Estandarización de técnicas moleculares para amplificar regiones cloroplastídicas y nucleares en el

material genético de Cedrela odorata, Cedrela montana y Cedrela fissilis en el Ecuador

Silvia Llerenaa, Claudia Segoviaa, b, Natalia Salinasa, c, Luiz Orlando de Oliveirad & Mónica Jadána

a Carrera de Biotecnología. Departamento de Ciencias de la Vida. Escuela Politécnica del Ejército. Sangolquí - Ecuador (alellerenag@gmail.com).

b Deparment of Biology. University of Florida. EEUU (claudia@ufl.edu). c Department of Agriculture. University of Oregon United States. EEUU (USDA)

d Departamento de Bioquímica e Biología Molecular. Universidad Federal de Viçosa. Brasil-MG.

Abstract— The genus Cedrela is native to the continental Ecuador with four species: C. odorata, C. montana, C. fissilis and C.nebulosa. Because of the valuable wood, the native trees of these species are now found only in scattered, remote areas in Ecuador. In the last decade, selective logging has reduced Cedar´s populations and as a consequence a substantial genetic degradation had occurred. In spite of their conservation status and priority, few molecular studies at local level had been carried out due to a lack of standardized methods to extract and amplify DNA from fresh leaves same as from herbarium specimens. In this study, the distribution and conservation rank of species of Cedrela in Ecuador are briefly described. Distribution maps are presented based on field collections, herbarium research and the application of geospatial software. Results showed that C. montana was restricted to the Ecuadorian highlands mainly in the western and eastern Andean montane cloud forest between 2200 to 2900 masl. C. odorata is the most widely distributed species in Ecuador, occupying areas in the lowland Amazon evergreen rainforests (210 to 250 masl), the North and Central Coast in the lowlands evergreen forests (330 to 432 masl), in foothill evergreen forests (805 to 825 masl), and the foothill semi-deciduous forests (400 to 700 masl), and the Galapagos islands (350 masl). While, Cedrela fissilis was only founded in the Amazon region in lowland evergreen forests about 200 to 510 masl. Cedrela nebulosa habits in Andean region about 1400 to 2000 masl. In addition, different standardized method for DNA extraction of Cedrela leaves were tested. The Riahi’s method showed lower levels of DNA contamination compare to Doyle’s one. Later, amplification conditions for chloroplast genes (trnT-trnL, trnS-trnG and psbB-psbF) and nuclear gene ITS (internal transcript spacer) were tested in different species and different populations. The Garcia et al´s method gave satisfactory results related to quality and concentration of the fragment obtained. This information contributes to define long and short term conservation and management goals of Cedar´s populations in Ecuador.

Keywords; Cedrela; ecoregion; altitude; chloroplast genes

I. INTRODUCCIÓN

La deforestación es un problema a escala mundial perdiéndose 13 millones de ha de bosque cada año, siendo América del Sur uno de los continentes con la tasa más alta (3,4 millones ha/año) (Mortinho, 2012). Ecuador tiene la tasa más alta de deforestación en Sudamérica con un 1.8% de pérdida anual de bosques (FAO, 2011).

Las causas de deforestación están relacionadas con la expansión urbana, ampliación de áreas para la agricultura y pastizales, ausencia de una vigilancia adecuada por parte del gobierno, alta demanda de productos de madera, explotación forestal e incendios forestales (García et al., 2011; Mortinho, 2012). En el Ecuador las principales causas de deforestación son las actividades económicas como el pastoreo, la agricultura, la urbanización y las actividades de los sectores madereros y petroleros (Zúñiga, 1999). En el caso de las petroleras, este impacto se ve incrementado por la construcción de carretera que contribuyen al acceso y asentamiento de los madereros (Viña, 2004).

El género Cedrela presenta una gran reducción del tamaño poblacional y de su rango de distribución debido a algunos de estos efectos de deforestación La mayor amenaza que sufre elcedro es la tala indiscriminada de árboles para proveer de materia prima a la industria maderera y de construcción. El cedro es cotizado por la alta calidad de su madera en cuanto a color, aroma, resistencia y durabilidad (Cavers, Navarro & Lowe, 2003; Hernández et al., 2007). Adicionalmente, la tala selectiva de árboles más grandes y mejor formados es una práctica común en el cedro que erosiona la calidad genética de las poblaciones (Varela, 1997; Palacios, 2011). Como consecuencia tres especies endémicas de Cedro están citadas en la Lista Roja de la IUCN (2011); C. fissilis está en peligro de

extinción y Cedrela odorata y C. nebulosa son consideradas como especies vulnerables.

A pesar de la relevancia económica que posee el género Cedrela, estudios sobre la situación actual de sus especies en el Ecuador son escasos o inexistentes (Varela, 1997; Palacios, 2011), en especial a nivel molecular lo cual es una limitación para plantear planes de manejo que preserven el Cedro. Este trabajo es pionero en nuestro país en producir datos moleculares con fines de conservación. Este estudio pretende determinar la distribución actual del género Cedrela en el Ecuador y estandarizar técnicas moleculares que aporten a futuros estudios de origen y evolución mediante análisis filogenéticos y filogeográficos de genes nucleares y cloroplastídicos lo cuales a más de contribuir al entendimiento de procesos evolutivos en Cedrela asociados con la distribución geográfica y cambios climáticos-geológicos pasados, proporcionarán una base técnica substancial para la toma de decisiones en cuanto a conservación mediante programas de manejo y protección del Cedro e incluso la posible reforestación de C. odorata y C. fissilis (Muellner, Pennington & Chase, 2009, García et al., 2011).

