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ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA
SEPARACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE MARTIN GALVIS
(Senna multijuga) CON ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA
TESIS DE GRADO
PREVIA LA OBTENCIN DEL TTULO DE
BIOQUMICO FARMACETICO
PRESENTADO POR
DIANA ELIZABETH SISALEMA SNCHEZ
RIOBAMBA- ECUADOR
2013
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2
DEDICATORIA
A Dios por ser mi gua espiritual por haberme permitido
llegar a este punto por darme la vida para lograr mis
objetivos y por su infinita bondad y amor.
A mis padres por darme la vida y ser mi pilar fundamental
de lucha y perseverancia.
A mi hermano Walter por estar conmigo y apoyarme
siempre.
A mi esposo Huguito por su amor constante y por ensearme a ser perseverante y a no desmayar frente a las
adversidades de la vida.
A mis gemelitas Anah y Fernandita quienes sern mi
nueva gua de mis metas e ideales.
-
3
AGRADECIMIENTO
Mi gratitud, principalmente est dirigida a Dios por
haberme dado la existencia y permitido llegar al final de
una etapa ms en mi vida.
A la Escuela Superior Politcnica de Chimborazo por ser los forjadores de mi enseanza.
A la Dra. Cumand Jtiva por su asesoramiento en la
direccin de la presente tesis por sus conocimientos que han sido el eje fundamental para la culminacin de mi trabajo.
Al Dr. Jacinto Mera, por la colaboracin desinteresada
que me ha brindado en el transcurso del trabajo de tesis y por motivarme a la realizacin de la misma.
A los Drs. Miembros del tribunal de Tesis por el gran aporte
brindado en la elaboracin del trabajo.
A mis padres por haberme apoyado en todo momento, por
sus consejos, sus valores, por la motivacin constante que
me ha permitido ser una persona de bien.
A mi amor eterno Huguito por siempre estar a mi lado,
brindndome todo su amor, entrega, dedicacin y sobre
todo tenerme mucha comprensin y paciencia.
A todas las personas que colaboraron de una u otra
manera para la culminacin de este trabajo de
investigacin.
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4
ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA
El Tribunal de Tesis certifica que: El trabajo de investigacin: SEPARACIN DE
METABOLITOS SECUNDARIOS DE MARTIN GALVIS Senna multijuga CON
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA, de responsabilidad de la seorita egresada Diana
Elizabeth Sisalema Snchez, ha sido prolijamente revisado por los Miembros del Tribunal de
Tesis, quedando autorizada su presentacin.
FIRMA FECHA
Dr. Silvio Alvarez L. --------------------------- -----------------------------
DECANO FAC. CIENCIAS
Dr. Ivn Ramos. --------------------------- -----------------------------
DIRECTOR ESCUELA
BIOQUMICA Y FARMACIA
Dra. Cumand Jtiva. --------------------------- -----------------------------
DIRECTOR DE TESIS
Dr. Jacinto Mera ---------------------------- -----------------------------
MIEMBRO DEL TRIBUNAL
Tc. Carlos Rodrguez ---------------------------- ------------------------------
DIRECTOR CENTRO
DE DOCUMENTACIN
NOTA TESIS --------------------------
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i
Yo, Diana Elizabeth Sisalema Snchez soy responsable de
las ideas, doctrinas y resultados expuestos en esta Tesis; y el
patrimonio intelectual de la Tesis de Grado, pertenece a la
ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE
CHIMBORAZO
________________________________________
DIANA ELIZABETH SISALEMA SNCHEZ
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NDICE DE ABREVIATURAS
Bu(OH) Butanol
C6H6 Benceno
CeSO4 Sulfato de cerio
Cl3CH
CH3COOH
Cloroformo
cido actico
Et(OH)
EtOAc
Etanol
Acetato de etilo
Exten.conj
g
Extencin de la conjugacin
Gramo
H2SO4 cido sulfrico
KOH
Me(OH)
Hidrxido de potasio
Metanol
mL Mililitros
nm.
CCF
CCFP
Nanmetros
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en capa fina preparativa
UV
Ultravioleta
Longitud de onda
i
-
NDICE GENERAL
NDICE DE ABREVIATURAS............................................................................................ i
NDICE DE CUADROS ..................................................................................................... vi
NDICE DE TABLAS ....................................................................................................... vii
NDICE DE GRFICOS .................................................................................................. viii
NDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... ix
NDICE DE FOTOGRAFAS .............................................................................................. x
NDICE DE ANEXOS ........................................................................................................ xi
NTRODUCCIN
1. MARCO TERICO.......................................................................................... 1
1.1 Plantas medicinales.......................... 1
1.2 Cassia angustifolia-Valh (India). 1
1.3 Senna multijuga................... 4
1.3.1 Clasificacin cientfica 5
1.3.2 Descripcin.................. 5
1.4 Extractos vegetales.................. 6
1.4.1 Mtodos de Extraccin 6
1.4.1.1 Maceracin...... 6
1.4.1.2 Percolacin o lixiviacin. 6
1.4.2 Clasificacin de los Extractos Vegetales..................... 7
1.4.3 Preparacin de Extractos 7
1.4.4 Especificaciones de calidad de la droga vegetal.. 8
1.4.5 Concentracin de extractos.. 9
1.5 Tamizaje Fitoqumico.. 9
1.5.1 Fundamento......................................................................................................... 9
1.5.2 Metodologa en el anlisis fitoqumico.... 10
1.5.3 Reacciones de identificacin .................. 10
1.6 Cromatografa de capa fina.. 15
1.6.1 Concepto de Rf.................... 15
1.6.2 Cromatografa en columna.................. 16
1.6.3 Cromatografa preparativa................... 16
1.7 Cromatografa en Capa Fina de Senna fructus y follum.................. 17
ii
-
1.8 Espectrofotometra................... 18
1.8.1 Espectrofotometra ultravioleta-visible... 19
1.8.2 El espectrofotmetro.................................................... 19
1.8.3 Caractersticas del sistema................... 19
1.9 Reglas de Woodward-Fieser ................... 21
1.9.1 Aplicacin de las reglas de Woodward-Fieser................... 23
2. PARTE EXPERIMENTAL.............................................................................. 28
2.1 Lugar de la investigacin..... 28
2.2 Materiales, Equipos y Reactivos.......... 28
2.2.1 Materiales.... 28
2.2.1.1 Material vegetal... 28
2.2.1.2 Materiales de laboratorio..................... 28
2.2.2 Equipos.................... 30
2.2.3 Reactivos...................... 30
2.3 Mtodos y tcnicas.. 31
2.3.1 Recoleccin.............................. 31
2.3.2 Comprobacin taxonmica.. 31
2.3.3 Procesamiento de la materia prima...................... 32
2.3.4 Obtencin de los extractos botnicos...................... 32
2.3.5 Preparacin de los sub extractos.............................. 33
2.3.5.1 Sub extracto etreo.............................. 33
2.3.5.2 Sub extracto clorofrmico................... 33
2.3.5.3 Sub extracto Butanlico... 34
2.3.6 Determinacin de las propiedades organolpticas y fsicas.................... 34
2.3.6.1 Color.................... 34
2.3.6.2 Olor...................... 34
2.3.6.3 Aspecto....... 34
2.3.6.4 Determinacin de la densidad relativa.................... 36
2.3.6.5 Determinacin del ndice de refraccin................... 36
2.3.6.6 Determinacin del pH del extracto ..... 37
iii
http://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metro
-
2.3.7 Tamizaje fitoqumico....................... 37
2.3.7.1 Ensayo de la espuma................................................ 37
2.3.7.2 Ensayo de H2SO4 concentrado. 38
2.3.7.3 Ensayo de Shinoda... 38
2.3.7.4 Ensayo del cloruro frrico....................... 38
2.3.7.5 Ensayo de Borntrger.................. 38
2.3.7.6 Ensayo de Dragendorff.................... 39
2.3.7.7 Ensayo de Wagner....................... 39
2.3.7.8 Ensayo de Rosentaler ...................... 39
2.3.7.9 Ensayo de Baljet...................... 40
2.3.7.10 Ensayo de Sudan III..................... 40
2.3.7.11 Ensayo de Liebermann-Burchard.... 40
2.3.8 Anlisis cromatogrficos del extracto y sub extractos............................ 41
2.3.8.1
2.3.8.2
2.3.8.3
2.3.8.4
2.3.8.5
3.
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.5.1
3.5.2
3.5.3
4.
5.
6.
7.
Comparacin cromatogrfica del Sen y Senna multijuga
Separacin de metabolitos secundarios del sub extracto etreo II..................
Tratamiento del Sub extracto clorofrmico III....................
Tratamiento del Sub extracto Butanlico IV...
Purificacin de metabolitos del extracto Etanlico I...
RESULTADOS Y DISCUSIN...
Composicin taxonmica e identificacin botnica....................
Control de calidad de la droga.................
Propiedades organolpticas y tamizaje fitoqumico....................
Discusin de resultados de las cromatografas....................
Determinacin de compuestos en el UV.................
Determinacin de compuestos del sub extracto etreo........................
Determinacin de compuestos del sub extracto Butanlico....................
Determinacin de compuestos del sub extracto Etanlico..................
CONCLUSIONES.
RECOMENDACIONES...
RESUMEN.
BIBLIOGRAFA...
41
42
44
44
45
55
55
55
55
57
60
60
61
62
64
66
67
70
iv
-
8.
ANEXOS.....................
.
78
v
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INDICE DE CUADROS
CUADRO No. 1 Esquema de preparacin de los extractos y sub
extractos. 35
CUADRO No. 2 Preparacin del extracto de sen. 41
CUADRO No. 3 Tratamiento de las fracciones 7-22... 44
vi
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NDICE DE TABLAS
TABLA No. 1 Valores de absorcin para las BI y BII de los diferentes
flavonoides..............................
