ENZIMAS

Tema 8

Br. Manuel PerdomoEstudiante de

Medicina

Universidad de Carabobo

Objetivos

n Analizar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente y compararla con una no catalizada.

n Interpretar el significado de KM, y Vmax

n Aplicar el concepto de KM y Vmax en la resolución de problemas.

n Interpretar la representación gráfica de

Lineweaver y Burk.

Contenido

n Relación matemática entre la velocidad de una reacción química y la concentración de sustrato, en reacciones catalizadas y no catalizadas enzimáticamente.

n Ordenes de reacción. Representación gráfica de la Velocidad

(inicial) vs concentración de sustraton Postulados de la teoría de Michaelis y Mentenn Reacciones de pseudo primer ordenn Representación gráfica de la ecuación de Michaelis y Menten.n Identificación de KM y Vmax en un gráfico de Vo vs [S]n Relación entre el valor de KM y la afinidad enzima-sustrato.

n Ejemplos de aplicación de los conceptos de KM y Vmax.n Representación gráfica de Lineweaver y Burk:

Utilidad de dicha gráfica.

¿Como funcionan las Enzimas?

lEstas proporcionan un ambiente específico dentro del cual

una reacción determinada es energéticamente más favorable

SITIO ACTIVO

SUSTRATO

ENZIMA

Quimotripsina unida a un sustrato

PRODUCTO

Factores que afectan la velocidad de una reacción enzimática

v Temperaturav pHv

Concentraciónv

de la Enzimadel Producto

v

Concentraciónv

del Sustratode o

ActivadoresBioquímica, Aspectos Estructurales y vías metabólicasMc Graw Hill, 1996

Introducción

La conversión:

S P

Se mide La Velocidadpara caracterizar a las Enzimas

VelocidadRevela la vía que siguen los reactivos

Indica el mecanismo de reacción

Cinética Enzimática

El enfoque central para estudiar el mecanismode una reacción catalizada por una enzima, consiste en medir la velocidad de la reacción y la forma en como ésta s e m od i f i c a en respuesta a cambios en los parámetros experimentales.

Cinética Enzimática

n Velocidad de una reacción: se define como la cantidad de materia inicial, sustrato, transformado, o como la cantidad de compuesto final, producto, formado, por unidad de tiempo.

¿Como se mide la velocidad?

Bajo Condiciones de laboratorio y en presencia de sustratos competidores o Inhibidores ENZIMAS

BUFFERSustrato

Inhibi dores

Deducción funciones Fisiológicas de los mecanismos reguladores de ENZIMAS

Espectrofotómetro

Conceptos

Ordenes de reacción

n El Orden de una reacción elemental: corresponde al número de moléculas que deben colisionar en forma simultánea para generar un producto

A temperatura constante, la Velocidad de una reacción elemental, es proporcional a la frecuencia con la que las moléculas que reaccionan se reúnen.

Ordenes de reacción

Reacción de primer orden: es unimolecularA P

V = k [A]1 La velocidad de la reacción en cualquier punto del tiempo es proporcional a la concentración de A

Reacción de segundo orden: es bimolecular

2A P A + B P

V = k [A]2 V = k [A]1. [B]1

El orden de una reacción es un término que se utiliza para definir ésta, en función de los factores que determinan su

velocidad.

Análisis matemático de una reacción catalizada por enzima

n Michaelis y Menten analizaron dicha rx

n La ecuación deduce a partir de un modelo de acción enzimática en donde:

E + S ES K2

K1

K1

E + Pn K1,k1 y k2: son las

constantes de velocidad

Postulados: Leonor Michaelis y MaudMentel, 1913

1. La enzima tiene un único sustrato.22.. ElEl ccoommplejoplejo EE-S-S ssee eennccuueentrantra eenn eesstadotado

eessttaacciioonnariarioo..33.. BBaajojo ccoonnddiicciioonneess dede ssatuaturraacciióón,n, ttodasodas

llasas mmoollééccuullasas ddee eennzziimmaa iinntteerrvviieenneenn eenn llaa foforrmmaacciióónn ddeell ccoommpplleejojo EE--SS..

44.. CCuuandoando totoddaa llaa eennzziimmaa ssee eennccuueentrantraeenn foforrmama ddeell ccoommpplleejojo EE--SS llaa vveellociociddadaddede llaa rreeaacccciióónn eses mmááxxiimma.a.

