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EnzimologEnzimologíía Cla Clíínicanica(Tema 17)

1. Los enzimas como catalizadores.1. Los enzimas como catalizadores.• Estructura y naturaleza de los enzimas• Comportamiento cinético de los enzimas

2.2.-- Medida de la actividad enzimMedida de la actividad enzimáática.tica.• Fundamento.• Factores que modifican la actividad enzimática.• Medida de la actividad enzimática de muestras clínicas• Instrumentación. Optimización de las condiciones de medida.• Sistemas acoplados.

3.3.-- Los enzimas como marcadores de lesiLos enzimas como marcadores de lesióón tisular.n tisular.• Enzimas como marcadores de daño celular• Distribución tisular de los enzimas• Patrón isoenzimático.

4.4.-- Enzimas sEnzimas sééricos de importancia diagnricos de importancia diagnóóstica clstica clíínica.nica.• Transaminasas (ALT, AST)• α−Amilasa• Creatín fosfoquinasa (CPK)• Fosfatasa ácida (ACP)• Fosfatasa alcalina (ALP)• Gama glutamil transpeptidasa (GGT)• Láctico deshidrogenasa (LDH)• 5’-nucleotidasa (NTP)

EnzimologEnzimologíía Cla Clíínica.Tnica.T--1717

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1.1. Los enzimas como catalizadores.Los enzimas como catalizadores.• Naturaleza proteica de los enzimas

El que una reacción discurra más o menos aprisa está en función no solo del estado energético de los compuestos antes y después sino también del propio mecanismo de la reacción.

Durante el curso de la reacción es necesaria la formación de intermedios reactivos cuyo nivel energético es superior a la energía media de las moléculas de los reactivos, lo que en la práctica hace que la formación de esos intermediarios suponga una barrera energética que impide que la reacción avance.

Cuanto mayor es el nivel energético de los intermedios reactivos tanto menor es la velocidad.

1.1. Los enzimas como catalizadores.Los enzimas como catalizadores.

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S → P

Δ [S]

Δ [P]

Δ T

Δ T

La velocidad de una reacción (S → P) se define como:

v= -d[S]/dt = d[P]/dt

1.2 Velocidad de una reacci1.2 Velocidad de una reaccióónn

1.3 El Comportamiento cin1.3 El Comportamiento cinéético de las tico de las reacciones catalizadas por enzimasreacciones catalizadas por enzimas

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La velocidad de una reacción catalizada por un enzima con cinética enzimática michaelianaes proporcional a la concentración de substrato, pero es saturable y alcanza un máximo.

1.4 Velocidad de una reacci1.4 Velocidad de una reaccióón catalizada por un enzima. n catalizada por un enzima.

Reacción no enzimática

• Actividad de un enzima: moles transformados por unidad de tiempo. Se expresa en Unidades Internacionales (μmoles transformados/seg).

• Actividad específica de un enzima: actividad enzimática por masa de enzima (μmoles/seg/mg proteína)

• Concentración: cantidad de enzima por unidad de volumen, o en su defecto cantidad de actividad enzimática por unidad de volumen

““ActividadActividad““ yy ““cantidadcantidad”” de un enzima en una muestra.de un enzima en una muestra.

En bioquímica clínica se recurre a expresar la cantidad de enzima de una muestra en forma de Unidades de actividad enzimUnidades de actividad enzimáática tica por mlpor ml..

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• Fundamento.

• Optimización de las condiciones de medida.

• Medida de la actividad enzimática de muestras clínicas

• Instrumentación.

• Sistemas acoplados

2.2.-- La medida de la La medida de la cantidadcantidad de un enzima en una muestra.de un enzima en una muestra.

2.1 Medida de la 2.1 Medida de la ““cantidadcantidad”” de enzima presente en una muestra:de enzima presente en una muestra:

Medida de la cantidad de enzima (proteína) presente en la muestra. Se utilizan métodos inmunológicos

Medida de la actividad catalítica correspondiente al enzima presente en la muestra. Se utilizan métodos espectrofotométricos

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2.1 Medida de la actividad enzim2.1 Medida de la actividad enzimáática.tica.