21
TABLA No. 2 Valores Rf y mximos de absorcin de algunas
antraquinonas.......... 21
TABLA No. 3 Determinacin de % de sub extractos............. 40
TABLA No. 4 Comparacin del sen y Senna multijuga. 41
TABLA No. 5 Resultados de propiedades fsicas y reacciones de coloracin del
extracto etanlico
56
TABLA No. 6 Determinacin de compuestos UV (cumarinas)......... 60
TABLA No. 7 Determinacin de compuestos UV (flavonoides)... 61
TABLA No. 8 Determinacin de compuestos UV (sesquiterpeno lactonas).......... 62
TABLA No. 9 Determinacin de compuestos UV (antraquinonas)... 62
vii
-
NDICE DE GRFICOS
GRFICO No. 1
TLC de Senna fructus y folium. 18
viii
-
NDICE DE FIGURAS
FIGURA No. 1 Estructuras de compuestos antracnicos . 3
FIGURA No. 2 Placa preparativa.. 17
FIGURA No. 3 Estructura de sensidos ........... 18
ix
-
NDICE DE FOTOGRAFAS
FOTOGRAFA No. 1 Martin Galvis, Senna multijuga 4
x
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NDICE DE ANEXOS
ANEXO No. 1 Tamizaje fitoqumico del extracto etanlico.. 78
ANEXO No. 2 Espectrofotometra UV...... 79
xi
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INTRODUCCIN
El empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una prctica que se ha utilizado
desde tiempo inmemorial. Durante mucho tiempo los remedios naturales, y sobre todo las
plantas medicinales fueron el principal e incluso el nico recurso que disponan los mdicos.
Esto hizo que se profundizara en el conocimiento de las especies vegetales que poseen
propiedades medicinales y ampliar su experiencia en el empleo de los productos que de ellas
se extraen.
En la actualidad las especies del gnero Senna han sido segregadas en dos gneros ms,
Chamaecrista Moench (250 especies) y Senna Mill. (250 especies) basndose en el detalle
androceo, de los frutos y la semillas se encuentran entre 2700 3800 msnm. Existen la Cassia
senna L.(Cassia acutifolia Delile, Senna alexandrine Mill) y Cassia augustifolia Valh, la
Cassia tora L. es utilizada en el Per como sustituto del caf, existe tambin la Cassia alata
L. (Senna alata L. Roxb), la Cassia occidentalis (Senna occidentalis L.) usada como laxante
y purgante.
Los vegetales del gnero Cassia o Senna son conocidas por la presencia de compuestos
antraquinnicos, reportados con diferentes acciones farmacolgicas. Estudios etnobotnicos
realizados en Cuba, reconocen a varias especies de Cassia como plantas que poseen inters
por sus propiedades medicinales y se reportan empleos tradicionales como antihipertensivos,
antiinflamatorios, antiinfecciosos, diurticos, antitumorales, antianmicos, antimicrobianos,
antiherpticos, anticatarrales, analgsicos, contra afecciones cutneas, para el tratamiento de
trastornos estomacales, espasmos, clicos nefrticos y clculos renales.
Se reporta como la accin ms reconocida de las quinonas detectadas en las plantas del gnero
Cassia la de laxante, por ejemplo, algunas antraquinonas presentes en el Sen (Cassia
angustifolia). Tambin se han reconocido los efectos beneficiosos de las hojas de estas plantas
en el tratamiento antiparasitario y contra infecciones cutneas de origen bacteriano y fngico.
La revisin bibliogrfica de la Senna multijuga indica se emplea en la Amazona ecuatoriana,
la infusin de Martin Galvis como antiinflamatorio.
En la Universidad Federal de Juiz de Fora, Laboratorio de productos Naturales Bioactivos, de
Brasil, se realiz un estudio sobre la actividad antimicrobiana y antioxidante de algunos
extractos de plantas en el que incluyen Senna multijuga, obteniendo resultado positivo para
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) por lo cual ha motivado el inters de investigacin para
realizar el anlisis de sus metabolitos secundarios.
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Con estas razones se plante los siguientes objetivos identificar la especie de Senna multijuga
existente en la Regin del Oriente Ecuatoriano Lago Agrio, Preparar el extracto y
subextractos, Identificar los grupos fitoqumicos por mtodos fsicos cromatogrficos,
Extraer, purificar y posible identificacin de metabolitos secundarios del extracto de Martin
Galvis (Senna multijuga).
Esta investigacin empieza con la identificacin taxonmica de la especie y una vez obtenida
el vegetal fue necesario que en conocimiento de que las antraquinonas son los metabolitos
secundarios presentes en las diversas variedades de Sennas se realiz la preparacin de los extractos etanlicos y sub extractos etreo, clorofrmico y butanlico seguida de la realizacin
del Tamizaje Fitoqumico para determinar la presencia de que grupos fitoqumicos estn
presentes en la composicin qumica de la Senna multijuga.
Posteriormente se separ, purific y se determin su posible estructura mediante mtodos
espectroscpicos (UV). Se hizo posible separar los metabolitos mediante la extraccin de
solventes orgnicos, separando cromatogrficamente ya sea en CCF, placa preparativa o en
columna y mediante las reglas de Woodward- Fieser la posible estructura de estos metabolitos
teniendo como resultado a los flavonoides, cumarinas, terpenoides y antraquinonas.
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CAPTULO I
1. MARCO TERICO
1.1 PLANTAS MEDICINALES
Plantas medicinales: Son aquellos vegetales que elaboran unos productos llamados principios
activos, que son sustancias que ejercen una accin farmacolgica, beneficiosa o perjudicial,
sobre el organismo vivo. Su utilidad primordial, a veces especfica, es servir como droga o
medicamento que alivie la enfermedad o restablezca la salud prdida; es decir que tienden a
disminuir o neutralizar el desequilibrio orgnico que es la enfermedad. Constituyen
aproximadamente la sptima parte de las especies existentes.(1)(3)(4)(20)
1.2 Cassia angustifolia-Valh (INDIA)
Los frutos y las hojas de la planta de sen contienen los llamados sensidos, que ejercen su
efecto laxante bien tolerado y seguro en destino, en el extremo del intestino grueso. Sensidos
actan en total: laxante. La motilidad intestinal es estimulada.
La liberacin de sodio y agua en el intestino se inhibe, por lo que ms agua que permanece en
el intestino y las heces se mantiene hmedo.
La afluencia de agua y electrolitos en el intestino se promueve.(26)(27)
Aplicacin
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- 2 -
Se recomienda el uso de sen como laxante estimulante con un estreimiento grave, si un
cambio en la dieta y agentes de relleno no han tenido el efecto deseado.
Adems, una aplicacin puede ser til para:
Enfermedades en las que un taburete suave es deseable, como las hemorroides, fisuras anales
o ciruga del recto-anal.
Limpieza del intestino antes y despus de la ciruga en el abdomen o de los rayos X.
Contraindicaciones No se debe utilizar Senna en:
Intestino (leo)
Apendicitis las enfermedades crnicas inflamatorias intestinales como la enfermedad de
Crohn, la colitis ulcerosa.
Dolor abdominal de causa desconocida
Deshidratacin severa.
Alergia al sen en el embarazo y la lactancia
Los nios menores de 12 aos
Efectos secundarios
Si se aplica correctamente, son efectos secundarios raros. En raras ocasiones puede causar
molestias gastrointestinales como calambres, que puede ser resuelto por una dosis ms baja.
Tambin puede ocurrir en algunos casos de reacciones alrgicas tales como picor, urticaria y
erupcin cutnea. (14)(27)
Interaccin
El uso a largo plazo no debe hacerse. En general, una aplicacin es suficiente de 1 a 2 semanas.
Si se abusa, puede causar una deficiencia de potasio. La deficiencia de potasio aumenta el
efecto de ciertos medicamentos, tales como glucsidos cardiacos (para la insuficiencia
cardaca) y antiarrtmicos (para trastornos del ritmo cardiaco). Por otra parte, las prdidas de
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- 3 -
potasio se ven reforzadas por ciertos medicamentos como los diurticos de tiazida,
Nebenierenrindensteroide (cortisona) y raz de regaliz.
Dosis
La dosis de la droga no debe exceder de 30 mg diario. Lo importante y til es una dosis
individual.
La diarrea o heces muy lquidas es un signo seguro de dosis muy altas o el uso frecuente de
esta droga.
El Senna est disponible en formas farmacuticas diferentes, por ejemplo en forma de
comprimidos o t. Los tees debe aplicarse en forma de infusin en fro, porque es mejor
tolerada.(47)
Componentes:
- Antraquinonas: Rehina, aloemodina, Sensidos A y B; C y D
- Flavonoides: Kamferol.
- cido crisofnico
- Cumarinas: visnadina
- sitosterol
- Aceites y resinas(11)((18)
FIG N1 ESTRUCTURAS DE COMPUESTOS ANTRACNICOS
FUENTE: http.quinonasp.pdf.co
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- 4 -
Kamferol Sitosterol
Uso Tradicional: las hojas de Senna se han utilizado tradicionalmente como una de las
principales recursos para el tratamiento de estreimiento.(32)(50)
1.3 Senna multijuga
FOTOGRAFA N1 MARTIN GALVIS, Senna multijuga FUENTE: http://www.henrietteesherbal.com
Senna es un gnero de la familia Fabaceae con alrededor de 250 especies. Es nativo de todas
las regiones tropicales con alguna de las especies distribuidas por las regiones
templadas.(43)(49)
http://es.wikipedia.org/wiki/Genushttp://es.wikipedia.org/wiki/Fabaceaehttp://es.wikipedia.org/wiki/Especies
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1.3.1 CLASIFICACIN CIENTFICA
Clase: Equisetopsida C. Agardh
Subclase: Magnoliidae Novk ex Takht.
Superorden: Rosanae Takht.
Orden: Fabales Bromhead
Familia: Fabaceae Lindl.
Gnero: Senna Mill.