II. MATERIALES Y MÉTODOS

A. Recolección y conservación del material vegetal

Para iniciar la recolección de material vegetal se realizó previamente una recopilación bibliográfica de las ubicaciones

geográficas de las poblaciones del Cedro en el Ecuador. La información se obtuvo del Herbario Nacional del Ecuador (QCNE), del Herbario de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador (QCA), del Ministerio del Ambiente y del experto en Meliaceae, Ingeniero Walter Palacios.

Se recolectaron muestras foliares para la extracción de ADN y muestras botánicas (con estructuras reproductivas) que fueron depositadas en la colección de Cedrela del Herbario Nacional (QCNE). De cada individuo se tomaron de tres a cinco hojas jóvenes y se las guardó en sobres de papel con la respectiva codificación que describe la especie (primera sigla), la localidad (Segunda sigla) y el número de individuo (tercera sigla). Para preservar las muestras se siguió dos procesos: 1) secado, en el cual se colocó sílica gel en los sobres para deshidratar las muestras, y 2) congelación, proceso en el cual se mantuvo a - 20°C las muestras.

En el caso de Cedrela montana se recolectaron hojas de 69 individuos. Los sitios de recolección se ubicaron en la provincia de Pichincha en las localidades de Nono, Amaguaña, Yunguilla, Calacalí (en el Bosque Protector “El Cedral”) y en el cantón Pedro Vicente Maldonado. También, se colectó En la provincia de Tungurahua en la ciudad de Ambato. De la especie C. odorata se recolectaron 40 individuos. El material vegetal se recolectó en las provincias de Esmeraldas, Reserva Mache-Chindul, Orellana en el Parque Nacional Yasuní, en Galápagos y en Manabí en la Reserva Natural de Manglares-Churute y en la localidad de Bulu-Bulu (Fig. 1).

Figura 1. Mapa de distribución de las muestras recolectadas de Cedrela odorata (rombo rojo) y C. montana (rombo azul) en el Ecuador y de las muestras de Cedrela fissilis (rombo amarillo) proporcionadas por el QCNE y el QCA (GPS Visualizer).

Para la especie Cedrela fissilis, el material vegetal fue proporcionado por el Herbario Nacional del Ecuador (QCNE) y del Herbario de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador (QCA). Se obtuvo en total 7 muestras pertenecientes a las

provincias de Morona Santiago (1), Napo (4), Orellana (2). En total se recolectaron 116 individuos de Cedro, el tamaño de muestra por locación está en un rango de 1 a 17 individuos. Todos los sitios de recolección fueron georeferenciados

utilizando los GPS (Garmin Etrex Summit y Magellan Meridian Platinum).

B. Caracterización del rango geográfico de Cedrela en las Ecoregiones Ecuatorianas

Con la información recopilada del Herbario Nacional del

Ecuador (QCNE), del Herbario de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador (QCA), del Ministerio del Ambiente y del experto en Meliaceae, Ing. Walter Palacios, se realizó un mapa de distribución geográfica del género Cedrela en el Ecuador usando los programas GPS Visualizer y Garmin.

Los puntos GPS de las muestras recolectadas fueron usados en el programa GPS TrackMaker (Ferreira, 2008) para la construcción del mapa de ubicación de los sitios de recolección en las respectivas Ecoregiones. Los nombres y los códigos de las Ecoregiones donde se recolectaron las especies de Cedro fueron consultados en la base de datos de las Ecoregiones Terrestres del mundo del World Wildlife Fund (Olson et al., 2001) y por medio del programa FloppyGIS V1.0 (Dinakis, 2008).

C. Extracción y cuantificación de ADN genómico

El proceso de extracción de ADN se realizó usando hojas preservadas por congelación. Se probaron dos métodos de extracción, protocolo Doyle & Doyle (1987) y el protocolo modificado de Riahi et al. (2010).

Para cuantificar y visualizar la calidad de ADN extraído se emplearon geles de agarosa al 1% (p/v). Los geles fueron preparados con TBE 1X ((Tris base 0,45 M, Ácido bórico 0,45 M, EDTA 10 mM) y agarosa grado biología molecular. La agarosa se disolvió en el TBE 1X mediante agitación por 1 minuto a temperatura ambiente, seguido de un calentamiento de la mezcla por 3 minutos en el microondas. Seguido, se enfrió la mezcla y cuando alcanzó la temperatura de 50 ºC se tiñó con bromuro de etidio (5µl/250 ml de la mezcla). Esta mezcla se transfirió a la cubeta previamente preparada para que se solidifique.

