Escalamiento de un bioproceso para la producción de Taq Pol
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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA Escalamiento de un Bioprocesos para la producción de Taq polimerasa QUE PARA OTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO. PRESENA: Edgar Olivares Barrios México, D.F. Junio 2009 Director de proyecto: Dr. Claudio Garibay
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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
Escalamiento de un Bioprocesos para la producción de Taq polimerasa
QUE PARA OTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO.
PRESENA: Edgar Olivares Barrios
México, D.F. Junio 2009
Director de proyecto: Dr. Claudio Garibay
Contenido
1.-INTRODUCCIÓN 2
2.-ANTECEDENTES 3
2.1.- ESCALAMIENTO DE BIORREACTORES 3
2.2.-CRITERIOS DE TRASLACIÓN ENTRE DOS ESCALAS DE OPERACIÓN. 5
2.3.-PRINCIPIO DE SIMILITUD. 6
2.4.- MÉTODOS DE ESCALAMIENTO. 7
2.5.- KLA CONSTANTE. 8
2.6.- NÚMEROS A DIMENSIONALES 11
2.7.-SISTEMAS GASEADOS NEWTONIANOS. 16
2.8.- TRANSFERENCIA DE OXIGENO AL MEDIO POR LA AGITACIÓN DENTRO DE UN MATRAZ. 18
3.-JUSTIFICACIÓN. 19
4.-OBJETIVO GENERAL 19
5.-OBJETIVOS PARTICULARES 19
6.-METODOLOGÍA 19
7.- RESULTADOS 22
8.-ANÁLISIS DE RESULTADOS. 31
9.-CONCLUSIONES 32
11.-ANEXOS 37
Índice de tablas.
Tabla 1 Precios de venta de Taq polimerasa 2008 .................................................................................... 3
Tabla 2 Ecuaciones de correlación para estimar el KLA.(Ordaz 2006) .................................................. 9
Tabla 3 Valor de los exponentes de la ecuación 11 en función del volumen de operación de los
biorreactores (Ordaz 2006) ......................................................................................................................... 10
Tabla 4 Preparación del gel separador. .................................................................................................... 20
Tabla 5 Preparación del gel concentrador. ................................................................................................ 20
Tabla 6 Reacción de Taq polimerasa PCR. .............................................................................................. 21
Tabla 7Parámetro del matraz ....................................................................................................................... 26
Tabla 8 Biomasa seca obtenida de la cinética en matraz. ..................................................................... 27
Tabla 9 Sustrato residual en matraz. ......................................................................................................... 28
Tabla 10 Parámetros que se pueden usar en el biorreactor. .................................................................. 30
Índice de figuras
Figura 1.-Cinética de la inducción de Taq polimerasa en matraz…………………………….………………..23
Figura 2.- Cinética de la inducción de Taq polimerasa en matraz…………………………...…………………..23
Figura 3.- Cinética de inducción de Taq polimerasa en matraz…………………………………………….……24
Figura 4.- Reacción en cadena de polimerasa con extracto de fermentación y polimerasa comercial…...…25
Figura 5.- Biomasa seca obtenida en el matraz…………………………………………………………………..27
Figura 6.- Sustrato residual en matraz…………………………………………………………………………..….29
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2
1.-Introducción La importancia de la enzima Taq polimerasa, radica en todas las tecnicas en las cuales es
usada esta, asi como en la reduccion de tiempo para poder obtener un fragmento de DNA
invitro en alta concentración en un tiempo razonable. A esta tecnica se le conoce como
PCR o tecnica de la reacción en cadena de la polimerasa, junto con sus variantes (Perez
2008).
Sus vastas aplicaciones dieron lugar a un avance vertical en el área de las ciencias
biológicas. Dentro de algunas de las aplicaciones de la PCR se encuentran el diagnóstico
molecular de enfermedades genéticas humanas, de infecciones virales y bacterianas, en
estudios de evolución molecular, clonación y expresión de genes, identificación de
individuos, etc (Perez 2008).
La PCR es una reacción de varios ciclos en cadena, donde cada ciclo se compone de
tres etapas que son: (a) desnaturalización del DNA, (b) hibridación de oligonucleótidos y
(c) síntesis de DNA. En el primer paso se separan las cadenas de DNA a temperaturas de
aproximadamente 94 °C, esto permite que en el segundo paso se hibriden los
oligonucleótidos a la región de DNA que se desea amplificar y, finalmente, en el tercer
paso la enzima Taq DNA polimerasa lleva a cabo la síntesis de DNA a una temperatura
de 72 °C. Estos tres pasos se repiten un promedio de 30 veces. Es decir, que durante
cada ciclo los componentes de la reacción pasan por temperaturas muy elevadas a las
cuales se inactivan la mayoría de las enzimas. Originalmente el procedimiento del PCR se
estableció usando la DNA polimerasa I de Escherichia coli. 1 Esta enzima no es resistente
a las temperaturas usadas en la desnaturalización del DNA y por ende se adicionaba
nueva enzima después del primer paso en cada ciclo de reacción. Este problema se
resolvió al sustituir la DNA polimerasa I de Escherichia coli por una enzima termoestable
que no perdía su actividad a dichas temperaturas. Esta enzima es la Taq DNA polimerasa
producida por la bacteria termófila Thermus aquaticus. La Taq DNA polimerasa simplificó
en gran medida la reacción de PCR al prescindir de adicionar enzima en cada uno de los
30 ciclos que se repite la reacción (Perez 2008)
En México se tienen diferentes compañias que brindan este tipo de enzimas para uso
especifico de las diferentes tecnicas de PCR y con diferentes caracteristicas, según se
requiera, así como el numero de unidades que se requieran siendo estos los parametros
3
de ajuste de precios; siendo asi lo que se busco en este trabajo es producir Taq
polimerasa, que sea util en un principio para la tecnica de PCR simple (Perez 2008)
Haciendo una comparación con los precios de tres grandes compañias que venden Taq
polimerasa estandar para PCR a diferentes concentraciones con el propocito de ver los
beneficios economicos que conllevaria el hecho de producir esta en la Unidad Profesional
Interdisciplinaria de Biotecnologia (UPIBI).
Tabla 1 Precios de venta de Taq polimerasa 2008
2.-Antecedentes
2.1.- Escalamiento de Biorreactores
La evolución normal de todo proceso biotecnológico (desde su concepción hasta la
operación a escala comercial del mismo) tiende a seguir las siguientes escalas o niveles
de operación: nivel laboratorio, nivel semipiloto o piloto y nivel de producción. En el nivel
de laboratorio se pretende demostrar o alcanzar la factibilidad técnica del proceso; el nivel
piloto o semipiloto tiene como finalidad reafirmar la factibilidad técnica y visualizar la
factibilidad económica del mismo y por último, el nivel de producción tiene como objetivo
la comercialización redituable de dicho proceso(Reisman 1993).
Escalamiento es el conjunto de metodologías y técnicas complejas empleadas para
transferir a escala de producción, un proceso de fermentación desarrollado a escala de
laboratorio o planta piloto.
Unidades de Taq polimerasa Empresa Precio en pesos mexicanos
500 Bioron 1232
2500 Bioron 5000
10000 Bioron 19000
100 Roche 512
250 Roche 1008
500 Roche 1760
1000 Roche 3136
100 fermentas 752
4
Todas las etapas que conforman dicho bioproceso (preparación del inoculó o semilla,
preparación y esterilización de las materias primas, fermentación, recuperación y
purificación del producto, etc.), deben ser escalados, no obstante, el presente trabajo solo
tratará exclusivamente con el traslado de datos cinéticos obtenidos en una escala menor
a una mayor.
