Estrategia catalítica de la lisozima

Ludwig O. Julca Universidad Nacional de Trujillo [email protected]

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ESTRATEGIAS CATALÍTICAS DE LAS ENZIMAS La catálisis enzimática comienza con la unión del sustrato. La formación del

complejo enzima-sustrato es favorecida termodinámicamente porque hay un

cambio negativo en la energía libre durante la formación del complejo, debido a

que se crea un gran número de interacciones débiles entre la enzima y el

sustrato. Se puede prever que esta energía de unión sirve para dos propósitos:

para establecer la especificidad de sustrato y para aumentar la eficacia

catalítica. Sólo el sustrato correcto puede participar en la mayor parte de las

interacciones con la enzima, potenciando así la energía de unión, lo que

explica la alta especificidad por el sustrato exhibida por muchas enzimas.

Además, el complemento perfecto para dichas interacciones solamente se

forma cuando el sustrato se encuentra en el estado de transición. De este

modo, las interacciones entre la enzima y el sustrato no sólo favorecen la unión

del sustrato, sino que también estabilizan al estado de transición, disminuyendo

así la energía de activación. La energía de unión puede promover también

cambios estructurales, tanto en la enzima como en el sustrato, los que

favorecen la catálisis, en un proceso denominado ajuste inducido.(1)

Para catalizar reacciones específicas, los enzimas normalmente emplean una o

más de las estrategias siguientes:

Catálisis covalente. El centro activo contiene un grupo reactivo,

habitualmente un nucleófilo potente que, en el transcurso de la catálisis,

llega a ser modificado covalentemente de forma temporal. La quimotripsina,

una enzima proteolítica, proporciona un excelente ejemplo de este

mecanismo.(1)

Catálisis general ácido-base: Por lo general en la catálisis ácido-base, una

molécula diferente al agua desempeña el papel de donador o aceptor de un

protón. La quimotripsina utiliza un residuo de histidina como un catalizador

básico para incrementar el poder nucleofílico de la serina de su centro

activo.(1)

Catálisis por ion metálico: Los iones metálicos pueden funcionar

catalíticamente de varias maneras: Por ejemplo, un ion metálico puede

actuar como un catalizador electrofílico mediante la estabilización de una


2

carga negativa sobre un intermediario de la reacción. De forma alternativa,

un ion metálico puede generar un nucleófilo cuando aumenta la acidez de

una molécula cercana, como el agua. Así sucede en la hidratación de CO2

mediante la anhidrasa carbónica. Finalmente, el ion metálico puede unirse

al sustrato, ya que aumenta el número de interacciones con el enzima y,

así, la energía de unión.(1)

Catálisis por aproximación: La reacciones incluyen dos sustratos diferentes.

En estos casos, la velocidad de la reacción puede aumentar

considerablemente si se atraen a los dos sustratos juntos sobre una misma

superficie de unión del enzima. Las NMP quinasas atraen dos nucleótidos a

la vez para facilitar la transferencia de un grupo fosforilador desde un

nucleótido al otro. (1)

LISOZIMA La lisozima (EC 3.2.1.17), sistemáticamente

llamada peptidoglucan N-

acetilmuramoilhidrolasa, y también conocida

como: 1,4-N-acetilmuramidasa, N,O-

diacetilmuramidasa, L-7001, lisozima PR1,

globulina G, globulina G1, lisozima g,

mucopeptido N-acetilmuramoilhidrolasa,

mucopeptido glucohidrolasa, y muramidasa,1

es una enzima hidrolítica –una hidrolasa.

