ESTUDIO ECONÓMICO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE …
46
TRABAJO FIN DE MÁSTER Máster en Ingeniería Química ESTUDIO ECONÓMICO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ANTITROMBINA EN PLANTA VS ANIMALES Memoria y Anexos Autor: Alejandro Rodríguez Armesto Director: Juan Jesús Pérez González Convocatoria: Octubre 2019
Transcript of ESTUDIO ECONÓMICO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE …
TRABAJO FIN DE MÁSTER
Máster en Ingeniería Química
ESTUDIO ECONÓMICO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE
ANTITROMBINA EN PLANTA VS ANIMALES
Memoria y Anexos
Autor: Alejandro Rodríguez Armesto Director: Juan Jesús Pérez González Convocatoria: Octubre 2019
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
i
Resum
El present treball pretén demostrar que els avenços biotecnològics assolits en els darrers anys
constitueixen una millora a nivell tecnològic i industrial. Per això es realitza una comparativa dels costos
d'equipament i materials principals que suposen l'obtenció d'1 quilogram d'antitrombina mitjançant la
metodologia tradicional, enfront de l'obtenció de la proteïna via animals transgènics.
Per poder realitzar la comparativa d'ambdós mètodes és necessari conèixer ambdós processos, i definir
les dimensions de les operacions unitàries principals. Un cop definides les dimensions s'obté un cost
estimat actualitzat el que proporciona una valoració objectiva sobre la millora en el procés.
En concloure que els costos de la metodologia d'animals transgènics són inferiors es pressuposa un
abaratiment també del producte final que arriba al consumidor, en aquest cas un medicament, en
aquest cas el cas això afavoreix que una major quantitat de població tingui accés a tractaments
farmacèutics .
Memoria
ii
Resumen
El presente trabajo pretende demostrar que los avances biotecnológicos alcanzados en los últimos
años constituyen una mejora a nivel tecnológico e industrial. Para esto se realiza una comparativa de
los costes de equipamiento y materiales principales que suponen la obtención de 1 kilogramo de
antitrombina mediante la metodología tradicional, frente a la obtención de la proteína vía animales
transgénicos.
Para poder realizar la comparativa de ambos métodos es necesario conocer ambos procesos, y definir
las dimensiones de las operaciones unitarias principales. Una vez definidas las dimensiones se obtiene
un coste estimado actualizado lo que proporciona una valoración objetiva sobre la mejora en el
proceso.
Al concluir que los costes de la metodología de animales transgénicos son inferiores se presupone un
abaratamiento también del producto final que llega al consumidor, en este caso un medicamento, de
ser así el caso esto favorece que una mayor cantidad de población tenga acceso a tratamientos
farmacéuticos.
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
iii
Abstract
The present work tries to demonstrate that the biotechnological advances reached in the last years
constitute an improvement at technological and industrial level.
For this, a comparison of the main equipment and materials costs involved in obtaining 1 kilogram of
antithrombin is carried out using the traditional methodology, compared to obtaining the protein via
transgenic animals.
In order to make the comparison of both methods it is necessary to know both processes, and define
the dimensions of the main unit operations. Once the dimensions are defined, an updated estimated
cost is obtained, which provides an objective assessment of the improvement in the process.
When concluding that the costs of the methodology of transgenic animals are lower, a reduction in the
final product that reaches the consumer is also assumed, in this case a medicine, if this is the case, this
favors that a greater amount of population has access to pharmaceutical treatments.
Memoria
iv
Glosario
AT: Antitrombina.
AT III: Antitrombina III.
rhAT: Antitrombina recombinante humana.
EMBL3: Un vector de ADN lambda que lleva polienlazadores a ambos lados de los sitios rojo y gam y,
si está equipado con promotores adyacentes, la ARN polimerasa puede transcribir directamente genes
clonados en la región "rellenadora" sin subclonar. [5]
ADNc: ADN complementario, generado a partir del molde de ARN, mediante la retrotranscripción del
ARNm maduro. [6]
hpAT: Antitrombina humana purificada.