Especie: Senna multijuga
1.3.2 DESCRIPCIN
Nombre comn: Martin Galvis
Forma de vida: rbol de hasta 12 m de alto y a. d. p. de hasta 40 cm, tronco derecho y copa
aplanada con las ramas ascendentes.
Corteza: externa lisa, pardo griscea, con numerosas lenticelas protuberantes dispuestas en
lneas horizontales. Interna pardo verdosa, ligeramente fibrosa de sabor muy amargo, exuda
un jugo verde amarillento. Grosor de la corteza de 7 a 8 mm.
Hojas: Dispuestas en espiral, paripinnadas, de 5 a 13 cm de largo incluyendo el peciolo,
compuestas por 20 a 50 pares de foliolos opuestos subssiles; laminas lineares con margen
entero y revoluto, pice redondeado y mucronado. Haz verde opaco y ligeramente glauco en
el envs con el margen pubescente.(43)(47)
Flor: En panculas o racimos axilares y terminales de 5 a 10 cm de largo, zigomorfas de 1.5 a
2.5 cm de dimetro, de color amarillo. Florecen de julio a enero.
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- 6 -
Fruto: Vainas de 10 a 15 cm de largo y de 1.5 a 2 cm de ancho, aplastadas con numerosas
septos angostos y paralelos, negras y glabras, cada septo contiene una semilla aplastada de 1
cm de largo, de color pardo brillante. Fructificacin de noviembre a febrero.
Distribucin: Esta especie se presenta en la vertiente del Golfo desde el sur de Hidalgo hasta
el norte de Chiapas. Es abundante en la vegetacin secundaria derivada de selvas altas o
medianas perennifolias y subperennifolias.
Usos: Se emplea frecuentemente como rbol de ornato. (50)
1.4 EXTRACTOS VEGETALES
Se define como extracto vegetal el producto lquido obtenido a partir de plantas o parte de
ellas con varios procedimientos y con varios solventes. (10)(39)
1.4.1 MTODOS DE EXTRACCIN
La extraccin slido-lquido es una operacin que est presente prcticamente en todos los
procesos tecnolgicos relacionados con la industria qumica y mdico-farmacutica; dentro de
sta, los mtodos de extraccin por maceracin y la percolacin o lixiviacin son los ms
utilizados. (18)(19)
1.4.1.1 Maceracin
El material crudo previamente triturado se pone en contacto duradero con cantidad suficiente
de solvente, en un tanque cerrado a temperatura ambiente durante 2-14 das hasta el
agotamiento de la droga vegetal. Puede utilizarse agitacin. Posterior a este tiempo la mezcla
es filtrada, el material insoluble es lavado con el mismo solvente y los filtrados se mezclan
para concentrar el extracto. (19)(20)
1.4.1.2 Percolacin o lixiviacin:
El material crudo previamente triturado se pone en contacto con cantidad suficiente de
solvente de forma tal que el solvente cubra la capa de slido en el tanque percolador. El
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- 7 -
solvente se renueva de modo continuo mantenindose un gradiente de concentracin, el
disolvente puro desplaza al que contiene la sustancia extrada sin ser necesario aplicar presin.
La droga residual es prensada y el fluido obtenido es combinado con el percolado para
concentrar el extracto. (23)
1.4.2 CLASIFICACIN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES
Dependiendo del grado de concentracin de los extractivos, los extractos pueden clasificarse
en:
-Extractos fluidos o lquidos
-Extractos semislidos o blandos
-Extractos secos (20)
1.4.3 PREPARACIN DE EXTRACTOS
Es importante establecer los parmetros de extraccin para lograr la estandarizacin del
proceso, esto garantizar la calidad, rendimiento, seguridad y eficacia del producto medicinal.
Por ejemplo: (1) (4)
Naturaleza qumica de la materia prima vegetal: conocer las caractersticas del metabolito
o compuesto qumico a extraer.
Seleccin del solvente: definir la selectividad del solvente a emplear, el solvente ptimo ser
el que logre extraer un mayor rendimiento del compuesto de inters.
Relacin slido-lquido: la proporcin ms conveniente de trabajo ser aquella con la que se
alcancen los mayores rendimientos de extraccin.(2)
Tamao de partcula del slido: de la forma y dimensin de los slidos depende en gran
medida el xito de la lixiviacin, a menor tamao de partcula, mayor superficie de contacto
entre la droga y el disolvente, y por tanto, mayor acceso de los principios activos al medio
lquido; no obstante, tamaos de partcula muy pequeos conducen a la formacin de polvos
demasiado finos, que pueden causar problemas en el proceso de extraccin.
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- 8 -
Temperatura: el aumento de la temperatura favorece la extraccin, hay que prestar especial
atencin cuando la sustancia de inters es termolbil o el menstruo es voltil, adems,
temperaturas elevadas pueden conducir a lixiviar cantidades excesivas de solutos indeseables.
(23)
Velocidad de agitacin y tiempo de extraccin: los ptimos valores de estos parmetros
sern aquellos que logren extraer un mayor rendimiento del producto. A mayor tiempo de
contacto, mayor capacidad tendr el disolvente para alcanzar el equilibrio de concentraciones.
Viscosidad del medio: no deben seleccionarse solventes de viscosidad relativamente alta.
El extracto vegetal obtenido se debe caracterizar en cuanto a: sustancias activas y marcadores,
densidad, solventes residuales, slidos totales, pH, control microbiolgico y volumen total.
(39)
1.4.4 ESPECIFICACIONES DE CALIDAD DE LA DROGA VEGETAL
Entre las especificaciones de calidad exigidas para la evaluacin de materias primas vegetales
con fines medicinales se encuentran:
Caractersticas macroscpicas (forma, tamao, caracteres superficiales, textura y
fractura).
Identificacin y cuantificacin de sustancias activas o marcadores.
Sustancias solubles.
Cenizas totales.
Materias extraas.
Contenido de agua.
Tamao de partculas.
Control microbiolgico.
Metales pesados(8)
http://www.monografias.com/trabajos13/ladrogcc/ladrogcc.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos11/conce/conce.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos14/problemadelagua/problemadelagua.shtml
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- 9 -
1.4.5 CONCENTRACIN DE EXTRACTOS
Toda vez que se ha realizado la etapa de extraccin y separacin, se procede a eliminar parte
del solvente de extraccin para aumentar el contenido de slidos en el extracto. Este proceso
se realiza a presin reducida con lo que se disminuye la temperatura de calentamiento
necesaria para la salida del solvente, el rotavapor es una buena alternativa para trabajos en el
laboratorio y es ampliamente usado mientras que sistemas anlogos se utilizan a escala
industrial (evaporadores, condensadores).
Tambin pueden utilizarse mtodos de precipitacin del principio activo, combinados con
etapas de filtracin, extraccin lquido-lquido, entre otras. (18)
1.4.6 EXTRACTO ETANLICO
De 100g de planta fresca y molida se coloca en un matraz erlenmeyer de 500mL y se deja
macerar con suficiente cantidad de etanol para cubrir completamente la planta. Despus se
filtra (papel filtro No. 4) u algodn y en un rotavapor se lleva a sequedad el extracto a 47oC
y a presin reducida. Se pesa el extracto seco y se coloca en un vial bien cerrado, en el
refrigerador (16)(23).
1.5 TAMIZAJE FITOQUMICO
El tamizaje fitoqumico o screening fitoqumico es una de las etapas intermedias de la
investigacin fitoqumica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos
qumicos presentes en una planta y a partir de all, orientar la extraccin y/o fraccionamiento
de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor inters. El tamizaje fitoqumico
consiste en la extraccin de la planta con solventes apropiados y la aplicacin de reacciones
de color y precipitacin. Debe de permitir la evaluacin rpida, con reacciones sensibles,
reproducibles y de bajo costo.
1.5.1 FUNDAMENTO
Se basa en pruebas preliminares sencillas y rpidas que permiten detectar cualitativamente la
presencia de determinados grupos de compuestos. Se ayudan de la micro qumica para
http://www.monografias.com/trabajos15/informe-laboratorio/informe-laboratorio.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos11/teosis/teosis.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos6/dige/dige.shtml#evohttp://www.monografias.com/trabajos/compelectropas/compelectropas.shtml
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- 10 -
evidenciar estos grupos de constituyentes mediante formacin de precipitados, coloraciones,
etc.
Estas reacciones se caracterizan son selectivas para las clases o grupos de compuestos que se
investigan, son simples y rpidas, detectan la mnima cantidad posible y utilizan un mnimo
de equipo de laboratorio (1) (3).
1.5.2 METODOLOGA EN EL ANLISIS FITOQUMICO
En trminos generales un anlisis fitoqumico debe comprender cuatro etapas bien definidas:
Recoleccin y clasificacin botnica de la especie en estudio.
Extraccin, separacin y purificacin de constituyentes qumicos.
Determinacin estructural, y
Ensayos farmacolgicas (1).
1.5.3 REACCIONES DE IDENTIFICACIN
Ensayo de Sudan
Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos grasos, para ello, a la alcuota
de la fraccin en el solvente de extraccin, se le aade 1 ml de una solucin diluida en el agua
del colorante Sudan III o Sudan IV. Se calienta en bao de agua hasta evaporacin del
solvente. La presencia de compuestos grasos se considera positiva si aparecen gotas o una
pelcula coloreada de rojo en el seno del lquido o en las paredes del tubo de ensayo
respectivamente.
Ensayo de Dragendorff
Permite reconocer en un extracto la presencia de alcaloides, para ello, si la alcuota del
extracto est disuelta en un solvente orgnico, este se debe evaporarse en bao de agua y el
residuo redisolverse en 1 ml de HCl al 1% en agua. Si el extracto es acuoso a la alcuota se le
aade 1 gota de HCl concentrado, (calentar suavemente y dejar enfriar hasta acidez). Con una
solucin acuosa cida se realiza el ensayo, aadiendo tres gotas de reactivo de Dragendorff, si
hay opalescencia se considera (+), turbidez definida (++), precipitado (+++).