La lisozima fue descubierta por

Laschtschenko2 en el huevo de gallina, y por

Fleming3, como agente antibacteriano del

moco nasal y otros tejidos y secreciones naturales4. Interviene en la defensa

natural contra las infecciones.5,6 Su nombre se debe a su acción lítica sobre las

células bacterianas. La lisozima carece de actividad como proteasa, quinasa,

amilasa, lipasa o fosfatasa7. La lisozima rompe los peptidoglucanos de la pared

celular de ciertas bacterias8 las que estallan, por falta de soporte mecánico, por

Ilustración 1. Modelo molecular de cintas de la lisozima, mostrando las estructuras secundarias. En verde, el residuo GLU 35, y en rojo, el residuo ASP 52.18


3

la alta presión osmótica intracelular.9 Sin embargo, la lisozima ha mostrado

actividad bactericida independientemente de su capacidad lítica.10

Estructura y clasificación Las lisozimas constituyen una superfamilia de proteínas, las mismas que están

clasificadas como proteínas alfa+beta.11 Cada molécula de lisozima es una

cadena polipeptídica simple. Existen varios tipos de lisozimas. La lisozima de la

clara del huevo de gallina Gallus gallus (HEWL) tiene una masa molecular

Ilustración 2. Estructura primaria de la lisozima de huevo de Gallus g.allus.

aproximada de 14 400 Da, y consta de 129 aminoácidos.12 La lisozima humana

(HTL) tiene una masa molecular ligeramente mayor, y consta de 130

aminoácidos. La diferencia radica en que HTL tiene un residuo de glicina

inserto en la posición 49.13 La lisozima de clara de huevo de pavo común

Meleagris gallopavo (TEWL) consta también de 129 aminoácidos, y guarda

algunas diferencias en la secuencia de aminoácidos con HEWL.14 Las

lisozimas HEWL, HTL, TEWL, así como de: Numida meleagris (guinea),

Phasianus colchicus (faisán), Colinus virginianus (codorniz cotuí norteña),


4

Coturnix coturnix japonica (codorniz japonesa), Equus caballus (caballo), Canis

familiaris (perro), Mus musculus (ratón), Tachyglossus aculeatus (equidna

australiano), Oncorhynchus mykiss (trucha arcoiris) y Bombyx mori (gusano de

la seda), son lisozimas del tipo “c”. También son lisozimas de tipo “c” las α-

lactoalbúminas. La lisozima de clara de huevo de ganso Anser anser anser

(GEWL) tiene una masa molecular aproximada de 20 500 Da.15 Junto con la

lisozima de cisne negro australiano Cygnus atratus, constituyen lisozimas del

tipo “g”. Las glucosidasas de la familia 19 incluyen la quitinasa de la cebada

Hordeum vulgare y la quitinasa de Canavalia ensiformis. Los bacteriófagos T4

tienen lisozima en la cola, la que les permite ingresar su material genético a

través de la pared celular bacteriana. Estas lisozimas se conocen como

lisozimas fago. El bacteriófago lambda posee su propia lisozima, una lisozima

lambda. Escherichia coli también posee su propia muramidasa bacterial. Las

quitanasas, como de Streptomyces sp. y Bacillus circulans, también pertenecen

a esta superfamilia.

La estructura primaria de HTL es:16

KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRS

TDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDP

QGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV.

Presentando puentes disulfuro entre los residuos de cisteinilo: 6 y 128, 30 y

116, 65 y 81, 77 y 95.

La lisozima se hizo repentinamente popular cuando el profesor D. C. Phillips y

sus colegas de la Royal Institution en Londres describieron la estructura

tridimensional de la lisozima de clara de huevo de gallina17, determinada

mediante análisis de cristalografía de rayos X (ver Ilustración 1)18. Actualmente,

