ESTUDIA UN DÍA BIOTECNOLOGÍA Facultad de Ciencias Experimentales 

GENÉTICA 

 

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ESTUDIA UN DÍA BIOTECNOLOGÍA EN LA UMH

Facultad de Ciencias Experimentales

Asignatura: GENÉTICA

Práctica: Extracción y electroforesis de ADN

Profesores: Pedro Robles y Víctor Quesada

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Introducción Se denomina Biotecnología a la utilización de los seres vivos, partes de estos, o los procesos que en ellos ocurren para generar productos de interés. La obtención del yogur a partir de la leche, o la del vino a partir del mosto de las uvas, es biotecnología. Ambos procesos utilizan microorganismos, bacterias o levaduras en este  caso, para  llevar a  cabo  fermentaciones. Se puede decir que  la biotecnología alimentaria es  la más antigua, pues es una actividad milenaria llevada cabo ya por culturas como la egipcia. Los avances sobre los conocimientos de la composición, estructura y función de los ácidos nucleicos, ADN y ARN, hace que a finales  del  siglo  XX  surja  la biotecnología molecular,  o moderna,  basada  en  la manipulación  de  los ácidos nucleicos para producir proteínas en el interior de células eucariotas o procariotas. La producción de insulina  humana  en  el  interior  de  bacterias  a  las  que  se  había  introducido  el  gen  que  codifica  dicha proteína, fue el primer gran hito de la biotecnología molecular, y permitió salvar muchas vidas humanas.  

1ª parte. Electroforesis de ácidos nucleicos Con esta práctica vamos a aprender los primeros pasos de cualquier proceso biotecnológico que implique el uso y manipulación del ADN: su aislamiento y visualización. Los ácidos nucleicos, en particular el ADN, son los portadores de la información que necesitan las células para llevar a cabo sus funciones. Habitualmente son moléculas muy  largas,  cargadas negativamente,  compuestas de unidades denominadas nucleótidos. Las cantidades pequeñas de ADN no pueden  ser visualizadas a  simple vista. Además, cuando  se obtiene ADN de una determinada muestra biológica o como  resultado de una prueba que genera copias de esta molécula, el ADN suele encontrarse en una disolución acuosa que contiene moléculas de ADN de distintos tamaños que no pueden distinguirse a simple vista.  Con la finalidad de visualizar el ADN y separar unas moléculas de otras, se realiza una electroforesis. Se trata de  una  técnica  de  separación de moléculas que  consiste  en hacer migrar  a  los  ácidos nucleicos  a través de una matriz porosa formada por un gel de agarosa (un polisacárido obtenido a partir de algas). Con el siguiente protocolo vamos a aprender cómo realizar una electroforesis de ácidos nucleicos en un gel de agarosa.  MEDIDAS DE PRECAUCIÓN EN EL LABORATORIO Aunque ninguno de  los  reactivos que  se utilizarán  en  esta práctica  es particularmente  tóxico,  todas  las manipulaciones  se  llevarán  a  cabo  con  las manos  protegidas  por  guantes  de  laboratorio  desechables. Igualmente, utilizaremos batas desechables para proteger nuestra ropa y no mancharnos.  

Etapas del proceso de preparación de un gel de agarosa  1. Pesar 0,5 g de agarosa que contendrá el gel. A mayor cantidad de agarosa más denso será el gel y menor el  tamaño  de  los  poros.  Las moléculas  grandes  de  ácidos  nucleicos migran  con más  dificultad  que  las pequeñas  a  través  de  los  poros,  de manera  que  al  transcurrir  posteriormente  la  electroforesis  se  irán separando por su tamaño.  2. Depositar la agarosa en un matraz de vidrio de 200 ml.  3. Añadir a la agarosa 50 ml de tampón de electroforesis: una disolución salina que permite el paso de la corriente eléctrica a través del gel. La agarosa no es soluble en este tampón a temperatura ambiente. La concentración de agarosa en nuestro gel es del 1% (0,5 g/50 ml).  4.  Disolver  la  agarosa  en  el  tampón  de  electroforesis  mediante  calor,  utilizando  un  microondas.  Se calentará el matraz con la agarosa y el tampón hasta que la agarosa se disuelva completamente. Se evitará que hierva para que la disolución no rebose del matraz. 