En un amplio sentido, el escalamiento. se refiere al estudio y explotación de los efectos de
la escala sobre los parámetros de fermentación, tanto físicos como biológicos. Por lo
tanto, se desprende que el objetivo debe ser el de mantener o prever en el nivel industrial,
las características de producción del sistema biológico o bioproceso obtenidas a, nivel
laboratorio o planta piloto y puesto que es en el biorreactor en donde se efectúan las
biotransformaciones, su escalamiento y diseño eficiente, es papel fundamental (Reisman
1993).
Los procesos que tienen como base el crecimiento de un cierto grupo de microorganismos
o de células en suspensión en un fermentador. para el desarrollo del producto, presentan
distintos tipos de problemas al trasladar el proceso de una escala a otra. Algunos factores
permanecen inalterables, mientras que otros son muy susceptibles a la escala en la que
se llevan a cabo. Los factores químicos (concentración de nutrientes, actividad acuosa,
etc.) son, por lo general, mucho menos sensibles a la escala que los factores físicos
(transferencia de masa y de calor, calidad de mezclado, consumos de potencia, etc.)
(Reisman 1993).
Los procesos de transporte (calor, masa y momento) se ven afectados fuertemente por la
escala., estos cambios en las velocidades de transporte constituyen uno de los mayores
problemas en el escalamiento. Existen mayores dificultades en el escalamiento de
procesos aeróbicos que de los anaeróbicos y mayores en sistemas de cultivo continuo y
alimentado que en el del cultivo por lote (Reisman 1993).
La escala, al afectar los procesos de transporte, modifica substancialmente el ambiente
en el que se desarrollan los microorganismos con consecuencias importantes en el
comportamiento de los mismos (los rendimientos y productividades del sistema
microbiano generalmente disminuyen al escalar un proceso) (Reisman 1993). A escala
pequeña, sistema que se acerca mucho al estado ideal de "mezclado perfecto", los
gradientes de concentración, presión y temperatura, prácticamente no existen, no
obstante, a nivel industrial es muy probable la existencia de tales gradientes, sobre todo
los de presión y concentración (Reisman 1993).
5
2.2.-Criterios de traslación entre dos escalas de operación.
Dado que el objetivo del escalamiento es el de mantener o prever en el nivel industrial las
características de producción obtenidas a nivel planta piloto o laboratorio y como existen
distintos factores que se ven afectados por la escala, surge consecuentemente la
pregunta: ¿cual será el criterio para el traslado a nivel industrial de los datos obtenidos a
nivel laboratorio? La respuesta reside en el "principio de similitud, el cual concierne a las
relaciones (geométricas, mecánicas, térmicas, etc.) entre sistemas físicos de diferentes
tamaños y que es fundamental en el escalamiento y modelamiento de procesos y
equipos. Es imposible mantener constante en el fermentador de producción, todas las
condiciones ambientales establecidas en el fermentador de menor escala o inclusive el
matraz, sin embargo, sí es posible mantener alguna(s) de ellas las cuales serían los
criterios de escalamiento. Entre estas se pueden mencionar las siguientes:
I. Potencia (gaseada o no gaseada) por unidad de volumen (P/V).
II. Coeficiente volumétrico de transferencia de masa (KLA).
III. Velocidad de punta del impulsor (Vti = NDi).
IV. Factor de momento [mf = (NDi)(NWiHp)(Di - Wi)].
V. Tiempo de mezclado (tmix).
VI. Número de Reynolds (Re)
VII. Velocidad de corte
El establecimiento de los criterios anteriores nace como consecuencia de la importancia
relativa que cada uno de ellos tiene sobre el proceso fermentativo, de ahí la necesidad de
mantener constante dicho parámetro o criterio en el escalamiento. De esta manera, si se
elige como criterio de escalamiento la potencia no gaseada por unidad de volumen (P0/V),
significa que se requiere mantener en la escala industrial, el valor obtenido en la escala
pequeña (Ordaz 2006)
6
2.3.-Principio de similitud.
Tanto los objetos materiales como los sistemas físicos se caracterizan por tres
cualidades: tamaño, forma y composición. Estas cualidades son independientes entre sí,
lo que significa que dos objetos (o sistemas) pueden diferir entre sí en tamaño pero tener
la misma forma y composición o ser semejantes solo en la forma y tener tamaños y
composiciones diferentes (Ordaz 2006).
La similitud puede establecerse de dos maneras: especificando las relaciones de distintas
mediciones realizadas en el mismo cuerpo (proporciones o relaciones intrínsecas) que
son las que establecen homogeneidad o no en el sistema (mismas velocidades, fuerzas o
temperaturas en distintos puntos de un cuerpo o sistema) o especificando las mediciones
correspondientes en distintos cuerpos (relaciones de escala: comúnmente aplicada a la
similitud geométrica entre dos cuerpos, aunque también referida a velocidades, fuerzas y
temperaturas en puntos correspondientes a otros cuerpos) (Ordaz 2006).
Las tres similitudes más importantes en sistemas o procesos biotecnológicos son:
I. Similitud geométrica
II. Similitud mecánica
III. Similitud térmica
La similitud geométrica entre dos cuerpos se dá cuando para cada punto de un cuerpo
existe un punto correspondiente en otro cuerpo. La similitud mecánica comprende
similitud estática, cinemática y dinámica, cada una de estas puede ser referida como una
extensión del concepto de similitud geométrica en sistemas estacionarios o en movimiento
sujetos a fuerzas. La similitud estática concierne a la deformación de estructuras, la
similitud cinemática y dinámica sí son de interés directo ya que conciernen a sistemas en
movimiento. La similitud geométrica involucra coordenadas rectangulares y la cinemática
introduce una dimensión adicional: el tiempo. La similitud dinámica refiere a las fuerzas
(gravitacionales, centrífugas, etc.) que aceleran o retardan el movimiento del fluido o de la
masa y solo en muy pocos casos es posible mantenerla (por ejemplo cuando la agitación
de un birreactor se hace con turbinas tipo Rushton, con bafles y en régimen turbulento,
donde las condiciones dinámicas son constantes).
Sistemas en movimiento "geométricamente similares", se describen como
"cinemáticamente similares" cuando las partículas trazan rutas geométricas similares en
intervalos de tiempo correspondientes. Desde este punto de vista, la imposibilidad
7
"práctica" de mantener esta similitud es evidente (resulta en un incremento excesivo -y por
ende prohibitivo- en la potencia por unidad de volumen de fermentación). Por su parte, la
similitud térmica es de importancia fundamental en aquellos procesos donde existe flujo
de calor, como en los procesos de esterilización y de remoción de calor en biorreactores,
aquí se introduce o adiciona la dimensión "temperatura" a las de longitud, fuerza, masa y
tiempo (Ordaz 2006).
2.4.- Métodos de escalamiento.
En la revisión efectuada por (Kossen 1985), se mencionan los siguientes métodos de
escalamiento:
♦ Método fundamental.
♦ Método semifundamental.
♦ Análisis dimensional.
♦ Prueba y error.
♦ Empirismo.