La velocidad de una reacción se puede expresar bien como moles de substrato consumidos, o bien como moles de producto formado por unidad de tiempo:

v= Δ [S]/ Δ T = Δ [P]/Δ T

La formación de producto o desaparición del compuesto de partida puede monitorizarse espectrofotométricamente midiendo cambios en la absorción óptica de la solución que contiene los substratos y el enzima

S → P

Δ [S]

Δ [P]

Δ T

Δ T

ColorTiempo

1 Unidad de actividad 1 Unidad de actividad enzimenzimááticatica se define como aquella cantidad de enzima capaz de transformar 1 1 μμmol de mol de substrato por minutosubstrato por minuto.

Las condiciones experimentales para la medida de la actividad enzimática deben ser tales que el grado de conversión de substratos sea pequeño en términos relativos, de manera que su concentración global apenas cambie.

Si la concentración de substrato está por encima de la Km (> 5x), el enzima estaráactuando a su velocidad máxima; aun habiéndose consumido una fracción del substrato, la velocidad de reacción del enzimeverá muy poco afectada.

Si las condiciones de velocidad máxima de la reacción se mantienen durante la duración del ensayo, existirá una relación lineal entre la velocidad de reacción y la actividad enzimática.

2.2 Medida de la actividad enzim2.2 Medida de la actividad enzimáática...tica...

Si [S] >> KM

V ≈ Vmax

Δ V ≈ 0

Si [S]= constante

V ≈ cte.

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2.3 Medida de la actividad enzim2.3 Medida de la actividad enzimáática de muestras bioltica de muestras biolóógicas.gicas.Por ejemplo, la actividad LDH se mide mediante la reacción:

Piruvato + NADH → Lactato + NAD+

Cada mol de piruvato que es convertido en lactato consume un mol de NADPH, que se transforma en NAD+, por lo que la velocidad de la reacción es equivalente a la velocidad de formación de lactato, de NAD+

o a la desaparición de piruvato o de NADPH

S → P

Δ [S]

Δ [P]

Δ T

Δ T

El NADH absorbe luz de 340 nm, cosa que el NAD+ no hace. La absorbancia a 340 nm es proporcional a la concentración de NADH (Ley de Beer), y cambios en la absorbancia a 340 nm se corresponde a cambios en la concentración de NADH.

NAD(P)HNAD(P)H

NAD(P)NAD(P)++

Abs

orba

ncia Absorbancia = ε x concentración x

recorrido óptico de la luz

A A ∝∝ concentraciconcentracióón n (molar)

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A medida que avanza la reacción y el piruvato se convierte en lactato, hay un consumo de NADPH, y como consecuencia de ello una disminución en la absorbancia a 340. La velocidad de la reacción se mide por la variación de la absorbancia con el tiempo con un espectrofotómetro.

Abs

orba

ncia

a 3

40 n

m

Tiempo

Δ Absorbancia 340 nm

Moles consumidos de NAD(PH)/seg

actividad enzimática

En primer lugar se preparan los reactivos y se mezclan en una cubeta de espectrofotómetro, de manera que las concentraciones de los substratos (Piruvato y NADH) estén por encima de sus respectivos KM.El enzima se añade al añadir la muestra de suero.Se mide entonces la velocidad de reacción como moles consumidos de NADPH por minuto.Se expresa este valor en Unidades de Actividad Enzimática (IU)Se refiere dichas unidades al volumen que se había añadido de sueroSe expresa el resultado final como Unidades de actividad enzimUnidades de actividad enzimáática tica por ml de suero.por ml de suero.

2.3 Medida de la actividad 2.3 Medida de la actividad enzimenzimááticatica de muestras biolde muestras biolóógicas.gicas.

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3.3.-- Los enzimas como marcadores de lesiLos enzimas como marcadores de lesióón tisular (I)n tisular (I)

3.1 Caracter3.1 Caracteríísticas de los enzimas utilizados como marcadores:sticas de los enzimas utilizados como marcadores:

• Los enzimas que se utilizan en el diagnóstico son enzimas intracelulares, cuya concentración en plasma es muy baja.

• Su relación concentración plasma/concentración tejidos es < 1:1000

• La presencia de niveles elevados de enzimas en el suero implica que ha habido lesión (muerte?) celular lo que permite la salida a la circulación de enzimas normalmente confinados en el interior de las células.

• La cantidad de actividad enzimática medible depende de su liberación al medio, de la estabilidad del enzima, de su velocidad de eliminación.