la posición de cada uno de los átomos en la molécula se conoce dentro de un

margen de 0,28 Å, distancia suficientemente reducida.19 La lisozima es la

primera enzima para la que se ha determinado una estructura tridimensional

tan detallada, y el conocimiento de su estructura ha sido extraordinariamente

útil para la determinación de su mecanismo de acción.20

La lisozima HEWL es una proteína básica, presentando punto isoeléctrico en el

rango 10,5 – 11,0.4


5

El polisacárido de la pared celular de muchas

bacterias se forma con dos clases de

azucares: N-acetilglucosamina (NAG) y N-

acetilmuramato (NAM).21,22 Ambos son

derivados de la glucosamina, en que el grupo

amino está acetilado. En el NAM, una cadena

lateral lactilo se une al C-3 del azúcar por

medio de un enlace éter.23,24 En la pared de las células bacterianas, el NAM y

el NAG están unidos por enlaces glucosídicos entre C-1 de un azúcar y el C-4

de otro. Todos los enlaces son de tipo β.25 En el polisacárido hay una

alternancia de residuos de NAM y NAG unidos por enlaces β.21 La lisozima

hidroliza el enlace glucosídico entre C-1 de NAM y C-4 de NAG. Los otros

enlaces glucosídicos entre C-1 de NAG y C-4 de NAM no son rotos.1

Mecanismo de unión lisozima-sustrato Los oligómeros de NAG con menos de cinco

residuos son hidrolizados muy lentamente, o

no lo son.20,26,27 Sin embargo, se unen al sitio

activo de la enzima, y reaccionan

preferentemente como aceptores en

reacciones de transglucosilación.28 El trímero

de N-acetilglucosamina es un potente

inhibidor competitivo de la lisozima.29 El

estudio por rayos X del complejo lisozima-

(NAG)3 muestra que el sustrato se liga a una

hendidura en la superficie de la enzima

ocupando cerca de la mitad de ella.29,30 La

unión del (NAG)3 y la lisozima se hace por

puentes de hidrogeno e interacciones de Van der Waals. El grupo carboxílico

del aspartato 10131 se une por enlaces de hidrogeno a los residuos A y B, entre

el residuo C y la enzima hay cuatro enlaces de hidrogeno: uno entre el NH del

anillo indol del triptófano 62 y el oxigeno del C6.32 Este enlace aún se produce

cuando el triptófano 62 es convertido en kinurenina33, y lisozimas mutantes con

Ilustración 4. Modelo molecular de la lisozima, superficie generada usando una sonda esférica de 1.0Å de radio. Se ve claramente la hendidura del centro activo, con el residuo GLU 35 en verde, y el residuo ASP 52 en rojo.18

Ilustración 3. Modelo molecular de la lisozima, complejada con tri-N-acetilglucosamina, superficie de la enzima generada usando una sonda esférica de 1,0 Å de radio. Los colores indican estructuras secundarias locales.30


6

otros aminoácidos (Leu, Ile, Val, Ala) en la posición 62 poseen una mayor

actividad lítica.34 Otro enlace se produce entre el triptófano 63 y el oxigeno del

C3,32 otro entre los grupos NH y CO de la cadena lateral acetamida y los

grupos CO y NH de la cadena principal de los aminoácidos 107 y 59,

respectivamente.35 El (NAG)3 tiene también contactos tipo Van der Waals con

la enzima, así el residuo B se acomoda al anillo indol del triptófano 57.


7

El hallazgo de que el (NAG)3 llena la mitad

de la hendidura de la lisozima sugería la

necesidad de residuos adicionales de azúcar

que llenen la hendidura para que se forme el

complejo enzima-sustrato. Habrá espacio

para tres residuos adicionales de azúcar.36

Tres residuos adicionales de azúcar

denominados D, E Y F fueron encajados en

la hendidura. El residuo D, para encajar, tuvo

que ser distorsionado de su conformación

normal. De los cinco enlaces del (NAG)6, el

único que se hidroliza es el enlace D-E por lo

siguiente: el enlace glucosídico entre A y B

no puede ser el sitio de hidrólisis porque

(NAG)3 es estable. El enlace B-C se excluye

por la misma razón. Otra evidencia crucial es que el sitio C puede ser ocupado

perfectamente por NAG, pero no así por NAM, porque éste es muy grande

debido a su cadena lateral lactilo y no encaja37. Por otra parte, se sabe que el

enlace que se rompe en la pared de las bacterias es el enlace NAM-NAG. Si

NAM no puede encajar en C, se excluyen también E-F como sitio de hidrólisis,

ya que el polisacárido de la pared celular es un polímero en el que NAM y NAG

alternan, por lo que si NAM no puede ocupar el sitio C, tampoco podrá ocupar

el sitio E. Excluidos los enlaces A-B, B-C, C-D y E-F como sitios posibles de

hidrólisis, se concluye que la ruptura se da en el enlace D-E.38

Ilustración 5. Modelo molecular de la lisozima complejada con hexa-N-acetilquitohexosa, superficie de la enzima generada usando una sonda esférica de 1,0 Å de radio. El residuo GLU 35 se muestra en rosa, y el residuo ASP 52 en rojo.44


