Elisa pasos, elaborado por josé mier
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Técnicas Aplicadas a la Proteómica
Universidad Anáhuac MayabEscuela de MedicinaProteómicaProf. José Escobedo
Integrantes: • Angélica Bautista• Patricio Correa• José Mier • Weyller Pam
• Jorge Valladares
WESTERN BLOT
Técnica
• Consiste en la utilización de anticuerpos para
detectar el antígeno o los antígenos específicos de
interés.
• La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo
permite la detección de una única proteína dentro
de una mezcla compleja de otras proteínas.
¿Como funciona?
• Se siguen una serie de pasos:
• A) separación de macromoléculas por geles de
electroforesis.
• B) las macromoléculas se transfieren a otra matriz.
(nitrocelulosa o PVDF)
• C) se bloquea la membrana para evitar la unión de Ac
utilizados para la detección de la proteína de interés.
• D) la proteína se le une un Ac marcado con una enzima.
• E) se añade un sustrato apropiado el cual reacciona con la
enzima y se obtiene un producto detectable. (luz)
Diferentes métodos
• Directo • indirecto
Directo • El anticuerpo primario marcado se une al antígeno
de la membrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable.
Indirecto • El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno.
Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y
reacciona con el sustrato.
Ventajas del método directo
• Mucho más rápido ya que sólo se utiliza un anticuerpo.
• • Se elimina la posible reacción cruzada del anticuerpo
secundario.
• • Se pueden detectar diferentes antígenos utilizando
diferentes marcajes en diferentes anticuerpos primarios.
Desventajas método directo
• La inmunoreactividad del anticuerpo primario
puede verse disminuida debido al marcaje.
• • El marcaje de los anticuerpos primarios es muy
cara y difícil.
• • No hay flexibilidad en el marcaje del anticuerpo
primario de un experimento a otro.
Ventajas método indirecto
• • Se incrementa la sensibilidad ya que cada anticuerpo primario posee
numerosos epítopos a los que
• puede unirse en anticuerpo secundario marcado, lo que permite la
amplificación de la señal.
• • Hay disponibles comercialmente una gran variedad de anticuerpos
secundarios marcados.
• • No se afecta la inmunoreactividad del anticuerpo primario por el
marcaje.
• • Se pueden utilizar diferentes marcadores con el mismo anticuerpo
primario
Desventajas método indirecto
• Puede producirse reacción cruzada con el
anticuerpo secundario, con lo que se obtienen
marcajes
• inespecíficos.
• • Es más lento ya que se necesita un paso extra de
incubación.
ELISA:
Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas.2 métodos: directo e indirecto.
Modo directo de la prueba ELISA.
• Se coloca un anticuerpo monoclonal en las paredes del (posito).
• Se le agrega una suspensión de sangre u otro fluido. Se hace para encontrar el antígeno complementario.
• Si se presenta el antígeno se va a pegar al anticuerpo que fue pegado al posito.
• Se puede ver como en la muestra del lado izquierdo se pego el antígeno al anticuerpo.
• Se le agrega otro anticuerpo monoclonal que va a tener una enzima reportera la cual va a ser la encargada de mostrar cierto marcaje al unirse al complejo antígeno- anticuerpo.
• Se le agrega primero el antígeno, estas pruebas son para detectar anticuerpos específicos por ejemplo: VIH.
Indirecto.
• Se le inyecta la sangre al pocito que puede contener los anticuerpos contra el antígeno que fue agregado de no serlo, se eliminan en el siguiente paso.
• Del mismo modo el anticuerpo se une al antígeno formando un complejo, después al igual que en la directa se le inyecta un anticuerpo con una enzima reportera que cambiara el colorante de la reacción.
• Al inyectarle un nuevo anticuerpo monoclonal con la enzima reportera cambia de color la muestra y se detecta.
ELECTROFORESIS:
Técnica de separación molecular dependiente
de la distribución de cargas moleculares.
Puede ser:• Unidimensional• Bidimensional
UNIDIMENSIONAL• 1 plano de separación• Utilizado en separaciones
rutinarias de proteínas y ácidos nucleicos.
• Su tipo de soporte es en tubos
BIDIMENSIONAL• Usado en el fingerprinting y
si es bien aplicado puede detectar todas las proteínas de una célula.
• Se usan hojas por mayor superficie.
• SISTEMA CATIONICO VS ANIONICO– Catiónico• Si los cationes +++ van hacia el cátodo
– Aniónico• Si se acomodan los aniones --- y van hacia el ánodo.
• Dependientes del acomodo de los electrodos:• CÁTODO – UPPER BATH• ÁNODO – LOWER BATH
– Las proteínas pueden tener carga + ó -, pero son dependientes del pH del búfer.
– Gel:• 3 secciones: Running, Stacking,
Sample
– La muestra debe ser introducida por un medio no convectivo (sucrosa)
– Los electrodos se conectan a los extremos de la columna y la electricidad pasa por los geles.
• TIPOS DE GELES– Continuos (menos utilizados)– Discontinuos: son múltiples porque
manejan concentraciones en un mismo medio, nos permiten medir ag. diferentes.
• GELES DE AGAROSA– Son más adecuados para separar ácidos
nucleicos de alto peso molecular (200 mil D).
– Menos acrilamida– La agarosa es un polisacárido que
disminuye la concentración de acrilamida
– Utilizados para elaborar mapas genéticos
Sds Page
Electroforesis del gel de poliacrilamida del sulfato dodecyl de sodio (SDS).
SDS PAGE
• Técnica de la biología molecular usada para separar
las proteínas por peso molecular. Puede separar
DNA Y RNA al igual.
• Técnica de gran alcance para conocer y resolver
mezclas proteicas.
SDS PAGE
• El dodecyl sulfato de sodio.- Es un detergente a
aniónico que desnaturaliza las proteínas, lo que las
disocia en subunidades.
• Esto hace que en el momento de la electroforesis
las subunidades puedan ordenarse por tamaño,
peso, plegamiento, etc.
PROTOCOLO
1. Solución proteica se mezcla con SDS.
2. EL SDS liga los residuos de aminoácidos con pesos
moleculares similares y les otorga una carga negativa
uniforme, lo que lineariza las moléculas por tamaño.
3. Se pone en el gel, en los respectivos pocitos, y se
agrega un tinte para que sigua el movimiento.
(Electroforesis)
SDS PAGE
• Gel empilador.- Gel de poliacrilamida de poros grandes (4%). Almacenador. PH 6.8, este gel se hecha sobre el gel de resolución.
• Gel de resolucion.- Gel de poliacrilamida de poros restrictivos, pequeños. PH de 8.8, aquí las moléculas se separan según su talla.
• Ambos usan como buffer el Tris.
Materiales • El gel de poliacrilamida.- Separa moléculas de
proteínas según talla y carga.• SDS• Electrodos
http://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G_pC8U