LIBERACIÓN · LIBERACIÓN 2 FRANCISCO CÂNDIDO XAVIER ANDRÉ LUIZ LIBERACIÓN
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA LIBERACIÓN IN VITRO
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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICAS ESTUDIO COMPARATIVO DE LA LIBERACIÓN IN VITRO DE LA ASOCIACIÓN DE LIDOCAÍNA-PRILOCAÍNA DESDE PREPARADOS MAGISTRALES MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO FELIPE ANDRÉS FERRUFINO ZARGES PROFESOR PATROCINANTE DIRECTORES DE TESIS: PROF. EDDA COSTA PROF. EDDA COSTA PROF. JAVIER MORALES Santiago, Chile 2011
Transcript of ESTUDIO COMPARATIVO DE LA LIBERACIÓN IN VITRO
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICAS
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA LIBERACIÓN IN VITRO
DE LA ASOCIACIÓN DE LIDOCAÍNA-PRILOCAÍNA
DESDE PREPARADOS MAGISTRALES
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO
FELIPE ANDRÉS FERRUFINO ZARGES
PROFESOR PATROCINANTE DIRECTORES DE TESIS: PROF. EDDA COSTA PROF. EDDA COSTA
PROF. JAVIER MORALES
Santiago, Chile 2011
2
AGRADECIMIENTOS
Primero deseo agradecer el gran apoyo que mi madre siempre me ha
dado, sobre todo en la difícil época en la cual mi padre se encontraba enfermo
en cama, sin su ayuda e incansable abnegación, nada de ésto habría sido
posible. Así también a mi padre por la protección que siempre me brindó,
seguro le habría hecho muy feliz poder estar presente en esta etapa.
Doy gracias a la Profesora Edda Costa por su gran paciencia conmigo y
la dedicación que siempre mostró hacia mi trabajo. Sobre todo por que sé que
en ocasiones surgieron adversidades que aunque no dependían de ella,
siempre hizo lo imposible por solucionarlas. Por eso y por los muchos pequeños
detalles, muchas gracias!. También quisiera agradecer al Profesor Javier
Morales el cual conozco desde años y siempre me ha ayudado y orientado mas
allá de sus obligaciones, tanto en los buenos momentos como en los no tan
buenos. Muchas gracias Javier!. Quisiera agradecer a todo el Departamento de
Ciencias y Tecnología Farmacéuticas, profesores y funcionarios, por su
constante preocupación, apoyo y compañía. No quiero dejar de agradecer al
Departamento de Química Orgánica y Físicoquímica, que aunque no fueron del
todo participes en este proceso, en muchas ocasiones, siempre me abrieron las
puertas y motivaron en mi un interés que creía perdería.
Por ultimo agradezco a mis compañeros que siempre estuvieron
conmigo, antes y después de las clases y las pruebas, en los trabajos, en los
recreos, en los paseos, congresos y por su puesto en los festejos. Su sincera
amistad es un regalo invaluable que siempre perdurará, sin importar todos los
años y todo lo que pase.
¡MUCHAS GRACIAS A TODOS!
3
RESUMEN
La administración de fármacos a través de la piel es una práctica muy
utilizada en dermatología. La vía de administración cutánea es poco invasiva,
de fácil acceso y en cierta manera, es segura debido a la externalidad de los
preparados utilizados.
En una lesión, ya sea causada por un por un golpe, una herida o una
intervención médica, las fibras nerviosas superficiales, ubicadas en la dermis y
la epidermis, son capaces de percibirlas cualquiera haya sido su origen,
mecánico, a causa del calor o el frío, o de un daño al tejido tisular.
La asociación prilocaína-lidocaína tópica (EMLA) es innovadora en el
tratamiento del dolor local. El mecanismo por el cual este fármaco realiza su
acción es la depresión de la conducción nerviosa al bloquear los canales de
sodio dependientes de voltaje.
La asociación tópica en cuestión se comercializa en Chile en forma de
gel en concentraciones de 2,5% de prilocaína y de 2,5% de lidocaína por varios
laboratorios farmacéuticos y es prescribidla como preparado magistral en la
misma forma de presentación.
En este trabajo se evaluaron los perfiles de liberación in vitro de dos
formulaciones de EMLA, (gel base carbomer y gel base poloxámero 407)
utilizando una modificación del aparato 5 de la USP 30.
Los resultados obtenidos mediante los modelos de cesión,
específicamente la ecuación de Peppas y Sahlin, indicarían que la cinética de
liberación de lidocaína y prilocaína de los dos productos se aproxima a un
modelo de transporte gobernado principalmente por la difusión de los
compuestos a través de la matriz.
Los resultados presentaron diferencias significativas entre ambos
productos, según el cálculo del factor de diferencia f1 y el factor de similitud f2.
4
ABSTRACT
In vitro release comparison of metronidazole from dermatological
formulations
Drug administration through skin is a very used practice in dermatology.
Cutaneous administration is minimally invasive, easily accessible and in some
way is safer due to the externality of the used formulations.
In a injury, cause for a hit, a hurt or a medical intervention, the nerve
superficial fibers, ubicated in the dermis and epidermis, are able of sensing any
alteration independent of your origin, mechanical, to cause cold or hot, or a
harm tisular.
The topical association of prilocaine-lidocaine (EMLA) is an innovator
treatment in the medication of local pain. The mechanism by which the drug
perform your action is the depression of nerve conduction, for blocking the
sodium channels dependent of voltage.
In our country, EMLA is marketed in gel form in a concentration of 2.5%
of both drugs, for several pharmaceutical laboratories. Is too prescribed like
compounding formulation in a same concentration.
In this research were evaluated in vitro release profiles of two EMLA
formulations (base gel carbomer and base gel poloxamer 407) using a
modification of USP 30 apparatus 5.
The results obtained through of models release, specifically the Peppas
and Sahlin model, indicate that the kinetics release of both drugs be produce
mainly by diffusion across of the matrix.
Results showed significant differences between both products, according
to the calculation of difference factor (f1) and similitud factor (f2).
5
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................................... 2
RESUMEN .......................................................................................................... 3
ABSTRACT ........................................................................................................ 4
ÍNDICE ................................................................................................................ 5
INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 7
Anestésicos locales ..................................................................................................................... 8
Lidocaína y prilocaína .................................................................................................................. 9
Características físico-químicas de los fármacos .................................................................... 10
Liberación in vitro ...................................................................................................................... 14
Modelos matemáticos de cesión in vitro ................................................................................. 15
Metodología analítica de cuantificación .................................................................................. 20
Validación de una metodología analítica ................................................................................. 21
HIPÓTESIS ....................................................................................................... 23
OBJETIVO GENERAL ...................................................................................... 23
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................. 23
MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 24
Preparación de las soluciones utilizadas ................................................................................ 26
Validación de la metodología analítica .................................................................................... 28
Validación de la metodología de liberación de fármacos ...................................................... 31
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 36
Validación del método analítico de cuantificación ................................................................. 36
Validación del método de disolución ....................................................................................... 45
Determinación de la cinética de liberación ............................................................................. 48
6
CONCLUSIONES ............................................................................................. 56
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 57
ANEXOS ........................................................................................................... 62
TABLAS ....................................................................................................................................... 63
CROMATOGRAMAS ................................................................................................................... 64
Propuestas para el mejoramiento de la celda de cesión y la aplicación de las muestras . 67
7
INTRODUCCIÓN
Frente a una lesión, ya sea causada por un por un golpe, una herida o
una intervención médica, las fibras nerviosas superficiales, ubicadas en la
dermis y la epidermis, son capaces de percibirlas cualquiera haya sido su
origen, mecánico, a causa del calor o el frío, o de un daño al tejido tisular.
La ruptura de células conlleva a la liberación de sustancias que
comúnmente no se encuentran en el medio extracelular. El ATP, la acetilcolina
y la serotonina actúan solos o en combinación con otros intermediarios
secundarios para sensibilizar a los nociceptores, responsables de la percepción
del dolor, tanto a nivel intracelular como extracelular. Esta cadena de eventos
provoca la despolarización de la membrana, lo que impulsa la apertura de los
canales de sodio responsables de la propagación del impulso nervioso, sitio
donde actúan los anestésicos locales.
Las fibras nerviosas en las que se ubican los nociceptores, encargadas
de la transmisión nerviosa relacionada al dolor, se encuentran en la dermis y la
epidermis. Éstas se clasifican en A- A- y C. Las fibras A son responsables
del dolor agudo e instantáneo experimentado frente a una lesión, mientras que
las C son las que provocan el dolor posterior más persistente e intenso (1,2).
8
Anestésicos locales
Estos compuestos actúan deprimiendo la conducción nerviosa al
bloquear los canales de sodio dependientes de voltaje. Las formas ionizadas de
estas moléculas son las activas, predominantes a pH fisiológico; su interacción
con el canal abierto disminuye la velocidad de despolarización y, por lo tanto, la
velocidad de conducción, aunque sin modificar el potencial de reposo (Figura
1). A concentraciones altas y crecientes la especie inactiva (no ionizada)
interactúa con el receptor alargando el periodo refractario, en consecuencia, el
número de potenciales de acción que el nervio puede trasmitir por unidad de
tiempo va disminuyendo hasta que el haz queda bloqueado totalmente (3).