8

MECANISMO DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA DE LA LISOZIMA Esta enzima rompe los enlaces repetitivos NAM (β:1→4) NAG de los

peptidoglucanos (NAM-NAG) en las paredes celulares de las bacterias,39 y los

enlaces NAG (β:1→4) NAG en las quitodextrinas40, que se encuentran en las

paredes celulares de ciertos hongos. Dado que estos polímeros son

hidrofílicos, se espera que el sitio activo de la enzima contenga un canal

accesible por un solvente hacia el que pueda unirse el polímero. Se ha

obtenido estructuras cristalinas de la lisozima y complejos de la lisozima y NAG

a alta resolución.41,42,43,44 Los inhibidores y sustratos forman fuertes enlaces de

hidrógeno y algunas interacciones hidrofóbicas con la enzima.30 Los estudios

cinéticos llevados a cabo usando polímeros de (NAG)n muestran un agudo

incremento en la kcat cuando n aumenta de 4 a 5. Los valores de kcat para

NAG6 y (NAG-NAM)3 son similares. Los estudios en modelos han mostrado

que, para que pueda darse la catálisis, el polímero (NAG-NAM)3 se une al sitio

activo con cada monómero de azúcar en la conformación de silla, excepto el

cuarto, que está distorsionado a una forma de media silla45, lo que labiliza el

enlace glucosídico entre los azúcares cuarto y quinto. Estudios adicionales han

mostrado que si los azúcares que encajan en el sitio de unión se etiquetan de A

a F, debido al voluminoso sustituyente lactilo del NAM, los residuos C y E no

pueden ser NAM, lo que sugiere que B, D y F deben ser residuos NAM. La

ruptura se da entre los residuos D y E.46


9

Una revisión de la química de la formación del enlace glucosídico (un acetal) y

su ruptura muestra que la ruptura de un acetal es catalizada por ácidos, y

procede por un mecanismo en el que aparece un ion oxonio, el cual existe

también debido a la resonancia, como un carbocatión.47,48,49

Ilustración 6. Mecanismo reversible de acetalización de aldehídos

La catálisis de la enzima involucra a los residuos Glu 35 y Asp 52, que están en

el centro activo. El aspartilo 52 está rodeado por grupos polares, pero el

glutamilo 35 está en un ambiente hidrofóbico. El triptófano 108, en contacto de

van der Waals con el residuo Glu 35, es especialmente importante en crear el

ambiente hidrofóbico. 50 Esto debiera aumentar el pKa aparente del residuo de

glutamilo 35,50 haciéndolo menos apto de donar un protón y adquirir una carga

negativa a valores bajos de pH, haciendo de él un mejor ácido a valores de pH

altos. El mecanismo general parece involucrar:

1. La unión de una unidad de hexasacárido al peptidoglucano, con la

concomitante distorsión del NAM en la posición “D”.


10

Ilustración 7. Fijación del peptidoglucano en el centro activo de la lisozima.51

2. La protonación del átomo de oxígeno de la cadena de acetilo sésil, por el

ácido genérico Glu 35 (con el pKa elevado), lo que facilita la apertura del

enlace glucosídico y la formación del ion carbenio estabilizado por

resonancia52 con el átomo de oxígeno adyacente.

Ilustración 8. Protonación del enlace glucosídico del peptidoglucano en el centro activo de la

lisozima.51


11

3. El residuo de aspartilo 52 estabiliza al catión oxonio a través de interacción

electrostática. La forma de media silla distorsionada del NAM en la posición

“D” estabiliza el catión oxonio, lo que requiere la coplanaridad de los

sustituyentes unidos al átomo de carbono hibridado en sp2 de la forma

resonante del carbocatión (del mismo modo que en los enlaces peptídicos

planares).

Ilustración 9. Ruptura del enlace glucosídico, y formación de carbocatión estabilizado por

aspartato.51 4. El agua ataca al carbocatión estabilizado, formando el hemiacetal, con

liberación del protón adicional del agua al residuo de glutamilo 35 que

previamente fue deprotonado, regenerando el catalizador.