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Ensayo de Mayer
A la solucin cida se le adiciona una pizca de NaCl en polvo, se agita y se filtra. Al filtrado
se le adiciona 2 3 gotas de solucin reactiva de Mayer, si se observa opalescencia se
considera (+), turbidez definida (++), precipitado coposo (+++).
En el caso de alcaloides cuaternarios y/o amino-xidos libres, stos slo se encontrarn en el
extracto acuoso y para considerar su presencia la reaccin debe ser (++) (+++), en todos los
casos, ya que un resultado (+), puede provenir de una extraccin incompleta de bases
primarias, secundarias o terciarias.
Ensayo de Wagner
Se parte de una solucin cida, aadiendo 2 3 gotas del reactivo de Wagner, y se reporta los
resultados de igual forma que en la reaccin anterior.
Ensayo de Baljed
Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos con agrupamiento lactnico, en
particular coumarinas, aunque otros compuestos lactnicos pueden dar positivo al ensayo.
Para ello, si la alcuota del extracto no se encuentra en alcohol, debe evaporarse el solvente en
bao de agua y redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1ml). En estas condiciones se
adicional 1 ml del reactivo, considerndose un ensayo positivo la aparicin de coloracin o
precipitado rojo (++ y +++) respectivamente.
Ensayo de Borntrger
Es til para detectar la presencia de quinonas.
Si la alcuota no est en cloroformo debe evaporarse el solvente en bao de agua y el residuo
redisolverse en 1 ml de cloroformo. Se adiciona 1 ml de hidrxido de sodio, hidrxido de
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potasio o amonio al 5%. Se agita mezclando las fases y se deja en reposo hasta su ulterior
separacin. El ensayo es positivo cuando la fase acuosa alcalina (superior) se colorea de
rosado, en este caso se reporta (++) o rojo, para lo cual se reporta (+++).
Ensayo de Lieberman Buchard
Permite reconocer en un extracto la presencia de triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos
de productos poseer un ncleo del androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la
posicin 5-6. Para ello, si la alcuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe
evaporarse el solvente en bao de agua y el residuo redisolverse en 1 ml de cloroformo. Se
adiciona 1 ml de anhdrido actico y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayo se dejan
resbalar 2-3 gotas de H2SO4 concentrado sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio
rpido de coloracin.
1. Rosado-azul muy rpido
2. Verde intenso-visible aunque rpido
3. Verde oscuro-negro-final de la reaccin
A veces el ensayo queda en dos fases o desarrollo de color. Muy pocas veces puede observarse
el primer cambio. El tercer cambio generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene
cantidades importantes de estos compuestos.
Ensayo de Resinas
Para detectar este tipo de compuestos, se adiciona a 2 ml de la solucin alcohlica, 10 ml de
agua destilada. La aparicin de un precipitado indica un ensayo positivo.
Ensayo de Fehling
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Permite reconocer en un extracto la presencia de azcares reductores. Para ello, si la alcuota
del extracto no se encuentra en agua, debe evaporarse el solvente en bao de agua y el residuo
redisolverse en 1-2 ml de agua. Se adiciona 2 ml del reactivo y se calienta en bao de agua 5-
10 minutos la mezcla. El ensayo se considera positivo si la solucin se colorea de rojo o
aparece rojo. El reactivo se prepara de la siguiente forma:
Solucin A: Se pesa 35 g de sulfato cprico hidratado cristalizado y se disuelve con agua hasta
un volumen total de 1000 ml.
Solucin B: Se pesa 150 g de tartrato de sodio y potasio y 40 g de hidrxido de sodio y se
disuelve con agua hasta un volumen total de 1000 ml.
Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezcla igual cantidad en
volumen de cada de ellas justo en el momento de realizar en ensayo. Dicha mezcla es la que
se adiciona a la alcuota a evaluar.
Ensayo de Espuma
Para reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como
triterpnica. De modo que si la alcuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces el
volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos.
El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del lquido de ms de 2 mm
de altura y persistente por ms de 2 minutos.
Ensayo del Cloruro Frrico
Permite reconocer la presencia de compuestos fenlicos y/o taninos en un extracto vegetal. Si
el extracto de la planta se realiza con alcohol, el ensayo determina tanto fenoles como taninos.
A una alcuota del extracto alcohlico se le adicionan 3 gotas de una solucin de tricloruro
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frrico al 5% en solucin salina fisiolgica (cloruro de sodio al 0.9% en agua). Si el extracto
es acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos.
A una alcuota del extracto se aade acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una
solucin de tricloruro frrico al 5% en solucin salina fisiolgica, un ensayo positivo puede
dar la siguiente informacin general:
- Desarrollo de una coloracin rojo-vino, compuestos fenlicos en general.
- Desarrollo de una coloracin verde intensa, taninos del tipo pirocateclicos.
- Desarrollo de una coloracin azul, taninos del tipo pirogalotnicos.
Ensayo de Shinoda
Permite reconocer la presencia de flavonoides. Si la alcuota del extracto se encuentra en
alcohol, se diluye con 1 ml de cido clorhdrico concentrado y un pedacito de cinta de
magnesio metlico. Despus de la reaccin se espera 5 minutos, se aade 1 ml de alcohol
amlico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen.
Si la alcuota del extracto se encuentra en agua, se procede de igual forma, a partir de la adicin
del cido clorhdrico concentrado.
El ensayo se considera positivo cuando el alcohol amlico se colorea de amarillo, naranja,
carmelita o rojo; intenso en todos los casos.
Ensayo de Kedde
Permite reconocer en un extracto la presencia de glicsidos cardiotnicos. Una alcuota del
extracto en etanol se mezcla con 1 ml del reactivo y se deja reposar durante 5-10 minutos. Un
ensayo positivo es en el que se desarrolla una coloracin violcea, persistente durante 1-2
horas. El reactivo de Kedee se prepara de la siguiente forma:
- Solucin 1: cido 3-5 dinitrobenzico al 2% en metanol
- Solucin 2: Hidrxido de potasio al 5-7 % en agua.
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Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezcla igual cantidad en
volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la
que se adiciona a la alcuota a evaluar.
Ensayo de Muclagos
Permite reconocer en los extractos de vegetales la presencia de esta estructura de tipo
polisacrido, que forma un coloide hidrfilo de alto ndice de masa que aumenta la densidad
del agua donde se extrae. Para ello una alcuota del extracto en agua se enfra a 0-5C, si la
solucin toma una consistencia gelatinosa el ensayo es positivo.
1.6 CROMATOGRAFA DE CAPA FINA
La I.U.P.A.C define la cromatografa de forma ms amplia. Para ellos es un mtodo usado
principalmente para la separacin de los componentes de una muestra, en el cual los
componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que
la otra es mvil.(21)(28)
1.6.1 CONCEPTO DE RF
Es el registro y se define como la distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicacin
/distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente.
Rf =Distancia recorrida desde el origen por el compuesto (Y)
Distancia recorrida desde el origen por el compuesto de referencia (X)
El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de absorbente,
eluyente, as como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturacin, etc.). Tiene
una reproductibilidad de +/- 20%, por lo que es mejor correr duplicados de la misma
placa.(30)(31)
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1.6.2 CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa.
Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna.
La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs
de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin (cromatografa flash).
La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo
en el fondo de sta un poco de algodn o lana de vidrio, para evitar que la slica o la almina
queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrase hasta el nivel del soporte. A
continuacin se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el
disolvente elegido, recogindose por lo general en tubos de ensayo. Una columna de
cromatografa es un tubo de vidrio relleno con una sustancia slida de propiedades adsorbentes
constituida por pequeas partculas: gel de slice y almina son las ms usadas. Este relleno
es lo que se conoce en cromatografa como la fase estacionaria. A travs de la columna se har
pasar una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada eluyente y/o fase
mvil .La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequea cantidad de disolvente
y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el
mismo.(30)(31)
1.6.3 CROMATOGRAFA PREPARATIVA
Las placas utilizadas en cromatografa preparativa son placas grandes, de aproximadamente
20x20 cm. que permiten separar aproximadamente 1 g. de mezcla utilizando unos 35 g. de
adsorbente.
La siembra de la muestra se realiza mediante la ayuda de una jeringuilla o tubo capilar. La
siembra se realiza a lo largo de una lnea recta (existen en el mercado diverso utensilios para
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evitar torcerse). Si al terminar la primera siembra todava queda muestra, se seca la primera
siembra y se aplica la segunda, intentando que sta quede sobre la anterior, para as conseguir
que el frente sea lo ms estrecho posible. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa.
Una vez sembrada la muestra se desarrolla la cromatografa. Se utiliza un adsorbente con
indicador fluorescente para ver en la lmpara ultravioleta donde han quedado las manchas de
los diferentes compuestos, dichas manchas se marcan.
Una vez localizados los compuestos, stos se extraen de la fase estacionaria, uno a uno, con la
ayuda de una esptula, sobre un papel de filtro u otro soporte. Posteriormente se coloca cada
componente en un erlenmeyer, y se mezcla con un disolvente (metanol). Una vez disuelto el
compuesto se filtra varias veces para separar el compuesto y la fase estacionaria. Una vez
separado se elimina el disolvente (destilacin), con lo cual se obtiene el componente separado.
Si no se dispone de indicador fluorescente, no se pueden usar reveladores qumicos sobre toda
la placa. El proceso a seguir es el siguiente: se raya la placa separando totalmente una pequea
franja de placa, sobre la cual se aplica el revelador qumico, y a partir de esta franja se marcan
las franjas de compuestos.(21)(30)
FIG:2 PLACA PREPARATIVA
FUENTE: http://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia-en-columna#ixzz2Msd2NjA
1.7 CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE Senna fructus y follum
Fase estacionaria: Slica gel
Solvente de corrido: n-propanol-EtOAc-H2O-cido actico glacial (40:40:29:1)
Muestra: Senna fructus y follum
http://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia-en-columna#ixzz2Msd2NjA
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Revelador: HNO3-KOH
Senna Fructus (1) y folium (2)
GRFICO N1 TLC DE Senna fructus y folium FUENTE: WAGNER.H. PAG 69.