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5. Preparar un portageles sellado por ambos extremos utilizando un sellador. Se trata de una cubeta que contendrá la agarosa disuelta en el tampón. En uno de los extremos del portageles se colocará un “peine” con  el  número  de  dientes  y  el  tamaño  adecuado  para  producir  los  agujeros  (pocillos)  en  los  que  se cargarán las muestras a analizar. El peine que utilizaremos en nuestro gel posee 6 dientes.  6.  Adicionar  a  la  agarosa  líquida  2 microlitros  de  un  agente intercalante denominado Safeview.  Se empleará  para  ello  una  micropipeta, un  instrumento  que  se  usa  en  los  laboratorios  para  manejar volúmenes muy  pequeños,  del  orden  de  los microlitros  (1 microlitro  =  1  µl=  10‐6  l).  Utilizaremos  una micropipeta que permite  tomar volúmenes de entre 2 y 20 µl y se  le acoplará en su extremo una punta desechable de color marillo. El Safeview es una sustancia que se introduce en el interior de las moléculas de ácido nucleico y que permitirá visualizarlas en el gel tras su irradiación con luz ultravioleta. A diferencia de otros agentes intercalantes el Safeview no es mutagénico.  7. Verter  la agarosa  líquida en el portageles ayudándose de un guante grueso de tela o un papel para no quemarnos.  8. Esperar unos 15‐20 minutos para que el gel se solidifique a temperatura ambiente. A continuación retirar el peine con mucho cuidado tirando de él hacia arriba. Sacar el portageles de la pieza selladora.  

Etapas de la electroforesis 9. Introducir el gel en una cubeta de electroforesis, que consta de un receptáculo para el gel y para el tampón de electroforesis, y de una tapa. En sus extremos,  la cubeta presenta un polo negativo  (negro) y uno positivo (rojo). El gel se orientará de forma que los pocillos queden más próximos al polo negativo que al positivo.  10.  Rellenar  la  cubeta  con  el  mismo  tampón  de  electroforesis  empleado  en  la  preparación  del  gel. Comprobar que el gel queda completamente cubierto por el tampón de electroforesis.  11.  Preparar  las  muestras  de  ácidos  nucleicos  que  proporcionará  el  profesor  y  que  se  someterán  a electroforesis. Para ello se añadirá a cada una de ellas un tampón de carga. Se trata de una mezcla de dos colorantes azulados y de una sustancia de elevado peso molecular (ficoll). Los colorantes ayudan a  la manipulación  de  las  muestras  y  permiten  visualizar  su  movimiento  durante  la  electroforesis.  El  ficoll aumenta la densidad de las muestras y ayuda a que entren en los pocillos del gel.  12. Cargar las muestras en el gel utilizando una micropipeta. Para pipetear las muestras utilizaremos una micropipeta que permite  tomar volúmenes de entre 2 y 20 µl y se  le acoplará en su extremo una punta desechable de color amarillo. En cada uno de los pocillos se depositará (cargará) una muestra diferente con un volumen final de 12 µl . En uno de los pocillos se cargará una muestra correspondiente al marcador de peso molecular,  una  colección  de  moléculas  de  ADN  de  tamaño  conocido  que  permite  calcular (aproximadamente)  los  tamaños  de  las  moléculas  de  ADN  de  las  muestras  por  comparación  de  su migración. En  la siguiente página se muestra una  fotografía del marcador de peso molecular utilizado en esta práctica.   