12

Ilustración 10. Interacción de agua con el carbocatión, y regeneración de la actividad enzimática.

Ilustración 11. Mecanismo de Phillips para la hidrólisis enzimática de peptidoglucanos, catalizada

por lisozima.51 La unión y distorsión del sustituyente D del sustrato (a la forma de silla como se

muestra arriba) se da previo a la catálisis. Dado que la distorsión ayuda a


13

estabilizar al intermediario oxonio, se presume que también estabiliza al estado

de transición. De ahí que parezca que esta enzima une al estado de transición

más fuertemente que al sustrato libre sin distorsionar, lo que es otro método de

catálisis.

Los estudios de pH muestran que se requieren cadenas laterales con pKa de

3,5 a 6,3 para la actividad enzimática. Estos valores de pKa corresponden

posiblemente a los residuos Asp 52 y Glu 35, respectivamente. Si los grupos

carboxilo de la lisozima son modificados químicamente en la presencia de un

inhibidor competitivo de la enzima, los únicos grupos carboxilo protegidos

corresponden a los residuos Asp 52 y Glu 35.

Una publicación reciente sugiere un mecanismo alternativo al mecanismo de

Phillips mostrado arriba.53 En este caso, el residuo aspartilo 52 actúa como

según catálisis nucleofílica, y forma un enlace covalente con NAM,

desplazando al grupo saliente NAG, con el residuo de glutamilo 35 actuando

como un ácido genérico. Este mecanismo alternativo también es consistente

con otras enzimas que rompen enlaces β-glucosídicos. La distorsión del

sustrato también es importante en este mecanismo alternativo54,55.


14

Ilustración 12. Mecanismo alternativo para la hidrólisis enzimática de peptidoglucanos, catalizada

por lisozima.53

Cinética de la reacción Tabla 1. Velocidades de la reacción de hidrólisis catalizada por lisozima HEW de análogos de sustratos de oligosacárido selectos

Compuesto kcat(s-1)

(NAG)2 2,5·10-8

(NAG)3 8,3·10-6

(NAG)4 6,6·10-5

(NAG)5 0,033 (NAG)6 0,25


15

(NAG-NAM) 0,5* * Fuente: Imoto, T., Johnson, L.N., North, A.C.T., Phillips, D.C., y Rupley, J.A., en Boyer P.D. (Ed.), The Enzymes (3ª ed.), Vol. 7, p. 842, Academic Press (1972).

Referencias (1) Stryer, L.: Bioquímica. 4º ed. Ed. Reverté. S.A. España 1995. Pp. 216 - 219