NF: Nanofiltración
UF: Ultrafiltración
MF: Microfiltración
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
v
Índice
RESUM ______________________________________________________________ I
RESUMEN __________________________________________________________ II
ABSTRACT __________________________________________________________ III
GLOSARIO __________________________________________________________ IV
1. PREFACIO ______________________________________________________ 1
1.1. Origen del Trabajo.................................................................................................... 2
1.2. Motivación ............................................................................................................... 4
2. INTRODUCCIÓN _________________________________________________ 9
2.1. Objetivos del trabajo ................................................................................................ 9
2.2. Alcance del trabajo .................................................................................................. 9
3. METODOLOGÍA EN ANIMALES TRANSGÉNICOS _______________________ 11
3.1. Especificaciones Método Leche de cabra .............................................................. 12
3.1.1. Dilución en tampón EDTA, Filtración y cromatografía de afinidad. .................... 12
3.1.2. Filtración eliminación vírica .................................................................................. 17
3.1.3. Columna interacción hidrofóbica ......................................................................... 18
4. METODOLOGÍA TRADICIONAL _____________________________________ 19
4.1. Especificaciones Método plasma sanguíneo ......................................................... 20
4.1.1. Centrifugación ...................................................................................................... 20
4.1.2. Precipitación ......................................................................................................... 21
4.1.3. Cromatografía de afinidad ................................................................................... 23
4.1.4. Pasteurización....................................................................................................... 25
4.1.5. Nanofiltración ....................................................................................................... 25
4.1.6. Ultrafiltración/diafiltración .................................................................................. 26
CONCLUSIONES _____________________________________________________ 28
ANÁLISIS ECONÓMICO _______________________________________________ 29
Índice de costes Marshall & Swift.................................................................................... 29
Obtención vía leche de cabra .......................................................................................... 31
Obtención vía plasma sanguíneo .................................................................................... 33
BIBLIOGRAFIA ______________________________________________________ 37
Memoria
vi
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
1
1. Prefacio
La antitrombina III (AT III) es una glicoproteína, presente en forma natural en la circulación sanguínea
con actividad anticoagulante. Se sintetiza en el hígado y en el endotelio vascular, su concentración
plasmática es de 100-150 microgramos por mI, y tiene una vida media de 2.71 ± 0.26 días. Su actividad
anticoagulante se realiza por medio de la inhibición de los factores IIa y Xa de coagulación, y con menos
afinidad, de las formas activadas de los factores IX, XI y XII. Desde el punto de vista químico, AT III es
un inhibidor de una serina proteasa y por lo tanto, pertenece al grupo de las serpinas. Presenta cuatro
puntos posibles de glicosilacion y presenta un peso molecular aproximado de 65.000 Da. Su estructura
tridimensional como se muestra en la Figura 1.1 es similar a la de otros inhibidores de la proteasa
plasmática, como la α1-anticimotripsina, la α 2-antiplasmina y el cofactor de heparina II. La α-
antitrombina es la forma dominante de antitrombina que se encuentra en el plasma sanguíneo y tiene
un oligosacárido que ocupa cada uno de sus cuatro sitios de glicosilación. [1].
Figura 1.1. Antitrombina III
Pág. 2 Memoria
2
El hígado es la mayor fuente de síntesis de la At III, su estudio es de gran utilidad en la evaluación de
diferentes trastornos hepáticos, incluyendo cirrosis, hepatitis y coagulación intravascular diseminada.
[1]
La antitrombina III funciona como el principal inhibidor fisiológico de la trombina, con un papel muy
importante en la modulación de la homeostasis. Además, inhibe otras proteasas, al formar complejos
irreversibles y estables con otros factores de la coagulación activados (Xlla, Xla, Xa, IXa, calicreína y
plasmina), excepto el factor VIla [1].
La heparina aumenta la tasa de actividad neutralizante de la ATIII, uniéndose a ésta y acelerando la
velocidad con la cual este inhibidor actúa sobre las proteasas, de modo que la función anticoagulante
de la heparina se fundamenta en esa unión con la ATlll [1].