En el método fundamental deben establecerse los "microbalances" de todos los procesos
de transferencia (calor, masa y momento), con la finalidad de obtener las ecuaciones de
escalamiento. Sin embargo, el establecimiento de tales microbalances para sistemas
industriales reales en los que no prevalecen las condiciones que lo faciliten, es tarea
prácticamente imposible de realizar (excepción hecha para sistemas con células o
enzimas inmovilizadas en reactores tubulares con flujo tapón), se vuelve prácticamente
imposible de realizar.
El método semifundamental por su parte, al realizar simplificaciones en las ecuaciones de
transferencia, se vuelve más práctico, sin embargo, es importante recalcar que, como ya
ha sido mencionado anteriormente, los procesos de transferencia son muy dependientes
de la escala, por lo que si las ecuaciones son obtenidas a escala pequeña, sin tener en
consideración lo anterior, el método resulta muy riesgoso (Ordaz 2006).
El análisis dimensional es, en principio, una técnica con la que se puede obtener
información útil aunque parcial, acerca de las relaciones aplicables a las variables que
caracterizan a un sistema físico dado. A pesar de su utilidad, presenta serias limitaciones
que también ya han sido mencionadas en párrafos precedentes (es imposible conservar
8
todos los grupos dimensionales durante el escalamiento, el mantenimiento de algunos de
estos puede estar en contraposición a la economía del proceso global, etc.).
Por su parte, el método de prueba y error solo es adecuado para la optimización gradual
de procesos, mas no para el escalamiento.
Dada la dificultad práctica de la aplicación directa de los enfoques o métodos de
escalamiento mencionados anteriormente, el escalamiento empírico ha mostrado su
utilidad (Ordaz 2006) (métodos basados en la experiencia). Los trabajos pioneros se
centraron en obtener relaciones físicas en los tanques de fermentación para dilucidar los
efectos que sobre el coeficiente global de transferencia de masa (KLA), la fracción de gas
retenido, el consumo de potencia por unidad de volumen (P/V), el número de Reynolds
(Re), etc., presentaban la geometría y el tipo de impulsor, las relaciones geométricas del
tanque, las características fisicoquímicas de los medios utilizados, las condiciones de
aireación o no aireación del líquido en el tanque, etc.. Posteriormente, se relacionaron
algunos de estos parámetros con los rendimientos celulares y productividades alcanzadas
en los procesos de fermentación, para dilucidar aquel que fuera más crítico.
2.5.- Kla constante.
Este criterio nació por los años 50´s, debido a las altas demandas de oxígeno de los
sistemas fermentativos (Bartholomew 1960). Sin embargo, este criterio presenta
problemas particulares ya que al existir múltiples y distintas ecuaciones que correlacionan
el KLA con las variables de operación de un biorreactor (tabla 2), se hace difícil la elección
de aquella ecuación que sirva adecuadamente con fines de escalamiento. Así por
ejemplo, las ecuaciones mostradas en la tabla 2 han sido obtenidas para volúmenes de
operación no mayores a 100 litros por lo que su utilidad para volúmenes de hasta 100 m3
es poco probable. Caso semejante se presenta al hablar del número y tipos de impulsores
implicados en el nivel laboratorio o planta piloto y nivel industrial.
De forma general se puede decir que para escalamiento con similitud geométrica el KLA
está representado por:
( )K A P D VL g i
a
sb∝
⎡⎣⎢
⎤⎦⎥
3 ……………………………………………………………...…….Ecuación 1
9
Tabla 2 Ecuaciones de correlación para estimar el KLA.(Ordaz 2006)
ECUACION TECNICA
IMPULSOR VOLUMEN (l)
SISTEMA DE UNIDADES
OBSERVACIONES
KLA α (P/V)0.95 VS0.67 Sulfito Disco
Vaneado
3-66.3
KLA α (P/V)0.53 VS0.67 Sulfito Paletas 3-66.3
KLA = 0.01 (P/V)0.475
VS0.4
--- Varios --- SI* Sistemas coalescentes
KLA = 0.02 (P/V)0.475
VS0.4
--- Varios --- SI* Sistemas no
coalescentes
KLA = 0.025 (P/V)0.4 VS
0.5 Varias Turbina de 6
álabe rectos 4-100 SI* Sistemas
coalescentes
KLA = 0.0018 (P/V)0.7
VS0.3
Varias Turbina de 6
álabes rectos
4-100 SI* Sistemas no
coalescentes
KLA = 0.0635 (Pg/V)0.95
VS0.67
Sulfito Disco
Vaneado
3-66.3 **
KLA α (P/V)0.4 VS0.5
N0.5
Sulfito Turbina de 6
álabes rectos
---
KLA α (P/V)a VSb Nd Sulfito Paletas (1-4) 11-27
a = 0.6-0.67, b = 0.47-0.6, d = 1.49-1.57
*) Sistema internacional.
**) (Pg/V) [=] Hp/m3 V [=] m/h KlA [=] kgmol/h m3atm
en la que de acuerdo a (Bartholomew 1960) , los valores de los exponentes "a" y "b"
toman los valores mostrados en la Tabla 3.
La razón de la variación de los exponentes de la ecuación 10 no es debida a una sola
causa. (Fuchs 1971) menciona que el efecto de la aireación superficial sobre el KLA
puede ser una de las principales causas -el efecto disminuye con el volumen de operación
de los biorreactores-, por su parte, (Humphrey 1985) menciona que no es perfectamente
conocido la dependencia de los exponentes con la escala y que además tales
correlaciones son muy dependientes de la viscosidad.
10
Tabla 3 Valor de los exponentes de la ecuación 11 en función del volumen de operación de los biorreactores (Ordaz 2006)
VOLUMEN DEL TANQUE
(L). a b
5 0.95 0.667
500 0.6 - 0.7 0.667
50,000 0.4 - 0.5 0.5
Dada la variación de los exponentes de la ecuación 10 con el volumen de fermentación,
se debe buscar la escala mínima en la que los exponentes permanezcan constantes para
que la correlación sirva con fines de escalamiento Así, la correlación queda como:
( )K A P D VL g i s∝ 37 10
2 3/
/ ………………………….……………………………..……….Ecuación 2
Por otro lado, se sabe que:
V F Ds a i= 2 ………………………………..………………………………….………….Ecuación 3
(Michel 1962)relacionaron la potencia aireada (Pg) con la no aireada (P0), de la siguiente
manera:
P CP ND
Fgi
a
=⎛
⎝⎜⎜
⎞
⎠⎟⎟
02 3
0 56
0 45
.
.
…………………………..………………………………………….Ecuación 4
De la cual, si el exponente 0.45 se tomase como aproximación a 0.5, se puede llegar a:
( )P
P
ND
Fg i
a0
3 1 2
1 4∝
/
/ ó
( )P
D
ND
Fg
i
i
a
P
Di
3
3 1 2
1 40
3
∝
/
/ ………………………………….Ecuación 5
11
2.6.- Números a dimensionales
Una posibilidad de predecir el estado de un líquido es la utilización de los números de
adimensiones. Allí son varias las dimensiones que permiten a los números comparar los
complejos sistemas de agitación y mezclado.
La mayoría de los números aplicados son:
• Número de Reynolds que se usa para comparar el patrón de flujo.
• Número de Froude para describir la influencia gravitacional.
