ESTIMACION DE LA VIABILIDAD DEL POLEN

INTRODUCCION

La calidad del polen es de gran importancia en las investigaciones relacionadas con la

reproducción sexual, pues permiten asegurar el éxito de las hibridaciones e incrementar la

eficiencia del mejoramiento.

El medio ambiente en condiciones adversas puede afectar la viabilidad del polen limitando la

producción de la semilla botánica. El estrés de calor y frio provocan una disminución de la

cantidad y calidad del polen, lo que puede ser ocasionado por una menor cantidad de

nutrientes presentes en la antera, así como una reducción importante en el número de granos

formados como consecuencia del elevado porcentaje de aborto de células madre de polen y

de microsporas en diferentes etapas de su formación.

OBJETIVOS

Familiarizar con la técnica de determinación de la viabilidad de los granos de polen

Reconocer las partes del grano de polen

Diferenciar morfológicamente los granos de polen de las especies utilizadas en la

práctica

Determinar la viabilidad del polen de la muestra por el método de tinción.

REVISION BIBLIOGRAFICA

EL POLEN

Es el elemento germinal masculino, producido en las anteras de las flores, indispensable para

la fecundación y consiguiente transformación de la flor en fruto.

a) Características organolépticas:

Se presenta como un polvo cuyo color varía en relación con la especie de que procede, siendo

generalmente amarillo o café claro, aunque también se puede encontrar blanco, rosado,

anaranjado, verde, rojizo, violáceo e incluso negro. Es más difícil de observar sobre las flores

que el néctar.

Al igual que el color de los pólenes, el sabor y olor de los mismos son también variables según

su procedencia. El sabor varía desde el dulce al amargo. El olor resulta característico de cada

flor, independiente del de sus pétalos o del polen de otro tipo de flores.

b) Constitución:

Los granos de polen están constituidos por una sola célula provista de una pared muy compleja

denominada esporodermis, la cual por su estructura y composición química es idéntica a la de

las esporas de los Pteridófitos. Esta pared polínica o esporodermis, consta de dos capas

concéntricas: en el interior, la intina, delicada, celuloso-péctica, que envuleve de forma

continua al protoplasto; en el exterior, la exina, gruesa, constituida por esporopolenina, siendo

ésta una de las sustancias vegetales conocidas más resistente a los agentes químicos y

degradaciones enzimáticas.

Fig. 1. Esquema de un grano de polen binucleado.

En el 70% de las Angiospermas, la pared polínica rodea y protege a dos núcleos (pólenes

binucleados), los cuales difieren entre sí desde un principio en el aspecto y en el tamaño.

Posteriormente también en su funcionamiento. Uno, el más grande y redondeado, con

vacuolas y reservas, no interviene en los fenómenos sexuales propiamente tal, desempeñando

un papel nutricional para los núcleos generativos e interviniendo en la formación de la pared

del tubo polínico cuando el grano de polen germina. Es el llamado núcleo vegetativo. El otro,

núcleo reproductor o generativo, más pequeño y alargado en forma de media luna, carente de

vacuolas y reservas, interviene directamente en la fecundación (Figura Nº2). Para ello, y en un

estado más o menos avanzado de germinación del grano de polen o lo que es lo mismo ya

claramente producido el tubo polínico, originará dos núcleos generativos los cuales llevarán a

cabo la fecundación en el primordio seminal, que, como es sabido, en las Angiospermas es

doble. Un núcleo generativo se fusiona con la ovocélula y el otro con los núcleos que ocupan la

parte central del primordio seminal (núcleos polares) (Figura Nº3).

Fig. 2. Esquema de los estados de germinación del grano de polen y desarrollo del tubo

polínico.