Figura 1: Mecanismo de acción de los anestésicos locales
Por lo general, la potencia y duración de un anestésico local se ha
asociado a su afinidad por las sustancias grasas, lo que se traduciría en una
mayor lipofilia del principio activo. Ejemplos de éstos son la bupicaína,
etidocaína y ropivacaína. Por el contrario, aquellos activos menos liposolubles,
a pesar de ser menos potentes y de menor duración, tienen la ventaja de
ofrecer una mayor rapidez de acción. Tanto la prilocaína como la lidocaína son
hidrosolubles a pH fisiológico y tienen constantes de disociación (pKa) muy
cercanas a este valor de pH (7,4). Esta característica les permite encontrarse
no ionizadas en una mayor proporción, facilitándoles la interacción con las
membranas de los nervios (3).
9
Lidocaína y prilocaína
La asociación compuesta por lidocaína y prilocaína forma una mezcla
eutéctica denominada Eutetic Mixture of Local Anesthetic, EMLA, sigla en
inglés. Ambos principios activos en sus formas básicas y en una relación de 1:1
permiten formar una mezcla eutéctica reduciendo su punto de fusión a 18ºC.
Esta mezcla, posteriormente se incorpora a geles, que producen una analgesia
más rápida por la alta proporción de agua en la formulación y con menores
efectos secundarios (4,5).
Esta mezcla se encuentra indicada como anestésico para el tratamiento
del dolor periférico, esencialmente cutáneo o superficial, abarcando lesiones
venéreas, prurito, ulceraciones, hiperhidrosis, herpes, prevención del dolor para
múltiples intervenciones médicas e incluso como coadyuvante en el tratamiento
del dolor crónico (4).
Estudios comparativos realizados en neonatos, mediante la medición de
indicadores de estrés, muestran una mayor eficacia de esta asociación al 5%
respecto al uso de lidocaína al 30% (6).
En nuestro país, esta asociación tópica se comercializa en forma de gel
en una concentración de 2,5% de ambos anestésicos -prilocaína y lidocaína-
respectivamente, por distintos laboratorios farmacéuticos y también se prescribe
como preparado magistral en la misma forma de presentación.
10
Características físico-químicas de los fármacos
Ambos fármacos, lidocaína y prilocaína, son bases débiles, aminas
terciaria y secundaria respectivamente, que están conectadas por un enlace de
tipo amida a un anillo aromático di y mono sustituido, respectivamente (Figura
2).
Figura 2: Estructuras químicas de lidocaína (A) y prilocaína (B)
Las características físico-químicas de ambos fármacos se encuentran en
la Tabla 1.
Fármacos Lidocaína Prilocaína
Peso molecular (g/mol) 234,3 220,3
pKa 7,9 7,9
Log P 2,56 2,11
Log D * 1,66 1,23
Solubilidad en agua (g/mol) 6,8 5,8
Punto de fusión (ºC) ~68,5 ~37,5
Longitudes de onda máxima (nm) 263 220
*Coeficiente de partición octanol-tampón fostato pH 7,4
Tabla 1: Características físico-químicas de la lidocaína y prilocaína
Sus solubilidades y características varían según se presenten en forma
pura o como sus respectivos clorhidratos, siendo los primeros solubles en
11
etanol y los segundos en agua y etanol. Con respecto a su aspecto físico, la
lidocaína en su forma clorhidrato, es ligeramente más amarillenta que la forma
pura; mientras que la prilocaína presenta aglomeración de los cristales en su
forma pura (5,7,8).
Polímeros
Esta asociación EMLA se utiliza en la elaboración de dos preparados
magistrales que se diferencian en el polímero. Uno de ellos es el carbomer cuya
estructura se presenta en la Figura 3.
Figura 3: Estructura del carbomer
Químicamente el carbomer es un derivado del ácido acrílico el cual
posee grupos funcionales carboxilos, responsables del hinchamiento con el
cambio de pH del medio, adquiriendo la mayor viscosidad entre valores de pH
de 5 y 9, como se muestra en la Figura 4.
12
Figura 4: Viscosidad (cP) en función del pH, para distintos subtipos de
carbomer al 0,5%
Este polímero a valores bajos de pH, pierde solubilidad al no tener sus
grupos neutralizados. Por el contrario, a altos valores de pH el polímero pierde
solubilidad por la repulsión electrostática causada por la presencia de
electrolitos en alta concentración. Las diferencias entre cada tipo de carbomer
radican principalmente en el largo de cadena y no en la cantidad de grupos
ionizables, ya que todos tienen en promedio 76 grupos (76 ± 4) (9).
Otro de los polímeros utilizados para incorporar estos anestésicos es el
poloxámero 407, comercializado como Lutrol® L127, el cual es un copolímero
en bloque A-B-A, donde A es una unidad de óxido de etileno (porción
hidrosoluble) y B es una unidad de óxido de propileno (porción hidrofóbica) cuya
estructura se presenta en la Figura 5.
Figura 5: Estructura del poloxámero 407
13
Este polímero presenta una viscosidad termorreversible, es decir que
ésta varía con la temperatura, como se muestra en la Figura 6.
Figura 6: Variación de la viscosidad del poloxámero 407 con respecto a la
temperatura a distintas concentraciones
Su punto de transición vítrea, temperatura a la que el polímero cambia de
estado sólido a estado gel, se encuentra entre los 15 a 25ºC, y está fuertemente
influenciado por la presencia de otros componentes en formulación como sales
orgánicas o inorgánicas, polietilenglicol, disolventes, etc. La presencia de
monómeros lipofílicos dentro de su estructura ha sido ampliamente utilizada
para modificar las propiedades de disolución y estabilidad de los principios
activos (10).
14
Liberación in vitro
El objetivo de realizar pruebas de liberación in vitro es comprender y
predecir la capacidad que tienen los excipientes de afectar la liberación de un
fármaco hacia y a través de la piel. Para ello se utilizan celdas de difusión, que
consisten en dos compartimentos separados por una membrana
semipermeable, siendo uno de ellos reservorio de la formulación del fármaco
(compartimento dador) y el otro una solución receptora homogénea
(compartimento receptor) (12,13).
En estos sistemas deben asegurar los supuestos teóricos sobre los que
se fundamente el modelo físico que se está estudiando. Es importante controlar
los siguientes parámetros (12,13):
Solución receptora: el medio más adecuado es una solución de pH 7,4
equivalente al pH plasmático.
Temperatura y agitación: debe disponerse de un sistema termostatado
que permita controlar la temperatura a 32 ± 1ºC que es la temperatura
fisiológica de la piel.
Exactitud y precisión en el muestreo: mediante un sistema que asegure
que el volumen de muestra sea exacta y representativa del contenido del
compartimiento de receptor. El volumen del compartimiento de receptor
no es lo suficientemente grande, respecto al volumen de la muestra, la
cual se debe reponer. Los resultados podrían ser más confiables si se
utilizara una celda de mayor volumen. En la Figura 7 se presenta un
esquema de la celda de difusión de Franz.
15
Figura 7: Esquema representativo de la celda de Franz
Por lo antes expuesto, en este trabajo se utilizó el Aparato 5 de la USP
30 empleado para parches transdérmicos, el cual fue modificado para evaluar la
liberación de los fármacos utilizados en los preparados magistrales.
Modelos matemáticos de cesión in vitro
La descripción mecanística o matemática de como un fármaco se
transporta desde un medio o hacia otro ha experimentado una serie de
correcciones y expansiones desde hace más de un siglo. A finales del siglo XIX,
Noyes y Whitney plantearon que en un medio biológico la disolución de un
sólido viene seguida por su absorción, lo que lleva a concluir que la
concentración del compuesto se mantendría a niveles muy bajos en relación a
su solubilidad (condición sink o sumidero). Así la suposición de un medio de
disolución infinito, por ser renovable, hace a la velocidad de cesión
independiente de la cantidad disuelta, siendo proporcional a una constante K1
(Ecuación 1). Dicha constante depende directamente del coeficiente de difusión
del compuesto en el medio D, su solubilidad en éste CS y de la superficie de
contacto de la forma farmacéutica con éste S e inversamente de la capa de
difusión h. Este conjunto de supuestos se conoce como “modelo de orden 0”,
16
ideal para dispositivos que no cambian su forma como dispositivos osmóticos o
de reservorio (14).
h
SDCS
1k
t
Q
Ecuación 1
donde:
t
Q
= la velocidad de liberación del activo
k1 = constante que integra los factores experimentales antes nombrados
Integrando indefinidamente la Ec.1 se obtiene la Ecuación 2:
tkQ 1t
Ecuación 2
donde:
Qt = cantidad cedida al tiempo t.
Es habitual que las formas farmacéuticas cambien su superficie de
liberación en función del tiempo, por esta razón Hixson y Crowell proponen que,
si la geometría no cambia, la superficie sería proporcional a la cantidad de
fármaco no liberada (Ecuación 3) (14).
)Q(Qkt
Qt2
Ecuación 3
Integrando definidamente con respecto a la cantidad a tiempo 0 y t se
obtiene la Ecuación 4, que es conocida como ―modelo de orden uno‖.
17
t-ke)Q(Q 2
t
Ecuación 4
donde:
k2 = reemplaza la superficie por un término de proporcionalidad entre ésta y la
cantidad que queda por ceder, a diferencia de k1.
Q∞ = cantidad cedida a tiempo infinito.