• Se trata de enzimas (o isoenzimas) que se expresan mayoritariamente en un determinado tejido, pudiendo servir de marcador tisular específico.

3 Los enzimas como marcadores de lesi3 Los enzimas como marcadores de lesióón tisular (II)n tisular (II)

¿¿por qupor quéé aumenta su nivel en plasma...?:aumenta su nivel en plasma...?:

• Necrosis de los tejidos

• Aumento del catabolismo celular (reparación tisular, cáncer)

• Aumento concentración intracelular (inducción)

• Obstrucción en la salida exocrina (α-amilasa)

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3 Los enzimas como marcadores de lesi3 Los enzimas como marcadores de lesióón tisular (III)n tisular (III)

3.2 Distribuci3.2 Distribucióón tisular de la actividad n tisular de la actividad enzimenzimááticatica de enzimas de enzimas con significacicon significacióón cln clíínicanica

TransaminasasTransaminasas en distintos tejidosen distintos tejidos

0102030405060

Hígado Corazón Músculo Cerebro Riñón Páncreas Pulmón Hematíes

Uni

dade

s/g

AST/GOT

ALT/GPT

AST: mitocondria y citosolALT: citosólica

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Actividad tisular Actividad tisular fosfatasafosfatasa áácidacida

0

200

400

600

800

1000

1200

Próstata Riñón Páncreas

Uni

dade

s/g

FosfatasaFosfatasa alcalina en tejidosalcalina en tejidos

Hueso

Hígado

Próstata

Duodeno

Riñón

0

10

20

30

40

50

60

Uni

dade

s/g

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CreatCreatíínn fosfoquinasafosfoquinasa en tejidosen tejidos

Cerebro

Miocardio

M. liso Riñón Hígado

M.esquel.

0

500

1000

1500

2000

2500

Uni

dade

s/g

LLááctico ctico deshidrogenasadeshidrogenasa en tejidosen tejidos

HígadoMiocardio

Ganglios

PáncreasEritrocitos

Pulmón

M. esquel

Riñón

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Uni

dade

s/g

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3.3.-- Los enzimas como marcadores de lesiLos enzimas como marcadores de lesióón tisular (IV)n tisular (IV)

3.3 Patr3.3 Patróón n isoenzimisoenzimááticotico de algunos enzimas con significacide algunos enzimas con significacióón cln clíínicanica

Estructura de la CPK y sus Estructura de la CPK y sus isoenzimasisoenzimas::

CPKCPK11 = bb22

CerebroCPKCPK22 = mmbb

corazónCPKCPK33 = mm22

m. esquelético

++--

112233

Muestra suero

La CPK está constituida por dos subunidades. Existen dos tipos de subunidades. diferentes, lo que explica la existencia de tres isoformas son distintas. En los los tejidos está presente una isoforma distinta.

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Estructura de LDH y sus Estructura de LDH y sus isoenzimasisoenzimas::

++--

1122334455

La LDH está constituida por cuatros subunidades. Existen dos tipos de subunidades. diferentes, lo que explica la existencia de 5 isoformas son distintas que poseen una movilidad electroforéticadiferente que permite distinguirlas. En los lostejidos está presente una isoforma distinta.

LDHLDH55 = ββ44

LDHLDH11 = αα44

LDHLDH22 = αα33ββ11

LDHLDH33 = αα22ββ22

LDHLDH44 = αα11ββ33

DistribuciDistribucióón de los n de los isoenzimasisoenzimas de de lláácticoctico deshidrogenasadeshidrogenasa en tejidosen tejidos

(1) α4

(2) α3β

(3) α2β

2

(4) αβ3

(5) β4

Híg

ado

Mio

card

io

Eritr

ocito

s

M. e

sque

l

Riño

n

Pánc

reas

Pulm

ón

0

50

100

150

200

Uni

dade

s/g

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Patrón isoenzimático de la LDH de suero en infarto de miocardio y en hepatitis aguda

3.3.-- Los enzimas como marcadores de lesiLos enzimas como marcadores de lesióón tisular (II)n tisular (II)

Magnitud del daMagnitud del dañño celularo celular

• Citoplasmático: LDH, ALT, CPK, AP

• Organelas (mitocondrial, microsomal): AST, γGT, 5’ nucleotidasa

Alteraciones inespecAlteraciones inespecííficas de enzimas sficas de enzimas sééricos.ricos.• Factores dependientes de la edad y sexo

• Factores atribuibles a la conservación de las muestras

LocalizaciLocalizacióón del dan del dañño celularo celular

• Muy pocos enzimas son específicos de un solo tejidos. Alternativas:•medida de más de un enzima (p. ej. “perfil hepático”)

•isoenzimas

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4.4.-- Enzimas sEnzimas sééricos de importancia diagnricos de importancia diagnóóstica clstica clíínica (I).nica (I).

