Una enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste, dependiendo de la enzima.Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de la ruptura de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o ohesivos/escalonados.

Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercanía (Apareamiento de Watson & Crick).

Eco RISmaI

Corte cohesivo Corte romo

•Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.

•Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para clonación de genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP.

•Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.

Hay otros sistemas de restricción descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E. coli (Eco571) que consta de una sola enzima que corta únicamente DNA metilado en una secuencia específica, y que además metila.

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo de vectores están los Plásmidos, moléculas circulares de ADN halladas en las bacterias.

Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas Isoesquizómeros. Por ejemplo, están los isoesquizómeros Asp718 y KpnI.

El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbiólogos Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las endonucleasas de restricción lo que condujo al desarrollo de la tecnología de ADN recombinante. El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos.

NOMENCLATURAEl nombre de cada enzima de restricción está asignado según el origen bacteriano de la misma. La nomenclatura utilizada para denominar estas enzimas consiste en:1º. Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras letras del nombre se escriben en cursiva. 2º. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli ) 3º. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción. 4º. Todas deberían llevar delante una R de restricción o un M de metilasa según la función de la enzima, pero generalmente se omite.

De esta manera, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se construiría de la siguiente manera:

Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:

E Escherichia Género de la bacteria

co coli Especie de la bacteria

R RY13 Cepa de la bacteria

ILa primera enzima identificada

Orden de identificación de la enzima en la bacteria

Enzima Origen Bacteriano Sitio de Reconocimiento Resultado del Corte

EcoRI Escherichia coli5'GAATTC3'CTTAAG

5'---G AATTC---3'3'---CTTAA G---5'

BamHI Bacillus amyloliquefaciens5'GGATCC3'CCTAGG

5'---G GATCC---3'3'---CCTAG G---5'

DpnI* Diplococcus pneumoniae

CH3

|5'GATC3'CTAG | CH3

CH3

|5'---GA TC---3'3'---CT AG---5' | CH3

HindIII Haemophilus influenzae5'AAGCTT3'TTCGAA

5'---A AGCTT---3'3'---TTCGA A---5'

TaqI Thermus aquaticus5'TCGA3'AGCT

5'---T CGA---3'3'---AGC T---5'

NotI Nocardia otitidis5'GCGGCCGC3'CGCCGGCG

5'---GC GGCCGC---3'3'---CGCCGG CG---5'

HinfI Haemophilus influenzae5'GANTC3'CTNAG

5'---G ANTC---3'3'---CTNA G---5'

Sau3A Staphylococcus aureus5'GATC3'CTAG

5'--- GATC---3'3'---CTAG ---3'

PovII* Proteus vulgaris5'CAGCTG3'GTCGAC

5'---CAG CTG---3'3'---GTC GAC---5'

SmaI* Serratia marcescens5'CCCGGG3'GGGCCC

5'---CCC GGG---3'3'---GGG CCC---5'

HaeIII* Haemophilus egytius5'GGCC3'CCGG

5'---GG CC---3'3'---CC GG---5'

AluI* Arthrobacter luteus5'AGCT3'TCGA

5'---AG CT---3'3'---TC GA---5'

EcoRV* Escherichia coli5'GATATC3'CTATAG

5'---GAT ATC---3'3'---CTA TAG---5'

KpnI[1] Klebsiella pneumonia5'GGTACC3'CCATGG

5'---GGTAC C---3'3'---C CATGG---5'

PstI[1] Providencia stuartii5'CTGCAG3'GACGTC

5'---CTGCA G---3'3'---G ACGTC---5'

SacI[1] Streptomyces achromogenes5'GAGCTC3'CTCGAG

5'---GAGCT C---3'3'---C TCGAG---5'

SalI[1] Streptomyces albue5'GTCGAC3'CAGCTG

5'---G TCGAC---3'3'---CAGCT G---5'

SphI[1] Streptomyces phaeochromogenes5'GCATGC3'CGTACG

5'---G CATGC---3'3'---CGTAC G---5'

XbaI[1] Xanthomonas badrii5'TCTAGA3'AGATCT

5'---T CTAGA---3'3'---AGATC T---5'

* = ADN queda con extremos romos

Uno de los campos en los que el uso de enzimas de restricción ha tenido mayor implicación ha sido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.

El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern para la detección de genes específicos en el ADN celular.El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas

Se muestra la dotación genética (azul) de un individuo homocigoto (A) y uno heterocigoto. (B) para un marcador; tras hibridarse con una sonda específica (rosa) se observa el resultado del Southern a la derecha.

El northern o northern blot, se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método northern sirve para identificar ARN.El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.

Hibridación in situUn desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico, utilizando técnicas inmunohistoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas.

También en esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ, donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma, con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un microscopio electrónico.

Resolving capacity of agarose gels with or without 50 % formamide.HpaII fragments of pBR322 DNA (0.8 μg) were electrophoretically separated on a 2 mn thick gel until the dye marker was within 4cm of the bottom of the gel and then stained with Et Br. The fragment lengths were obtained from sequence data.Lane 1: 2% agarose gellane 2: 2 % agarose-50% formamide gel1ane 3: 7% agarose-50% formamide gel