La determinación de la cantidad de ADN extraído se realizó en base a la comparación de la intensidad de las bandas de ADN con las del patrón del marcador de peso molecular High DNA Mass Ladder. En el primer pocillo del gel se aplicó 4ul de marcador de peso molecular, y en el resto de pocillos se añadieron 7 µl de la mezcla resultante de 4 µl de agua destiladaautoclavada, más 2 µl de ADN y 1 µl de colorante tipo V. El colorante está compuesto de un producto básico intermedio (color naranja), que se transforma en el colorante propiamente dicho cuando se combina con el ADN formando una sal (esta reacción desencadena en un color azul), y de glicerol para hacer a la solución de ADN más pesada; estas características facilitan la carga del ADN en el pocillo y su visualización (Carson & Robertson, 2005). La corrida electroforética se

realizó a 120 V y 300mA durante 40 minutos. La visualización de los geles se la realizó en un transiluminador Locus L-PIX bajo luz UV. El gel resultante se fotodocumentó para su posterior análisis.

D. Amplificación de regiones cloroplastídicas y región nuclear (ITS) mediante PCR (reacción en cadena de la polimeraza)

Para la amplificación de fragmentos de ADN se emplearon los marcadores moleculares descritos en la Tabla I (García et al., 2011).

TABLA I. DETALLE DE LOS MARCADORES MOLECULARES CLOROPLASTÍDICOS Y NUCLEAR USADOS PARA LA AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS ESPECÍFICOS DE CEDRELA

Primer Gen Descripción Secuencia 5`a 3

Descrito

2 CpADN Región espaciadora entre los genes transportadores de ARN de treonina y de

leucina

CAAATGCGATGCTCTAACCT

Cronn et al.(2002)

aC CpADN Región espaciadora entre los genes transportadores de ARN de treonina y de

leucina

CGTAGCGTCTACCGATTTCG

Taberlet et al. (1991)

C CpADN Región espaciadora entre los genes transportadores de ARN de treonina y de

leucina

CGAAATCGGTAGA

CGCTACG

Taberlet et al. (1991)

D CpADN Región espaciadora entre los genes transportadores de ARN de treonina y de

leucina

GGGGATAGAGGGACTTGAA

C

Taberlet et al. (1991)

trnS CpADN Región espaciadora intergénica

GCCGCTTTAGTCCACTCAGC

Hamilton (1999)

trnG CpADN Región espaciadora intergénica

GAACGAATCACACTTTTACC

AC

Hamilton (1999)

psbB CpADN Región espaciadora intergénica

GTTTACTTTTGGGCATGCTTC

G

Hamilton (1999)

psbF CpADN Región espaciadora intergénica

CGCAGTTCGTCTTGGACCAG

Hamilton (1999)

ITS4 NrADN Espaciador interno transcrito del ribosoma nuclear de la subunidad 18S-26S (incluido gen

5.8S)

TCCTCCGCTTATTGATATGC

White et al. (1990)

ITSLEU NrADN Espaciador interno transcrito del ribosoma nuclear de la subunidad 18S-26S (incluido gen

5.8S)

GTCCACTGAACCTTATCATTT

AG

Baum et al. (1998)

En las reacciones de PCR se trabajó con un control negativo con el fin de comprobar la ausencia de contaminación en los reactivos. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en el termociclador Eppendorf AG modelo Mastercycler® pro. Las concentraciones de reactivos usados en la PCR fueron formuladas a partir de la investigación de García et al. (2011), las mismas se detallan en la Tabla II.

TABLA II. CONCENTRACIONES INICIALES, FINALES Y VOLÚMENES DE REACTIVOS PARA 1 REACCIÓN DE PCR DE 25 µL PARA LOS GENES CLOROPLASTÍDICOS Y DEL RIBOSOMA NUCLEAR AMPLIFICADOS

Reactivo Concentración inicial

Concentración final

Volumen final (µl)

PRIMER A2-aC H2O 10

Tampón IB (pHt) 10X 1X 2,5 MgCl2 (pHt) 50 mM 3,5mM 1,75 BSA (pHt) 10 mg/ml 1,5

dNTPs 2,5 Mm 0,2 mM 2 Primer A2 5µM (pmol/ul) 0,5 µM (pmol/ul) 2,5 Primer aC 5µM (pmol/ul) 0,5 µM (pmol/ul) 2,5

Go TAQ Promega © 5 U 1,25 U 0,25 ADN 20-50 ng/ul 40-100 ng 2

TOTAL 25

PRIMER C-D

H2O 9,5 Tampón IVB (pHt) 5X 1 x 5

BSA(pHt) 10 mg/ml 0,7 mg/ml 1,75 dNTPs 2,5 mM 0,25 mM 2,5

Primer C 5µM (pmol/ul) 0,4 µM (pmol/ul) 2 Primer D 5µM (pmol/ul) 0,4 µM (pmol/ul) 2 Taq (pHt) 5 U 1,25 U 0.25

ADN 20-50 ng/ul 40-100 ng 2

TOTAL 25

PRIMER trnS-trnG

H2O 10 Tampón IVB (pHt) 5X 1X 5

BSA(pHt) 10 mg/ml 0,7 mg/ml 1,75 dNTPs 2,5 Mm 0,2 mM 2

Primer trnS 5µM (pmol/ul) 0,4 µM (pmol/ul) 2 Primer trnG 5µM (pmol/ul) 0,4 µM (pmol/ul) 2

