hc = AC ⇒ Altura de la cromátida en caso de que su sección fuera circular. tgαap ⇒ Tangente del ángulo aparente de platinación. L0 = AB ⇒ Longitud de la sombra medida a partir del centro de la cromátida. Sin embargo, debido a la gran dificultad en determinar con exactitud el centro de

una cromátida a través de las micrografías obtenidas, se optó por medir la sombra de la

cromátida a partir de su base:

hap = tgαap × L1 (4)

a Ángulo aparente de platinación. b Ángulo existente entre el disco soporte de las rejillasy el eje vertical. c Ángulo existente entre los cañones del evaporador yel eje vertical.


75

O lo que es lo mismo:

DE = tgαap × DB hap = DE ⇒ Altura aparente de la cromátida tgαap ⇒ Tangente del ángulo aparente de platinación. L1 = DB ⇒ Longitud de la sombra medida a partir de la base de la cromátida. Tal como podemos ver en la figura 2.4.1A, esta altura aparente es inferior a la

verdadera altura de la cromátida:

hap = DE < AC = hc

Si queremos calcular hc a partir de L1, entonces es necesario modificar la expresión

(3):

hc = tgαap × (L1 + r) (5) O según la figura 2.4.1A:

AC = tgαap × (DB + AD) r = AD ⇒ Radio de la cromátida.

El valor que se utilizó como r, corresponde al promedio final del radio de las

cromátidas en presencia de Mg2+ (0.265 µm) (ver más adelante en sección 3.2.8.1). Para

cada una de las cromátidas en las que se determinó su altura (hc) se realizaron diversas

medidas de la longitud de la sombra partiendo de su base (L1) y se efectuó un promedio de

éstas (Lex). Así pues, para calcular la altura de una cromátida de sección circular se aplicó

esta última expresión matemática:

hc = tgαap × (Lex + r) (6) Y para el cálculo de la altura aparente (es decir, sin tener en cuenta el radio de la

cromátida), esta otra:

hap = tgαap × Lex (7)


76

2.4.2.3.2 Cromátida de sección en forma de óvalo. Es muy probable que los

cromosomas al depositarse por centrifugación sobre las rejillas de microscopía electrónica

(sección 2.3.5.1) resulten un tanto aplanados, de manera que la sección de sus cromátidas

no fuera circular, sino en forma de óvalo (figura 2.4.1B). En este caso la mejor

aproximación sería aplicar la fórmula:

ho = tgαreal × L1 (8) O si miramos la figura 2.4.1B:

DG = tgαreal × DB Ya que:

DG ≅ AH ho = AH ≅ DG ⇒ Altura de la cromátida con sección en forma de óvalo. tgαreal ⇒ Tangente del ángulo real de platinación. L1 = DB⇒ Longitud de la sombra medida a partir de la base de la cromátida. Si hubiéramos utilizado αap, habríamos calculado una altura inferior a la altura real

del óvalo (DE < AH) (ver figura 2.4.1B).

El cálculo de αreal se efectuó por métodos gráficos a partir de los resultados

obtenidos para las bolas de látex.

También en esta ocasión, ho se determinó a partir de Lex. Así pues:

ho = tgαreal × Lex (9) 2.4.2.3.3 Factores de corrección para hc y ho. Cuando las muestras son platinadas

unidireccionalment, las bolas de látex que estamos utilizando como referencia, también son

platinadas. Esto provoca que se acumule una pequeña cantidad de platino alrededor de las

bolas. Por tanto, el diámetro que estamos midiendo en las micrografías es ligeramente

superior al de las bolas sin platinar.


77

Para corregir esta diferencia de diámetros se procedió a medir diversas bolas

situadas en la sombra de los cromosomas, y por tanto que no estaban platinadas. Los

diámetros obtenidos eran de 0.090 ± 0.03 µm. Este dato además coincide con el diámetro

dado por el fabricante (0.091 µm, Bal-Tec, 1992).

Los cromosomas también tienen la misma acumulación de platino en su superficie

que las bolas de látex (aproximadamente 0.01 µm). Sin embargo este valor en los

cromosomas representa un % muy bajo respecto el tamaño del cuerpo que estamos

midiendo (aproximadamente 0.6 µm), mientras que en las bolas de látex la diferencia

representa el 10%. Teniendo en cuenta que esta diferencia nos daría un error elevado en el

cálculo de la tgαap y consecuentemente de las alturas calculadas a partir de este parámetro,

decidimos aplicar un factor de corrección a las alturas obtenidas, utilizando el verdadero

diámetro de las microesferas.