Las zonas pardas corresponden a los sensidos B (T2),A(T1) :(Rf 0.25 y 0.40) y los sensidos
D,C (Rf 0.5 y 0.7). Las zonas amarillas indican a la rehina Rf 0.8 y sus glucsidos (Rf 0.3 a
0.6).
FIG:3 ESTRUCTURA DE SENSIDOS FUENTE: WAGNER.H. PAG. 71
1.8 ESPECTROFOTOMETRIA
La espectrofotometra se utiliza para identificar compuestos por su espectro de absorcin,
conocer la concentracin de un compuesto en disolucin.
La espectrofotometra surgi con el estudio de la interaccin entre la radiacin y la materia
como funcin de la longitud de onda ().
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1.8.1 ESPECTROFOTOMETRA ULTRAVIOLETA-VISIBLE
La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de
molculas, y adems, para determinar el contenido y fuerza de una sustancia.
Se utiliza de manera general en la determinacin cuantitativa de los componentes de
soluciones de iones de metales de transicin y compuestos orgnicos altamente conjugados
(30)(32).
Principio fsico
El principio de la espectroscopia ultravioleta-visible involucra la absorcin de radiacin
ultravioleta visible por una molcula, causando la promocin de un electrn de un estado
basal a un estado excitado, liberndose el exceso de energa en forma de calor. La longitud de
onda () comprende entre 190 y 800 nm.
La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia, stos son promovidos a estados
excitados (de energa mayor). Al absorber radiacin electromagntica de una frecuencia
correcta, ocurre una transicin desde uno de estos orbitales a un orbital vaco. Las diferencias
entre energas varan entre los diversos orbitales. Algunos enlaces, como los dobles, provocan
coloracin en las molculas ya que absorben energa en el visible as como en el UV (31)(32).
1.8.2 EL ESPECTROFOTMETRO
El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o
transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que
contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Esta espectrofotometra utiliza radiaciones del campo UV de 80 a 400 nm, principalmente de
200 a 400 nm (UV cercano) y de luz visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad
para caracterizar las soluciones en la regin ultravioleta-visible del espectro.
1.8.3 CARACTERSTICAS DEL SISTEMA
http://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3n_ultravioletahttp://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3n_ultravioletahttp://es.wikipedia.org/wiki/Electr%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metrohttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metro
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Las muestras en solucin se ponen en una pequea celda de Si.
Se utilizan dos lmparas: una de H o deuterio para la regin UV, y una de W / halgeno
para la regin visible
Se utiliza tambin una celda de referencia que contiene slo solvente.
La luz pasa simultneamente por la celda de muestra y la celda de referencia.
El espectrmetro compara la luz que pasa por la muestra con la que pasa por la celda de
referencia.
La radiacin transmitida es detectada y el espectrmetro obtiene el espectro de absorcin
al barrer la longitud de onda de la luz.
Consideraciones generales
La espectroscopia ultravioleta-visible es la ms limitada para la informacin de compuestos.
Los compuestos que tengan un cromforo o instauraciones son visibles en esta regin.
Los compuestos orgnicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugacin, tambin
absorben luz en las regiones del espectro UV. Los disolventes orgnicos pueden tener una
significativa absorcin de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso
en espectrofotometra UV. El etanol absorbe muy dbilmente en la mayora de longitudes de
onda. La polaridad y el PH del disolvente pueden afectar la absorcin del espectro de un
compuesto orgnico (32).
Los espectros de los flavonoides son determinados usualmente en solucin metanlica. El
espectro tpicamente consiste de dos mximos de absorcin en los rangos de 240-285 nm
(Banda II) y 300-500 nm (Banda I).
Podra indicarse como caractersticas de dihidroflavonas. Dihidroflavanoles e isoflavonas.(17)
-
- 21 -
TABLA 1.- VALORES DE ABSORCIN PARA LAS BI Y BII DE LOS DIFERENTES FLAVONOIDES.
TABLA 2.- VALORES RF Y MXIMOS DE ABSORCIN DE ALGUNAS ANTRAQUINONAS
FUENTE: http.quinonasp.pdf.com
1.9 REGLAS DE WOODWARD-FIESER
Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones empricas que pueden
utilizarse para predecir la longitud de onda de la absorcin ( max) UV-Visible,para
compuestos orgnicos conjugados como dienos y cetonas.
Banda II,nm Banda I, nm Tipo de flavonoide
250 - 280 310 - 350 Flavonas
250 - 280 330 - 360 Flavonoles
250 - 280 350 - 385 Flavonoles
245 - 275 310-330 Isoflavonas (5-deoxi-6,7
dioxi)
275 - 295 300-330 Isoflavonas,
dihidroflavonoles
230-270(baja intensidad) 340-390 Chalconas
230-270(baja intensidad) 380-430 Auronas
270-280 465-560 Antocianidinas,antocianinas
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- 22 -
Las longitudes de onda de los picos de absorcin pueden correlacionarse con los tipos de
enlace en una determinada molcula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales
dentro de la molcula. La absorcin UV- Visible no es sin embargo, una prueba especfica
para ningn compuesto determinado, la naturaleza del disolvente, el pH de la solucin, la
temperatura, la concentracin de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden
influir en los espectros de absorcin de los compuestos as como las variaciones en la anchura
de la hendidura (ancho de banda efectivo) en el espectrofotmetro (32).
Espectroscopa UV/Vis
Reglas de Woodward para compuestos carbonlicos conjugados
Valores bsicos:
X = R
Enona de partida con anillo de seis miembros o acclica =215 nm
Enona de partida en anillo de cinco miembros =202 nm
Dienona acclica =245 nm
X = H =208 nm
X = OH, OR =193 nm
Incrementos para
Doble enlace conjugado adicional 30
Doble enlace exocclico 5
Doble enlace endocclico en un anillo de 5- o 7- miembros para X = OH, OR 5
Componente dinico homocclico 39
Sustituyente alquilo o resto de anillo 10
12
o superior 18
Grupos polares
-OH 35
30
50
-OC(O)CH3 6
-OCH3 35
30
-
- 23 -
17
31
-Cl 15
12
-Br 30
25
-NR2 95
Correcin por disolvente max (calc'd) variable
1.9.1 APLICACIN DE LAS REGLAS WOODWARD-FIESER
Flavonoide (Kamferol (250,266,298,320nm)
-
- 24 -
Benzo y pirona246
OH (o) 7
OH (p) ......25
Exten.conj5
283nm
Terpenoide ( sitosterol (202-250nm))
Quinonas
Las antraquinonas muestran intensa absorcin bencenoide a 250 nm y de intensidad media
322 nm;la absorcin quinoidea fuerte se observa a 263 y 277 nm y una debil a 405 nm.(17)
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- 25 -
A=250 nm y 322 nm
B=quinoidea 263 y 272 nm debil a 405 nm
Crisofanol (228,257,277,289 nm)
Anillo A.250 Anillo B..263 Anillo C fenol.211
OH(o)7 OH(o).7 C=O(o)...3
C=O(o)..3 OH(o).....7 C=O(m...3
C=O(m).3 CH3(m)..3 CH3(m)...3
263 nm 280 nm 220nm
Rehina (230, 260, 432 nm)
Anillo A..250 Quinoide405
OH(o).7 ( A) OH(o).7
COOH(m)..3 COOH(p).10
260 nm (C) OH(o).....7
429 nm
-
- 26 -
Anillo base.204
OH(o).7
COOH(m)......7
C=O(o)...........3
C=O(o)...........3
224 nm
Cumarinas (274 - 311)
Las cumarinas muestran bandas de absorcin ultravioleta caractersticas a 274 y 311 nm las
cuales son atribudas a los anillos de benceno y pirona respectivamente.(17)
Benceno..274 Pirona.311
O(m)...7 O(m).......7
C(o)3 C(o)3
284 nm 321 nm
Sesquiterpeno lactona (250-270nm)
-
- 27 -
Enona cclica215 nm Enona cclica 215 nm
OH ()30 nm Exten.conj...5 nm
Enlace.conj.30 nm Residuo.......3 nm
Residuo....... 3 nm 223 nm 278 nm
-
- 28 -
CAPTULO II
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1 LUGAR DE INVESTIGACIN
La presente investigacin se llev a cabo en la Escuela Superior Politcnica de Chimborazo
en la Facultad de Ciencias:
Laboratorio de Fitoqumica
2.2 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
2.2.1 MATERIALES
2.2.1.1 Material vegetal
-Martin Galvis (Senna multijuga), recolectada en la Amazona Ecuatoriana (Puerto del
Carmen) por Lennin Rea.
2.2.1.2 Material de Laboratorio
- Tubos de ensayo
- Vasos de precipitacin
- Balones esmerilados de 1000mL.
- Pipetas de 1, 5 ,10mL
-
- 29 -
- Pinzas para tubos
- Gradillas
- Embudo simple
- Varrilla de vidrio
- Papel aluminio
- Papel toalla absorbente
- Frascos mbar de 10, 30, 50,1000 ml.
- Algodn
- Reverbero
- Mascarilla 3M
- Gafas
- Esptula
- Probetas
- Erlenmeyer
- Trpode
- Piceta
- Embudo
- Pera de succin
- Termmetro
- Cinta adhesiva
- Tapones de caucho para tubos
- Embudo de Separacin
- Capilares
- Cuba de vidrio
- Mandil Blanco
- Estilete
- Mangueras
- Regla
- Tijeras
-
- 30 -
- Borrador
- Cuaderno de apuntes
2.2.2 EQUIPOS
- Rotavapor (HEIDOLPH TYPE HEIZBAD HEI-VAP)
- Balanza analtica (BOECO GERMANY)
- Desecador
- Cmara Fotogrfica (SONNY)
- Refrigerador (ELECTROLUX)
- Estufa (MEMMERT)
- Cmara UV
- Refractmetro
- Espectrofotmetro
- Bomba de presin
- Computadora
- Peachmetro
- Sorbona
- Atomizador (Equipo de revelado cromatogrfico).