Con posterioridad Wagner en el año 1959, demostró que la mayoría de
las formas de liberación prolongada mostraban cinéticas in vitro de pseudo
orden uno ya que el modelo no era capaz de ajustar la primera parte de la curva
de liberación. Posteriormente, Higuchi en el año 1961, propuso un modelo para
el ajuste de la cinética de liberación de fármacos suspendidos en bases de
pomadas. Este modelo parte de la condición de que la concentración del activo
en la base C es mucho mayor a su solubilidad en ella Cs. Así, se introduce el
factor mencionado, anteriormente del espesor de la capa de difusión h, el que
se va incrementando a medida que el activo se cede al medio a través de una
superficie semipermeable (Ecuación 5) generándose una diferencia de
concentración, a lo largo de h, entre Cs y la concentración en el medio, el que
describe la variación de la cantidad liberada en el tiempo (Ecuación 6) (14, 15).
h
DC
t
Q s
Ecuación 5
hVChCQ
Ecuación 6
18
Reemplazando la Ec. 6 en la Ec. 5, y realizando un arreglo matemático
se obtiene la Ecuación 7:
SSt )CC(2CtDQ
Ecuación 7
donde:
Qt = cantidad de fármaco disuelto al tiempo t
D = coeficiente de difusión del compuesto en el medio.
C = concentración del activo en la base.
CS = solubilidad del activo en la base
Este ajuste solo es aplicable a matrices homogéneas y granulares, no
porosas y no hinchables. Lapidus y Lordi modificaron esta Ec. 7 para describir
la liberación de fármacos solubles en agua desde matrices hidrófilicas de
liberación prolongada (Ecuación 8) (14,16).
τπ
Dt
V
SQQt
Ecuación 8
donde:
Qt = cantidad de fármaco disuelto al tiempo t
Q∞ = dosis de la matriz
S = área superficial
V = volumen del medio de disolución
D = coeficiente de difusión del fármaco en el medio
= tortuosidad de la matriz.
Simplificando términos y los valores constantes se obtiene una fórmula
simplificada, que corresponde a la Ecuación 9:
19
tkQt
Ecuación 9
donde:
k = contante que agrupa los valores constantes antes mencionados.
En la década de los 70, el desarrollo de numerosos sistemas de
liberación modificada, intercambio iónico, osmosis, hinchamiento, etc., deja de
manifiesto que las ecuaciones basadas principalmente sólo en la difusión,
planteadas hasta esa fecha, con frecuencia concluían en ajustes inadecuados.
Por lo tanto, Peppas y sus colaboradores plantearon una nueva solución donde
se incluyen fenómenos como el hinchamiento (Ecuación 10) (14,17).
nt ktQ
Q
Ecuación 10
Donde si n = 0,5 coincide con la Ec. 9, siendo un transporte fickiano, y
cuando 0,5 < n < 1 corresponde a un transporte no-fickiano donde la liberación
se ve influenciada por la relajación de las cadenas poliméricas y el consecuente
hinchamiento de la matriz. Este modelo es aplicable para tiempos cortos y
donde Qt/Q∞ < 0,6 (14).
Posteriormente, se postula que el hinchamiento de una matriz se produce
en varios frentes (frentes de Stefan-Neumann), donde cada polímero está cada
vez más hinchado en dirección a la interfase con el medio de disolución donde,
además, las cadenas poliméricas se desagregan de la matriz. En consecuencia,
Peppas y Sahlin derivan una nueva ecuación a partir de la anterior (Ec. 10) para
incluir el efecto del hinchamiento en la liberación del fármaco, siempre y cuando
éste no sea mayor a un 25% respecto del volumen inicial (Ecuación 11) (14,18).
20
2m
2
m
1t tktk
Q
Q
Ecuación 11
donde:
m = al exponente de difusión fickiano n = 0,5.
k1 = constante correspondiente a la difusión
k2 =constante correspondiente a la relajación del polímero
Metodología analítica de cuantificación
La USP 30 no propone un método para cuantificar esta asociación de
fármacos, sin embargo, plantea métodos bastante semejantes para cada analito
por separado, ambos por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), lo
que resulta lógico por la similitud de sus estructuras. Ambas metodologías
utilizan una columna RP-18 y fases móviles con los mismos solventes,
soluciones tamponadas y acetonitrilo, en una proporción semejante, 4:1 para la
lidocaína y 73:27 para la prilocaína, respectivamente. Las longitudes máximas
de absorción para medición son de 254 nm y 240 nm y flujos de 1 y 1,5 mL/min,
para la lidocaína y prilocaína, respectivamente. La principal diferencia radica en
el tampón utilizado siendo para lidocaína ácido acético glacial ajustado a pH
3,4, y una mezcla de sales de fosfato (fosfatos mono y disódico) ajustada a pH
8 para prilocaína. En el caso de lidocaína se propone el uso de metilparabeno
para lograr una resolución óptima (>3) y el prilocaine related compound B RS
para la prilocaína.
La gran mayoría de las publicaciones, optan por la mezcla de solventes
acetonitrilo y solución tampón, en una proporción de 1:3, para cuantificar la
asociación de estos fármacos y una columna C18. Es recurrente el uso de
fosfato monosódico como buffer ajustado indistintamente con fosfato de sodio,
trietilamina o hidróxido de sodio a pH superiores a 7. La longitud de onda de
medición varía regularmente entre 210 a 260 nm y el flujo entre 0,6 a 1,5
21
mL/min. El uso de patrones internos es más relativo, siendo éstos siempre
analgésicos locales, como la trimecaína y la bubicaína, lo que es esperable
teniendo en cuenta la marcada similitud estructural entre los integrantes de esta
familia. El rango de calibración fue de 2,5 a 100 mg/L (15-17). Existe otra opción
donde se reemplaza el acetonitrilo por metanol y una fase móvil formada por
metanol y buffer fosfato, ajustado a pH 8, en una proporción de 30:70 utilizando
una columna Lichrosorb RS-8. Las condiciones cromatográficas indicaban un
flujo de 1 mL/min y una longitud de onda de medición de 245 nm (5).
Se ha descrito otro método de cuantificación mediante cromatografía de
gases acoplado a un espectrofotómetro de masas. Este obtuvo límites de
detección del orden de 100 veces menores a los logrados mediante HPLC,
permitiendo la lectura de concentraciones mucho menores a las logradas por
ese método (0,016 – 50mg/L). La muestra era sometida a una extracción
alcalina previa a la inyección y como patrón interno se utilizaba ropivacaína
(22).
Validación de una metodología analítica
La validación de un método de análisis se define como: ―la confirmación
por examen y la provisión de evidencia objetiva de que se cumplen los
requisitos particulares para un uso propuesto‖ (NMX EC 17025 IMNC 2006) ó
―el proceso de establecer las características de desempeño y limitaciones de un
método de medición y la identificación de aquellas influencias que pueden
modificar estas características y a qué grado lo afectan‖ (EURACHEM ―The
Fitness for Purpose of Analytical Methods‖), por lo tanto, se puede decir que la
validación de un método analítico, es una herramienta para demostrar que el
desempeño de un método analítico específico cumple con las especificaciones
necesarias para las características de medición definidas (23, 24).
Internacionalmente la comunidad analítica, ha establecido las principales
especificaciones y requisitos operativos de un laboratorio de análisis por medio
de la Norma Internacional ISO/IEC 17025:2005 ―Requisitos generales para la
competencia de los laboratorios de ensayo y calibración‖, esta norma específica
22
muestra claramente la necesidad de la validación de los métodos analíticos
como un requisito indispensable antes de realizar una medición analítica, ya
que el desempeño de un método analítico es diferente en cada laboratorio que
lo realiza y además los métodos analíticos no se pueden utilizar para medir un
analito en cualquier matriz, sino que muchas veces son específicos para la
matriz en la que fueron desarrollados. Esto adquiere una mayor importancia en
el presente caso, por tratarse de una metodología analítica nueva y por la
importancia en su posterior aplicación (25).
Lo anteriormente expuesto, se utilizará para estudiar en forma
comparativa la liberación in vitro de la asociación de lidocaína-prilocaína desde
preparados magistrales.
23
HIPÓTESIS
En el presente trabajo se plantea como hipótesis que la velocidad de
liberación in vitro de la asociación de lidocaína y prilocaína desde preparados
magistrales, formulados en una matriz de carbopol y otra de poloxámero 407,
son similares entre sí.
OBJETIVO GENERAL
Comparar la liberación in vitro de la asociación lidocaína-prilocaína desde
preparados magistrales.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Optimizar y validar una metodología analítica para cuantificar la asociación
lidocaína-prilocaína a ser cuantificada.
Estandarizar el método de liberación de la asociación lidocaína-prilocaína
mediante el Aparato 5 adaptado de la USP 30.
Comparar los perfiles de liberación in vitro de ambos fármacos desde los
preparados magistrales en estudio.
Determinar la cinética de liberación de los fármacos desde ambos
preparados.
24
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
Solventes y reactivos usados en cromatografía líquida
Etanol grado HPLC
Acetonitrilo grado HPLC
Potasio dihidrogenofosfato para análisis EMSURE® ISO
Acido clorhídrico
Hidróxido de sodio
Agua destilada
Lidocaína base estándar USP 99,3% pureza
Prilocaína estándar USP 99,3% pureza
Principios activos y excipientes
Lidocaína base estándar USP 99,3% pureza
Prilocaína estándar USP 99,3% pureza
Carbomer (Carbopol® Ultrez-10) grado USP, Münnich
Tween®80 grado USP, Münnich
Trietanolamina grado USP, Henkel
Agua destilada y desaireada
Preparados en estudio
EMLA gel de carbomer (P1)
EMLA gel poloxamer 407 (P2)
25
Materiales
Jeringas Hamilton HPLC 25 y 50 uL aguja fija
Chromolith performance RP-18E 100-4.6 columna preparada monolítica
para HPLC Chromolith
Papel filtro Advantec No. 5ª, Quantity 100, diámetro 9 cm.