• Número de potencia (Número de Newton) para postular el consumo de energía.
• Número de etapas para describir el patrón de flujo en un matraz.
El número de Reynolds (Nre) es la relación de fuerzas inerciales y las fuerzas viscosas y
se utiliza para determinar si un flujo es turbulento o laminar.
Flujo laminar se produce a Números de Reynolds menores a (Re<1000), cuando la
viscosidad del fluido es dominante, y se caracteriza por un fluido con movimiento
constante , mientras que un flujo turbulento, por otra parte, es un numero de Reynolds
mayores a (Re> 10000) y está dominado por fuerzas inerciales, produciendo cambios
inestable. La transición entre flujo laminar y un flujo turbulento es a menudo indicado por
un numero de Reynolds entre 1000 y 10000.
)*......(..........cos)......(..........
)/....(..........).........(....................
viscosasFuerzasinerciales FuerzasRe
3
22
spaliquidodelidadvismimpuldordeldiametroD
mKgagitaciondefrecuenciaNliquidodensidad
NDDN
i
i
DN
i
i
−−=−−=−−=
−−=
===
μ
ρμ
ρμρ
……………………………...…………….Ecuación 6
12
La ecuación anterior es usada para el cálculo del Reynolds en bioreactores, sin embargo
se necesito encontrar ecuaciones para obtener el tipo de flujo que existe en el matraz y
para calcular el Número de Reynolds en un matraz con agitación orbital se requirió de la
siguiente ecuación:
Reynolds de articulos de Büchs 2000
Reynolds adimensional
densidad del liquido en Kg/m^3 ρm 1:=
frecuencia de agitacion 1/s n 1:=
dm 1:=diametro del matraz m
viscosidad dinamica del liquido Pa*s η 1:=
Reρm n⋅ dm2
⋅
η:=
……………………………….Ecuación 7
Para la evaluación del patrón de flujo en un matraz agitado, el número de Reynolds se
extendió al numero de Reynolds de la película ((Buchs et al. 2000b)) (Eq 21). Que
representa el número de fase.
Reynolds de la pelicula Ref Büchs 2000
Ref numero de reynolds de la peliculaRe 1=
numero de reynolds de matraz
volumen de matraz m^3 Vl 1:=
diametro del matraz m dm 1:=
Ref Reπ
2⋅ 1 1
4π
Vl
1
3
dm
⎛⎜⎜⎜⎝
⎞⎟⎟⎟⎠
2
⋅−−
⎡⎢⎢⎢⎣
⎤⎥⎥⎥⎦
2
⋅:=……………………………..Ecuación 8
13
Mientras que El número de Froude Fr es una medida de la relación entre la fuerza inercial
y la fuerza gravitacional por unidad de área que actúa sobre el fluido. Interviene en
situaciones fluido dinámicas donde hay un movimiento de lo significativo sobre la
superficie del líquido.
………………Ecuación 9
Otro número adimensional es el número de Froude (Fr), que representa la proporción de
fuerzas inercia y las fuerza gravitacional. En caso de agitación orbital, el número de
Froude es la relación de fuerzas centrífugas inducida por el agitador de mesa en dirección
radial a la aceleración gravitatoria que actúan en dirección axial. Este número, junto con la
numero de fase, se utiliza para describir el fenómeno basado en el patrón de flujo de un
fluido agitado en un matraz. Número de Newton puede calcularse utilizando los siguientes
ecuación ((Buchs et al. 2000b));
Numero de froude de büchs 2000
Fra numero froude adimensional
frecuencia de agitacion 1/s n 1=
diametro del agitador m da 1:=
gravedad m/s^2 g 9.807m
s2=
Fra2 π⋅ n⋅( )2 da⋅
2 g⋅:=
………………………………….…….Ecuación 10
El número de potencia o de newton es análogo a un factor de fricción o a un coeficiente
de rozamiento. Es proporcional a la relación entre la fuerza de rozamiento que actúa
sobre una unidad de área del impulsor y la fuerza inercial. La fuerza inercial, a su vez,
)/........(..................................................).(..............................)/1.....(
nalesgravitacio Fuerzasinerciales FuerzasFr
2
22
smgravedadgmimpulsordeldiametroDisimpulsordeloperaciondenumeroN
gDN
gDN ii
=
−−=−−−−=
===ρ
ρ
14
está relacionada con el flujo de cantidad de movimiento correspondiente al movimiento
global del fluido.
)....(....................)/1..(....................
)/.......(....................
inerciales Fuerzasexternas FuerzasNp
3
532
13
cmimpulsordeldiametroDisagitacióndefrecuenciaNcmgliquidodeldensidad
impulsorelporconsumidapotenciapDN
PDN ii
DNDPg
iic
−−=−−=
−−=
−−−−=
===
ρ
ρρ
…………………………..……….Ecuación 11
Número de energía (Ne ), (también conocido como Número de Newton), es un número sin
dimensiones relativas con la fuerza de resistencia a la fuerza de la inercia. Este número
tiene diferentes especificaciones de acuerdo con el ámbito de aplicación. Fue modificada
por ((Buchs et al. 2000b)) para el líquido agitado en un recipiente (Eq 25) y puede ser
utilizado para describir el consumo de energía en matraces agitados.
………………………….………………………….Ecuación 12
Al despejar de la ecuación anterior la potencia
…………………………………………...…….Ecuación 13
Con el fin de proporcionar el adecuado mezclado al fluido, es esencial conocer la cantidad
de energía mecánica introducida. En caso de agitación orbital, esto es energía mecánica
inducida por el par y la velocidad angular, y se transfiere a través de la superficie de
fricción entre la pared del frasco y la rotación de fluido para un buen mezclado. Este
puede ser utilizado para calcular la potencia volumétrica (P / Vl) y puede ser estimado;
para aplicaciones directas. El aumento de agitación periódica, respectivamente aumenta
con el movimiento de rotación del fluido esto se traduce como un aumento en el consumo
de potencia volumétrica. La disminución de la fricción del liquido con la pared del matraz,
conduce a la disminución de consumo de energía y Posteriormente, a un buen mezclado
P Ne´ρm⋅ n3⋅ dm4⋅⋅:=
15
y una buena transferencia de masa. Se puede también correlacionar con el régimen de
flujo hidrodinámico y el estrés de la agitación (Buchs et al. 2000b). Buchs et al. Ha
estudiado el consumo de energía específico en matraces agitados con movimientos
orbitales y se describe el Número de potencia (NE) como una función de el número de
Reynolds (Re) del matraz
Ne' numero de potencia de büchs 2000
numero de potencia modificada adimensional Ne´
potencia Watt P 1:=
densidad del medio en kg/m^3 ρm 1=
n 1=frecuencia de agitacion 1/sdm 1=diametro del matraz m
volumen de matraz Vl Vl 1=
Ne´ 70 Re 1−⋅ 25 Re .6−
⋅+ 1.5 Re .2−⋅+:= …………..……….……….Ecuación 14
Número de fase (Ph) es un número adimensional (Eq 28), que es el más reciente numero
definido por (Buchs et al. 2001; Buchs et al. 2000b). Es muy útil para predecir el
comportamiento de la rotación de líquido en matraces agitados, si "en fase" o "fuera de
fase". En "en fase" condición, el líquido gira a lo largo de la pared del matraz y la máxima
altura del líquido en la dirección de aceleración centrífuga en el matraz agitado.