Estado Estacionario

Para un modelo simple:

E + S ES P

Donde Et = E + ES

Tomado de: Bioquímica Aspectos estructurales y vías metabólicas.Interamericana, McGraw Hill

Efecto de la concentración de sustrato, sobre la velocidadInicial de una reacción catalizada por una enzima

Leonor Michaelis y Maud Mentel, 1913

K1

E + S ESK1

Expresión algebraica de la curva

Ecuación de Michaelis-Menten

ES E + PVi =

Vma x[S]

KM + [S]

Donde E: enzima S: sustrato P: producto

ES: complejo Enzima + Sustrato

Vi: Velocidad inicialVmax: Velocidad máxima[S]: concentración de sustratoKM: constante de Michaelis

[ (K1 + K2) / K1]

n Representación gráfica de la ecuación

de Michaelis Menten

Se observa el efecto de la concentración de sustrato, sobrela velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima

Nelson y Cox, 2001

Km: Constante de Michaelis: Defi ne la afi nidad de la enzima por su sustr ato

Retomando Ordenes de reacción

La v es independiente de la concentración

de sustrato

Cinética de orden cero

Cinética de primer orden

Mathews y van Holde, 1998

Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial

De una reacción catalizada por una enzima

Tomado de: Bioquímica ilustrada. Harper

La dependencia de la velocidad de reacción y [s] y Km, puede ilustrarseal evaluar la ecuación de MM bajo 3 condiciones: ptos. a, b y c en la grafica

Análisis de la relación entre la velocidad de reaccióny [s] y Km

Punto a: la [s] << km

Vi es proporcional a la [s]Punto b: la [s] =

kmVi = Vmax / 2

Punto c: la [s] >> km

Vi = Vmax

Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción

La E1: Km pequeñaAlta afinidad

La E2: Km grande baja afinidad

Richard Harvey, Pamela Champe, 2006

TRANSFORMACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MMEN UNA ECUACIÓN LINEAL (y = mx + b)

Se invierte

Se factoriza

Se simplifica

Representación de Lineweaver Burk

(y = mx + b)

Pendiente

1 =

KM 1 +

1vo Vmax [S] Vmax

y = 1/Vo

x = 1/ [ s ]

b = 1/ Vmáx

m = Km/ Vmáx

(pendiente)

Nelson y Cox, 2001

Problemas:

Los datos de velocidad y [S] que se muestran a continuación fueron obtenidos paraLa reacción S P catalizada por la enzima E

Se desea conocer el valor de km de la enzima E por el sustrato S

Vmax [ S]v =

KM + [S]

Despeje: km

Km: 5x 105 M/L

[S] (mol/L)

V (microm/min)1,3 x 105 12

1,5 x 104 45

2,0 x 104 48

2,0 x 103 60

2,0 x 102 60

2,0 x 101 60

Tarea:

Los datos de velocidad y [S] que se muestran a continuación fueron obtenidos para La reacción S P catalizada por la enzima E

Se desea conocer el valor de km de la enzima E por el sustrato S

[S] (mol/L) 1/S

V (microm/min)

1/V

5,0 x 106 5,4

1,3 x 105 12,0

1,5 x 105 14,0

3,0 x105 22,8

5,0 x 105 30,0

1,0 x 104 40,0

2,0 x 104 48,0

4,0 x 104 53,3

1 =

KM 1 +

1Invertir los valoresBuscar una escala

vo Vmax [S] VmaxGraficarVer puntos de corte yCalcular Km y Vmax

n Solución…

Invertir valores:

1/s 1v

200000 0,185

76923

0,083

66667

0,071

33333

0,044

20000

0,033

10000

0,025

5000

0,021

2500

0,019

Graficar:

DOBLE RECIPROCO

0,250

0,200

0,150

m: 8 x 10 7 (pendiente)

b: 0,0165

0,100

0,050

200000 100000 100000 200000 300000

0,050

0,100

0,150

0,200

1/v

1/s

De la grafica se sacan algunos valores, para meterlos en las formulas

y = mx + b

1 =

KM 1 +

1 b = 1/ Vmáxvo Vmax [S]

y = 1/Vo

m = Km/ Vmáx

(pendiente)

x = 1/ [ s ]

b = 1/ Vmáx

Vmax Vmáx = 1/ b

m = Km/ VmáxKm = Vmáx x m

Resultado:

Km: 5 x 105Vmax: 62.5

Resumen

n La ecuación de Michaelis Menten, ilustra en términos matemáticos la relación entre la velocidad de reacción inicial yla concentración de sustrato.

n La transformación de dicha formula, en una ecuación de la recta, facilita la determinación

de los valores de Vmax y km para una enzima determinada.

Bibliografían Fundamentos de Bioquímica. VoetVoetPratt.

2ª edición 2007; Capitulo 12: Catálisis enzimática. Editorial medica Panamerica

n Bioquímica. Richard Harvey, Pamela Champe. 2006

n Bioquímica. Juan C. Díaz Zagoya y Marco Antonio Júarez Oropeza.1era edición. 2007. Editorial Mc Graw Hill.

n Bioquímica. Mathews. 3era edición. 2005. Capitulo 11: Enzimas:catalizadores Biológicos. Editorial Pearson.

n Lehninger Principios de Bioquímica. Nelson y Cox. 4ta edición.Ediciones OMEGA

n Bioquímica, Aspectos Estructurales y vías metabólicas. Editorial McGraw Hill. 1996.

n Seminario Enzimas (2008, 2009)n Bioquimica Ilustrada. Harper. 28ª Edición. Capitulo: Enzimas:

Cinética. 2010