Baño termorregulado Elma E 30 H
Vórtex Super Mixer Cat. Nº 1291
Sonicador
Membrana de diálisis Snake Skin® 3.5MWCO Thermo Scientific
6 celdas de cesión elaboradas en acero inoxidable
Material de vidrio de uso habitual en el laboratorio
Equipos
Sistema HPLC consistente de un controlador Waters 600, un desgasificador
de helio, una bomba cuaternaria y un fotodetector Waters 996 con arreglo de
diodos.
Sistema HPLC consistente de un integrador cromatográfico D-2500, un
detector UV-VIS L-4200 y una bomba L-6000A, Merck-Hitachi.
Espectrofotómetro Spectronic Genesys 5
Equipo medidor de pH
Balanza analítica Adam Modelo AQT-200
Balanza de precisión Denver Modelo PI-214
Equipo de disolución Pharmatest Type Ptw SIII
26
Metodología
Preparación de las soluciones utilizadas
Preparación de soluciones para las curvas de calibración
Tanto para lidocaína como para prilocaína (estándares), se preparó un
conjunto de 4 soluciones de concentraciones crecientes en matraces aforados
de 50 mL utilizando como solvente agua destilada, las primeras 3 fueron de 60
a 200 mg/L con intervalos relativamente regulares entre cada punto, la restante
se preparó a una concentración más elevada (aproximadamente 500 mg/L).
Cada una de éstas fue diluida, de la primera se tomó una alícuota de 5 mL con
pipeta aforada y se transfirió a un matraz aforado de 10 mL, de cada una de las
tres restantes se extrajo una alícuota de 8mL con pipeta aforada y, de la misma
forma que se hizo con la primera solución, fueron trasladadas a sus respectivos
matraces aforados de 10mL. De esta forma, finalmente se obtuvieron 2
conjuntos de 8 soluciones de concentraciones crecientes de ambos estándares
a partir de 8 pesadas iníciales en balanza analítica. Cada solución fue inyectada
por triplicado y fueron registradas sus respectivas áreas.
Preparación de soluciones para determinar precisión
Para cada uno de principios activos -lidocaína y prilocaína-, se
prepararon 3 soluciones de concentraciones cercanas a 120 mg/L. De cada una
de ellas, se tomaron 3 alícuotas de 8mL, salvo de la última en que se tomaron
4; éstas fueron llevadas por separado a matraces aforados de 10mL los que
posteriormente se enrasaron con agua destilada. Cada solución fue inyectada
por triplicado y se registraron sus respectivas áreas el día en que se prepararon
las soluciones y al día siguiente (intradía e interdía).
27
Preparación de soluciones para las pruebas de estrés y especificidad
De igual manera a lo descrito anteriormente, se prepararon dos
soluciones de cada principio activo de aproximadamente 120 mg/L en matraces
de 100mL, utilizando como solvente agua destilada. De cada matraz se tomaron
7 alícuotas de 8mL las cuales fueron trasladadas a 7 matraces aforados de 10
mL. Un matraz fue acidificado con 1mL de HCl 0,5 N, otro alcalinizado con 1mL
de NaOH 0,5 N y a otro se le agregó aproximadamente 9mg de Tween®80.
Posteriormente, todos los matraces fueron enrasados con agua destilada. Cada
solución fue inyectada por triplicado y se registraron sus respectivas áreas.
Preparación de la fase móvil y condiciones cromatográficas
Se pesaron 3,4g de KH2PO4 y 0,8g de NaOH y se trasladaron a matraces
aforados de 200 y 250mL respectivamente, y se completó su volumen con agua
destilada. Ambas soluciones se mezclaron en un matraz Erlenmeyer de 500mL
y se determinó su pH, ajustándolo de ser necesario, a 7,4. Así se obtuvo una
solución 0,1M de tampón pH 7,4, la cual se diluyó con factor de dilución 10,
utilizando una pipeta aforada de 25mL y un matraz aforado de 250mL. La fase
móvil se preparó mezclando la solución anterior con acetonitrilo calidad
cromatográfica en una proporción respectiva de 65:35 (tampón fosfato pH 7,4 :
acetonitrilo). Todas las mediciones se realizaron según las condiciones
expresadas en la Tabla 2.
Temperatura de medición 20±2ºC
Flujo de fase móvil 1,3 mL/min
Longitud de onda de detección 210 nm
Tabla 2: Condiciones cromatográficas empleadas en la determinación de EMLA
28
Validación de la metodología analítica
Con el objeto de demostrar que la metodología analítica es apta para el
uso esperado, se deben realizar varias pruebas por separado que darán cuenta
de cada criterio fundamental, y en su conjunto, de la solidez de la técnica.
Limites de detección y cuantificación
El límite de detección (LD) se define como la concentración mínima a la
cual el analito puede detectarse en forma confiable. Por otro lado, el límite de
cuantificación (LC) es la menor cantidad de analito en una muestra que puede
determinarse con precisión y exactitud aceptables bajo las condiciones
establecidas. Experimentalmente se obtienen por relaciones entre la respuesta,
alto del peak, y la diferencia entre el límite inferior y superior de la señal base o
ruido (ancho de línea base), siendo de 3:1 para el LD y 10:1 para el LC. Luego
de definir el ancho de la línea base, se procedió a buscar mediante soluciones
diluidas de cada analito, valores de concentración que cumpliesen con estas
relaciones.
Linealidad y rango
La linealidad de un método analítico es su capacidad para obtener
resultados de prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por
medio de una transformación matemática bien definida, a la concentración de
analito en muestras en un intervalo dado. Con el fin de demostrar esta
proporcionalidad, se realizó una curva de calibración para cada analito con seis
concentraciones en el intervalo que se esperaba se encontrasen las lecturas del
análisis. Además se integraron a la curva dos concentraciones más alejadas de
este intervalo con el propósito de verificar que la proporcionalidad se
conservara a valores de concentración más elevados. No obstante, esta técnica
está enfocada al rango en el cual se encontraban la mayoría de las
concentraciones medidas.
29
Preparación de una solución madre
Dilución de una alícuota y medición de la solución por
triplicado
Medición de la solución por
triplicado
Dilución de una alícuota y medición de la solución por
triplicado
Medición de la solución por
triplicado
Dilución de una alícuota y medición de la solución por
triplicado
Medición de la solución por
triplicado
El rango se define como el intervalo de un método analítico
correspondiente a la amplitud entre los niveles superior e inferior del analito
(incluidos estos niveles) que se determinó con un nivel adecuado de precisión,
exactitud y linealidad.
Precisión
Es el parámetro analítico que tiene por finalidad, evaluar el grado de
concordancia entre las lecturas individuales de una medición, cuando se aplica
el procedimiento repetidas veces a una muestra homogénea. Para evaluar esta
propiedad, se prepararon tres soluciones madres de diferentes concentraciones
para cada analito, estas fueron diluidas para obtener un total de 10 soluciones a
cuantificar. Se midieron el día en que fueron preparadas y al día siguiente para
evaluar que la precisión se mantuviese y se describe en la Figura 8.
Día 1
Día 2
Figura 8: Elaboración de cada uno de los tres conjuntos por analito y su medición
Exactitud
Es una propiedad de toda metodología analítica que se define como la
cercanía de los resultados obtenidos al valor verdadero. Se evalúo mediante la
recuperación de un conjunto de 10 ampollas de lidocaína al 1%, cada una de
las cuales fue diluida y medida mediante el método desarrollado. La
30
recuperación es la proporción de la cantidad de analito, presente en la porción
de la muestra, en este caso cada ampolla, o adicionado a ésta, que es
cuantificada por el método de ensayo. El error relativo es el parámetro que da
cuenta de ella en términos porcentuales y se expresa de acuerdo a la Ecuación
12:
100C
CC%R
r
ro
Ecuación 12
donde:
%R = porcentaje del error relativo
Co = concentración observada
Cr = concentración real del analito (valor verdadero)
Especificidad
Es la capacidad de evaluar en forma inequívoca al analito en presencia
de los componentes cuya existencia se esperaría, tales como impurezas,
productos de degradación y componentes de la matriz. Se estudió la
interferencia del único excipiente declarado Tween®80, que pudiese interferir
con la cuantificación de los analitos. Para ello se prepararon dos soluciones de
igual concentración para cada analito, agregándole a la segunda en cada caso
una cantidad conocida del interferente, posteriormente, se procedió a medir y
comparar características del peak, tiempo de retención y área respecto a
aquella que no lo contenía.
Robustez
Es una medida de la capacidad del método analítico, y demuestra que no
resulta afectado por pequeñas, pero deliberadas variaciones en los parámetros
del método y proporciona una indicación de su confiabilidad durante su uso
31
normal. Se estudió realizando pequeños cambios en la longitud de onda de
medición, velocidad del fluyo, concentración del tampón y proporción de los
constituyentes en la fase móvil.
Validación de la metodología de liberación de fármacos
De acuerdo a lo señalado en la USP 30, para el ensayo de liberación se
debe evaluar sólo la precisión (Categoría III). Para esto se utilizaron los valores
obtenidos en cada uno de los vasos para obtener el coeficiente de variación.