En el 30% restante de las Angiospermas nos encontramos con granos de polen trinucleados:

Familias como Apiaceae, Asteraceae, Boraginaceae, Apocynaceae, Caprifoliaceae, Rubiaceae,

etc., poseen un polen de este tipo. Cada grano tiene un núcleo vegetativo y dos generativos

c) Formación:

El grano de polen se forma en el tejido esporógeno de los sacos polínicos, por meiosis de las

células madres del polen. Cada una origina cuatro granos de polen. Las cuatro células

haploides resultantes, forman en el interior de la célula madre una tétrada hasta su

maduración (en las Angiospermas Monocotiledóneas las cuatro células se disponen en un

mismo plano y no en tetraedros como en las Angiospermas Dicotiledóneas).

Estas células haploides se redondean, elaboran su propia pared y, degenerándose la de la

célula madre primitiva, quedan libres. Posteriormente se transformarán cada una en un grano

de polen, para lo cual engrosan su pared, diferenciándola en dos capas: una externa o exina y

una interna o intina; esta última originada posteriormente a la primera. Asimismo, estas

células o microsporas se dividen mitoticamente de una manera desigual en el interior de su

envoltura, formándose así dos núcleos, el núcleo vegetativo grande y otro pequeño y

fusiforme, que es el núcleo reproductor generativo. Este último puede quedar, o no, en una

posición excéntrica.

Los granos de polen así formados se deshidratan parcialmente y entran en vida ralentizada.

Están listos para ser diseminados, lo cual se producirá con la desecación de la antera. Por lo

general, son liberados por separado (mónadas o pólenes libres), aunque en algunos táxones se

libera la tétrada entera (pólenes compuestos), o incluso se libera el saco polínico entero,

formando poliadas.

d) Polaridad:

La tétrada juega un papel importante, pues ella es responsable de la disposición del grano de

polen, de su polaridad y, por ende, de su forma, así como también de la situación de las

aperturas.

En cuanto a la polaridad, cada grano de polen presenta un área proximal que corresponde a la

zona más cercana al centro de la tétrada y una zona distal que corresponde al lado externo

opuesto. El centro de cada una de las zonas se denomina polo, habiendo por tanto un polo

proximal y otro distal. La línea imaginaria que une ambos polos se denomina eje polar.

Además existe otra línea perpendicular al eje polar por el ecuador, llamada eje ecuatorial o

diámetro ecuatorial.

Fig. 4. Dibujo de un grano de polen

Según su polaridad, se denomina apolar al polen en el que una vez liberado de la tétrada no

pueden reconocerse las zonas polares, y polar al que presenta dos zonas polares más o menos

bien definidas. En este último caso es isopolar, el polen cuyas zonas polares son semejantes, lo

que ocurre normalmente, y heteropolar el que las presenta diferentes; se denomina

subisopolar al que tiene zonas polares ligeramente diferentes (Valdés, 1987).

Según Valdés (1987), los granos de polen pueden ser simétricos o asimétricos y según la

polaridad de los mismos se pueden distinguir los cinco modelos siguientes:

- Polen isopolar radiosimétrico: con un plano horizontal y dos o más planos verticales de

simetría de igual dimensión.

- Polen heteropolar radiosimétrico: sin plano horizontal de simetría.

- Polen isopolar bilateral: con tres planos de simetría, uno horizontal y dos verticales, los

últimos de distintas dimensiones, por lo que se reconocen dos diámetros ecuatoriales.

- Polen heteropolar bilateral: con dos planos de simetría, ambos verticales y de distintas

dimensiones.

- Polen asimétrico: con ningún plano de simetría, pueden ser tanto apolares como

heteropolares.

e) Morfología:

Se podría considerar a los granos de polen como pequeñas esferas, pero la realidad es que

pronto se deforman debido a la discontinuidad física de la pared que los recubre (sistema

apertural) y a la acción del medio (natural o artificial) que los rodea, por lo general causante de

turgencias y plasmólisis que el mecanismo harmomegático de los granos (las aperturas

permiten cambios de volumen para la acomodación del polen a distintos grados de humedad =

harmomegatia) no puede neutralizar.