La importancia fisiológica de su control, se atribuye a la asociación entre los estados de deficiencia de
AT III y el aumento frecuente de eventos tromboembólicos , aun cuando la ATIII representa solamente
una pequeña fracción de la capacidad total de neutralización de proteasas de la sangre. Estas
deficiencias pueden ser adquiridas o hereditarias y difieren de otros trastornos comunes de la
coagulación, en que el heterocigoto con actividad de ATIII del 40 por ciento al 60 por ciento,
manifiestan un síndrome de tromboembolismo recurrente. La deficiencia familiar es un trastorno
autosómico dominante, que lleva a episodios recurrentes de tromboembolismo, siendo su incidencia
tan alta como 1:2000 en la población general [1].
La deficiencia adquirida ha sido reportada en un gran número de trastornos, que incluyen el cáncer,
enfermedad cardiaca, enfermedad renal, enfermedad hepática, sepsis, complicaciones obstétricas,
post-cirugía, durante estados trombóticos activos, coagulación intravascular diseminada y otras [5, 10],
sugiriéndose que, en algunos casos extremos, esta disminución puede perpetuar la tendencia
hemorrágica, así como llevar estados de resistencia a la heparina [1].
Las enfermedades hepáticas están asociadas con defectos hemostásicos complejos en el cual las
plaquetas, la coagulación y la fibrinolisis pueden estar afectadas. Se ha reportado que las
concentraciones plasmáticas de este inhibidor fisiológico, son bajas en las enfermedades hepáticas
crónicas severas [1].
1.1. Origen del Trabajo
En enero de 2009 la FDA aprueba el medicamento ATryn, cuyo principio activo es una antitrombina
humana recombinante. La antitrombina (recombinante) es una glicoproteína de 432 aminoácidos con
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
3
un peso molecular de aproximadamente 57,215 Daltons y su fórmula molecular es
𝐶2191𝐻3457𝑁583𝑂656𝑆18 [2].
Figura 1.2. ATRyn (antitrombina recombinante). Imagen tomada de: http://www.atryn.com/order-atryn.php
La antitrombina (recombinante) se produce mediante tecnología de ADN recombinante utilizando
cabras modificadas por ingeniería genética en las que se ha introducido la secuencia codificante de
ADN para la antitrombina humana junto con una secuencia de ADN específica de la glándula mamaria,
que dirige la expresión de la antitrombina hacia la leche [2].
Esta forma farmacéutica se trata de un inyectable nanofiltrado, estétril, tratado con calor y liofilitzado
[2].
La secuencia de aminoácidos de la antitrombina (recombinante) es idéntica a la de la antitrombina
derivada del plasma humano. Tanto la antitrombina (Recombinante) como la antitrombina derivada
del plasma contienen seis residuos de cisteína que forman tres puentes disulfuro y 3-4 restos de
carbohidratos unidos a N. El perfil de glicosilación de la antitrombina (recombinante) es diferente de
la antitrombina derivada del plasma, lo que resulta en un aumento de la afinidad por la heparina.
Cuando se ensaya en presencia de un exceso de heparina, la potencia del producto recombinante no
es diferente de la del producto derivado de plasma [2].
En el organismo, la antitrombina bloquea la trombina, una sustancia que desempeña una función
esencial en el proceso de coagulación de la sangre. Los pacientes con deficiencia congénita de
Pág. 4 Memoria
4
antitrombina presentan bajos niveles de antitrombina en la sangre y, por lo tanto, están expuestos a
un mayor riesgo de sufrir coágulos sanguíneos. ATryn corrige la deficiencia de antitrombina y permite
controlar temporalmente la formación de coágulos [3].
ATryn está indicado en adultos que padecen una «deficiencia congénita de antitrombina» (bajos
niveles hereditarios de la proteína antitrombina). Se usa durante las intervenciones quirúrgicas, para
evitar los problemas que ocasiona la formación de coágulos sanguíneos. ATryn se administra
normalmente con heparina (otro medicamento anticoagulante) [3].
