Mara Jos Gonzlez

Gabriel Lassabe

Santiago Mansilla

Es una hormona glucoproteica estimuladora de la produccin de eritrocitos, por tanto es de valor en el tratamiento de la anemia en casos de insuficiencia renal crnica

Consiste de 166 amino cidos, con 3 potenciales sitios de N-glicosilacin y 1 de O-glicosilacin

40% de su peso son carbohidratos

Clonado a partir de clulas de rin humanas

Eritropoyetina Humana (HuEPO)

Prohibido su uso como mtodo de dopaje en actividades deportivas.

Aumenta rendimiento fsico.

Eritropoyetina Humana (HuEPO)

Lance Armstrong: se le retiraron siete ttulos del Tour de France por uso de productos dopantes, entre los cuales se encontraba el EPO

Rol de las glicosilaciones: Role of antennary structure of N-linked sugar chains in renal handling of recombinant human erythropoietin T Misaizu, S Matsuki, TW Strickland, M Takeuchi, A Kobata, and S Takasaki, December 1, 1995; Blood: 86 (11)

Se sugiere que las cadenas glucdicas poseen un rol importante en el mantenimiento de las concentraciones altas en plasma, lo que garantiza su efectiva transferencia a los rganos y la estimulacin de clulas progenitoras

Eritropoyetina Humana (HuEPO)

Actualmente la rHuEPO es producida por clulas de ovarios de hamsters chinos, lo cual resulta costoso y poco eficiente

Se ha intentado expresar en procariotas, pero carecen de las glicosilaciones necesarias, mientras que al expresarlo en levaduras es hiperglicosilada.

Eritropoyetina Humana (HuEPO)

Hongo filamentoso del phylum ascomycota

Utilizado industrialmente para la produccin de enzimas hidrolticas (aprox. 40 g/L)

Emplea modificaciones postraduccionales similares a las de los mamferos

Trichoderma reesei

En estudios anteriores de los mismos autores, se generaron promotores optimizados del gen de la cellobiohydrolase 1 (cbh1).

Tambin se haba obtenido una cepa (T108) que posee el gen de la n-acetylglucosaminyl transferase, para sintetizar n-glicanos como los de los mamferos.

Trichoderma reesei

Materiales y mtodos

T. reesei RutC-30 M3- cepa carente de proteasas (26% con respecto a la normal)

T. reesei T108, cepa RutC-30M3 con gen humano N-acetil glucosaminyl transferasa I

E. coli DH5, cepa para construccin y propagacin de vectores

Cepas T. reesei utilizadas para la expresin heterloga del gen HuEPO

Construccin del vector para la expresin de HuEPO en T. reesei

Amp r= resistencia ampicilina Ori= Origen de replicacin del plsmido Epo= gen Erytropoyetina Humana Pcbh1= Promotor de gen cellobiohydrolasa I (cbh) inducible por lactosa y celulosa. Incluye secuencia seal para exportacin Tcbh1= secuencia de finalizacin de transcripcin correspondiente al gen cbh HindIII, BcoRI, XhoI= sitios de restriccin

Primers diseados para las construcciones

Primers CSP para amplificacin de secuencia seal cbh 1 con sitio XhoI al extremo 5` (51 pb)

Xh

oI

SScbh 51 pb

PCR 1

Primers diseados para las construcciones

Primers EPO para amplificacin de secuencia epo a partir de cDNA (501 pb)

PCR 2

SScbh epo gen 501 pb

PCR 1 PCR 2 X

ho

I

SScbh 51 pb SScbh epo gen 501 pb

PCR 3

epo gen 501 pb

Xh

oI

SScbh 51 pb

Primers diseados para las construcciones

Primers TCT para amplificacin de secuencia terminadora cbh 1 con sitio EcoRI en 3` (790 pb)

PCR 4

Terminador cbh (790 pb) epo gen

Eco

RI

PCR 1 PCR 2

PCR 4

PCR 3

Xh

oI

SScbh 51 pb SScbh epo gen 501 pb

epo gen 501 pb

Xh

oI

SScbh 51 pb Terminador cbh (790 pb) epo gen

Eco

RI

PCR 5

epo gen 501 pb

Xh

oI

SScbh 51 pb Terminador cbh (790 pb)

Eco

RI

Transformacin del vector en E. coli para conservacin y amplificacin del vector

Secuenciacin para confirmar casette en vector de expresin

Mtodo de transformacin en protoplastos de T. reesei

Los protoplastos son extrados de las hifas miceliares a partir de degradacin de las paredes mediante el uso de enzimas

Co-transformacin en protoplastos de T. reesei

Resistencia a hygromycina

Transformacin de protoplastos en CaCl2 y PEG Transformantes fueron plaqueadas en medio mnimo con hygromycina, crecimiento a 28C durante 5 das Micelios aislados fueron sometidos a 2 y 3 rondas de seleccin Clones estables con el gen incorporado en su ADNg se dejan esporular en placas de dextrosa de papa para conservar

Extraccin de ADN

Extraccin de ADN fenol/cloroformo a partir de medio de cultivo lquido

Anlisis moleculares de los clones recombinantes

PCR del gen Hu-epo (primers EPOf y EPOr) y del gen Hu-epo con secuencia seal (primers CSPf y EPOr). Corrida en gel de agarosa para evaluar los productos

DOT BLOT. Hibridacin del producto de PCR (marcado con DIG) con el gen HuEPO en el ADNg del hongo.