Debido a que la forma del grano de polen está sometida a cambios, y siendo un carácter

importante en los estudios polínicos, los palinólogos acordaron referir la misma a granos

acetolizados en evitación de desuniformidades en las descripciones palinológicas, y considerar

al menos dos formas observadas al microscopio óptico: una en vista polar (corte óptico

ecuatorial), cuando el haz luminoso es paralelo al eje polar; y otra, en vista ecuatorial (corte

óptico meridiano), cuando éste es perpendicular.

Según Valdés (1987), la forma del polen se define de dos maneras: utilizando la razón de los

ejes polar y ecuatorial (P/E) y describiendo el contorno del mismo, tanto en visión polar, como

ecuatorial. Pero para razones de este trabajo sólo nos referiremos al primer criterio de

clasificación en cuanto a la forma del polen, porque ésta fue utilizada en la descripción de ellos

y además se agrega, más adelante, un segundo criterio de selección del autor Calvin Heusser,

que también fue utilizada.

Para Valdés (1987), según la razón P/E, pueden distinguirse nueve tipos de pólenes:

La forma del polen es el primer criterio de identificación, y los reconoce como se presenta a

continuación:

- Los pólenes bilateralmente simétricos son clasificados como: Plano-convexo, concavo-

convexo y biconvexo. Cuando son mirados lateralmente o ecuatorialmente, y son

generalmente elípticos en vista polar.

- Los tipos radiosimétricos caen dentro de varias clases, dependiendo de los radios de

sus ejes polares y ecuatoriales, de ahí la razón P/E.

- El amb (contorno del polen en vista polar) de granos de polen radiosimétricos es:

circular, triangular y poligonal o representado por alguna modificación de estas

formas.

f) Tamaño y cantidad:

Según la longitud del eje más largo, se pueden distinguir seis grupos de pólenes, que se indican

en la tabla Nº 5.

En cuanto al número de granos de polen que originan las anteras se puede decir que es muy

variable y, por lo general, muy elevado.

Tabla Nº5: Tipos de pólenes según longitud del eje mayor (Observación: no siempre el eje

polar coincide con el eje mayor)

g) Estructura:

Las capas que rodean y protegen los granos de polen constan de dos complejos de estratos, ya

indicados anteriormente, la exina y la intina.

La intina envuelve al protoplasto sin solución de continuidad, suele ser delicada y

químicamente poco resistente. Muchas veces se observan en ella dos o tres estratos, de los

cuales el más externo contiene a menudo, abundante pectina que facilita la separación entre

intina y exina; en el estrato interior o medio los elementos fundamentales son fibrillas de

celulosa. Al germinar el grano de polen, solamente la intina se desarrolla para dar el tubo

polínico.

La intina junto con el contenido celular, es eliminada por el procedimiento acetolítico,

quedando exclusivamente la exina, en la que estudian los caracteres necesarios para

diferenciar a unos táxones de otros. Por lo tanto, uno de los objetivos principales en los

estudios palinológicos radica en la exina.

La exina, como ya fue indicado, está constituida esencialmente por esporopoleninas,

químicamente muy resistentes y degradables sólo por oxidación. Se trata de terpenos, los

cuales parece ser que se originan por polimerización oxidativa de carotenoides o ésteres de los

mismos .

En general, en la mayoría de las Angiospermas la exina está formada por un conjunto de

elementos radiales, llamados columelas o báculos, que pueden soportar una estructura

continua o perforada denominada téctum y cuyas bases siempre se funden formando un

soporte común (Valdés, 1987).

Tiñendo con fucsina básica se observan dos capas con distintas apariencias de colorante, un

estrato superior o capa basal (foot-layer) y una capa inferior, menos densa a la luz y

denominada endexina.

Fig. 5. Esquema de los componentes de la exina.

La estructura según Heusser (1971), puede ser:

- Tectada: cuando los granos de polen poseen un téctum sobre la mayor parte de la

superficie.

- Intectada: cuando existe ausencia de un téctum, esto es, sin una escultura de ectexina

fusionada que forma una membrana o téctum por fuera de la endexina.