Perfil de liberación de EMLA
Se realizó en un equipo de disolución Pharma Test Modelo PTW S III de
seis vasos. Las condiciones experimentales para realizar las pruebas de
liberación in vitro se presentan en la Tabla 3.
Método Aparato 5 modificado de la USP 30
Velocidad de rotación 50 r.p.m.
Medio de disolución Agua destilada y desaireada
Volumen 900 mL
Temperatura 32 0,5ºC
Volumen de la muestra 10 mL
Tabla 3: Condiciones experimentales del estudio de liberación de EMLA
desde los geles en estudio
El método utilizado para evaluar la liberación de EMLA desde los geles
analizados fue una modificación del Aparato 5 de la USP 30 (paleta sobre
disco), utilizado originalmente para la evaluación de la cesión de parches
transdérmicos.
32
El esquema del aparato 5 de la USP 30 modificado se presenta en la
Figura 9.
Figura 9: Diseño esquemático del aparato 5 de la USP 30 modificado.
El equipo fue configurado bajo las indicaciones señaladas en la USP 30,
para el aparato 2 de la USP, que consisten en la utilización del vaso y la paleta
utilizados en el, junto con un disco de acero inoxidable ligeramente troquelado
(ahuecado) donde se crea un volumen para ubicar el parche transdérmico a
evaluar el que a su vez esta sellado con una junta de goma, y opcionalmente
con una membrana semipermeable, fijada al disco mediante un anillo, tuercas y
pernos de acero inoxidable 316. La modificación introducida sólo radica en la
naturaleza del disco, obtenido por repujado (moldeado), mayor volumen para
depositar el preparado dermatológico, distinto origen y dimensiones de la junta
de caucho. Se utilizó una membrana de diálisis Snake Skin de 3.5 MWCO con
medio de cesión entre ambos compartimentos. El esquema se presenta en la
Figura 10. Adicionalmente se plantean en los Anexos, sección ―Propuestas
para el mejoramiento de la celda de cesión y la aplicación de las muestras‖,
33
varias propuestas para el mejoramiento de la celda y la aplicación de las
muestras basadas en dificultades experimentales.
Figura 10: Diseño esquemático de la celda utilizada en el aparato 5 de la USP 30
modificado
La distancia entre la paleta y la célula fue de 25 + 2 mm, la muestra se
extrajo desde el punto medio ubicado entre la parte superior de la paleta y la
superficie del medio de disolución y a más de 1 cm desde la pared del vaso
utilizando una pipeta aforada.
Se tomaron muestras de 10 mL cada una hora durante las primeras 4
horas y posteriormente cada 2 horas hasta las 10 horas, reponiendo en cada
ocasión el volumen extraído con medio de disolución (agua destilada y
desaireada) a igual temperatura.
Las muestras extraídas fueron filtradas e inyectadas en un sistema de
cromatografía liquida de alto rendimiento y leídas a una longitud de onda de 210
nm, como se describió anteriormente.
34
Determinación de la cinética de liberación
Con el propósito de determinar que modelo cinético se ajustaba mejor a
los datos obtenidos para cada formulación estos fueron linearizados según la
ecuación correspondiente a cada modelo revisado: orden 0, orden 1, Higuchi,
Peppas y Peppas y Sahlin, teniendo como parámetro comparativo el factor de
determinación (r2).
Análisis estadístico
Se determinó la constante de velocidad para cada principio activo en
cada vaso. Estas fueron agrupadas en su respectivo ensayo, teniendo un total
de tres ensayos (tres grupos) para cada activo en cada preparado, para realizar
finalmente 4 análisis con tres grupos cada uno. Con estos datos se procedió a
realizar las 4 pruebas de Tukey correspondientes conformadas por un análisis
de varianza de ANOVA que buscó diferencias significativas entre los ensayos.
También, en forma anexa e independiente, se mostró si existía una diferencia
significativa entre cada arreglo de par ensayos posibles, 3 para cada prueba.
Esta prueba fue realizada mediante el software SPSS Statistics 17.0.
Comparación de los perfiles de liberación de los preparados
La comparación de los perfiles de liberación de los fármacos liberados
desde los preparados en la forma de gel, se realizó utilizando métodos
matemáticos modelo independientes, como son el factor de diferencia f1 y el
factor de similitud f2 que se presentan en las ecuaciones 13 y 14,
respectivamente.
100
1
11
n
t
t
n
t
tt
R
TR
f
Ecuación 13
35
1001
1501
22
n
t
tt TRn
Logf
Ecuación 14
36
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Validación del método analítico de cuantificación
En una primera etapa, dedicada al montaje y optimización de los
parámetros cromatográficos, se trabajó con un equipo cromatográfico
conformado por un controlador Waters 600, desgasificador de helio, bomba
cuaternaria y un fotodetector con arreglo de diodos Waters 996. A partir de ello,
se estableció un método de gran calidad analítica obteniendo una óptima
separación de las señales y una buena definición de éstas. La totalidad de la
validación del método, según como se describe a continuación, fue realizada en
un equipo conformado por un sistema HPLC consistente de un integrador
cormatográfico D-2500, un detector UV-VIS L-4200 y una bomba L-6000A,
marca Merck-Hitachi, con el que se procedió a medir las concentraciones de
analitos contenidas en las muestras obtenidas durante el ensayo de liberación.
Análisis cromatográfico
Tabla 4: Parámetros de calidad cromatográficos
Se realizó un análisis de los principales parámetros cromatográficos
(Tabla 4). El factor de asimetría (B/A), es sin duda el que se aleja de los valores
PRILOCAÍNA LIDOCAÍNA
tr (min) W1/2 B 1/10 A 1/10 tr (min) W1/2 B 1/10 A 1/10
1 3,92 0,4 0,15 0,65 7,32 0,7 0,2 1,1
2 3,91 0,45 0,1 0,65 7,32 0,8 0,3 1,05
3 3,91 0,4 0,15 0,65 7,3 0,72 0,3 1
Media 3,91 0,42 0,13 0,65 7,31 0,74 0,27 1,05
k' (f. de capacidad) 3,35 7,13
f.a. (Factor de asimetría) 0,21 0,25
(desviación estándar de peak) 0,18 0,31
R l-p (resolución) 21,03
a l-p (f. de selectividad) 2,13
Nef (número de platos efectivos) 487 539
37
óptimos, debiendo tener un valor mínimo de 0,5 y uno máximo de 1,4. Este
valor tan pequeño, se debe principalmente a la presencia de tailing, la razón de
su existencia y por qué no pudo corregirse se describe más en detalle adelante
en ―robustez‖. Inicialmente, producto del desconocimiento de la interferencia de
la matriz, se decidió realizar el análisis cromatográfico a un tiempo más largo
por la probabilidad que apareciesen interferentes. Como no se presentaron, el
flujo pudo incrementarse para acelerar la medición. Es importante notar que se
cuenta con el criterio de resolución exigido por la USP 30 en la cuantificación de
ambos analitos, R > 3 (8, 26, 27).
En los Anexos, sección cromatogramas, se muestran ejemplos de los
cromatogramas obtenidos tanto en conjunto como por separado para ambos
analitos y a distintas concentraciones de estos.
Limites de detección y cuantificación
Primero se procedió a determinar el ruido mediante la inyección de etanol
y observación de la línea base durante periodos largos de 20 a 30 min. A
continuación, se realizaron diluciones a partir de una solución madre de cada
estándar (lidocaína y prilocaína) e inyectaron hasta que se obtuvieron
relaciones señal-ruido de 3 y de 10 para cada compuesto, límites de detección y
cuantificación respectivamente, siendo de 1 mg/L y 3,5 mg/L para la prilocaína y
de 1,6 mg/L y 5,6 mg/L para la lidocaína, respectivamente (28, 29).
38
Linealidad y rango
Las soluciones patrones de calibración preparadas fueron de 30 a 500
mg/L. En la Tabla 5 se presentan los coeficientes de variación, señalados, y
calculados a partir de las 3 mediciones por punto, donde casi la totalidad de
ellos fueron menores al 5%.
LIDOCAINA
C [mg/L]
DE áreas [u.a]
Media áreas [u.a]
CV áreas [%]
DE Tr [min]
Media de Tr [min]
CV Tr [%]
33 30652 1300147 2,4 0,07 7,27 0,9
66 103978 2613862 4,0 0,01 7,29 0,1
81,6 159311 2843864 5,6 0,01 7,31 0,1
102 6075 3496504 0,2 0,01 7,34 0,1
114 54849 3788789 1,4 0,01 7,33 0,2
142 64481 4623241 1,4 0,01 7,28 0,1
410 465193 12549126 3,7 0,03 7,16 0,4
512 390473 15851290 2,5 0,01 7,10 0,1
PRILOCAINA
C [mg/L] DE áreas
[u.a] Media áreas
[u.a] CV áreas
[%] DE Tr [min]
Media de Tr [min]
CV Tr [%]
28 13523 982202 1,4 0,01 4,08 0,1
56 19833 1968487 1,0 0,01 4,06 0,1
94,4 181587 3273066 5,5 0,01 4,05 0,1
118 68133 3977797 1,7 0,00 4,04 0,0
157 87293 5590975 1,6 0,01 4,03 0,1
196 308076 6926413 4,4 0,00 4,02 0,0
416 113669 14451126 0,8 0,01 3,87 0,3
520 640177 17879893 3,6 0,01 3,93 0,3
Tabla 5: Curvas de calibración de prilocaína y lidocaína
39
En las condiciones cromatográficas de trabajo se obtuvieron curvas de
calibración para ambos compuestos, cuya ecuación de la recta fue igual a y =
34465x + 52092 para la prilocaína e y = 30538x + 37165 para la lidocaína,
respectivamente. Los coeficientes de correlación (r) y coeficientes de
determinación (r2) fueron 0,99987 y 0,9997 para la prilocaína y 0,99976 y
0,9995 para la lidocaína, respectivamente (Figura 6).