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 Foto de una Micropipeta 

 13. Una vez cargado el gel, cerrar la cubeta de electroforesis con la tapa haciendo coincidir los respectivos polos (rojo con rojo y negro con negro). La cubeta está conectada a una fuente de electroforesis que permite  seleccionar el voltaje al que  realizar  la electroforesis. Cuanto mayor  sea el voltaje,  las muestras migrarán más rápidamente hacia el polo positivo (rojo). Para geles pequeños como el que vamos a utilizar seleccionaremos un voltaje de 100 V.  14. Tras unos treinta minutos, observar la migración de las muestras. Los colorantes azules habrán migrado hacia el polo positivo al estar cargados negativamente, al  igual que  los ácidos nucleicos de  las muestras. Aunque no podemos verlos directamente en el gel, la migración de los colorantes nos sirve como referencia para inferir el desplazamiento de los ácidos nucleicos.  15. Finalmente, extraer el gel de  la cubeta de electroforesis e  introducirlo un documentador de geles. Se trata de un aparato que consta de una fuente de luz ultravioleta que se encuentra en el interior de una cámara oscura conectada a una cámara fotográfica. El Safeview unido a los ácidos nucleicos del gel absorbe la energía de  la  luz ultravioleta y  la devuelve en  forma de  luz verde que es captada por  la cámara y nos permite  visualizarlos  en un monitor.  Se  imprimirá una  fotografía del  gel que  entregará  el profesor  y  se interpretará siguiendo sus explicaciones.   

 

  

 Fotografía del gel de agarosa tras electroforesis (a la derecha se muestra el marcador de peso molecular) 

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INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS  Calle 1:  Calle 2:  Calle 3:  Calle 4:  Calle 5:  Calle 6: 

2º parte. Extracción de ADN de fresas. Además de  la electroforesis, en esta práctica vamos a aprender a extraer ácidos nucleicos de una manera casera, empleando un procedimiento muy  sencillo que  cualquiera puede  llevar a  cabo en  su  casa y que ejemplifica a  la perfección  los procedimientos de extracción más  laboriosos realizados en  los  laboratorios de Genética.  Materiales para llevar a cabo la extracción a partir de fresas:  ‐ 2 fresas ‐ Agua ‐ Detergente líquido para platos ‐ Alcohol de botiquín ‐ Sal ‐ Un colador ‐ Unos vasos y cucharillas de plástico ‐ Una bolsita de plástico para congelación con cierre zip Protocolo de extracción de ADN a partir de fresas 1. Introducir dos fresas en el interior de la bolsa de plástico y cerrar bien.  2. Machacar las fresas con ayuda de las manos. Resulta más fácil si se hace con el puño con cuidado de no romper la bolsa. De este modo preparamos el tejido de fresa para la extracción de ADN.  3.  En  un  vasito  de  plástico  poner  un  par  de  dedos  de  agua  y media  cucharilla  de  detergente  para  el lavavajillas.  4. A continuación añadir a la mezcla una cucharilla de sal.  5. Remover la mezcla con la cucharilla hasta que se disuelva la sal. La mezcla constituye lo que se denomina disolución de lisis.  

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7. Colocar un colador sobre un vaso de plástico limpio y hacer pasar a través de la malla el lisado generado en el paso anterior. Al filtrar el  lisado estaremos eliminando gran parte de  los desechos resultantes de  la ruptura del tejido de la fresa y los trozos más grandes de fruta.  8. En el vaso se encontrará un líquido denso que entre otros componentes contiene el ADN en disolución. 

Para  precipitarlo,  añadiremos  un  chorro  de  etanol de 96 (el  alcohol  que  se  encuentra  en  todos  los botiquines). El ADN es soluble en agua, pero no lo es en etanol, de manera que al añadírselo, y ayudado por los  cationes  de  sodio  aportados  por  la  sal  en  la  disolución  de  lisis,  el  ADN,  aglutina  formando  un precipitado.  9. Al añadir el etanol veremos que se forman dos fases en el vaso, una más densa de color rosa en el fondo y otra  superior más  transparente con el etanol. En  la  fase con el etanol aparecerán unas  fibras de color blanquecino y aspecto gelatinoso. Éstas podrán ser observadas con mayor claridad si  las  retiramos de  la disolución con ayuda de unas pinzas.   10. Esa masa gelatinosa es principalmente ADN y  como podrás observar  se ha obtenido mucho,  incluso visible a  simple vista partiendo  solamente de dos  fresas. Esto es así debido a que  las células de  la  fresa contienen mucho ADN.   

NOTAS: 

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Preparación de un gel de agarosa y electroforesis de ácidos nucleicos

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Extracción de ADN de la fresa