2.2.3 REACTIVOS
- Agua destilada
- Alcohol potable 96%
- Reactivo Dragendorff
- Reactivo Wagner
- Reactivo Sudan III
- Reactivo de Borntrger
- Reactivo Mayer
- Cloroformo
-
- 31 -
- Anhdrido actico
- cido sulfrico concentrado
- Hidrxido de potasio o Sodio
- Reactivo de Baljet
- Hidrxido de Sodio
- Metanol
- Tricloruro frrico al 5%
- Solucin de Ninhidrina al 5%
- cido sulfrico concentrado
- ter Dietlico
- cido clorhdrico concentrado
- Limaduras de magnesio metlico
- ter
- Benceno
2.3 MTODOS Y TCNICAS
2.3.1 RECOLECCIN
La Senna multijuga recolect Lennin Rea el 25 de Octubre del 2012 en la Amazona
Ecuatoriana, Puerto del Carmen a 900-1300 m.s.n.m., se trata de un rbol de hasta 12 m de
alto, el mismo debe estar en flor (amarillas) y estn dispuestas en racimos axilares y terminales
de 5 a 10 cm de largo incluyendo el peciolo, sus frutos se tratan de vainas de 10 a 15 cm de
largo aplastadas con numerosos septos angostos y paralelos, cada septo contiene una semilla
aplastada de 1 cm de largo y de color pardo brillante, sus hojas de color verde opaco, dispuestas
en espiral, paripinnadas, de 5 a 13 cm de largo incluyendo el peciolo.
2.3.2 COMPROBACIN TAXONMICA E IDENTIFICACIN BOTNICA
-
- 32 -
La identificacin taxonmica fue realizada por el Ing. Jorge Caranqui; curador del herbario de
la ESPOCH quien certific el ejemplar
2.3.3 PROCESAMIENTO DE MATERIA PRIMA: LIMPIEZA Y DESINFECCIN DEL
MATERIAL VEGETAL
- Se tomo el vegetal 587g con todas sus partes y se desecha sus partes secas y daadas,
impurezas y cuerpos extraos.
- Se lav con abundante agua sumergiendo en un recipiente con agua varias veces.
- Se sumergi el material vegetal en una solucin de hipoclorito de Sodio al 1%.
- Se elimina el hipoclorito de sodio del vegetal con abundante agua.
- Se dej escurrir a temperatura ambiente por 12 horas, hasta secarla.
- Se tritur toda la planta lo ms fino posible.
- Se almacen la droga evitando contacto con luz y humedad en bolsas de papel de ser posibles
estriles o de plstico.
2.3.4 OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS BOTNICO INICIALES
Para el desarrollo de esta investigacin se llevo a cabo el siguiente proceso, el mismo que fue
obtenido de todo el vegetal Martin Galvis (Senna multijuga).
1. En un recipiente de vidrio con su respectiva tapa, se transfiere la droga cruda triturada y
pesada, se humedece directamente con el etanol a 96, procurando que no quede lquido
residual. (generalmente se emplea por cada gramo de droga, 2mL de alcohol para la
humectacin). Macerar por 3-5 das.
2. A los 3-5 das se transfiere a un erlenmeyer de 1000mL el lquido obtenido por
decantacin.
-
- 33 -
3. Filtrar la solucin, para eliminar las impurezas.
4. El filtrado se coloca en un baln esmerilado (previamente pesado), para concentrar por
destilacin simple hasta 1/8 de su volumen inicial que da lugar al extracto.
5. El extracto se mantiene fuera del alcance de la luz y humedad.
2.3.5 PREPARACIN DE LOS SUB EXTRACTOS
2.3.5.1 Sub extracto Etreo
100 ml de extracto etanlico se trat con solventes de menor constante dielctrica e inmiscible
para separar los metabolitos secundarios de acuerdo a su polaridad; generalmente se procesa
en un embudo de separacin al que se aade unos 20 ml de ter dietlico, y se agit
suavemente, dejar en reposo hasta separacin en fases, la superior corresponde al ter II y la
inferior al etanol I.
La extraccin se lo realiz tantas veces fueron necesarias hasta que la parte etrea recobre su
estado inicial transparente lo cual indico la extraccin completa de los compuestos solubles
en ter.
Colocar en un baln esmerilado previamente pesado, concentrar al vaco, dejar en desecador,
posteriormente pesar.
2.3.5.2 Sub extracto Clorofrmico
A la fase etanlica I se agreg Cl3CH en un embudo de separacin agitar en forma circular y
dejar en reposo, se forman dos fases en este caso el cloroformo corresponde a la fase inferior,
la misma que se separa cuidadosamente.
Se procedi a realizar las extracciones necesarias hasta que el cloroformo no se coloree,
recobre su caracterstica de color inicial, el nmero de veces que se extrae depende de la
coloracin de la fase inferior.
Colocar todas las fases clorofrmicas en un baln esmerilado previamente pesado, concentrar
y pesar forma el sub extracto clorofrmico III
-
- 34 -
2.3.5.3 Sub extracto Butanlico
A la fase superior etanlica I contenida en un embudo de separacin agregar un volumen de
butanol agitar y dejar en reposo, posteriormente separar la solucin etanlica (fase inferior) de
la butanlica (fase superior) extraer cuantas veces sean necesarias hasta recobre el color inicial
del solvente puro. Las fases butanlicas se unen en un baln pesado concentrar por destilacin
normal se elimina el olor del solvente con aire comprimido, dejar en desecador, y pesar da el
sub extracto Butanlico IV.
La fase inferior correspondiente al etanol I, se concentra en un baln pesado y se tiene el sub
extracto etanlico. El producto que se obtuvo se envas en frascos mbar de vidrio, y se los
conserva en refrigeracin.
2.3.6 DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES ORGANOLPTICAS Y FSICAS
DE LOS EXTRACTOS
2.3.6.1 Color
Se procedi a colocar en un vaso de precipitacin limpio y seco se llen las 3 cuartas partes
con el extracto etanlico, se procedi a observar el color a tras luz, la presencia de partculas
y la transparencia.
2.3.6.2 Olor
Se determin con el olfato el olor caracterstico del extracto.
2.3.6.3 Aspecto
Se analiz el aspecto externo, teniendo en cuenta la limpidez de la muestra de ensayo. Es decir
la presencia o no de partculas.
-
- 35 -
CUADRO No. 1. ESQUEMA DE PREPARACIN DE LOS EXTRACTOS Y SUB EXTRACTOS
EtOH 96%
Macerar
Macerado Filtrar
Filtrado Vegetal que se elimina
Concentrar
Propiedades Fsicas
Extracto Etanlico I Alcuota
Tamizaje Fitoqumico
Alcuota 100ml
ter etlico 20ml c/vez
6 veces
Fase Etanlica I Fase Etrea CHCl3 20ml c/vez Concentrar
6 veces
Sub extracto Etreo II
Fase Clorofrmica Fase Etanlica Concentrar BuOH 20ml c/vez
6 veces
Sub extracto Clorofrmico III
Fase Butanlica Extracto Etanlico Final I
Concentrar
Sub extracto Butanlico IV
Senna multijuga triturada 587g
-
- 36 -
2.3.6.4 Determinacin de la densidad relativa
Se entiende por densidad relativa a la relacin entre masa de un volumen de la sustancia a
ensayar a 25C y la masa de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Este trmino
equivale a peso especfico.
Primeramente psese el picnmetro vaci y secos 2 C y llnese con la porcin de ensayo,
mantngalo a la temperatura de 25 C (1C) durante 15 min y ajuste el lquido al nivel
empleado, si es preciso, una tira de papel para extraer el exceso secar exteriormente el
picnmetro.
Se pesa cuidadosamente el picnmetro con la porcin de ensayo y se repite la operacin con
el agua destilada a 25 C, despus de limpio el picnmetro.
Expresin del resultado.
La densidad relativa a 25C se calcula por la siguiente frmula:
25 =Masa
Volumen
2.3.6.5 Determinacin del ndice de refraccin
Es una constante caracterstica de cada sustancia, la cual representa la relacin entre el seno
del ngulo de incidencia de la luz y el seno del ngulo de refraccin cuando la luz pasa
oblicuamente a travs del medio.
Para calibrar el equipo, se coloc sobre el prisma de medicin una gota de agua destilada,
utilizando para ello una varilla de vidrio que no tenga cantos agudos, y se seleccion la zona
del espectro visible que aparece en la lnea lmite del campo visual, moviendo el compensador
cromtico y colocando la interseccin del retculo sobre la lnea lmite de los campos claro y
oscuro.
Se coloc una gota de la muestra de ensayo sobre el prisma de medicin, se cerr el termo
prisma y se enfoc la luz por medio del espejo, de modo tal que la misma incidi sobre la
apertura de entrada del prisma de medicin, y se procedi igual que con el agua.
-
- 37 -
2.3.6.6 Determinacin del pH del extracto
La acidez o la alcalinidad de las soluciones acuosas se caracterizan por el valor del ndice de
hidrgeno (pH). El pH es por tanto un ndice numrico que se utiliza para expresar la mayor
o menor acidez de una solucin en funcin de los iones hidrgenos. Se calcula tericamente
mediante la ecuacin:
pH = - log [H+]
[H+ ] = actividad de los iones hidrgeno.
En la prctica la medicin del pH se lleva a cabo por medio de la lectura de pH en la escala de
un instrumento medidor de pH, ya sea igual o analgico. Esta lectura est en funcin de la
diferencia de potencial establecida entre un electrodo indicador y un electrodo de referencia
usando como solucin de ajuste de la escala del medidor de pH, una solucin reguladora del
mismo.