Figura 6: Curvas de calibración de prilocaína (A) y lidocaína (B)
La mayor cantidad de los puntos se concentró entre los 30 y 200 mg/L,
rango esperado de las concentraciones de trabajo durante los ensayos de
liberación. Así como en toda la curva, en este intervalo se logró una buena
correlación lineal. Los puntos más alejados tienen por finalidad asegurar la
linealidad a valores mas altos de concentración, permitiendo además a esta
metodología realizar análisis de materias primas.
El análisis de los factores de respuesta mostró que ambas curvas
cumplían con una variación aceptable menor a un 5%, siendo los coeficientes
de variación de un 1,74% para la prilocaína y de un 4,48% para la lidocaína.
A
02
46
810
1214
1618
20
0 200 400
concentración (mg/L)
UA
(M
IM v
olts)
B
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 200 400concentración (mg/L)
UA
(M
IM v
olts)
40
Precisión
Este parámetro analítico tiene la finalidad de evaluar el grado de
concordancia entre las lecturas individuales de una medición cuando se aplica
el procedimiento repetidas veces a una muestra homogénea. Se preparó un
conjunto de soluciones para cada analito las que se midieron por triplicado el
día en que fueron elaboradas para evaluar la variación diaria (intradía) entre
soluciones de teóricamente igual concentración, y de igual modo, al día
siguiente, para determinar si el paso de un periodo breve (24 hrs) afectaba
dicha concordancia de datos (interdía) (Tabla 6) (26, 29).
PRILOCAÍNA LIDOCAÍNA
INTRADÍA INTRADÍA INTERDÍA INTERDÍA
C
[mg/L] Media [u.a]
C [mg/L] Media [u.a]
C [mg/L] Media [u.a]
C [mg/L]
Media [u.a]
M1 68 68 68 68
Media 1937685 1930639 1937685 1930639
DE 29550,04 49432,0
8 29550,04
49432,08
CV 1,5 2,5 1,5 2,5
M2 124 124 124 124
Media 3256591 3297881 3256591 3297881
DE 72272,88 77441,4 72272,88 77441,4
CV 2,2 2,3 2,2 2,3
M3 110 110 110 110
Media 2524897 2484094 2524897 2484094
DE 84920,09 27756,4 84920,09 27756,4
CV 3,3 1,1 3,3 1,1
Tabla 6: Análisis de la precisión intradía e interdía por analito. Cada valor de media
corresponde al promedio de los duplicados de cada matraz con idéntica concentración
donde m1, m2 y m3 son sus respectivas soluciones madres. Lo mismo ocurre con las
respectivas desviaciones estándar (DE) y coeficientes de variación (CV)
41
Exactitud
El error relativo es un parámetro analítico que relaciona porcentualmente
el valor experimental de una medición con el valor verdadero, dando cuenta de
la exactitud del método. Se obtuvo por medio de la recuperación de un conjunto
de 10 diluciones provenientes de 10 alícuotas, cada una tomada de una
ampolla de lidocaína al 1% para uso intravenoso. Cada dilución fue inyectada
por triplicado, promediados los valores de integración, interpolados en la curva
de calibración y corregidos por factor de dilución con el objeto de obtener el
valor experimental en cada caso, el valor verdadero fue considerado como el
declarado en la ampolla (1%). Los promedios de área, concentración
equivalente, valor experimental y error relativo para cada ampolla se muestran
en la Tabla 7. Cada error relativo obtenido en cada caso se encontró dentro de
límites aceptables, +/- 3%.
Ampolla Promedio de áreas
[u.a] Concentración
equivalente [mg/L] Valor experimental
Error relativo [%]
1 3161979 90,2 1,002 0,26
2 3113527 88,8 0,986 -1,30
3 3226295,67 92,1 1,023 2,33
4 3143139,67 89,7 0,996 -0,34
5 3073238,33 87,7 0,973 -2,60
6 3155151 90,0 1,000 0,03
7 3217633,67 91,8 1,020 2,05
8 3197854,67 91,3 1,014 1,41
9 3154768 90,0 1,000 0,02
10 3126332,33 89,2 0,991 -0,89
Tabla 7: Los promedios de área, concentración equivalente, valor experimental y error
relativo para cada ampolla.
42
La recuperación de prilocaína fue imposible de realizar por este método
ya que no se contaba con ampollas de este fármaco, de manera similar a la
lidocaína.
Especificidad
La especificidad es la capacidad de determinar inequívocamente el
analito dentro de una muestra en presencia de componentes cuya aparición
resulte previsible, como productos de degradación o componentes de la matriz
de un producto terminado. Debido a que esta metodología incluye una etapa de
separación de los componentes de la muestra según su naturaleza química, se
hace muy poco probable que los excipientes puedan interferir en la medición de
los principios activos (analitos) ya que estructuralmente son muy diferentes a
éstos.
Pese a lo anterior, se evalúo la incidencia del único excipiente
probablemente interferente (Tween®80). Para tal efecto, se prepararon 2
blancos, uno para cada analito, y dos más de igual concentración pero con una
cantidad de Tween®80, según como lo descrito. Una vez realizado el análisis,
para la lidocaína se obtuvo un 2,4% de exceso en la media de las áreas
registradas para la mezcla con Tween®80 respecto de la media de las áreas
registradas para el blanco. En el caso de la prilocaína, se produjo un error por
defecto de -2,4%. Ambos valores se encuentran dentro de un criterio aceptable
para poder afirmar que no se presentó interferencia en la medición (Tabla 8).
Por otro lado, no se observó ningún cambio aparente en las
características de los peaks o los respectivos tiempos de retención, ni presencia
de peaks distintos al cromatograma común.
43
Estabilidad
Se evalúo la estabilidad de las soluciones preparadas realizando
ensayos de resistencia a la luz, a la hidrólisis alcalina y ácida (periodos de 1 h)
y a la degradación térmica en un intervalo de 20 a 80º C (periodos de 30 min).
Cada muestra fue inyectada por triplicado y comparada con la solución medida
a temperatura ambiente (20ºC), la cual se consideró como blanco (25). Los
resultados se muestran en la Tabla 8.
ENSAYOS LIDOCAÍNA [%]
PRILOCAÍNA [%] Degradación térmica (30 min en cada caso):
40ºC 0,6 -2,4
60ºC -1,7 -2,2
80ºC -1,1 -2,5
Tween 80 2,4* -2,3**
Medio ácido, 60ºC por 60 min (pH 2) 2,8 0,5
Medio alcalino, 60ºC por 60 min (pH 12) -1,5 1,5
Fotólisis (exposición a ampolleta por 12 hrs) -1,0 -0,6
*950 mg/L de Tween®80 en matraz
**880 mg/L de Tween®80 en matraz
Tabla 8: Variación porcentual de la media de las áreas bajo cada condición de
estrés y para cada analito respecto de la media de las áreas de cada blanco,
tomados como el 100%.
Todas las variaciones se encontraron dentro de un criterio aceptable de
+/- 3% respecto del blanco. Esto demuestra que ambos compuestos son
estables bajo todas las condiciones de estrés ensayadas.
Sensibilidad
La sensibilidad de un método analítico es su capacidad para discernir
pequeñas variaciones en la concentración de analito, esto significa un amplio
intervalo de señal (área) para abarcar un pequeño intervalo de concentración.
44
Así, el método que logre la pendiente mayor en la curva de calibración será el
más sensible al analito en cuestión.
Para alcanzar la máxima sensibilidad del método, se buscó inicialmente
la longitud de onda para la cual la absorbilidad de la mezcla fuese máxima y de
esa manera obtener una mayor respuesta instrumental a pequeños cambios en
la concentración. Finalmente, se presentó una mayor respuesta para la
prilocaína en relación a la lidocaína, siendo la primera 34465 u.A./[mg/L] y la
segunda 29932 u.A./[mg/L], respectivamente.
Robustez
En una primera etapa de montaje del método se procedió a evaluar
distintas condiciones cromatográficas variando flujo, composición de la fase
móvil, tanto en los solventes como en su proporción, valores de pH y
concentración. La distancia entre los dos peaks de analitos, prilocaína (tr = 4,0)
y lidocaína (tr = 7,3) respectivamente, disminuyó al aumentar la proporción de
solventes orgánicos, metanol o acetonitrilo. Por el contrario, ésta se incrementó
al aumentar la proporción de agua en la fase móvil. El efecto del pH, fue crucial
en la obtención de peaks definidos, se observó que al aumentar el pH del
tampón el tailing de las señales se fue reduciendo progresivamente. A pH 7,4
se lograron señales de bastante calidad, sin embargo, el tipo de columna no
permitía trabajar a valores mas altos de pH, lo cual habría sido de gran utilidad
para optimizar el método. El aumento en la concentración del tampón produjo
una proyección del peak hacia valores de tiempo menores, dando una
apariencia truncada, por el contrario la remoción completa de éste, generó un
incremento del tailing, en la cual se encontró una concentración óptima de 1,36
g/L de tampón fosfato dihidropotásico. Finalmente, el solvente orgánico
seleccionado fue el acetonitrilo ya que su uso disminuía la aparición del tailing.