1 International Union of Biochemistry and Molecular Biology (2010). “Enzyme Nomenclature EC 3.2.1.17.” (2010). <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/17.html> 2 Laschtschenko P (1909). “Über die keimtötende und entwicklungshemmende Wirkung Hühnereiweiß” (en alemán). Z. Hyg. InfektKrankh. 64: 419–427. doi:10.1007/BF02216170. 3 Fleming A (1922). “On a remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretions”. Proc Roy Soc Ser B 93 (653): 306–317. doi:10.1098/rspb.1922.0023 4 Alderton G, Ward W, Fevold H (1944). Isolation of lysozyme from egg white. J. Biol. Chem. 1945 157: 43-58. 5 Revenis ME, Kaliner MA (1992). “Lactoferrin and lysozyme deficiency in airway secretions: association with the development of bronchopulmonary dysplasia”. J. Pediatr. 121 (2): 262–70. doi:10.1016/S0022-3476(05)81201-6 6 Lönnerdal B (June 2003). “Nutritional and physiologic significance of human milk proteins”. Am. J. Clin. Nutr. 77 (6): 1537S–1543S. 7 Meyer K, Palmer J, Thompson R, Khorazo D, (1936?). "On the mechanism of lysozyme action". 8 Salton M (1952). “Cell Wall of Micrococcus Lysodeikticus as the Substrate of Lysozyme”. Nature 170, 746 – 747. doi:10.1038/170746a0 9 Feiner R. R., Meyer K., Steinberg A. (1946). Bacterial Lysis by Lysozyme. J Bacteriol. 1946 September; 52(3): 375–384. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC518196/pdf/jbacter00673-0122.pdf> 10 Nash J, Ballard T, Weaver T, Akinbi H (2006). “The Peptidoglycan-Degrading Property of Lysozyme Is Not Required for Bactericidal Activity In Vivo”. The Journal of Immunology, 2006, 177: 519-526. 11 Medical Research Council, Brenner S, (2009). “Structural Classification of Proteins”. <http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.e.c.A.html> 12 Thompson A (1954). “Amino Acid Sequence in Lysozyme”. Biochem. J. (1955) 60, 507-515. 13 Artymiuk P.J., Blake C.C. (1981). Refinement of human lysozyme at 1.5 A resolution analysis of non-bonded and hydrogen-bond interactions. J Mol Biol. 1981 Nov 5;152(4):737-62. doi:10.1016/0022-2836(81)90125-X 14 Harata K, Muraki M. (1997). X-Ray Structure of Turkey-Egg Lysozyme Complex with Tri-N-Actylchitotriose. Lack of Binding Ability at Subsite A. Acta Crystallogr., Sect.D, V. 53, 650 1997. doi: 10.1107/S0907444997005362. 15 Weaver L. H., Grutter M. G., Matthews B. W. (1994). The refined structures of goose lysozyme and its complex with a bond trisaccharide show that the "goose-type" lysozymes lack a catalytic aspartate residue. J. Mol. Biol. 245, 54, 1995. doi: 10.1016/S0022-2836(95)80038-7. 16 K.Chiba-Kamoshida, T.Matsui, T.Chatake,T.Ohhara,A.Ostermann, I.Tanaka,K.Yutani,N.Niimura Site-Specific Softening Of Peptide Bonds By Localized Deuterium Observed By Neutron Crystallography Of Human Lysozyme Hydrogen. 17 Blake CC, Koenig DF, Mair GA, North AC, Phillips DC, Sarma VR. (1965). “Structure of hen egg-white lysozyme. A three-dimensional Fourier synthesis at 2 Angstrom resolution”. Nature 206 (986): 757–61. doi:10.1038/35090602 18 Ueno T, Abe S, Koshiyama T, Ohki T, Hikage T, Watanabe Y (2009). “Elucidation of metal-ion accumulation induced by hydrogen bonds on protein surfaces by using porous lysozyme crystals containing Rh(III) ions as the model surfaces”. Chemistry - A European Journal Vol. 16, Issue 9 , pp. 2730-2740. doi: 10.1002/chem.200903269. 19 Deacon A, Weeksl C, Miller R, Ealick S (1998). “The Shake-and-Bake structure determination of triclinic lysozyme”. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 August 4; 95(16): 9284–9289.