Se ajusta el equipo con la solucin reguladora de pH adecuada al rango en que se realizar la
determinacin. Posteriormente determnese el valor del pH de la muestra.
2.3.7 TAMIZAJE FITOQUMICO
El tamizaje se realiz en el extracto alcohlico del vegetal objeto de estudio. Se toma 10 mL
de extracto y se lo divide en tubos de ensayo, sobre los cuales se realiza las siguientes pruebas.
2.3.7.1 Ensayo de la espuma
Se aade sobre el extracto una proporcin igual de agua, se agita vigorosamente y se observa.
Permite reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como
triterpnica. De modo que si la alcuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su
volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos.
El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del lquido de ms de 2 mm
de altura y persistente por ms de 2 minutos.
-
- 38 -
2.3.7.2 Ensayo del H2SO4 concentrado
Por la pared del tubo de ensayo se deja caer cido sulfrico concentrado, una coloracin
fuertemente amarilla indica la presencia de flavonas y flavonoides, las flavonas forman un
complejo soluble color naranja o guinda, las chalconas y auronas forman coloraciones rojo-
guinda a rojo-azulado. (6) (49)
2.3.7.3 Ensayo de Shinoda
Permite determinar la presencia de flavonoides. En un tubo de ensayo se coloca una alcuota
de extracto, y se agrega una pequea cantidad de limaduras de Mg y unas gotas de HCl
concentrado.
La reaccin se considera positiva cuando se presenta coloracin amarilla, naranja, carmelita,
rosada o rojo guinda; intensos en todos los casos.
2.3.7.4 Ensayo del Cloruro Frrico
Se aade sobre el extracto de 2 a 3 gotas de Cloruro Frrico, y se observa.
Permite reconocer la presencia de compuestos fenlicos y/o taninos en un extracto vegetal.
1. Desarrollo de una coloracin rojo-vino, compuestos fenlicos en general.
2. Desarrollo de una coloracin verde intensa, taninos del tipo pirocateclicos.
3. Desarrollo de una coloracin azul, taninos del tipo pirogalotnicos.
2.3.7.5 Ensayo de Borntrger
Con este ensayo se determina la presencia de quinonas, para lo cual se tom una alcuota de
extracto en un tubo de ensayo y se agreg gotas de NaOH 5%, finalmente se aadi 1mL de
-
- 39 -
cloroformo y se observ la coloracin de la fase acuosa alcalina. El ensayo es positivo cuando
se presenta las siguientes coloraciones:
- Amarillo para Benzoquinonas
- Rosado para Naftoquinonas
- Violeta para Antraquinonas
2.3.7.6 Ensayo de Dragendorff
Este ensayo sirve para determinar la presencia de alcaloides, se aadi sobre una alcuota de
extracto 3gotas del reactivo de Dragendorff, y se observa, si hay opalescencia se considera
(+), turbidez definida (++), precipitado (+++).
2.3.7.7 Ensayo de Wagner
Este ensayo determina la presencia de alcaloides, a la solucin formada en el ensayo de
Borntrger, se le evapor el cloroformo, obtenindose un residuo al que se aadi 1mL de
EtOH, una gota de HCl y unas gotas del reactivo de Wagner (2g de yodo y 2g de yoduro de
potasio aforados a 100mL con agua), se agit suavemente, los resultados se clasifican as:
Opalescencia: (+)
Turbidez definida: (++)
Precipitado: (+++)
2.3.7.8 Ensayo de Rosenthaler
Permite comprobar en los extractos etanlicos la presencia de terpenos. Se tom una alcuota
de extracto etanlico, se adicion gotas de reactivo de Rosentaler (solucin 1% de vainillina
en EtOH y 5mL de H2SO4 concentrado) y se calent. Se considera positivo cuando se forma
una coloracin en gama de rosada a violeta o pardas.
-
- 40 -
2.3.7.9 Ensayo de Baljet
En un tubo de ensayo de coloc una pequea porcin de extracto etanlico y se aadi 2-3
gotas de cido Pcrico y gotas de KOH 5%.
Una coloracin anaranjada o rojiza indica que la prueba es positiva para
sesquiterpenolactonas.
2.3.7.10 Ensayo de Sudan III
Con este ensayo se determina la presencia de monoterpenos, entonces, se aadi a la muestra
1mL de una solucin diluida en agua del colorante Sudan III (solucin al 6% en partes iguales
de alcohol y glicerina.) Se calienta en bao de agua hasta evaporacin del solvente.
La presencia de compuestos grasos se considera positiva si aparecen gotas o una pelcula
coloreada de rojo en el seno del lquido o en las paredes del tubo de ensayos respectivamente.
(26) (28) (42).
2.3.7.11 Ensayo de Liebermann-Burchard
Mediante esta reaccin se determina triterpenos, esteroles y esteroides. En un tubo se coloc
una alcuota de extracto etanlico, se evapor a sequedad. Se disolvi el evaporado en 1mL
de CHCl3, y se aadi, por las paredes del tubo, 1mL de reactivo (anhdrido actico: H2SO4
(40:1), sin agitar.
Si forma un anillo verde la prueba ser positiva o puede darse el siguiente cambi (rpido) de
coloracin de verde-azul, pasando por verde intenso hasta llegar a negro en la interfase.
Tabla #3 Determinacin de % de sub extractos
Subextractos Peso del Baln vaco Peso del Baln vaco
+ muestra
% de muestra
-
- 41 -
2.3.8 ANALISIS CROMATOGRFICOS DEL EXTRACTO Y SUB EXTRACTOS
Con los resultados del tamizaje fitoqumico se procede a comprobar la presencia de
compuestos en placas de silicagel G F254 con solventes de recorrido para cada grupo
fitoqumico, y revelando en soluciones caractersticas propuesto en bibliografa siendo estos
Rosentaler para terpenos, Sulfato de Cerio para Flavonoides, KOH para cumarinas y
antraquinonas buscando los parmetros cromatogrficos, eficiencia, eficacia y resolucin para
la separacin de los metabolitos secundarios.
2.3.8.1 Comparacin cromatogrfica del sen y Senna multijuga
Cuadro N2 PREPARACIN DEL EXTRACTO DE SEN
5ml H2O y alcohol
Calentar e ebullicin
Centrifugar
Lquido pardo claro Extracto etanlico Sedimento pardo obscuro
Comparar CCF
Fase estacionaria de Slica gel G F254
Muestras: Extracto etanlico de Sen y de Senna multijuga
Solvente de recorrido: CH3COOH, H2O, EtOAc, 1 propanol; (1:30:40:40)
Revelador: KOH alcohlico
Etreo 117.1985 g 117.3485 g| 2.5%
Clorofrmico 117.2083 g 118.0113 g 13.68%
Butanlico 117.2199 g 118.1399 g 15.67%
Etanlico 117.2143 g 119.5843 g 34.82%
Sen(Cassia angustifolia)
triturado 0.5g
-
- 42 -
Al comparar la cromatografa del sen (1) y la Senna multijuga (2); determinamos que 4
manchas son similares en color y Rf. siendo as.
Tabla N4 COMPARACION DEL SEN Y Senna multijuga
Especificaciones Resultados
Sen Senna multijuga
Rf Rf
0.5
0.7
0.8
Sensido D pardo
Sensido C violeta
Rehina amarilla
0.5
0.7
0.8
Sensido D pardo
Sensido C violeta
Rehina amarilla
FUENTE: WAGNER.H. PAG 69.
Segn datos de bibliografa las manchas amarillas corresponden a antraquinonas agliconas
con Rf 0.8 a la rehina y sus glucsidos crisofanol; cafs y violeta Rf 0.5 y 0.7 sensidos D y
C . (CCF N1)
Cromatografa en capa fina de los sub extractos
Se realiz cromatografa de los 3 sub extractos: Sub extracto Etreo (II), Sub extracto
Clorofrmico (III), Sub extracto Butanlico (IV) con solvente de recorrido: C6H6, CHCl3,
EtOH; (3:5:2) y Revelador: Rosentaler. (CCF N2)
2.3.8.2 Separacin de metabolitos secundarios del sub extracto etreo II
El sub extracto etreo fue de 0.15g de color verde amarillento, mucilaginoso con olor
caracterstico al solvente.
Separacin por Cromatografa en Columna del Sub Extracto Etreo (II)
- De las fracciones #1 a #7 con C6H6
-
- 43 -
- De #8 al #11 con C6H6, EtOH; ( 90:10)
- De #12 a #16 con CHCl3 (100)
- De #17 a #22 con CHCl3, EtOH; (100:10)
Las fracciones se cromatografian para comprobar la presencia de metabolitos.
En las fracciones 1-6 se utiliz solvente de recorrido: C6H6 y revelado con Rosentaler las
muestras 4 y 5 presentan 3 manchas redondeadas con Rf 0,0; 0,59 y 0,9 se purifican en
placa preparativa corrida en y EtOAc (10:5) y revelado con Rosentaler.( CCF N4)
Las fracciones 7 a 22 corridas en C6H6 (100) y revelado con I2 tienen los mismos
metabolitos, se renen y se cromatografan en micro columna con tolueno; cido actico
93:3.7 revelado con Rosentaler da bandas coloreadas las fracciones de la 1 a la 3 es
transparente y tiene dos manchas redondas con Rf 0.53 y 0.94 posiblemente siendo
terpenos. (CCF N6)
Las fracciones 4-7 corridas con EtOAc tienen un Rf entre 0.36 a 0.40 ,la fraccin 8 corrida
en acetato de etilo presenta un compuesto a Rf 0.81, la fraccin 9 Rf 0.73; la fraccin 10
Rf 0.67 estas fracciones no se pudieron leer en el espectrofotmetro debido a que no exista
suficiente muestra.( CCF N7)
La fraccin 11 corrida con EtOAc 100% da 2 manchas se purifican en CCFP da un
compuesto 11a con Rf 0.58 max 284 y 11b Rf 0.67 max 304 nm .(CCF N8)
En las fracciones 13 a16 corridas en Tolueno, CH3COOH; (93:3.7) y revelado con KOH,
la fraccin 13 presenta un compuesto puro con Rf 0.68 posiblemente siendo una
cumarina.(CCF N9)
-
- 44 -
CUADRO N3 TRATAMIENTO DE LAS FRACCIONES 7-22
2.3.8.3 Tratamiento del Sub extracto Clorofrmico III
El sub extracto clorofrmico fue amarillo slido, corrido en CHCl3, MeOH ;(6:2) tenemos los
Rfs: 0.46, 0.48 y 0.93 (CCF N10).