La variación del flujo no afectó la relación entre los tiempos de retención de
ambos analitos, disminuyendo el tiempo total del análisis cromatográfico. No
obstante, se prefirió un cromatograma más extendido, no solo para lograr
parámetros analíticos de calidad, sino que principalmente por el
45
desconocimiento inicial de los componentes de la muestra, los que podrían
haber actuado como interferente, lo cual no ocurrió (21).
Validación del método de disolución
El método de liberación fue validado con respecto sólo a su precisión, tal
como lo señalan las recomendaciones de validación de la USP 30. El criterio de
aceptación corresponde a un C.V. 5%. Estos resultados se presentan en los
Anexos, sección Tablas I y II, los cuales cumplen con el criterio de aceptación
para estandarizar el método de liberación de prilocaína y lidocaína utilizando el
Aparato 5 modificado de la USP 30. (8)
Perfiles de liberación de prilocaína y lidocaína
En la Figura 11, se presenta el perfil de liberación de prilocaína y
lidocaína desde el producto P1.
Figura 11: Perfiles de liberación de prilocaína y lidocaína desde P1 (n=7)
Los porcentajes promedios de prilocaína y lidocaína liberados en función
del tiempo del producto P1 se presentan en los Anexos, sección Tabla I y II, con
0
2
4
6
8
10
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tiempo (h)
Po
rce
nta
je lib
era
do
prilocaína
lidocaína
46
sus respectivas desviaciones estándares y coeficientes de variación en
porcentajes.
En la Figura 12, se presenta el perfil de liberación de prilocaína y
lidocaína desde el producto P2.
Figura 12: Perfiles de liberación de prilocaína y lidocaína desde P2 (n=7)
Los porcentajes promedios de prilocaína y lidocaína liberados desde el
producto P2 en función del tiempo se presentan en los Anexos, sección Tablas I
y II, con sus respectivas desviaciones estándares y coeficientes de variación en
porcentajes.
En la Figura 13, se presentan los perfiles de liberación de prilocaína y
lidocaína desde los dos productos ensayados.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tiempo (h)
Po
rce
nta
je lib
era
do
prilocaína
lidocaína
47
Figura 13: Comparación de los perfiles de liberación de prilocaína y lidocaína
desde ambos productos en estudio.
En esta figura se puede observar que la velocidad de cesión de ambos
principios activos se reduce considerablemente en el preparado P1 respecto del
preparado P2. Esto se debe a la diferencia entre los grupos funcionales del
polímero de cada formulación. La formulación del producto P1 contiene un gel a
base de carbomer el cual, por sus grupos carboxílicos ionizados, genera una
mayor resistencia a la difusión de los principios activos al establecer con éstos
interacciones ión-ión de mayor energía que las de ión-dipolo ejercidas por los
monómeros de óxido de etileno del poloxámero 407, polímero base del
producto P2. Así también, la velocidad de cesión de la prilocaína es bastante
menor a la de la lidocaína en el preparado P1. Esto se puede atribuir a
pequeñas diferencias en la solubilidad de ambos compuestos, las que pasan a
ser significativas en un medio donde la competencia por el disolvente disponible
crece considerablemente al existir una elevada cantidad de grupos carboxílicos
ionizados.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tiempo (h)
Po
rce
nta
je lib
era
do
P1, prilocaínaP1, lidocaínaP2, prilocaínaP2, lidocaína
48
Determinación de la cinética de liberación
Se realizaron interpolaciones de los datos experimentales obtenidos para
cada modelo matemático descrito: orden cero, orden uno, Higuchi, Peppas y
Peppas y Sahlin. Se calculó el factor de determinación (r2) y la prueba de
independencia chi-cuadrado (2) para cada fármaco en cada preparado (P1 y
P2). Los resultados se muestran en las Tablas 9 y 10 respectivamente.
Formulación Fármaco Orden 0 Orden 1 Higuchi Peppas Peppas y Sahlin
P1 Prilocaína 0,9909 0,9925 0,9936 0,9887 0,9981
Lidocaína 0,9909 0,9926 0,9912 0,9934 0,9976
P2 Prilocaína 0,9964 0,9979 0,9894 0,9984 0,9994
Lidocaína 0,9959 0,9972 0,9866 0,9957 0,9984
Tabla 9: Valores de coeficiente de determinación (r2) para los modelos cinéticos
de orden cero, orden uno, Higuchi, Peppas y Peppas y Sahlin para cada
fármaco en cada preparado.
Fármaco orden 0 orden 1 Higuchi Peppas Peppas y Sahlin
P1 prilocaina 0,9986 7x10
-20 0,9669 2 x10
-18 1,0000
lidocaina 0,9984 4 x10-18
0,9770 2 x10-16
1,0000
P2 prilocaina 0,9994 4 x10
-17 0,9376 6 x10
-15 1,0000
lidocaina 0,9997 1 x10-16
0,9482 2 x10-14
1,0000
Tabla 10: Prueba de independencia chi-cuadrado (2) para los modelos
cinéticos de orden cero, orden uno, Higuchi, Peppas y Peppas y Sahlin para
cada fármaco en cada preparado.
Los valores de coeficiente de determinación r2 resultaron ser bastante
similares entre los modelos, mostrando solo una ligera aproximación al de
Peppas y Sahlin. En la prueba de independencia chi-cuadrado 2 cuando el
49
resultado se acerque más a 1 mayor será el nivel de concordancia entre los
valores observados y los teóricos, siendo estos últimos obtenidos mediante la
ecuación de la recta en cada caso. Esta prueba permitió discriminar de mejor
forma los modelos de orden cero, Higuchi,Peppas y Sahlin, especialmente este
último, mostrando una mayor correlación con los datos experimentales. En la
Figura 14 se muestran gráficos de cada modelo para cada formulación.
50
Figura 14: Gráficos de cada modelo para cada formulación, P1 y P2.
0,0
10,0
20,0
30,0
0 5 10
Qt
(mg/
L)
t (h)
Orden 0
0,0
20,0
40,0
0 5 10
Qt
(mg/
L)
t (h)
Orden 0
5,50
5,55
5,60
5,65
0 5 10
Ln(Q
o -
Qt)
Ln(t)
Orden 1
5,48
5,58
5,68
0 5 10
Ln(Q
o -
Qt)
Ln(t)
Orden 1
0,0
10,0
20,0
30,0
0,80 1,80 2,80
Qt
(mg/
L)
raiz cuatrada del t
Higuchi
0,0
20,0
40,0
0,80 1,80 2,80
Qt
(mg/
L)
raiz cuadrada del t
Higuchi
-5,50
-3,50
0,00 1,00 2,00
Ln(Q
t/Q
o)
Ln(t)
Peppas
-4,50
-4,00
-3,50
-3,00
-2,50
-2,00
0,00 1,00 2,00
Ln(Q
t/Q
o)
Ln(t)
Peppas
0,000
0,050
0,100
0,80 1,80 2,80
Qt/
Qo
t^n
Peppas y Sahlin
0,000
0,050
0,100
0,150
0,80 1,80 2,80
Qt/
Qo
tn
Peppas y Sahlin
Prilocaina
Lidocaina
P1 P2
51
Con el objeto de determinar el mecanismo de liberación de los fármacos
se analizaron los datos obtenidos de las interpolaciones de las ecuaciones de
Peppas (Ec. 10) y de Peppas y Sahlin (Ec. 11). Para cada principio activo en
ambas preparaciones se obtuvo el valor del exponente n a partir del ajuste de
Peppas y los valores k1 y k2 a partir del ajuste de Peppas y Sahlin. Estas
constantes fueron expresadas como el cuociente entre k1 y k2 con el fin de
explicar en forma directa la relación entre ambas. Los resultados obtenidos se
muestran en la Tabla 11.
Formulación Fármaco n k1/k2
P1 Prilocaína 1,038 6
Lidocaína 0,821 6
P2 Prilocaína 0,916 3
Lidocaína 0,782 2
Tabla 11: Valores de exponentes n y de cuocientes entre k1 y k2, calculados
mediante la ecuación de Peppas y la ecuación Peppas y Sahlin para cada
fármaco en cada preparado.
Los valores de n muy cercanos a 1 indican un transporte no-fickiano
donde la liberación se ve influenciada por la relajación de las cadenas
poliméricas y el consecuente hinchamiento de la matriz. Por el contrario, los
cuocientes entre la constante k1, correspondiente a la difusión, y la constante k2,
correspondiente a la relajación del polímero, dan cuenta que la contribución de
la difusión de los fármacos en la matriz de los preparados es más relevante que
la ofrecida por el fenómeno de relajación de las cadenas poliméricas. Sin
embargo, como se demostró anteriormente, el modelo de Peppas y Sahlin es el
que mejor describe la liberación de los principios activos.
Resulta importante notar que la contribución de la difusión es mayor en el
preparado P1 que en el P2. Esto se atribuye a lo señalado anteriormente, donde
52
los grupos funcionales del polímero de esta base oponen mayor resistencia a la
difusión de los activos a través de la matriz.