Anlisis de la expresin gnica

Induccin de la expresin de HuEPO en medio lquido con el inductor Lactosa

Evaluacin de los transcriptos mediante RT-PCR Extraccin de ARN rompiendo micelios por congelado y descongelado Retro-transcripcion con TR realizada con primer reverse EPOr y 1ug de ARN molde. Amplificacin de cDNA mediante PCR con fEPO y rEPO Corrida en geles de agarosa

Evaluacin de protenas mediante SDS-PAGE y western Blot Los sobrenadantes de cultivo fueron concentrados y se analiz la presencia de la protena de inters en una electroforsis desnaturalizante (SDS-PAGE) y tincin con Coomassie Por otro lado los geles fueron transferidos membrana nitrocelulosa para realizar Western Blot utilizando suero policlonal especifico para la HuEPO

Cuantificacin proteica por mtodo de Bradford

Luego de la transformacin , se confirm la insercin del cassette de expresin en el cromosoma de T. reesei mediante PCR.

Se trabaj con las cepas recombinantes T47 y T112.

Amplificacin del gen epo con primers EPO-F/EPO-R

Amplificacin del fragmento fusionado: Secuencia seal cbh1 y gen epo con primers CSP-F/ EPO-R

Resultados y discusin

Resultados y discusin

P, vector pTrCBH-EPO N, T. reesei wt 1, Amplificacin gen epo de T47 2, Amplificacin gen epo de T112 3, Amplificacin regin de fusin de T47 4, Amplificacin regin de fusin de T112 M, marcador de peso molecular

Ensayo de dot blot de ADN, en bsqueda de gen epo.

Se marca la sonda con DIG.

Resultados y discusin

P, vector pTrCBH-EPO 1, Seal de hibridacin de RutC-30 M3 2, Seal de hibridacin de T47 3, Seal de hibridacin de T108 4, Seal de hibridacin de T112

Deteccin de la expresin de HuEPO en T. reesei mediante RT-PCR

Resultados y discusin

1, transformante T47 2, T. reesei RutC-30 M3 3, transformante T112 4, T. reesei T108 M, Marcador de peso molecular.

Secrecin de rHuEPO en diferentes cepas de T. reesei

SDS-PAGE de los sobrenadantes de los cultivos inducidos por lactosa.

Mximo nivel de expresin a las 48hs.

El nivel de expresin alcanz aprox. 97 mg/L para T47 y 46 mg/L para T112.

Posterior confirmacin por western blot.

Resultados y discusin

Resultados y discusin

M, marcador de peso molecular de protenas en kDa 1, protenas extracelulares de T47 sin inducir 2, protenas extracelulares de RutC-30 M3 inducido 3, protenas extracelulares de T47 inducido 4, protenas extracelulares de T108 inducido 5, protenas extracelulares de T112 inducido

Diferencias en el tamao de las protenas heterologas

rHuEPO en T47 es de aprox. 28 kDa y en T112 es de 32kD.

Esto indicara una diferencia en la glicosilacin de las protenas en cada cepa

Resultados y discusin

1 y 2, protenas extracelulares de RutC-30 M3 y T47 inducidos 3 y 4, protenas extracelulares de T108 y T112 inducidos

Tratamiento con N-glicosidasa F (PNGasa F) reduce la masa molecular de rHuEPO a 20 kDa en ambos transformantes T47 y T112.

Resultados y discusin

La PNGasa F hidroliza el enlace N-glicosidico entre GlcNAc y la Asn.

El nuevo promotor cbh1 mejor el nivel de expresin de genes heterlogos en trabajos previos.

El principal problema en la secrecin de protenas heterlogas es el clivaje para liberar al medio a la protena deseada.

La solucin encontrada fue la fusin del pptido seal CBH1 para la correcta secrecin de la molcula.

Resultados y discusin

Utilidad de cepas con una actividad proteoltica reducida.

rHuEPO en cepas de T. reesei T47 con una deficiencia en proteasas, se encontr una cantidad mayor de la protena en el sobrenadante.

Por lo tanto se logr aumentar la produccin de rHuEPO (46 a 97 mg/L) que la producida en otros huspedes no mamferos.

Resultados y discusin

Muchos hongos filamentosos pueden sintetizar cadenas cortas de N-glicanos y O-glicanos similares a las de mamferos.

HuEPO contiene 3 complejos de N-glicanos y uno de O-glicanos, que representan el 40% de la masa total de la protena (32~39 kDa)

En este trabajo se encontr dos posibles estrategias de modificacin postraduccional, que genera dos protenas con distinto tamao dependiendo de la cepa.

Resultados y discusin

Se aument el nivel de rHuEPO expresada en las dos cepas transformadas estudiadas.

Se logr la optimizacin del sistema de expresin, siendo importante el pptido seal para la correcta secrecin de la protena.

Se demostr el potencial de T. reesei como una plataforma alternativa para la expresin extracelular de glicoprotenas humanas recombinantes.

Conclusiones

GRACIAS!