Go TAQ Promega © 5 U 1,25 U 0.25 ADN 20-50 ng/ul 40-100 ng 2

TOTAL 25

PRIMER psbB-psbF

H2O 10 Tampón IVB (pHt) 5X 1X 5

BSA (pHt) 10 mg/ml 0,7 mg/ml 1,75 dNTPs 2,5 Mm 0,2 mM 2

Primer psbB 5µM (pmol/ul) 0,4 µM (pmol/ul) 2 Primer psbF 5µM (pmol/ul) 0,4 µM (pmol/ul) 2

Go TAQ Promega © 5 U 1,25 U 0,25 ADN 20-50 ng/ul 40-100 ng 2

TOTAL 25

PRIMER ITS4-ITSLEU

H2O 8,5 Tampón IVB (pHt) 5X 1 x 5

MgCl2 (pHt) 50 mM 2mM 1 DMSO (pHt) 1.25

dNTPs 2,5 mM 0,2 mM 2 Primer ITS4 5µM (pmol/ul) 0,5 µM (pmol/ul) 2,5

Primer ITSLEU 5µM (pmol/ul) 0,5 µM (pmol/ul) 2,5 Taq pHt 5 U 1,25 U 0,25

ADN 20-50 ng/ul 40-100 ng 2

TOTAL 25

Fuente: García et al. (2011).

Las condiciones de temperatura y tiempo empleados en el termociclador para llevar a cabo la PCR se formularon a partir de la investigación de García et al. (2011) y son detalladas en la Tabla III.

TABLA III. CONDICIONES DE TIEMPO Y TEMPERATURA DE CADA FASE DE LA PCR

FASES

Espaciador intergénico trnT-trnL

Espaciador intergénico trnS-trnG

Espaciador intergénico psbB-psbF

ITS del ribosoma nuclear

(18S-26S)

A2-aC C-D trnS-trnG psbB-psbF ITS4-ITSLEU Temp ºC T min Temp

ºC T min Temp ºC T min Temp

ºC T min Temp ºC

T min

Denaturación inicial 95 5 95 5 96 5 96 5 94 4

3 4 C I C L O S

Denaturación 94 1 94 1 95 50 s 95 50 s 94 1

Alineamiento 60 1 52 1 58 1 58 1 49 1

Extensión 72 1½ 72 1½ 72 1 72 1 72 45s

Extensión final 72 5 72 5 72 5 72 5 72 5

Fuente: García et al. (2011).

Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 2 % mediante una corrida de electroforesis a 110V por 40 minutos. En cada pocillo se colocó la mezcla de 4µl de solución PCR junto con 4 µl de agua destilada autoclavada y 1 µl de colorante tipo IV. En el gel se incluyó también 4 µl del marcador molecular Tracklt 100 pb DNA Ladder para determinar los pesos de los fragmentos obtenidos. Se comparó la intensidad de las bandas de ADN con las del patrón de los marcadores de peso molecular. El gel fue visualizado bajo luz UV en el transiluminador Locus L-PIX, se fotoducomentaron estas imágenes para ser analizadas posteriormente.

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A. Distribución geográfica de Cedrela en el Ecuador

A gran escala se evidenció una clara división en la ubicación geográfica de las especies de Cedro (Fig. 2). Según las tres regiones en que está dividido el Ecuador (Región Costa, situada bajo los 1300 msnm (metros sobre nivel del mar) y dividida en las subregiones norte, centro y sur; Región Sierra: áreas sobre los 1300 msnm, posee las subregiones norte-centro y sur; y Región Amazónica u Oriente, por debajo de los 1300 msnm, dividida las subregiones norte y centro-sur; Sierra et al., 1999; Torres et al., 2008) las especies de Cedrela se distribuyen de la siguiente forma: Cedrela montana en la Región Sierra en alturas entre 2196 a 2913 msnm, Cedrela odorata en las Regiones de la Costa Centro e Insular y Regiones Costa Norte y Amazonía en alturas entre 214 a 825 msnm y Cedrela fissilis se encontró sólo en la Región Amazónica en altura entre 200 a 510 msnm (Fig. 3 A).

Figura 2. Mapa de distribución de Cedrela en el Ecuador. La simbología de las especies de C. odorata, C. montana (círculo rojo), C. fissilis (círculo gris) y C. nebulosa (círculo azul) se indica en la parte inferior derecha. Fuente: QCNE, QCA, Ministerio Ambiental del Ecuador

(GPS Visualizer-http://www.gpsvisualizer.com/).

B. Distribución de Cedrela asociado en las Ecoregiones Ecuatorianas

La distribución a nivel más específico basado en las clasificaciones de Ecoregiones de Olson et al. (2001), Sierra et al. (1999) y en la clasificación dada por el Ministerio del Ambiente (Báez et al., 2010) adaptada de la división de Josse et al. (2003) mostró una notoria preferencia de cada especie por diferentes Ecoregiones (Fig. 4) y por ende diferentes hábitats.