- Semitectada: cuando el téctum está desarrollado sólo parcialmente sobre el grano de

polen, por lo tanto, es transicional entre tectada e intectada.

h) Escultura:

Los términos ornamentación y escultura del grano de polen son sinónimos, siendo empleados

indistintamente por muchos autores. Estos términos se refieren únicamente a los caracteres

geométricos externos de la exina, la superficie del téctum y los elementos supratectales, no

considerando la estructura interna.

La ornamentación del grano de polen es enormemente variada. A continuación se indican los

tipos de escultura más frecuentes según Heusser (1971):

Baculada: Tipo de escultura que consiste en baculas.

Clavada: Tipo de escultura que expone clavas o elementos en forma de garrotes.

Echinada: Tipo de escultura con punteado de por lo menos 1 μ de altura. Sus

componentes son llamados echinis.

Estriada: Tipo de escultura que consiste en lomas paralelas, llamadas vallas, y estrías.

Fossulada: Tipo de escultura ranurada o surcada.

Foveolada: Tipo de escultura donde los pits son por lo menos de 1 μ de diámetro.

Estos pits se denominan foveas.

Gemmada: Tipo de escultura consistente en gemmas.

Psilada: Tipo de escultura que posee una superficie lisa o con pits menores a 1 μ en

tamaño.

Reticulada: Escultura que expone un diseño de red o de retículo. Esta puede ser

homobrochada cuando los brochis del retículo son uniformes en tamaño o

heterobrochada cuando los brochis del retículo no son uniformes en tamaño.

Rugulada: Tipo de escultura que contiene rugulas.

Scabrada: Tipo de escultura con elementos menores a 1 μ de tamaño y radialmente

más o menos isodiamétricas.

Verrucada: Escultura que contiene verrucas.

i) Aperturas:

Es uno de los caracteres prioritarios en la descripción de los granos de polen.

La exina está generalmente provista de áreas adelgazadas o interrumpidas, por lo común

especialmente delimitadas, llamadas aperturas, las cuales son variables en número y posición,

así como en morfología, que pueden permitir la salida del tubo polínico y la regulación del

volumen hídrico para la acomodación del polen a distintos grados de humedad

(harmomegatia).

Algunos pólenes carecen de aperturas, denominando a éstos como inaperturados. Pero, por lo

general, los pólenes presentan de una a muchas aperturas, que básicamente son de dos tipos:

largas o colpus y cortas o poros.

Los colpus son aperturas alargadas y paralelas al eje polar, y en la mayoría de los casos

recubiertas por una fina capa de exina. Esta fina capa es la llamada membrana del colpus.

Suele ser elástica, lisa o con analogía con el resto del grano, aunque en este último caso tendrá

menos relieve y sólo se conservarán fragmentos.

El número de colpus varía de 1 a 30, incluso más. La presencia de un solo colpus es

característico de las Angiospermas Monocotiledóneas.

El número y disposición de los colpus, cuando hay más de uno, depende de la posición y modo

de formación de los granos de polen en la tétrada, pues los colpus se forman sobre la

superficie de contacto de un grano de polen con los otros granos hijos, en un estado inicial de

su desarrollo. El colpus de los granos monocolpados se encuentra situado en la cara distal.

En las Angiospermas Dicotiledóneas lo frecuente es encontrarnos con granos tricolpados.

En los granos tricolpados, la longitud de los colpus, así como sus bordes y formas, son

variables. En cuanto a lo primero, no llegan a los polos. El conjunto de los tres colpus sólo es

visible en visión polar. En visión ecuatorial sólo uno o dos colpus serán visibles y el resto

podrán ser observados por transparencia a través del grano de polen.

En los tetracolpados, los colpus están en el ecuador a distancias iguales, pero en la mayor

parte de los casos no siguen los meridianos, sino que pasan oblicuamente por el ecuador y se

unen dos a dos en cuatro puntos formando ángulos de 120º.

Si las aperturas alargadas se disponen no paralelas al eje polar del grano de polen, sino que

perpendiculares al mismo, se denominan sulcos, y si se encuentran en cualquier otra posición,

rugas. A veces, las aperturas se disponen en espiral (polen espiraperturado).