1.2. Motivación
En el otoño de 1992, nace una cabra en la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad de Tufts:
esta es una cabra macho normal y sana (Fig. 1.3) que cuenta con material genético agregado en sus
cromosomas. Este material era un vector de ADN que imbuiría a su progenie con una capacidad única
para producir una proteína humana recombinante, la antitrombina, en su leche. Los descendientes de
esta cabra genéticamente modificada son biorreactores vivos que producen una proteína
recombinante de manera mucho más eficiente que los biorreactores de cultivos celulares tradicionales
[4].
Figura 1.3. Cabra original modificada genéticamente [4]
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
5
Tecnología de expresión de proteínas en leche
Esta tecnología de expresión de proteínas se basa en la producción de proteínas recombinantes en la
leche de animales transgénicos. Comienza con el enlace de la región promotora de un gen específico
de la leche a un gen de interés. Este vector de ADN se introduce posteriormente en los cromosomas
de un embrión de mamífero para ser transferido a madres sustitutas. Los animales que llevan este
vector son capaces de producir el producto genético en su leche (Fig. 1.4). Durante la lactancia, la
proteína recombinante se sintetiza en la glándula mamaria y se secreta en la leche. El producto se
puede purificar de la leche a una pureza de grado farmacéutico [4]
Figura 1. 4. Representación del proceso de producción de rhAT. El ADNc de hAT se vinculó a elementos
reguladores específicos de la glándula mamaria caprina. Este transgén se microinyectó en embriones de cabra que luego se transfirieron a los oviductos de los receptores y se llevaron a término [4].
Una ventaja del sistema de expresión en la leche es que los vectores generados se pueden expresar
tanto en el sistema del modelo de ratón como en el sistema de producción de animales lecheros de
gran tamaño a niveles similares. Esto permite la optimización de la expresión transgénica en el sistema
del ratón, antes de iniciar el proceso en los animales grandes [4].
Pág. 6 Memoria
6
La proteína predominante en la leche de cabra es la beta caseína (10-20 mg/mL), se cree que esta
comprende el 25-50% de la proteína total (aprox. 30 mg/mL). El gen de la beta caseína está regulado
tanto en un tejido específico como temporal, con una expresión máxima de la glándula mamaria que
se produce después del parto. El gen de la caseína beta de cabra se clonó como un fragmento de 18.5
kilobases pares (kb) en un vector lambda EMBL3 de una biblioteca genómica de cabra Saanen y se
caracterizó en ratones transgénicos. La secuencia de codificación de la beta caseína de cabra se
reemplazó con un sitio de clonación XhoI inmediatamente corriente arriba del codón ATG iniciador. La
región descendente 3’ comienza al final del exón 7’ y continúa a través de la región no traducida 3’
hasta 6.2 kb de secuencia genómica descendente. Este tipo de vector se utiliza actualmente para
expresar casi 100 proteínas diferentes en la leche de ratones. También se utiliza con éxito para secretar
altos niveles (g/L) de 14 de estas proteínas en la leche de cabras transgénicas. Tiene una capacidad
única para expresar vectores de ADNc a niveles de gramo, lo que ha sido un desafío para otros
promotores de leche [4].
La Antitrombina Transgénica
El ADNc de AT humano se obtuvo del Dr. G. Zettlemeissl (Behringwerke A.G., Marburg, Alemania) en
el plásmido p AT6. La secuencia del ADnc es la misma que la publicada por Bock et al., 1982, con la
excepción de los cambios de nucleótidos silenciosos en bp 1050 (T⇾C), 1317 (C⇾T) y bp 1371 (A⇾G).