No se pudo purificar debido a que no exista suficiente muestra.
2.3.8.4 Tratamiento del Sub extracto Butanlico IV
Separacin por cromatografa en columna
- El sub extracto butanlico 0.72g se fracciona; las fracciones 1-5 eludas con Hexano, B
Acetona ;(50:40).
- La 6 -10 con Acetona 100 %.
- La 11 a #13 con Acetona, MeOH; (5:10)
- La 14 a #19 con MeOH 100%
Comprobacin en CCF de las fracciones de la columna
-
- 45 -
En las fracciones 1-4 se utiliz como solvente de corrido Acetona, EtOAc; (2:1) y revelado
con Rosentaler dndonos manchas redondas de color rosado con valores de Rf1=0.42,
Rf2=0.43, Rf3=0.40, Rf4=0.43 se uni las que presentan igual valor de Rfs. (CCF N 11)
La cromatografa de las fracciones 5 a 9 en acetona, acetato de etilo 2:1 y revelada con
Rosentaler las fracciones 5 y 6 tienen un Rf tienen un Rf 0.42-0.41 se unen. Las fracciones
7 a 9 presentan Rf 0.19 y 0.42 se unen y separan en capa fina en las mismas condiciones.
(CCF N 12)
Las fracciones de 10 y 11 corridas con acetato de etilo, metanol 95:5 dan Rf de 0.25 y 0.44
se unen y separan en placa preparativa dan 3 bandas que se recuperan y se comprueba en
el mismo solvente dando banda 1 Rf 0.60 max 228 nm la 2 con Rf 0.46; la 3 con Rf 0.70
(CCF 13 y 14) al ser reveladas con Rosentaler son terpenos.
Las fracciones 15 y 18 corridas en MeOH y reveladas con Rosentaler dan Rf 0.24 y 0.61
purificadas en capa fina en acetato de etilo (100) dan Rf entre 0.25 y 0.91 con buena
resolucin cromatogrfica. (CCF 15 y 16).
La fraccin 19 corridas en Tolueno, EtOAc ;(80:20) y revelado con Rosentaler da 2
manchas que purificadas en capa fina la banda 1 Rf 0.75 max 227 nm y la banda 2 Rf 0.92
max 276 nm. (CCF N 17)
2.3.8.5 Purificacin de Metabolitos del Extracto Etanlico I
La cromatografa del extracto etanlico corrido en solvente de corrido en CH3COOH:H2O:
EtOAc: 1 propanol (1:30:40:40) y revelado con KOH alcohlico dan 6 manchas con Rf
definidos por lo cual se fragmenta en columna 1.37 g con el mismo solvente (CCF N18).
La cromatografa de las fracciones de 1-6 con solvente de corrido: CH3COOH, H2O,
EtOAc, 1 propanol; (1:30:40:40) y revelado con KOH alcohlico tenemos mezclas de
-
- 46 -
compuestos los que presentan Rf 0.50 y 0.70 son sensidos C y D.(CCF N19 ). En la
fraccin 6 tenemos un compuestos puro con Rf 0.42 con max 277, 283 y 302 nm.
Placa cromatogrfica de las fracciones de 7-12 con solvente de corrido: CH3COOH,
EtOAc, 1 propanol; (1:40:40) unir de la 10 -12 presentan similares Rfs y purificar para
realizar una microcolumna. (CCF N20).
La fraccin 2 corrido en EtOAc, MetOH; (45:15) con Rf 0.45 y 0.53 d a un compuesto
puro. (CCF N21). Para las muestras 3 y 4 se cambia el solvente con CH3COOH, EtOAc,
1 propanol; (1:40:40) en la que existe 1 compuesto puro con Rf = 0.24 a una max 227,
271 y 313 nm. (CCF N22).
-
- 47 -
Placa N1
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestra:
1. Extracto Etanlico del
Sen
2. Extracto etanlico
Senna multijuga
Solvente de recorrido: CH3COOH,H2O,EtOAc,1
propanol; (1:30:40:40)
Revelador: KOH
alcohlico
Placa N2
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Solvente de recorrido:
C6H6, CHCl3, EtOH;
(3:5:2) Revelador: Rosentaler Muestras:
Subextracto Etreo II
Subextracto
Clorofrmico III
Subextracto Butanlico
IV
Placa N3
Fase estacionaria de Slica
gel G F254
Muestras II : Fracciones 1-6
Solvente de recorrido: C6H6 Revelador: Rosentaler
1: Sen Rf1: 0.50
Rf2: 0.70
Rf3: 0.80
Rf4:0.82
Rf5:0.93
2: Senna multijuga
Rf1: 0.50
Rf2: 0.70
Rf3: 0.80
Rf4: 0.93
E: Etreo
C: Clorofrmico
B: Butanlico
Fraccin 4 y 5 Rf1: 0,0
Rf2: 0,59
Rf3; 0,90
-
- 48 -
Placa preparativa
II.4 y II.5
Solvente de recorrido:
C6H6
Revelador:Rosentaler
Placa N4
Fase estacionaria de Slica
gel G F254
Muestras: II.4 y II.5
Solvente de recorrido:
C6H6 EtOAc; (10:5)
Revelador: Rosentaler
Placa N5
Fase estacionaria Slica
gel G F254
Muestra del Extracto:
Fraccin de la columna 7-
17
Solvente de recorrido:
C6H6
Revelador: I2
Rf1: 0.0
Rf2: 0.23
Rf3:0.93
Rf1: 0.0
Rf2:0.58
Rf3:0.93
Fraccin 7 Fraccin 8 Rf1: 0.65 Rf1: 0.67 Rf2: 0.90 Rf2: 0.92
Fraccin 9 Fraccin 10 y 17 Rf1: 0.68 Rf1: 0.65 Rf2: 0.93 Rf2: 0.93
-
- 49 -
Placa N6
Fase estacionaria de Slica
gel G F254
Muestra II: 22.1-22.2
Solvente de recorrido:
Tolueno,
CH3COOH;(93:3.7)
Revelador: Rosentaler
Placa N7
Fase estacionaria de Slica
gel G F254
Muestra II:22.4- 22.7
Solvente de recorrido:
EtOAc
Revelador: Rosentaler
Placa N8
Fase estacionaria
de Slica gel G F254
Muestra II.: 22.8-
22.12
Solvente de
recorrido: EtOAc
(100%)
Revelador: CeSO4
# 1: Rf1= 0.53
Rf2= 0.94
#2: Rf1 = 0.53
Rf2= 0.92
# 4: Rf1= 0.38
#5: Rf1 = 0.40
#6:Rf1= 0.37
#7:Rf1= 0.36
#8: Rf1= 0.81
#9: Rf1=0.73
#10: Rf1= 0.67
#11: Rf1= 0.58
Rf2=0.67
#12: Rf1= 0.58
Rf2=0.67
-
- 50 -
Placa N9
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestra II: 22.13-22.16
Solvente de recorrido:
Tolueno, CH3COOH;
(93:3.7)
Revelador: KOH
Placa N10
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestra de Subextracto:
Clorofrmico III
Solvente de recorrido:
CHCl3,MeOH ;(6:2)
Revelador: KOH
alcohlico
Placa N11
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestra de Subextracto
IV: Fraccin 1-4
Solvente de recorrido:
Acetona,EtOAC; (2:1)
Revelador: Rosentaler
# 13:Rf= 0.68
#14:Rf = 0.68
#15:Rf= 0.69
#16: Rf= 0.71
Rf: 0.46
0.48
0.93
# 1:Rf= 0.42
#2:Rf = 0.43
#3:Rf= 0.40
#4: Rf= 0.43
-
- 51 -
Placa N12
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestra de Subextracto
IV: Fraccin 5-9
Solvente de recorrido:
EtOAc
Revelador: Rosentaler
Placa N13
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestra de Subextracto
IV: Fraccin de 10-14
Solvente de recorrido:
EtOAc,MeOH; ( 95:5)
Revelador: Rosentaler
Placa N14
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestras IV
11.1,11.2,11.3,11.4
Solvente de recorrido:
EtOAc,MeOH; ( 95:5)
Revelador: Rosentaler
#5:Rf= 0.42
#6:Rf = 0.41
#7:Rf= 0.18
0.42
#8: Rf= 0.19
0.40
#9: Rf= 0.19
0.38
#10:Rf= 0.25
0.44
#11:Rf= 0.25
0.44
#12: Rf=0.23
0.48
#13: Rf= 0.24
0.51
#14: Rf= 0.25
0.55
#1 Rf =0.60
#2 Rf =0.46
#3 Rf =0.70
#4 Rf =0.52
-
- 52 -
Placa N15
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestra de Sub extracto
IV: Fraccin 15-18
Solvente de recorrido:
MeOH 100%
Revelador: Rosentaler
Placa N16
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestra de Sub extracto
IV : 18.1 ,18.2,18.3
Solvente de recorrido:
EtOAc (100)
Revelador: Rosentaler
Placa N17
Fase estacionaria de
Slica gel G F254
Muestra de Sub extracto
IV: 19.1 ,19.2,19.3
Solvente de recorrido:
Tolueno,EtOAc ;(80:20)
Revelador: Rosentaler
#15:Rf= 0.24
0.61
#16: Rf=0.24
0.61
#17: Rf=0.61
#18: Rf=0.61
#1 Rf=0.25