Se denomina mesocolpia al área delimitada por dos colpus adyacentes y al resto de la

superficie como apocolpia. El grano de polen sincolpado, es aquel que presenta los colpus

unidos en uno o ambos polos.

En cuanto a los poros, que son orificios de la exina, son muy variables en número pudiendo

oscilar desde uno en Poaceae a más de cien en Chenopodiaceae. El número y forma, en

general, se mantiene constante para un determinado grupo.

La posición de los poros está estrictamente determinada para una especie dada. En los granos

monoporados, el poro se encuentra en posición distal.

Si los granos de polen tienen tres o más poros, se disponen generalmente equidistantes en el

ecuador. Cuando los granos de polen no sólo tienen colpus, sino también poros (pólenes

colporados), estos se disponen normalmente en el centro.

El área delimitada por dos poros adyacentes se denomina mesoporia, y al resto de la superficie

apoporia.

En el plano, el poro se presenta generalmente como una abertura redondeada o más o menos

oval; esta abertura tiene un contorno doble por los diferentes niveles de la exina. La sección

mayor se ve por transparencia y corresponde al contorno exterior; el contorno interior es la

sección más pequeña.

En un corte óptico se ve la disposición de las capas de la exina alrededor del poro. Puede

ocurrir que las capas de la exina no se desdoblen, es decir, que no exista separación entre las

partes interna y externa de la exina; son los poros sin cámara o vestíbulo. Por el contrario, en

otros casos se produce la separación entre dichas partes de la exina, originando una cavidad

por debajo de la ectoapertura; en este caso se habla de poros con cámara o vestíbulo.

Las aperturas varían en su disposición pudiendo disponerse:

En los polos (aperturas polares)

En el ecuador

En toda la superficie

Los colpus o poros pueden afectar a la ectexina (ectoaperturas) o bien a la endexina

(endoaperturas). Si afectan a una sola capa, se habla de aperturas simples; de aperturas

compuestas, cuando afectan a ambas capas (ectexina y endexina), siendo, en este caso, las

aperturas diferentes en forma y tamaño. A veces, afectando a ambas capas, no se presentan

tales diferencias, por lo que en este caso se consideran como aperturas simples.

Polen típico de Vicia sp. (fig. 6)

Mónada, isopolar, radiosimétrico; Prolado; Amb circular; Estructura tectada; Escultura

rugulada en latitudes inferiores y llegando a ser psilada hacia los polos; Tricolporado, colpi

moderadamente largos, ensanchados ecuatorialmente donde está el poro, estrechándose, en

gran medida meridionalmente, costae evidente, poros circulares. Medidas en μ: P: 38.5 ± 2.5 y

E: 24.2 ± 0.7 (Heusser, 1971).

Fig. 6. Polen de haba, 49 y 59 polen de raphanus sativus (rabanito).

VIABILIDAD DEL POLEN

La viabilidad del polen hace referencia a los métodos de tinción utilizados para conocer la

calidad del pone previo a la polinización. Los granos de polen redondeados y coloreados de

rojo se consideran viables y no viables los costreñidos y sin teñir. Existe una clasificación visual

de los granos de polen basada en la forma y contenido, utilizándose para las tinciones

Acetocarmin y lactofenol. Por ejemplo: Los conteos de polen se efectuaron en número de 200

granos por preparación en un total de 5 preparaciones. Se utilizó polen fresco (primer día de

colectado) y almacenado por 150 días a 17°C y 4°C y se estimaron los porcentajes de viabilidad

del polen fresco y almacenado, y se realizaron mediciones del diámetro del polen (um) de

algunas especies silvestres y cultivadas de papa.