El ADNc se diseñó con un sitio XhoI en el extremo 5' por mutagénesis dirigida al sitio para permitir la
escisión del ADNc como un fragmento XhoI a Sa1I de 1,45 kb. El transgén (pBC6; Fig. 1.5) se ensambla
luego uniendo el ADNc AT al sitio XhoI del vector de la beta caseína de cabra. El transgén resultante de
14.8 kb se escindió de las secuencias bacterianas al digerir pBC6 con NotI y SalI, los sitios de restricción
que flanquean las secuencias eucarióticas. El fragmento de ADN se purificó mediante electroforesis en
gel de agarosa. El fragmento resultante es el utilizado posteriormente para generar animales
transgénicos [4].
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
7
Figura 1.5. Representación esquemática del transgén BC6 para la expresión recombinante de rhAT en la leche
de animales transgénicos. El cDNA que codifica hAT (caja de rayas) reemplaza a la región de codificación del gen de la beta-caseína caprina. Este cDNA está flanqueado por el promotor y por las secuencias de beta-caseína
caprina no traducidas en 3 '. Las cajas negras indican los exones no codificantes del gen de la caseína. R, enzima de restricción EcoRI; N, enzima de restricción NotI; S, enzima de restricción SalI.
Se usaron ratones transgénicos para probar la expresión del gen transgénico de AT. La generación de
ratones transgénicos es una práctica rutinaria en los laboratorios académicos y comerciales. Sin
embargo, a principios de la década de 1990, todavía podría ser un desafío generar ratones
transgénicos. Se usó la microinyección de embriones pronucleares de preimplantación para introducir
el ADN heterólogo (transgén BC6) en el genoma. De los más de 200 animales fundadores nacidos de
embriones microinyectados, solo se identificó un ratón transgénico. Las hembras que pertenecen a la
línea derivada de este fundador produjeron de manera consistente casi 1 mg/mL de AT humana
recombinante (rhAT) en su leche, según lo medido por análisis Western. Con este éxito, se decidió
generar cabras transgénicas del mismo modo [4].
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
9
2. Introducción
Una vez determinado que es la antitrombina, el avance que supuso la aprobación de un medicamento
obtenido a partir de animales transgénicos y como se consiguió la obtención de dichos animales. En el
siguiente trabajo se procede a realizar un estudio económico sobre la producción de antitrombina
mediante la producción en planta frente al uso de animales transgénicos.
2.1. Objetivos del trabajo
Para realizar el estudio económico se han de fijar unos objetivos de producción comunes en ambos
métodos, por ello se procederá al cálculo del coste de producción de 1 Kg de antitrombina en planta y
1 Kg de antitrombina en animales transgénicos y así determinar la ventaja económica de un método u
otro.
2.2. Alcance del trabajo
El alcance del presente trabajo no es otro que, el de tratar de evaluar mediante un método objetivo,
como puede ser una evaluación/comparación económica, si el avance en el campo de la biotecnología
lo es también para la producción industrial de fármacos, mediante el uso de las nuevas técnicas
descubiertas (animales transgénicos).
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
11
3. Metodología en animales transgénicos
Se diseñó un proceso (resumido en la figura 2.1) para la purificación de rhAT a partir de leche de cabra
con un rendimiento acumulado superior al 50%. La materia prima para la purificación es la leche
producida por cabras transgénicas que expresan la proteína rhAT en una cantidad aproximada de 2g/L.
Las cabras suelen lactar durante 300 días al año, produciendo 2 – 4 L de leche diariamente. Este proceso
normalmente produce 300 g de rhAT purificado por lote de aproximadamente de 375 L de leche que
contiene aproximadamente 600 g de rhAT [4].
La leche que contiene rhAT se diluye con tampón de EDTA y luego se clarifica por filtración de flujo
tangencial con un filtro de membrana de fibra hueca nominal de poro de 500 kDa. El permeado del
filtro se realiza un ciclo a través de un circuito cerrado que une el sistema de filtración a una columna
de afinidad Heparin-Hyper D hasta que se captura más del 90% de la rhAT. La cromatografía de afinidad
con heparina también se utiliza de forma rutinaria en la producción de todos los hpAT disponibles
comercialmente en la Unión Europea. Una vez que se obtiene el eluato de Heparin Hyper D, se
transfiere a un área de procesamiento posterior [4].