Altura corregida para hc (hc’)

tgα’ap = φ’/ L (10) tgαap = φ/ L (11) tgα’ap ⇒ Tangente del ángulo de platinación aparente corregida. tgαap ⇒ Tangente del ángulo de platinación aparente sin corregir. φ’ ⇒ Diámetro corregido (0.090 ± 0.003 µm) (bolas sin platinar). φ ⇒ Diámetro sin corregir (0.098 ± 0.005 µm) (bolas platinadas). L ⇒ Longitud de la sombra proyectada por la bola de látex. tgα’ap = 0.090 / L tgαap = 0.098 / L

De donde resulta:

tgα’ap = 0.92 tgαap

Es decir:

hc’ = 0.92 hc (12)


78

Altura corregida para ho (ho’)

A partir de tgα’ap , se determinó por un método gráfico teniendo en cuenta los datos

obtenidos con bolas de látex, la tgα’real (tangente del ángulo de platinación real, corregido).

El factor de corrección se obtuvo a través del cociente:

tgα’real / tgαreal = 0.91

Y por tanto:

ho’ = 0.91 ho (13)

Aun teniendo en cuenta estos factores de corrección, hay otro aspecto que nos

influye sobre el cálculo de la altura de un cromosoma. Durante la platinación, la altura

crece la mitad (0.005 µm) respecto del crecimiento del diámetro de la bola (0.01 µm). Esto

hace que desconozcamos si la longitud de la sombra medida corresponde al diámetro total

de la bola platinada (0.1 µm) o bien al grueso del platino en la parte norte de la bola (0.95

µm).

2.4.2.4 Determinación de la altura de una placa

Al igual que en la sección anterior, el cálculo de la altura de una placa se efectuó

utilizando la técnica del platinado unidireccional. Con este fin, se determinó primero el

ángulo de platinado aparente a partir de la medición del diámetro de las bolas de látex

presentes en cada micrografía, y sus sombras proyectadas. Con estos datos se aplicó la

expresión (2) descrita en la sección 2.4.2.1 y se obtuvo la tangente del ángulo aparente.

Finalmente la altura aparente de las placas se calculó a través de la siguiente fórmula

matemática:

hap = tgαap × Lex (14) hap ⇒ Altura aparente de la placa. tgαap ⇒ Tangente del ángulo aparente de platinación.


79

Lex ⇒ Longitud de la sombra proyectada por la placa. La medición se efectuó desde la base de la placa hasta el final de la sombra, teniendo en cuenta la dirección del haz de platino.

Sin embargo, el ángulo aparente no es el apropiado para realizar el cálculo de la

altura de una placa, puesto que este ángulo es inferior al ángulo de platinación real (ver

figura 2.4.2)

Así pues se determinó el ángulo real de platinación por métodos gráficos a partir de

los datos obtenidos con bolas de látex y con este nuevo parámetro se realizó un nuevo

cálculo corregido de la altura de las placas, aplicando la expresión:

hreal = tgαreal × Lex (15) hreal ⇒ Altura real de la placa. tgαreal ⇒ Tangente del ángulo real de platinación.

Lex ⇒ Longitud de la sombra proyectada por la placa. Finalmente, al igual que en la sección 2.4.2.3.3, se aplicó a ambas alturas

calculadas, un factor de corrección que tenía en cuenta el verdadero diámetro de las bolas,

en lugar del diámetro platinado. En caso de la altura aparente corregida (hap’) se utilizó el

factor de corrección calculado en (12), es decir:

hap’ = 0.92 hap (16)

Figura 2.4.2. Representacióngráfica de la altura aparente yreal de una placa.


80

Para la altura real corregida (hreal’) se aplicó el factor obtenido en (13), es decir:

hreal’ = 0.91 hreal (17) 2.4.3 Tratamiento informático de las imágenes

Las imágenes eran adquiridas digitalmente usando un escáner G5-700 Imaging

Densitometer (Bio-Rad Laboratories) con una resolución de 600 ppi. Durante este proceso

se tenía especial cuidado en no invertir las imágenes. Este aparato estaba conectado a un

ordenador personal PC que permitía pasar las imágenes adquiridas a formato TIFF (tagged

image file format), para su posterior tratamiento con programas de procesamiento de

imágenes como Adobe PhotoshopTM 3.0 o Photostyler 2.0. Estos programas permitían

incrementar el contraste. Finalmente, se motaban las figuras y se añadían barras de escala

utilizando el software del programa Corel DrawTM versión 8.0.

Elementos Estructurales de La Cromatina en los Cromosomas Mitoticos.

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