Considerando que, en "fuera de fase" el liquido hace una forma de oz en la pared del
matraz lo que significa que punto focal de los líquidos no sigue la dirección de la
aceleración centrífuga. Incluso en determinadas condiciones, este desplazamiento es tan
grande que una gran cantidad de líquidos sigue estando en el fondo del matraz y hace
irreproducible el tipo de flujo. La disminución de la superficie fraccionada entre la pared
del matraz y el mezclado del liquido así como el intercambio de gas afecta de una
manera negativa.
Uso de la Fase Número (Ph), junto con el número de Froude axial (Fra), estos dos
estados hidrodinámico se puede distinguir.
16
numero de fase Büchs 2001
numero de fase Ph adimensional
diametro del agitador m da 1=
diametro del matraz m dm 1=
numero de Reynolds de la apelicula adimensional Ref 1.1=
Phdadm
1 3 log Ref( )⋅+( )⋅:=…………….……….Ecuación 15
En la medida en que el PH> PH (= 1,26) y de la Fra> .4, con estos datos se pueden
estimar el estado del fluido agitado en el matraz. La disminución en el diámetro de
agitación y / o frecuencia de agitación son también en favor de "fuera de la fase".
2.7.-Sistemas gaseados newtonianos.
Al burbujear aire (o un gas cualquiera) a un sistema agitado, el consumo de energía para
agitación mecánica disminuye, esta disminución es una función compleja de la geometría
del sistema y de las características fisicoquímicas del líquido. Se menciona que dicha
disminución se debe principalmente a la disminución de la densidad del líquido por
presencia de las burbujas de aire en las inmediaciones del impulsor (Aiba 1973)) .
Oyama y Endoh trabajando con distintos impulsores, relacionaron el consumo de potencia
con un número adimensional que definieron como "número de aireación" o Na, graficando
la relación "Pg/P" contra dicho número. La relación "Pg/P" se refiere a la potencia
consumida para agitar el líquido aireado "Pg" respecto a la no aireada "P". El número de
aireación "Na", que da idea del grado de dispersión de las burbujas en el tanque, se
obtiene al relacionar un valor proporcional a la velocidad lineal del aire (Vs) con un valor
proporcional a la velocidad de punta del impulsor (Vi), como se muestra a continuación:
17
NV
V
Fa D
NDFa NDa
s
i
i
ii= = =
( / )/ ( )
23 ……………………………………………..……….Ecuación 16
en la que Fa es el flujo volumétrico del aire. Debe hacerse notar que solo para este caso,
la Vs se calcula tomándose como base una área equivalente al diámetro del impulsor.
(Michel 1962.)) utilizando sistemas geométricos no similares e impulsor tipo turbina de 6
álabes rectos, encontraron la siguiente relación:
P CP NDFag
i=⎛
⎝⎜
⎞
⎠⎟
2 3
0 56
0 43
.
.
…………………………………………………………………….Ecuación 17
Ecuación en la que la constante "c" depende muy probablemente de la geometría del
impulsor, aunque los autores establecen su valor igual a 0.08 para cuando la potencia P,
la velocidad de rotación del impulsor N, el diámetro del impulsor Di y el flujo de aire Fa, se
expresan en HP, revoluciones por minuto, pies y pies cúbicos por minuto respectivamente
y cuando se trabaja con impulsores tipo turbina de 6 álabes rectos. Los exponentes de la
ecuación 52 son menos sensible a la geometría que la constante "c".
No obstante que Michel y Miller utilizaron diámetros de impulsores de 3 a 8 pulgadas y
diámetros de tanque de entre 6.5 y 18 pulgadas, dicha correlación funcionó para datos
obtenidos por otros autores que trabajaron a mayor capacidad como lo mencionan en su
trabajo. Por otro lado, los fluidos usados cubrieron un intervalo de densidades de 0.8 a
1.65 g/cm3, de viscosidades de 0.9 a 100 centipoises y tensiones superficiales del orden
de 27 a 72 dinas/cm. Por estas razones se puede estimar con buena precisión la potencia
aireada cuando se emplean turbinas de 6 álabes para agitar el sistema líquido-gas.
Existen otras correlaciones para sistemas específicos que correlacionan el consumo de
potencia aireada con el "hold-up" como la obtenida por (Calderbank 1958; Richards
1961)), aunque las más utilizadas son las mencionadas anteriormente.
18
2.8.- Transferencia de oxigeno al medio por la agitación dentro de un matraz.
El volumen de oxigeno transferido al medio se ve afectado por las siguientes condiciones:
• Forma y tamaño del matraz
• Diámetro del agitador
• Frecuencia de agitación
• Volumen de llenado
• Propiedades de los materiales del medio (hidrófilo o hidrófobo)
• Propiedades físico-químicas de los líquidos (viscosidad, la solubilidad del gas, pH
etc ...)
• Temperatura
La máxima capacidad de transferencia de oxígeno de un determinado sistema puede ser
aumentado por el aumento de la frecuencia de agitación o por el diámetro de agitación,
mientras que se incrementa por la reducción en el volumen de llenado del matraz y el
diámetro del matraz. Información proporcionalidad por (Maier 2001).
|velocidad de transferencia de oxigeno de Maier
VTO=velocidad de transferencia de oxigeno mol/L/
frecuencia de agitacion 1/s n 1=
volumen del matraz m^3 Vl 1=
diametro del agitador m da 1=
diametro del matraz m dm 1=
VTO n0.84 Vl 0.84−⋅ da.27
⋅ dm 1.25−⋅:= …………………………...….Ecuación 18
Liu et al. (2006) ha informado recientemente de la mayoría de una correlación de
transferencia de oxígeno con velocidad agitador y volumen de líquido en el frasco que dio
lugar a la siguiente ecuación (kla en 1/min)
19
Kla en 1/min coeficiente volumetrico de transferencia de oxigeno de Liu
coeficiente volumetrico de transferencia de oxigeno 1/min
volumen de matraz litros Vll 1=
Vnl 1:=volumen nominal del matraz litros
Na 1:=frecuencia de agitacion 1/min
Kla 0.141 Na.88⋅
VllVnl
⎛⎜⎝
⎞⎟⎠
0.80⋅:=
………......Ecuación 19
3.-Justificación.
La intención de llevar acabo este proyecto de investigación surgió de la necesidad de
producir su Taq polimerasa en una institución interdisciplinaria de biotecnología, la cual
ocupa esta enzima de manera común para sus investigaciones y prácticas docentes,
buscando así un ahorro significativo; llevando acabo a un nivel de ingeniera aplicada los
conocimientos obtenidos durante el transcurso de la carrera, dejando con ello un producto
útil a nivel piloto.
4.-Objetivo General
• Escalar un bioproceso para la producción de Taq polimerasa para un bioreactor de 5L..
5.-Objetivos particulares
• Evaluar la producción de Taq polimerasa en matraz
• Escalar la producción de Taq polimerasa de un matraz a un birreactor a partir de
datos obtenidos a nivel matraz.
• Comprobar la producción de Taq polimerasa en un birreactor de 5 litros
• Determinar parametros de uso del biorreactor
6.-Metodología
6.1 Comprobar la producción de Taq polimerasa en matraz: 6.1.1 Producción de la Taq DNA polimerasa en caldo LB con ampicilina.