La especie más ampliamente distribuida fue Cedrela odorata, encontrándose en las siguientes Ecoregiones: Bosques húmedos del Napo (NT0142) (Olson et al., 2001) llamados también los Bosques Siempre verdes de Tierras Bajas de la Amazonía (Sierra et al., 1999) o Bosque siempre verde de la llanura no inundable de la Amazonía, donde el clima es cálido-húmedo con temperaturas medias anuales de 26ºC (Josse et al., 2003; Báez et al., 2010), en alturas desde 214 a 256 msnm (Fig. 3 B). También se presentó en la Ecoregión Bosques húmedos del occidente del Ecuador (NT0178) (Olson et al., 2001) o Bosques Siempre Verdes de Tierras Bajas de la Región Costa caracterizada por tener clima cálido ardiente y húmedo (Sierra et al., 1999; Josse et al., 2003; Báez et al., 2010), en alturas desde 330 a 432 msnm (Fig. 3 B). En el límite oeste de los Bosques montanos de los Andes del Noroeste (NT0145) (Olson et al., 2001) específicamente en los Bosques Siempre Verdes Piemontanos (Sierra et al., 1999) o Bosques pluviales Piemontanos de los Andes del Norte (Josse et al., 2003; Báez

et al., 2010) esta especie se ubicó en alturas entre 805 y 825 msnm (Fig. 3 B), donde el clima es pluvial húmedo termotropical (Báez et al., 2010).

Figura 3. Mapa de distribución geográfica de las muestras recolectadas de Cedrela odorata (rombo rojo), C. montana (rombo azul) y C. fissilis (rombo amarillo) asociadas a sus formaciones vegetales. Las Ecoregiones terrestres

donde se ubican tales muestras son las siguientes: NT0178, Bosque húmedos del occidente del Ecuador; NT0142, Bosque húmedos del Napo; NT1307, Matorral Xérico de las Islas Galápagos; NT0905, Pastizales inundados de

Guayaquil; NT0145, Bosques montanos de los Andes del Noroeste; NT0121, Bosques montanos en la Cordillera Real Oriental (Olson et al., 2001; Bow et al., 2008). Se muestra la codificación de los colores de las Ecoregiones (GPS

TrackMaker Versión 13.8, FloppyGIS v1.0).

Figura 4. Graficas de dispersión (A) del rango altitudinal según especie de Cedro y (B, C y D) según la Ecoregión en donde se distribuye cada especie.

En la formación vegetal Pastizales inundados de Guayaquil (NT0905) conocido a nivel nacional como Bosques Semideciduos Piemontanos de la Región Costa (Sierra et al., 1999) o Bosque tumbesino Deciduo Premontano (Josse et al., 2003; Báez et al., 2010) se encontró C. odorata en alturas desde 400 a 700 msnm (Fig. 3 B). En esta zona el clima es cálido seco fresco y podría encontrarse favorecido por el aporte de humedad de nubes atrapadas por la topografía y la proximidad al océano, con temperaturas que oscilan entre 17 a 24 ºC (Báez et al., 2010). En las islas Galápagos se lo encontró en la Ecoregión Matorral Xérico de las Islas Galápagos (NT1307) (Olson et al., 2001) a 350 msnm (Fig. 3 B), específicamente en la zona de Scalesia donde las lluvias son de 1000 mm anuales (2002).

De la distribución encontrada para C. odorata se determina que esta se encuentra adaptada a dos tipos de hábitat: cálido seco y cálido húmedo en las Regiones de la Costa Centro e Insular y en las Regiones Costa Norte y Amazonía, respectivamente (alturas entre 214 a 825 msnm). Esta adaptación ya ha sido registrada en estudios anteriores (Navarro & Vázquez, 1987; Navarro, 2002; Navarro Ward & Hernández, 2002), en donde se encontró que las poblaciones de C. odorata de los ambientes Xéricos (alta radiación solar y poca humedad) y Mésicos (mayor humedad y menor radiación) de Costa Rica difieren en características morfológicas y

adaptativas como el peso de la semilla, tamaño de plántula, diámetro del cuello de la raíz (RCD) de la plántula, tamaño de la hoja, peso de la hoja. Los valores mayores en las características morfológicas de las poblaciones de C. odorata de ambiente Xérico se atribuye a la adaptación para sobrevivir a la sequía (Navarro, 2002). Para comprobar si en las poblaciones ecuatorianas de C. odorata, los ambientes secos y húmedos causaron una presión selectiva y por ende su adaptación deben realizarse estudios morfológicos y ecológicos.

Cedrela montana se encontró restringida a la Región Sierra en dos Ecoregiones (Fig. 3 C): Bosques montanos de los Andes del Noroeste (NT0145) entre 2196 a 2913 msnm y los Bosques montanos en la Cordillera Real Oriental (NT0121) a 2830 msnm, a estas Ecoregiones les pertenecen los Bosques de Neblina Montano de los Andes Occidentales y Orientales (Sierra et al., 1999), respectivamente, o Bosques montanospluviales de los Andes del Norte (Josse et al., 2003; Báez et al., 2010). Estos Bosques se encuentran en zonas caracterizadas por la presencia frecuente de neblina en movimiento de donde extraen o capturan la humedad atmosférica (este fenómeno se denomina lluvia horizontal), la cual se suma a las precipitaciones normales. El clima es pluvial húmedo a hiperhúmedo termotropical y su suelo es bien húmedo y drenado (Torres et al., 2008; Báez et al., 2010).