La VIABILIDAD del grano de polen, previo a la polinización puede evaluarse mediante TEST

BIOLÓGICOS basados en la germinación en medios nutritivos Azucarados o mediante

reacciones químicas de coloración. Uno de ellos consiste en recolectar polen a partir de la

DEHISCENCIA, sembrado éste es un medio de cultivo estéril y colocado en condiciones

controladas, es posible determinar la evolución diaria del proceso de maduración de la

gameta, previamente a la fecundación. Otra técnica consiste en colorear granos de polen con

CROMATO POTÁSICO FÉRRICO al 1% en solución acuosa filtrada y estabilizada durante 24

horas a temperatura de laboratorio. La observación microscópica de una cantidad conocida de

granos permite determinar los porcentajes de polen viable (coloreado de ROJO) y no viable (no

coloreados, BLANCOS).

La germinación del polen IN VITRO son métodos efectivos para la estimación de la CALIDAD del

polen, los cuales están relacionados con el número de semillas por fruto, permitiendo

estimados confiables de fertilidad masculina y de esta forma seleccionar al que será utilizado

como progenitor masculino o femenino. Sin embargo, la germinación in vitro es un método

mas fácil y aporta resultados confiables. Además el polen no debe conservarse a 4°C y 17°C por

más de 10 y 5 días para ser utilizado en las polinizaciones.

En haba (Vicia faba) la germinación del polen y el alargamiento del tubo son procesos

biológicos, y como tal son inhibidas por temperaturas muy bajas o muy altas, pero en V. faba

su polen es capaz de germinar entre 10º y 30º C y la evaluación de viabilidad se puede hacer

dentro de este rango. Sin embrago, la temperatura óptima para el crecimiento del tubo

polínico, cae dentro de un rango estrecho. Las temperaturas óptimas entre 20º a 25º C, fuera

de este rango de crecimiento del tubo será más lento.

Ningún factor opera de forma independiente, observándose que el polen de V. faba se

desarrolla mejor en un medio compuesto por un 2% de agar y sacarosa al 25% en peso se

incuba a 25º C. una duración de dos horas de incubación era necesario para el crecimiento

máximo in vitro. (Lim, 1979)

Tabla 6. Efecto de la concentración de agar y sacarosa y la duración de la incubación en la

germinación del polen de Vicia faba.

MATERIALES

Material vegetal: botones florales de haba; Aceto carmín al 4%, Lacto propionico – orceina o

Aceto orceina; porta y cubre objetos; placas Petri y microscopio electrónico.

METODOS

Tinción de los granos de polen

a. Colectar flores abiertas o maduras (con anteras dehiscentes) en placas Petri.

b. Colocar grano de polen en un porta objeto, agregar una gota de acetocarmín y poner

un cubre objeto, luego dejar a Tº ambiente.

c. Realizar la evaluación contando el número de polen teñido y no teñido en unos 5

campos ópticos por cada flor, en un microscopio de aumento de 100X a 400X.

d. Se considera que los granos bien formados y teñidos son fértiles o por lo menos son

viables, y los granos deformes y no teñidos son esteriles, se expresa en porcentaje

según la formula:

% Viabilidad = Nº de granos bien formados y teñidos * 100

Nº total de granos

RESULTADOS

Lectura del polen de Vicia faba, contaje de polen

Total = 74

Viable =73

No Viable = 1

Viabilidad = 98,64 %

CONCLUSIONES

Los resultados indican una buena calidad del polen por lo que lo habilita para realizar el

proceso de hibridación por polinización manual.

De la tabla 6 se puede observar una germinación de 94,6% con una concentración de agar 3%,

similares a nuestras condiciones en laboratorio, pues se utilizó una concentración de agar 4%,

pudiéndose evaluar a germinación también para ratificar el la calidad del polen.

BIBLIOGRAFIA

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Dominantes de la Comuna de Litueche, VI Región. Tesis para obtener Título de

Ingeniero Agrónomo, Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal, Pontificia

Universidad Católica de Chile, Santiago de chile, Chile. 83 p. web:

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Lim, E. S.(1979). Pollen Studies on Vida laba L. I, Germination Medium and Incubation

Duration and Temperature [Estudios de polen en Vicia faba L. germinación y duración

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