•Aspartato aminotransferasa (AST/GOT)

•Valores normales: < 40U/ml

•Aumento importante: Infarto e miocardio, hepatitis, traumatismos

•Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, hemólisis

•Alanina aminotransferasa (ALT/GPT)

•Valores normales: < 50 U/ml

•Aumento importante: Shock, hepatitis

•Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia,

• α-amilasa• Valores normales: <50U/ml

•Aumento importante: pancreatitis aguda y crónica, cáncer de páncreas.

•Aumento moderado: parotiditis, algunos carcinomas, procesos parapancreáticos(gastritis, úlcera duodenal, peritonitis, obstrucción intestinal.

4.4.-- Enzimas sEnzimas sééricos de importancia diagnricos de importancia diagnóóstica clstica clíínica (II).nica (II).

•Creatín fosfoquinasa (CPK)•Valores normales: < 160U/ml en varones y <130U/ml en mujeres

•Aumento importante: Infarto de miocardio (isoenzima CPK-1)

•Aumento moderado: miopatías, distrofia muscular, accidente cerebro-vascular

•Fosfatasa ácida (ACP)• Valores normales: < 2 U/ml

• Aumento importante: hipertrofia o cáncer de próstata (isoenzima prostático), hiperparatiroidismo, Hodkin, enf. Paget

• Aumento moderado: enf. Gaucher, insuficiencia renal aguda, hepatitis, ictericia obstructiva

• Fosfatasa alcalina (ALP)• Valores normales: 85-190U/ml en el adulto. Hasta 500U/ml en niños en desarrollo

• Aumento importante: ictericia obstructiva, colelitiasis, neoplasia de vías biliares, cirrosis, hepatomas

• Aumento moderado: neoplasias óseas osteogénicas, osteomalacia, enf. Paget, hiperparatiroidismo

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4.4.-- Enzimas sEnzimas sééricos de importancia diagnricos de importancia diagnóóstica clstica clíínica (III).nica (III).

• Gamaglutamil transpeptidasa (GGT)•Valores normales: < 35U/ml en varones y <25U/ml en mujeres

•Aumento importante: Hepatitis vírica, obstrucción biliar, metástasis hepáticas, enf. alcohólica

•Aumento moderado: infecciones que afectan al hígado (citomegalovirus, mononucleosis infecciosa)

•Láctico deshidrogenasa (LDH)• Valores normales: < 120-230 U/ml

• Aumento importante: infarto de miocardio (LDH1), hepatitis víricas (LDH4, LDH5)

• Aumento moderado: hemólisis, accidente cerebro-vascular, distrofia muscular

• 5´ nucleotidasa (NTP)• Valores normales: <9U/ml en el adulto.

• Aumento importante: colestasis intra o extrahepática, enfermedades hepatobiliares, cáncer hepático

• Aumento moderado:

Enzimas sEnzimas sééricos en la enfermedad ricos en la enfermedad cardiacacardiaca

• Creatín fosfoquinasa (CPK) < 160 U/L (Isoenzima “mb”)• Láctico deshidrogenasa (LDH) < 120-230 U/L; isoenzima 1

(15-25%).• Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L

Tras el infarto, hay una liberación de proteínas intracelulares de las células dañadas. La primera en ser detectada es la troponina (5-10 h post infarto), seguida de la CK-MB (pico a 1 día), y finalmente la LDH, cuyo máximo se alcnzaden los 2-3 días post infarto

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Enzimas sEnzimas sééricos en la enfermedad hepricos en la enfermedad hepááticatica

• Alanina aminotransferasa (ALT; GPT) < 50 U/L• Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L• Lactato deshidrogenasa < 90 U/L (isoenzima 5)• γ glutamil transpeptidasa (GGT) < 50 U/L• Fosfatasa alcalina < 70 U/L• Fosfatasa ácida < 0.6 U/L• 5’ nucleotidasa < 5 U/L