Cedrela fissilis sólo se encontró en la Región Amazónica en la Ecoregión Bosque húmedos del Napo (NT0142) en alturas de 200 a 510 msnm (Fig. 3 D) compartiendo la distribución de C. odorata en la formación vegetal Bosques Siempre verdes de Tierras Bajas de la Amazonia (Sierra et al., 1999) en el Bosque Siempreverde de la llanura no inundable de la Amazonía (Josse et al., 2003; Báez et al., 2010). En Muellner et al. (2010) esta especie se vio altamente restringida a estos bosques siempre verdes.

Las regiones en donde fueron encontradas las especies de Cedrela se encuentran dentro de tres diferentes Hotspots de biodiversidad. C. odorata al ubicarse en la Región Costa (Reserva Ecológica mache Chindul y Reserva Natural Maglares Churute) esta dentro del Hotspot Chocó-Darién-Western Ecuador. Esta zona costera se encuentra bajo la amenaza más grave, ya que sólo aproximadamente el 2% de la cubierta forestal original permanece intacta. La principal amenaza es la deforestación a causa de la expansión agrícola, otras actividades que contribuyen a la deforestación en menor medida son los asentamientos humanos, expansión de pastizales por la ganadería, construcción de caminos, minería y tala de bosques (CEPF, 2005). Conjuntamente, Cedrela odorata y C. fissilis se ubicaron en la Amazonía en donde las principales causas de deforestación son las actividades económicas de los sectores madereros y petroleros (Zúñiga, 1999).

Cedrela montana al ubicarse en la Sierra ecuatoriana se encuentra en el Hotspot de los Andes tropicales. En esta región en el siglo 20 la revolución verde trajo importantes inversiones económicas que promovieron la industrialización de la agricultura. Esta actividad humana y otras como la ganadería extensiva y tala de bosques han fragmentados y aislado los ecosistemas en la región andina, disminuyendo la biodiversidad (Corrales, 2001; Jarvis et al., 2010; Herzog et al., 2011).

La distribución restringida al hábitat de cada especie de Cedro (Tabla IV) que coincide con zonas altamente deforestadas, como se vio anteriormente, convierten a estas especies en un grupo prioritario para la conservación debido a su vulnerabilidad a la extinción como resultado de actividades antropogénicas que destruyen o modifican el ambiente; en especial C. fissilis en calidad de especie rara (de distribución restringida y poblaciones poco abundantes) y en peligro de extinción (Ceballos, 2001). Al encontrarse los Hotspots ecuatorianos y la zona silvestre Amazónica en constante amenaza a más de la alta biodiversidad que poseen, son prioridad para la conservación, lo que contribuye a que todas las especies incluidas en estas áreas como lo es el cedro tengan más oportunidades de ser conservadas.

TABLA IV. RESUMÉN DE UBICACIÓN DE ESPECIES DE CEDRELA SEGÚN HOTSPOT, ECOREGIÓN, ECO-CÓDIGO Y FORMACIÓN TERRESTRE

Especie Hotspot (h) ó Región (r)

Ecoregión (Olson et al.,

2001)

Eco-código

Formación terrestre (Sierra et al., 1999)

Cedrela odorata Amazonía (r) Bosques

húmedos del NT0142 Bosques Siempre verdes de Tierras Bajas

Napo de la Amazonía

Choco-Darien (h)

Bosque húmedos del occidente del

Ecuador NT0178

Bosques Siempre Verdes de Tierras Bajas

de la Región Costa Pastizales

inundados de Guayaquil

NT0905 Bosques Semideciduos

Piemontanos de la Región Costa

Andes Tropicales (h)

Bosques montanos de los

Andes del Noroeste

NT0145 Bosques Siempre Verdes Piemontanos

Islas Galápagos (r)

Matorral Xérico de las Islas Galápagos

NT1307 Zona de Scalesia

Cedrela montana

Andes Tropicales (h)

Bosques montanos de los

Andes del Noroeste

NT0145 Bosques de Neblina

Montano de los Andes Occidentales

Bosques montanos en la Cordillera Real

Oriental

NT0121 Bosques de Neblina

Montano de los Andes Orientales

Cedrela fissilis Amazonía (r)

Bosques húmedos del

Napo NT0142

Bosque Siempreverde de la llanura no inundable de la

Amazonía

C. Extracción y cuantificación de ADN

Con el protocolo Doyle & Doyle (1987) se obtuvo una alta concentración de ADN, sin embargo, se obtuvo también una alta contaminación (Fig. 5).

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa al 1 % de soluciones de ADN de Cedrela odorata (O) de distintas poblaciones (Segunda sigla: Reserva Mache chindul: M, Yasuní: Y, Galápagos: G) extraídas con el método basado en el

protocolo Doyle & Doyle (1987).