Se inocularon 50 ml de caldo LB con 3 asadas de una placa de LB que contenía la cepa
E.coli ARC-2 (Bl21 que contiene una gen de resistencia a la ampicilina, un operon lac y un
gen para expresar Taq polimerasa de Thermus aquaticus ), inmediato se metió el matraz
20
que contenía este a una incubadora a 30°C y a 200 RPM (revoluciones por minuto),
dejando crecer hasta alcanzar una densidad óptica (a 600 nm) de 0.3 a 0.6.
La expresión del plásmido se indujo con IPTG (isopropil-ß-D-tiogalactopiranosido) por no
mas de 16 horas. La concentración de IPTG en el caldo fue de 0.5mM (Perez 2008)).
6.1.2 Purificación de Taq DNA Polimerasa Se centrifugo el medio de cultivo durante 10 min a 4000 RPM y posteriormente se re
suspendieron las células en 5 ml de solución A (Tris-Cl 50mM pH 7.9, EDTA 1mM pH 7.9
y glucosa 50mM) y sele añadió lisozima, la cual debía quedar a una concentración final de
4mg/ml. Se dejo reposar 15 min a temperatura ambiente. Después se adiciono 5 ml de
solución B (Tris-Cl 10nM PH 7.9, EDTA 1mM pH 7.9, KCl 50 mM, Igepal 0.5%, Tween 20
0.5%) y se incubo por 1 hora a 75 °C agitando cada 5 min. A continuación se centrifugo a
18000 RPM durante 60 min a 4 °C. La extracción de la Taq DNA Polimerasa se determino
por electroforesis en el gel de acrilamida-bisacrilamida SDS(Perez 2008))
6.1.3 Preparación del gel acrilamida-bisacrilamida (SDS-PAGE) Primero se prepara el gel separador (Perez 2008)
6.1.4 Preparación del gel separador.
Para preparar e gel separador se coloca agua desionizada a una concentración final del
40% (V/V), seguido de tris 2M ph 8.8 con una concentración final de 25% V/V, seguida de
SDS con una concentración final del 1% V/V, seguida de un volumen de acrilamida
bisacrilamida 33.34% V/V, colocando TEMED para una concentración final de 0.06%
V/V seguido del persulfado de amonio ( concentración 1%) para una concentración final de
0.6% V/V.
6.1.5Preparación del gel concentrador.
Se coloca el 60% V/V de agua desionizada, seguido de tris 2M ph 6.8 a una concentración
final de 25% ; después se coloca SDS a una concentración final de 1.3% V/V colocando
acrilamida bisacrilamida a una concentración final del 13.2% V/V, colocando el catalizador
TEMED a una concentración final del 0.17% V/V seguido de persulfado de amonio al 1%
para terminar a una concentración de .7% V/V.
Una vez agregado el catalizador se mezclan y se vierten inmediatamente en el molde,
nivelado ahora el peine a su posición horizontal, sin atrapar burbujas. Se deja polimerizar.
21
Se retira el peine deslizándolo suavemente, se lavan los pozos llenándolos con agua y
aspirando luego con una jeringa. Esto elimina residuos de componentes no polimerizados. Tabla 4 Reacción de Taq polimerasa PCR.
Volumen de reacción de 30 μl
C/DNA TAQ COMERCIAL
1
S/DNATAQ COMERCIAL
2
C/DNATAQ
PURIFICADA 3
S/DNATAQ
PURIFICADA 4
Agua desionizada
17.0 22.0 16.2 21.2
ID universal para bacterias (10 μM)
0.6 0.6 0.6 0.6
II universal para bacterias (10 μM)
0.6 0.6 0.6 0.6
Nucleótidos (10 mM)
0.6 0.6 0.6 0.6
Buffer (1 X) 3.0 3.0 3.0 3.0
Taq (1 U/μl) 0.2 0.2 1 1
MgCl2 (50 mM) 3.0 3.0 3.0 3.0
DNA 50 ng 5.0 ------ 5.0 -----
6.2 Investigación de ecuaciones de numero adimensionales modificados para matraces.
Estas ecuaciones pueden apreciarse en el punto 2.6.
6.3 Obtención de parámetro o datos a nivel matraz a partir de las ecuaciones investigadas.
Ver en anexos.
7.- R
Figu
1 Fi
difer
Figu
2 Fi
difer
190 120 85 kDa
191285kD
Resultados
ura 1 Cinéti
gura 1. Electrrentes horas de
ra 2 Cinét
gura 2. Electrrentes horas de
Pm
a
Pm
90 20 5 Da
ca de la ind
roforesis en gee inducir con
ica de la in
roforesis en gee inducir con
m 0
m 0
ducción de
el de SDS-PAn IPTG , indic
nducción d
el de SDS-PAn IPTG , indic
1 2
9 10
e Taq polim
AGE de Taq pocando la flecha
e Taq polim
AGE de Taq pocando la flecha
3 4
11 12
merasa en m
olimerasa obtea la posible T
merasa en
olimerasa obtea la posible T
4 5
2 13
matraz.
enida de E.colTaq polimeras
matraz.
enida de E.colTaq polimeras
6 7
14 15
1
li , colocando a, gel teñido c
2
li , colocando a, gel teñido c
8 H
Horas
95
22
muestras a con azul de
comassie.
muestras a con azul de
comassie
Horas
95 kD
5 kDa
Da
Figu
3 .Fdife
191285kD
ra 3 Cinét
igura 3 Electrerentes 15 ho
90 20 5 Da
tica de indu
roforesis en georas de inducc
PM 15
ucción de T
el de SDS-PAción con IPTG
5/I 1
Taq polime
AGE de Taq poG , indicando
15/S 1
erasa en m
olimerasa obtela flecha la p
15/I 15
atraz
enida de E.colposible Taq po
/S 15/
3
li , colocando olimerasa, gel
azul de
/I Horas
95
24
muestras a teñido con
e comassie.
5 kDa
25
Figura 4 Reacción en cadena de polimerasa con extracto de fermentación y polimerasa
comercial
1 2 3 4
4
4 Figura 4 Electroforesis en gel de agarosa al 0.75% de la prueba funcional de Taq polimerasa comercial y
Taq polimerasa extraída de nuestro proceso, usando una cantidad de 1 microlitro de nuestro extracto para los carriles 1 y 4, donde para el cazo particular del pozo 4 no sele coloco DNA; siendo un control negativo
fallido, donde en cada carril se cargo 20 microlitros del producto de PCR. En la anterior PCR se comprobó la producción de Taq polimerasa al obtener gran
cantidad de DNA proporcional a la banda que se observa en el carril 3 y 4; sin embargo
este mismo gel nos indica que la purificación de nuestra Taq polimerasa no es la
adecuada ya que en el carril 4, donde se coloco una muestra control negativa, la cual no
contenía DNA lo cual indicaría que no tenia por q haber duplicación de DNA al no haber
este, se tiene una banda indicando lo contrario , lo cual indica que hay contaminación de
DNA en el extracto del la Taq polimerasa, y se confirma esto al comparar el carril 2, que
26
siendo control negativo pero con una Taq polimerasa comercial, esta no tiene ninguna
banda que indicara que se duplico DNA durante la PCR.