Se obtuvieron los valores de constantes de velocidad k para cada
fármaco en cada formulación mediante el modelo de Higuchi simplificado (Ec 9).
Como se conocía la superficie de cesión, el volumen del medio de disolución y
la dosis de la matriz fue posible igualar los valores de k obtenidos
experimentalmente a los términos constantes de la ecuación completa para
matrices hidrófilicas, ecuación de Lapidus y Lordi (Ec. 8). Esto permitió calcular
el cuociente D entre el coeficiente de difusión de cada fármaco en la matriz y
la tortuosidad de ésta. Además, mediante valores de cuocientes de difusión
obtenidos en la literatura, fue posible calcular la tortuosidad teórica de cada
matriz (30). Estos resultados se presentan en la Tabla 12.
Formulación Fármaco D/
P1 Prilocaína 11,6 1,5
Lidocaína 15,2 2,0
P2 Prilocaína 31,7 4,1
Lidocaína 30,3 4,0
Tabla 12: Valores del cuociente entre el coeficiente de difusión de cada fármaco
en la matriz y la tortuosidad de esta y valores de tortuosidad teóricos.
A pesar que los coeficientes de difusión encontrados en la literatura
provienen de otro polímero (agarosa), los valores representan una buena
aproximación al esperado para ambos compuestos en la preparación P2. Esto
se atribuye a que tanto el poloxámero 407 como la agarosa, no oponen una
gran resistencia al paso de los activos al no poseer grupos ionizables en su
estructura, a diferencia del carbomer. Sin embargo, los valores de tortuosidad
obtenidos no pueden ser considerados en rigor por lo disímiles que son ambas
estructuras poliméricas (Figura 15).
53
A
B
Figura 15: Estructuras químicas del poloxámero 407 (A) y de la agarosa (B)
Resulta interesante notar que las tortuosidades obtenidas para ambos
fármacos fueron casi idénticas en la formulación P2. Esto es de esperarse, si se
tiene en consideración la extremada semejanza en el tamaño de ambos
compuestos. Distinto es lo que ocurre con la formulación P1 donde los valores
de ambos parámetros son marcadamente diferentes entre cada activo. Si se
considera que la tortuosidad es semejante para ambos activos, se podría
deducir que los coeficientes de difusión de la lidocaína y la prilocaína se
encuentran en una relación de 4:3. Así nuevamente queda de manifiesto, que
las pequeñas diferencias en la solubilidad de ambos compuestos en un
ambiente con elevada competencia por el disolvente (grupos carboxílicos
ionizados del carbomer) provocan cambios en los coeficientes de difusión,
diferenciándose uno de otro, en relación a los obtenidos experimentalmente en
otro medio más neutro eléctricamente.
Mediante el empleo de métodos matemáticos modelo independientes se
calcularon los valores del factor de diferencia f1 y de similitud f2 para los
productos P1 y P2 los que se presentan en la Tabla 13.
54
FÁRMACO FACTOR RESULTADO CRITERIO DE ACEPTACIÓN
PRILOCAÍNA f1 40,00 0-15%
f2 126,21 50-100%
LIDOCAÍNA f1 32,00 0-15%
f2 119,93 50-100%
Tabla 13: Factores de diferencia (f1) y de similitud (f2) calculados para cada
fármaco entre los preparados P1 y P2
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede concluir que los
productos comparados (P1 y P2) no pueden ser considerados similares.
El análisis de varianza de ANOVA mostró diferencias significativas para
ambos principios activos en P2. En busca de un análisis más exhaustivo, se
evalúo entre pares de ensayos en forma independiente y se observaron
diferencias significativas entre las parejas [1,2] y [2,3] para la prilocaína y la
pareja [2,3] para la lidocaína.
55
La lenta liberación de los fármacos no permitió liberar el porcentaje
requerido (85%). Se observó que el hinchamiento de la matriz produjo un
incremento en el volumen total del recipiente contenedor por un estiramiento de
la membrana semipermeable, sin embargo, esto sería insuficiente para lograr
un hinchamiento de la gran cantidad de muestra (10 g) depositada en el
dispositivo, como se muestra en la Figura 16.
Figura 16: Ejemplo de una celda de cesión dentro del vaso de disolución
terminado el ensayo.
Lo anteriormente expuesto, quedó en evidencia en un ensayo realizado
con un producto comercial en el cual se obtuvieron tiempos de cesión similares
a la formulación P2 destacando que el producto comercial presentaba una
menor viscosidad que los productos utilizados en este estudio.
56
CONCLUSIONES
Se desarrollo una metodología analítica para cuantificar lidocaína y
prilocaína la que fue validada en lo que respecta a su linealidad, rango,
precisión, exactitud y especificidad.
El método de liberación de lidocaína y prilocaína utilizando el Aparato 5
modificado de la USP 30 fue estandarizado a partir de su precisión.
Los resultados obtenidos mediante la ecuación de Peppas y Sahlin
indicarían que la cinética de liberación de lidocaína y prilocaína de los dos
productos se aproxima a un modelo de transporte donde predomina el
proceso de difusión de los compuestos a través de la matriz.
La diferente naturaleza química de los polímeros fue el factor que explico las
diferencias en los tiempos de cesión de ambos preparados.
En este estudio se comparó la liberación in vitro de lidocaína y prilocaína
desde dos preparados magistrales en forma de gel, obteniéndose
diferencias significativas entre ambos productos.
57
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62
ANEXOS
63
TABLAS
Prilocaína Lidocaína
Tiempo (h) % Liberado DE CV (%) % Liberado DE CV (%)
1 0,70 0,05 5,43 1,53 0,23 5,94
2 1,79 0,08 4,29 2,75 0,20 5,42
3 2,63 0,08 2,94 3,66 0,26 5,14
4 3,65 0,12 3,32 4,86 0,10 2,02
6 5,31 0,11 2,07 6,74 0,15 2,29
8 6,57 0,17 2,53 8,23 0,07 0,87
10 7,93 0,29 3,61 9,80 0,13 1,30
Tabla I: Porcentaje promedio de Prilocaína y lidocaína liberado desde el
producto P1.
Prilocaína Lidocaína
Tiempo (h) % Liberado DE CV (%) % Liberado DE CV (%)
1 1,65 0,11 5,57 2,37 0,11 4,49
2 3,21 0,14 4,41 3,72 0,08 2,20
3 4,66 0,25 5,39 5,21 0,17 3,32
4 6,17 0,28 4,49 6,51 0,23 3,50
6 8,74 0,47 5,42 9,40 0,45 4,77
8 11,29 0,62 5,47 11,64 0,51 4,35
10 13,54 0,87 5,45 13,91 0,76 5,46
Tabla II: Porcentaje promedio de Prilocaína y lidocaína liberado desde el
producto P2.
64
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
U.A
.
tiempo / minutos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
U.A
.
tiempo / minutos
CROMATOGRAMAS
a.- HPLC cromatograma de soluciones estándares de prilocaína y lidocaína 5
mg L-1monitoreado a 210 nm.
b.- HPLC cromatograma de soluciones estándares de prilocaína y lidocaína 31
mg L-1monitoreado a 210 nm.
65
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
U.A
.
tiempo/ minutos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
U.A
.
timpo/ minutos
c.- HPLC cromatograma de soluciones estándares de prilocaína y lidocaína 31
mg L-1monitoreado a 210 nm.
d.- HPLC cromatogramas de soluciones estándares de prilocaína y lidocaína.
Comparación por superposición de cromatogramas de soluciones de 5, 31 y 72
mgL-1 de cada compuesto monitoreado a 210 nm.
66
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
U.A
.
tiempo/ minutos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
U.A
.
tiempo/ minutos
e.- HPLC cromatograma típico de una solución estándar de lidocaína
monitoreado a 210 nm.
f.- HPLC cromatograma típico de una solución estándar de prilocaína
monitoreado a 210 nm.
67
Propuestas para el mejoramiento de la celda de cesión y la aplicación de
las muestras
Del diseño:
A continuación se plantean algunas mejoras al diseño que podrían
aplicarse en versiones posteriores:
1. El uso de tornillos y tuercas dificultaba y retrasaba en gran medida la
aplicación de la muestra, por lo que se propone remplazarlo por un sellado
mediante imanes que, como beneficio extra, podría hacer innecesario el
uso de una junta de goma al proporcionar un sellado más estrecho.
2. El elevado volumen de muestra hizo que los tiempos de liberación fuesen
exageradamente largos por lo que se propone reducir el volumen de la
muestra.
3. Asignar y marcar un número en cada anillo y su correspondiente celda,
que indique el conjunto de 6 al que pertenece y conjunto especifico de
anillo y celda. Con el propósito de que cada componente encaje perfecta y
estrechamente con su contraparte.
En base a estas correcciones el nuevo diseño se muestra en la figura 16.
68
Figura 17: Muestra un diseño mejorado tomando en cuenta las complicaciones
experimentales.
De la aplicación de la muestra:
1. Se propone pesar sobre el centro de la placa un peso de preparado
dermatológico semejante al volumen disponible para el en la celda,
teniendo en cuenta que su densidad sea semejante a 1 (aproximadamente
0,2 cm x 15,9 cm2).
2. Posteriormente se propone someter las placas a vacío para eliminar las
burbujas que pudiesen encontrarse dentro de la matriz del preparado.
Realizar nuevamente el procedimiento después de colocar la membrana y
el anillo para eliminar las burbujas que pudiesen haberse formado entre la
membrana y el preparado.