La contaminación observada se atribuye a una limpieza deficiente ya que emplea un solo lavado con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Este paso sirve para que el cloroformo desnaturalice las cadenas polipeptídicas y el alcohol isoamílico las elimine por arrastre al unirse a las colas hidrofóbicas de las moléculas que quedan atrapadas en la interfase agua-cloroformo (Surzycki, 2000). Otro factor que aportó a la contaminación observada fue la gran cantidad de metabolitos secundarios que contienen las hojas de Cedro (Ribeiro & Lovato, 2007) como son los terpenoides, específicamente nortriterpenos amargos y tetranortriterpenos (meliacianinas y limonoides), los cuales dan el olor tan característico de ajo a las hojas (Muellner et al., 2003). También contiene alcaloides, fenoles, polisacáridos (Pérez, Eigenbrode & Hilje, 2012) y aceites volátiles (Maia et al., 2000, Nunes et al., 2007).

Con el método de Riahi et al. (2010) para extraer ADN de material vegetal con alto contenido de metabolitos secundarios la mayoría de individuos de Cedrela odorata y especialmente de Cedrela montana presentaron bandas bien definidas, sin degradación ni contaminación, y con una concentración de ADN adecuada (entre 10 y 50 ng/µl) (Fig. 6A) para ser

amplificación con genes ITS y cloroplastídicos. Sin embargo, las muestras de Cedrela fissilis fueron la excepción, en su mayoría no se logró extraer ADN de buena calidad (Fig.6 B).

Figura 6. Electroforesis en geles de agarosa al 1 % de las soluciones de ADN de Cedro (Primera sigla: C. odorata: O, C. nebulosa: N, C. fissilis: F y C.

montana: M) de distintas localidades ( Segunda sigla: Mache Chindul: M, Y: Yasuní, G: Galápagos, Bulu Bulu:B, El Cedrel: C, Pedro Vicente Maldonado:

P, Morona Santiago: M, Napo: N, Perú:P, Bolibia: B, Ambato: Ab) con el método modificado de Riahi et al. (2010). En los geles se indica la

concentración correspondiente a cada banda del marcador de peso molecular High DNA mass ladder INVITROGEN®.

Con el protocolo modificado de Riahi et al. (2010) la contaminación se eliminó, debido a los altos porcentajes de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) y de PVP (polivinilpirrolidona) que contiene el tampón de extracción (2%). El PVP se une a los compuestos fenólicos formando un complejo; y la buffer de lisis CTAB al tener una alta concentración de NaCl (5M) aumenta la solubilidad de los polisacáridos en etanol, reduciendo eficazmente la co-precipitación de los polisacáridos y ADN (Ribeiro & Lovato, 2007). Además, la remoción de los contaminantes en el protocolo Riahi et al. (2010) es más eficiente ya que incluye dos lavados con cloroformo alcohol isoamílico 24:1. Pero principalmente, la disminución de contaminación fue a causa del shock térmico que se usó en este protocolo, lo que aseguró la eliminación de metabolitos contaminantes e inhibidores de la PCR especialmente en las muestras de herbario (Vinson, 2012).

La calidad de ADN deficiente para las muestras de herbario de C. fissilis se debe a las condiciones de recolección (uso de alcohol) y preservación de muestras (proceso de desinfección refrigerando a 4ºC por una noche y secado en horno) empleadas en el herbario. Se usaron muestras de herbario de C. fissilis debido a la dificultad de recolección en regiones de difícil acceso (Fig. 1). En estudios realizados con muestras de herbario se ha visto, así mismo, que los métodos de recolección y preservación de material usado influyen directamente sobre la calidad del ADN obtenido y por ende en la amplificación del mismo (Ribeiro & Lovato, 2007). Otra limitante de obtención de ADN óptimo para estas muestras fue la cantidad limitada de material vegetal que se obtuvo (Riahi et al., 2010).

D. Amplificación de regiones cloroplastídicas y región nuclear (ITS) mediante PCR (reacción en cadena de la polimeraza)

Los productos amplificados mostraron una banda única de tamaño aproximado de 1000 pb (pares de bases) con el primer A2-aC (Fig. 7 A), 600 pb con el primer C-D (Fig. 7 B), 800pb con el primer trnS-trnG (Fig. 7 C), 750 pb con el primer psbB-psbF (Fig. 7 D) y de 750 pb con el primer ITS4-ITSLEU (Fig. 7 E). La presencia de una banda única y nítida para cada primer usado muestra que son primers específicos y que las condiciones usadas para la PCR (concentraciones, temperatura y tiempos) fueron debidamente optimizados. Estos primers al ser informativos para el género pero poco informativos entre especies se planea secuenciarlos para detectar polimorfismos.

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de productos amplificados de ADN de Cedro (C. odorata: O, C. nebulosa: N y C. montana: M) de

distintas localidades (Mache Chindul: M, Y: Yasuní, G: Galápagos, Bulu Bulu:B, El Cedrel: C, Pedro Vicente Maldonado: P, Nono: N, Amahuaña: A, Ambato: Ab) con los Primers (A) A2-aC, (B) C-D, (C) trnS-trnG, (D) psbB-

psbF y (E) ITS4-ITSLEU. A la derecha se indica el tamaño en pb de las bandas de acuerdo al marcador molecular Tracklt 100 pb INVITROGEN®.