Parámetro o datos a nivel matraz
Tabla 5Parámetro del matraz
Parámetros en el matraz
Re 1.023*10^4
Ref 1.749*10^3
Fra 0.514
Ne´ 0.342
P 4.617*10^-3 watt
Ph 4.406
Hl 0.042 cm
VTO 1.495*10^5 mol/L/h
Kla 7.174 1/min
Estos valores nos permite saber que el patrón de flujo dentro del matraz es turbulento
tanto en la película que forma en la pared del matraz como en el medio, esto debido a los
dos primero parámetros de la tabla 7 lo cual nos permite saber que a 200 revoluciones por
minuto se tiene una adecuada transferencia de masa, lo cual se interpreta en una
adecuada transferencia de oxigeno.
Mientras que en numero de potencia Ne así como la potencia en si P solo nos indica la
potencia suministrada por la agitación al medio, la cual no esta fuera de proporción siendo
que el volumen usando en los matraces era de 50 ml, mientras que el valor del numero de
fase nos indica que se encuentra fuera de fase al tener un valor mayor a 4, lo que quiere
decir que dentro del matraz hay turbulencia, explicando que no solo se mueve el liquido
junto con el liquido.
La transferencia de masa ejemplificada con el Kla solo nos permite saber el parámetro a
mantener constante si se quiere tener la misma tendencia de crecimiento y de producción,
quedando en mayor importancia la de producción ya que lo busca este escalamiento es
tener la producción del matraz en el biorreactor y si esta es mayor se abra cumplido
satisfactoriamente esta conservación de este parámetro.
27
Resultados de la cinética en matraces. Tabla 6 Biomasa seca obtenida de la cinética en matraz.
Horas g de biomasa seca/ml
1 0.124643065
2 0.123702071
4 0.1234119
5 0.122497128
6 0.123161076
7 0.122829102
8 0.123827483
9 0.142370408
10 0.14811805
11 0.146648377
12 0.143095011
13 0.141241701
14 0.142453207
15 0.14261305
Figura 5 Biomasa seca obtenida en el matraz.
5
5 Figura 5 Se realizaron tomas de muestra de 1 ml por triplicado, en tubo con peso contante, durante 15 horas de fermentación recomendadas en trabajos anteriores ( Pérez , 2008 ); de varios matraces que contenía 50 ml de medio LB con ampicilina concentración ( 100 microgrmos/ml) con una concentración de IPTG final ( 0.5 mM).
0.11
0.115
0.12
0.125
0.13
0.135
0.14
0.145
0.15
0.155
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Biom
asa seca en gram
os
horas.
28
Al ver esta tendencia tan larga de adaptación atribuimos a que la inoculación no se
coloco en la fase exponencial, en este caso se debió de colocar un inoculo con un tiempo
de fermentación de 8 horas lo cual, reduciría el tiempo de fermentaciónincluso en la mitad
de tiempo, y la inducción con ITPG se debió de hacer, después de 8 horas lo cual
reduciría el tiempo de inducción hasta en 8 horas solo dejando el tiempo en que se tiene
la mayor concentración de microorganismos, la cual se ve que comienza a reducir a las
13 horas.
Tabla 7 Sustrato residual en matraz.
Horas ABS para cinética mg/ml de proteína
0 14.76
2 0.196 14.1539387
5 0.195 14.05197904
9 0.197 14.25589837
10 0.193 13.84805971
11 0.189 13.44022105
12 0.181 12.62454373
13 0.177 12.21670507
14 0.189 13.44022105
15 0.187 13.23630172
29
Figura 6 Sustrato residual en matraz.
6
6 Figura 6 Se realizaron tomas de muestra de 1 ml por triplicado, en tubo con peso contante, durante 15 horas de fermentación recomendadas en trabajos anteriores ( Pérez , 2008 ); de varios matraces que contenía 50 ml de medio LB con ampicilina concentración (100 microgrmos/ml ) con una concentración de IPTG final ( 0.5 mM);se cuantifico la cantidad de proteína contenida en la muestra por medio de la prueba de Biuret, el tratamiento para procesar la muestra solo se precipito el total de la biomasa por centrifugación, realizando esta prueba con el sobrenadante.
Esta tendencia nos permite saber q después de hacer la inducción se recomendara parar
la fermentación a las 13 hora. Después de 14 horas el microorganismo comienza a morir y
lisarse lo cual aumenta la cantidad de proteína en el medio.
Resultados del escalamiento a un biorreactor de 5.5 L de operación.
Usando las siguiente ecuaciones especificas para este tipo de birreactor y capacidad
volumétrica VER ANEXO
12
12.5
13
13.5
14
14.5
15
0 2 4 6 8 10 12 14 16
mg/ml
Horas
30
Obteniendo estos resultados Tabla 8 Parámetros que se pueden usar en el biorreactor.
Pi
.758·10 -8
1.61·10 -7
.319·10 -6
.562·10 -6
.288·10 -5
.565·10 -5
.519·10 -5
.315·10 -5
.091·10 -4
.584·10 -4
.173·10 -4
.892·10 -4
.824·10 -4
hp
=
Ns
.833
1.667
3.333
5
6.667
8.333
10
11.667
13.33
15
16.667
18.333
20
⎛⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎝
⎞⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎠
s( ) 1−:= Re
0
01
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
431.093862.705
1.725·10 3
2.588·10 3
3.45·10 3
4.312·10 3
5.175·10 3
6.038·10 3
6.899·10 3
7.763·10 3
8.625·10 3
9.488·10 3
1.035·10 4
= Numerodepotenci
3.5
4
4.1
4.2
5
5.1
5.2
5.3
5.3
5.4
5.4
5.4
5.5
⎛⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎜⎝
⎞⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎟⎠
:=
Pg1i
.487·10 -9
.778·10 -8
.572·10 -7
.928·10 -6
.326·10 -6
1.06·10 -5
.867·10 -5
.018·10 -5
.507·10 -5
.534·10 -5
.973·10 -5
.195·10 -4
.578·10 -4
=hp KlATi
8.0238.762
9.533
10.018
10.434
10.725
10.97
11.183
11.364
11.534
11.681
11.816
11.948
= m2
h
Los parámetros para mantener el Kla constante al ser estimados con la ecuación empírica
antes mencionada , se ve como la velocidad de Ns al aumentar se ve un incremento en
proporción al Reynolds y por consecuencia la potencia, mientras que la potencia
gaseada va en reducción conforme aumenta las revoluciones por minuto, mientras que
lo valores van aumentando de Kla conforme aumenta la velocidad del impulsor lo cual nos
da una idea del aumento de la transferencia de oxigeno , lo que nos permitirá igualar o
31
superar el valor de Kla del matraz aun acierte velocidad del impulsor y una potencia la
cual va muy relacionada y por l cual se cubre el valor del Kla de matraz a las 600
revoluciones por minuto , 1 volumen de aire por volumen de medio.
8.-Análisis de resultados.
La tabla 7 de los parámetros obtenidos de matraz indica que se encuentra el patrón de
flujo en una zona turbulenta lo que favorece la transferencia de masa, lo que hace que en
esta fermentación no se vea limitado el crecimiento debido al oxigeno, sino en su totalidad
al agotamiento de sustrato, mientras que el valor de el numero de Reynolds en la película
nos dice que incluso en la película que se forma en la pared del matraz contribuye de
alguna forma a la transferencia de masa lo que confirma el numero de fase con un valor
superior a 4 lo que indica que hay mezclado dentro del liquido.
Lo cual nos indica que el parámetro que se debe mantener constante en el biorreactor es
el valor de Kla.