16

20 Chipman D, Sharon N, (1969). “Mechanism of Lysozyme Action”. Science 1 August 1969: Vol. 165. no. 3892, pp. 454 - 465. doi: 10.1126/science.165.3892.454. 21 Ghuysen J M, Strominger J, (1963). “Structure of the Cell Wall of Staphylococcus aureus, Strain Copenhagen. II. Separation and Structure of Dissacharides”. Biochemistry, 1963, 2 (5), pp 1119–1125 doi: 10.1021/bi00905a036 22 Ghuysen J M, (1968). “Use of bacteriolytic enzymes in determination of wall structure and their role in cell metabolism”. Bacteriol Rev. 1968 December; 32(4 Pt 2): 425–464. 23 National Institute of Health (2010). “N-acetylmuramate”. <http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=542212&loc=ec_rcs> 24 National Institute of Health (2010). “Acetylglucosamine”: <http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=24139&loc=ec_rcs> 25 Jeanloz R, (1967). “Structure of the cell wall of Gram-positive bacteria”. Pure Appl. Chem. 14:57-70. Visto el 12 de agosto del 2010 en: <http://media.iupac.org/publications/pac/1967/pdf/1401x0057.pdf>. 26 Masaki A, Fukamizo T, Otakara A, Torikata T, Hayashi K, Imoto T, (1981). “Lysozyme-catalyzed reaction of chitooligosaccharides”. J Biochem. 1981 Aug;90(2):527-33. 27 Fukamizo T, Minematsu T, Yanase Y, Hayashi K, Goto S, (1986). ”Substrate size dependence of lysozyme-catalyzed reaction”. Archives of Biochemistry and Biophysics. Volume 250, Issue 2, 1 November 1986, Pages 312-321. doi:10.1016/0003-9861(86)90732-0. 28 Chipman D, (1971). “A Kinetic Analysis of the Reaction of Lysozyme with Oligosaccharides from Bacterial Cell Walls”. Biochemistry, vol. 10, no. 9, 1971. 29 Cheetham J C, Artymiuk P J, Phillips D C, (1992). “Refinement of an enzyme complex with inhibitor bound at partial occupancy. Hen egg-white lysozyme and tri-N-acetylchitotriose at 1.75 A resolution.” J Mol Biol. 1992 Apr 5;224(3):613-28. doi:10.1016/0022-2836(92)90548-X. 30 Ose T, Kuroki K, Matsushima M, Maenaka K, Kumagai I, (2009). “Importance of the Hydrogen Bonding Network Including Asp52 for Catalysis, as Revealed by Asn59 Mutant Hen Egg-white Lysozymes”. Journal of Biochemistry 2009 146(5):651-657; doi:10.1093/jb/mvp110. 31 Fukamizo T, Hayashi K, Goto S, (1986). “The role of binding subsite A in reactions catalyzed by hen egg-white lysozyme”. SO: European Journal of Biochemistry, vol. 158, n.3, 463-467, 1986. doi: 10.1111/j.1432-1033.1986.tb09777.x. 32 Miura T, Takeuchi H, Harada I, (1990). “Raman Spectroscopic Characterization of Tryptophan Side Chains in Lysozyme Bound to Inhibitors: Role of the Hydrophobic Box in the Enzymatic Function.” Biochemistry 1991, 30, 6074-6080. doi:10.1021/bi00238a035. 33 Yamasaki N, Tsujita T, Eto T, Masuda S, Mizuno K, Sakiyama F, (1979). “Preparation and Characterization of an Active Lysozyme Derivative: Kyn 62-Lysozyme”. J. Biochem, 1979, Vol. 86, No. 5 1291-1300. 34 Maenaka K, Kawai G, Watanabe K, Sunada F, Kumagai I, (1994). “Functional and structural role of a tryptophan generally observed in protein-carbohydrate interaction. TRP-62 of hen egg white lysozyme.” The Journal of Biological Chemistry (1994), 269, 7070-7075. 35 Perkins S J, Johnson L N, Phillips D C, Dwek R A, (1981). “The binding of monosaccharide inhibitors to hen egg-white lysozyme by proton magnetic resonance at 270 MHz and analysis by ring-current calculations”. Biochem. J. 193, 554, 1981. 36 Blake C C, Johnson L N, Mair G A, North A C, Phillips D C, Sarma V R, (1967). “Crystallographic studies of the activity of hen egg-white lysozyme.” Proc R Soc Lond B Biol Sci. 1967 Apr 18;167(9):378-88. 37 Schindler M, Assaf Y, Sharon N, Chipman D, (1977). “Mechanism of Lysozyme Catalysis: Role of Ground-State Strain in Subsite D in Heg Egg-White and Human Lysozymes”. Biochemistry. Vol. 16, No. 3, 1977. 38 Perkins S J, Johnson L N, Phillips D C, Dwek R A, (1980). ”The binding of monosaccharide inhibitors to hen egg-white lysozyme by proton magnetic resonance at 270 MHz and analysis by ring-current calculations.” Biochem J. (1981) 193, 553-572. 39 Janloz et al., 1963. 40 Berger L, Weiser R, (1957). “The β-glucosaminidase activity of egg-white lysozyme”. Biochimica et Biophysica Acta Vol. 26, Issue 3, December 1957, 517-521. doi:10.1016/0006-3002(57)90098-7. 41 Ose T, Kuroki K, Matsushima M, Maenaka K, Kumagai I, (2009). “Importance of the hydrogen bonding network including Asp52 for catalysis, as revealed by Asn59 mutant hen egg-white lysozymes.” J Biochem. 2009 Nov;146(5):651-7. Epub 2009 Jul 15. doi: 10.1093/jb/mvp110. 42 Leung A K W, Duewel H S, Honek J F, Berghuis A M, (2001). “Crystal structure of the lytic transglycosylase from bacteriophage lambda in complex with hexa-N-acetylchitohexaose.” Biochemistry. 2001 May 15;40(19):5665-73. doi: 10.1021/bi0028035.