Los factores que influyeron en la adecuada optimización fueron: 1) Correcta concentración de la enzima Taq polimerasa, ya que se visualizó fácilmente una banda específica; de haber existido falta de enzima la banda es difícil

A

B

A

B

C

D

E

de visualizar y de existir un exceso se generan productos inespecíficos (Surzycki, 2000; Pht, 2009) y 2) óptima concentración de primers, no se observó la presencia de primer-dimer (se muestran en el gel como bandas de 50 pb) que se dan por un exceso de primer (Surzycki, 2000). De la eficiencia de la PCR (bandas nítidas y únicas) dependen los resultados de la secuenciación por lo que su optimización es fundamental para un análisis contundente (SCAI, 2012).

El conocimiento de la distribución actual del género Cedrela y la estandarización de técnicas moleculares permitirán futuros estudios filogenéticos y filogeográficos que son herramientas para la conservación y mantenimiento a largo plazo de recursos genéticos (Newton et al., 1999 Cavers Navarro & Lowe, 2004). En este contexto, los resultados obtenidos contribuyen al desarrollo de estrategias de conservación para las especies de Cedro al permitir la identificación de unidades apropiadas para la conservación (Cavers et al., 2004; Herzog et al., 2011).

IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Las especies de Cedrela odorata, C. montana y C. fissilis mostraron una diferente distribución. C. montana se vio restringida a la Sierra en la Ecoregión de los Bosques de Neblina Montano de los Andes Occidentales y Orientales en alturas entre 2196 a 2913 msnm. C. odorata mostró ser la más ampliamente distribuida y la única adaptada a dos ambientes (Húmedo y Seco), ubicándose en la Amazonía en los Bosques Siempre verdes de Tierras Bajas en alturas desde 214 a 256 msnm, el la Costa Norte en los Bosques Siempre Verdes de Tierras Bajas Costa en alturas desde 330 a 432 msnm y en los Bosques Siempre Verdes Piemontanos en alturas entre 805 y 825 msnm, en la Costa Central en los Bosques Semideciduos Piemontanos en alturas entre 400 a 700 msnm y en la Región Insular en la zona Scalesia en la altitud de 350 msnm. Cedrela fissilis solo se encontró en la Región Amazónica en los Bosques Siempre verdes de Tierras Bajas en alturas de 200 a 510 msnm.

De la estandarización de técnicas moleculares se obtuvo que el uso de material vegetal congelado de Cedro junto con el protocolo modificado de extracción de ADN de Riahi et al. (2010) incrementaron la efectividad del proceso de aislamiento y disminuyeron notablemente la contaminación por contener altos porcentajes de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) y de PVP (polivinilpirrolidona) en el tampón de extracción, más un shock térmico y dos lavados con cloroformo alcohol isoamílico 24:1. En el caso de muestras de C. fissilis de herbario se observó que las condiciones de recolección (uso de alcohol) y preservación (proceso de desinfección refrigerando a 4ºC por una noche y secado en horno) afectan negativamente en la obtención de resultados óptimos de la extracción de ADN y por ende su la amplificación. En la estandarización de amplificación de regiones cloroplastídicas e ITS, las condiciones de PCR usadas en base a la investigación de García et al. (2011) y sus modificaciones proporcionaron resultados óptimos de amplificación resultando en una alta concentración (>50 ng/µl) y sin degradación.

Para futuras investigaciones a nivel molecular del género Cedrela se recomienda realizar las extracciones de ADN de material vegetal fresco y estandarizar un método de extracción a nivel de corteza por su fácil acceso. Se recomienda usar las condiciones optimizadas de extracción y amplificación de ADN, además, se recomienda secuenciar los productos amplificados y de esta forma mediante estadística bayesiana obtener la relaciones filogenéticas entre especies. Con estas relaciones entre especies, más los resultados geográficos encontrados se podrá determinar la Filogeografía del Cedro, es decir los procesos geológicos y climáticos pasados que influenciaron en su actual diversificación en el Ecuador. El conocimiento de estas relaciones evolutivas y geográficas permitirá la elaboración de estrategias de conservación eficaces y una reforestación adecuada, en especial de las especies en peligro de extinción y vulnerables de Cedro que tenemos en nuestro país.

AGRADECIMIENTOS

Un agradecimiento a la Escuela Politécnica del Ejército por el apoyo financiero. A los laboratorios de Biotecnología vegetal y Cultivo de Tejidos de la Carrera de Ingeniería en biotecnología y a la Dra. Karina Proaño (Escuela Politécnica del Ejército - Departamento de Ciencias de la Vida). Esta investigación se realizó gracias a fondos de la ESPE según la aprobación del proyecto de Iniciación Científica N° 2011-376-ESPE-b-1-UGI y gracias a los permisos de investigación científica N° 051-IC-FLORA-DPE-MA (10/11/11) y N° 15-FLORA-MAE-DPO-PNY (12/09/11).

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