Se tiene que las correlaciones experimentales de Kla en función de su volumen y de su
Pg es limitada si no se cumple con exactitud el tipo de medio para el cual fueron usadas,
reología del fermentador, la coalescencia, e incluso la temperatura y su geometría del
birreactor, lo cual me permite incluso limitar estas ecuaciones empíricas en la forma en la
que se obtuvo los parámetros de Kla ya sea en un método usando sulfito, dinámico, de
balance de oxigeno etc.
Mientras que la figura 1 y 2 se aprecia el incremento de la intensidad de la línea a la altura
de 85KDa que representa la presencia de Taq polimerasa, lo que deja a la vista que entre
mayor sea el numero de horas que se deje la inducción se tendrá mayor cantidad de esta
enzima, siendo solo limitada por el agotamiento del sustrato.
El agotamiento del sustrato en la figura 6 que limita el aumento de biomasa y por
consecuente la expresión de Taq polimerasa; al verse disminuir la cantidad de biomasa a
la 10 horas después de la inducción que se ve en la figura 5, mientras que en la figura 6
demuestra que se comienza a limitar el crecimiento microbiano a concentraciones de
proteína menores a 12.2 mg/ml de sustrato que en este caso es la proteína, lo cual indica
que después de las 15 horas es apropiado detener la fermentación o incluso antes en la
etapa en la comienza en una fase estacionara a las 13 horas.
32
La tabla 10 proporciona los datos de rpm, y valores de Kla que puede alcanzar el
biorreactor empleado a 1vvm demuestra que la cantidad del potencia gaseada es menor
en cada uno de los diferentes valores de rpm, comparada con la potencia sin gasear, con
forme a eso se puede hacer enfoque a los valores de Kla que son mayores al del matraz,
por arriba de valores de 600 rpm lo que indica que el biorreactor proporciona las
condiciones para obtener los mismo parámetros de rendimiento que los obtenidos en el
matraz manteniendo el criterio de escalamiento.
9.-Conclusiones
Sin embargo el criterio de Kla constante es uno de los mas comúnmente elegidos para
realizar escalamiento de procesos donde la velocidad de transferencia de oxigeno es una
variable fundamental a controlar dentro del biorreactor, la cual nos permitirá tener la
misma cantidad de crecimiento y de rendimiento de expresión de Taq polimerasa.
Se considera el criterio de escalamiento Kla bajo la premisa de que sea la transferencia
de masa su única limitante para su óptimo crecimiento.
Se concluye que la ecuación usada para calcular el Kla en el biorreactor no es la
adecuada, lo cual no quiere decir que el criterio de escalamiento este incorrecto, sino que
se deja una amplia gama de posibilidades de usar otras ecuaciones que cubran mayores
características de este biorreactor
La mayor producción de Taq polimerasa se observa a las 15 horas.
La Taq polimerasa es funcional para el uso en PCR salvo se tiene que usar
DNAasa en la purificación.
El criterio de escalamiento fue el Kla con una valor de 10.95 m2/h
A 600 RPM (revoluciones por minuto) y 1 vvm ( volumen de aire por volumen de
medio), se mantiene contante el criterio de escalamiento en el biorreactor.
33
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37
11.-Anexos
Redensidadmedio Ns⋅ diametroimpulsor2
⋅
viscosidad:=
Pi Numerodepotenci i densidadmedio⋅ Nsi( )3⋅ diametroimpulsor5⋅:=
Pg1i .082 P1i⋅( )2 Nsx1i⋅ diametroimpulsorf13⋅
FA10.56
⎡⎢⎢⎣
⎤⎥⎥⎦
0.43
⋅:=
KlAi
Pg1i
volx1
⎛⎜⎝
⎞⎟⎠
⎛⎜⎝
⎞⎟⎠
.04
vs1.5⋅ 1.78⋅:=
Reynolds de articulos de Büchs 2000
Reynolds adimensional
densidad del liquido en Kg/m^3 ρm 1006.845:=
frecuencia de agitacion 1/s n 3.333333333333:=
dm .056:=diametro del matraz m
viscosidad dinamica del liquido Pa*s η 1.02918115210 3−⋅:=
Reρm n⋅ dm2
⋅
η:=
Re 1.023 104×=
38
Reynolds de la pelicula Ref Büchs 2000
Ref numero de reynolds de la peliculaRe 1.023 104×=
numero de reynolds de matraz
volumen de matraz m^3 Vl 5 10 5−⋅:=
diametro del matraz m dm .056:=
Ref Reπ
2⋅ 1 1
4π
Vl
1
3
dm
⎛⎜⎜⎜⎝
⎞⎟⎟⎟⎠
2
⋅−−
⎡⎢⎢⎢⎣
⎤⎥⎥⎥⎦
2
⋅:=
Ref 1.749 103×=
Numero de froude de büchs 2000
Fra numero froude adimensional
frecuencia de agitacion 1/s n 3.333Hz=
diametro del agitador m da .023m:=
gravedad m/s^2 g 9.807m
s2=
Fra2 π⋅ n⋅( )2 da⋅
2 g⋅:=
Fra 0.514=
39
Ne' numero de potencia de büchs 2000
numero de potencia modificada adimensional Ne´
potencia Watt PT 1:=
densidad del medio en kg/m^3 ρm 1.007 103×=
n 3.333=frecuencia de agitacion 1/sdm 0.056=diametro del matraz m
volumen de matraz Vl Vl 5 10 5−×=
Ne´ 70 Re 1−⋅ 25 Re .6−
⋅+ 1.5 Re .2−⋅+:=
Ne´ 0.342=
P Ne´ ρm⋅ n3⋅ dm4
⋅ Vl
1
3⋅:=
P 4.617 10 3−×=
numero de fase Büchs 2001
numero de fase Ph adimensional
diametro del agitador m da 0.023=
diametro del matraz m dm 0.056=
numero de Reynolds de la apelicula adimensional Ref 1.749 103×=
Phdadm
1 3 log Ref( )⋅+( )⋅:=
Ph 4.406=
40
altura del liquido alcanzada durante la agitacion
Hl altura del liquido en cm
volumen del matraz litros Vll .05:=
diametro del agitador cm dacm 2.3:=
numero de frecuencia 1/s n 3.333=
diametro interno del matraz cm dmcm 5.6:=
Hl 0.92 dacm0.02⋅ dmcm .11−
⋅ n0.06⋅ Vll⋅:=
Hl 0.042=
velocidad de transferencia de oxigeno de Maier
VTO=velocidad de transferencia de oxigeno mol/L/h
frecuencia de agitacion 1/s n 3.333=
volumen del matraz m^3 Vl 5 10 5−×=
diametro del agitador m da 0.023=
diametro del matraz m dm 0.056=
VTO n0.84 Vl 0.84−⋅ da.27
⋅ dm 1.25−⋅:=
VTO 1.495 105×=
41
Kla en 1/min coeficiente volumetrico de transferencia de oxigeno de Liu
coeficiente volumetrico de transferencia de oxigeno 1/min
volumen de matraz litros Vll 0.05=
Vnl .125:=volumen nominal del matraz litros
Na 200:=frecuencia de agitacion 1/min
Kla 0.141 Na.88⋅VllVnl
⎛⎜⎝
⎞⎟⎠
0.80⋅:=
Kla 7.174=