17

43 Von Dreele R B, (2001). “Binding of N-acetylglucosamine to chicken egg lysozyme: a powder diffraction study”. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2001 Dec;57(Pt 12):1836-42. Epub 2001 Nov 21. doi:10.1107/S0907444904025715. 44 Von Dreele R B, (2005). “Binding of N-acetylglucosamine oligosaccharides to hen egg-white lysozyme: a powder diffraction study”. Acta Cryst. (2005). D61, 22-32. doi:10.1107/S0907444904025715. 45 Sykes B, Patt S, Dolphin D, (1972). “The Role of Distortion in the Lysozyme Mechanism”. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1972. 36: 29-33. doi:10.1101/SQB.1972.036.01.007. 46 Rupley J, Gates V, (1967). “Studies on the enzymic activity of lysozyme, II. The hydrolysis and transfer reactions of N-acetylglucosamine oligosaccharides”. Symposium on Three-Dimensional Structure of Macromolecules of Biological Origin. by Invitation of the Committee on Arrangements for the Autumn Meeting. Presentado ante la Academia el 19 de Octubre de 1966. Chairman, Walter Kauzmann. 47 Fundenburk L, Aldwin L, Jencks W, (1978).”Mechanisms of General Acid and Base Catalysis of the Reactions of Water and Alcohols with Formaldehyde”. J. Am. Chem. Soc., 1978, 100 (17), pp 5444–5459. doi: 10.1021/ja00485a032. 48 Sørensen P E, Jencks W P, (1987). “Acid- and Base-Catalyzed Decomposition of Acetaldehyde Hydrate and Hemiacetals in Aqueous Solution”. J. Am. Chem. Soc., 1987, 109 (15), pp 4675–4690. doi: 10.1021/ja00249a034. 49 Cordes E H, Bull H G, (1973). “Mechanism and Catalysis for Hydrolysis of Acetals, Ketals, and Ortho Esters.” Chem. Rev., 1974, 74 (5), pp 581–603. doi: 10.1021/cr60291a004. 50 Inoue M, Yamada H, Yasukochi T, Kuroki R, Miki T, Horiuchi T, Imoto T, (1991). “Multiple Role of Hydrophobicity of Tryptophan-108 in Chicken Lysozyme: Structural Stability, Saccharide Binding Ability, and Abnormal pKa of Glutamic Acid-35.” Biochemistry 1992, 31, 5545-5553. 51 Vin, S (2010?). “The Phillips Mechanism for the Lysozyme Reaction en Fundamentals of Biochemistry”, Wiley. Visto el 31 de julio del 2010, <http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz11/11-19.html>. 52 Dahlquist FW, Rand-Meir T, Raftery MA, (1969). “Application of Secondary α-Deuterium Kinetic Isotope Effects to Studies of Enzyme Catalysis. Glycoside Hydrolysis by Lysozyme and β-Glucosidase”. Biochemistry 53 Vocadlo DJ, Davies GJ, Laine R, Withers SG, (2001). "Catalysis by hen egg-white lysozyme proceeds via a covalent intermediate." Nature. 2001 Aug 23;412(6849):835-8. doi: 10.1038/35090602. 54 Bottoni A, Miscione GP, De Vivo M (2005). “A theoretical DFT investigation of the lysozyme mechanism: computational evidence for a covalent intermediate pathway.” Proteins. 2005 Apr 1;59(1):118-30. 55 Karplus M, Post CB, (1996). “Simulations of lysozyme: internal motions and the reaction mechanism”. EXS. 1996;75:111-41.

Estrategia catalítica de la lisozima

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