Figura 3.1. Representación esquemática de la purificación de rhAT a partir de la leche de cabras transgénicas.
Memoria
12
Posteriormente, el eluato se filtra a través de un filtro de eliminación viral Pall DV-20 [4]
La formulación final se logra por concentración y diafiltración en un tampón de citrato, glicina, cloruro
de sodio con la fuerza iónica adecuada y la dilución hasta la concentración de proteína final de
aproximadamente 25 mg/mL. El producto se carga en viales (10 ml, que contienen aproximadamente
250 mg de proteína), se liofiliza y, a continuación, se trata en una etapa de inactivación viral terminal
validada [4].
3.1. Especificaciones Método Leche de cabra
Teniendo en cuenta que el proceso normalmente produce 300 g de antitrombina purificada por lote
de no más de 375 l de leche que contiene aproximadamente 600 g de antitrombina, con un
rendimiento del 50% se obtendrán los 1000 g que se buscan:
1000 𝑔 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑡𝑟𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎 ·375 𝐿 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒
600 𝑔 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑡𝑟𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎·
1
0,5= 1250 𝐿 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑏𝑟𝑎 (3.1)
Se necesitan 1250 L de leche de cabra para obtener un kilogramo de antitrombina.
3.1.1. Dilución en tampón EDTA, Filtración y cromatografía de afinidad.
Figura 3.2. Esquema de la dilución, filtración y cromatografía de afinidad [7]
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
13
3.1.1.1. Dilución
Para comenzar con el proceso de purificación, la corriente de alimentación de leche de cabra se diluye
con un volumen igual de tampón EDTA [7]. Por lo tanto, se necesitan 1250 L de tampón EDTA.
3.1.1.2. Filtración de flujo tangencial
El proceso TFF emplea tres operaciones de filtración en las que se clarifica, concentra y fracciona el
producto. El sistema está diseñado de modo que sea altamente selectivo para la molécula de interés.
El paso de clarificación elimina las partículas más grandes, como los glóbulos de grasa y las micelas de
caseína de la leche. Los pasos de concentración / fraccionamiento eliminan la mayoría de las moléculas
pequeñas, incluyendo lactosa, minerales y agua, para aumentar la pureza y reducir el volumen del
producto [7].
Figura 3.3. Detalle sobre la etapa de filtración por flujo tangencial [7]
Memoria
14
La leche se coloca en un tanque de alimentación y se bombea en un circuito para concentrar el retenido
de leche dos veces (ver diagrama de flujo en la figura 3.3). Una vez concentrado, el producto retenido
de la leche se diafiltra, permitiendo que el producto y las proteínas, azúcares y minerales de pequeño
peso molecular pasen a través de una membrana de tamaño apropiado. Esta operación está diseñada
actualmente para procesar sobre 1000 L de leche al día en un periodo de 2-3h [7].
Para el cálculo del área necesaria del filtro con los parámetros anteriormente descritos se utiliza la
siguiente ecuación [12]:
𝐴 =𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜
𝐹𝑙𝑢𝑗𝑜 · 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑐𝑒𝑠𝑜 (3.2)
De tal manera que:
𝐴 =2500 𝐿
100 𝐿 · 𝑚−2 · ℎ−1 · 3 ℎ= 8,33 𝑚2 (3.3)
Considerando una separación del 60% el volumen a tratar en el siguiente paso es de 1500 L.
El filtrado clarificado del primer paso se concentra y fracciona usando ultrafiltración. El permeado
clarificado fluye hacia el tanque de alimentación de UF y se bombea en un circuito para concentrar el
producto dos veces. Una vez que se inicia el paso de concentración, el permeado del UF se coloca en
el retenido de leche en el tanque de alimentación de clarificación en el primer paso. El permeado del
UF contiene proteínas, azúcares y minerales de pequeño peso molecular que pasan a través de la
membrana. Una vez que el 95% del producto se acumula en el material retenido del UF, se detiene la
clarificación y se inicia una concentración / diafiltración del material de UF. El producto se concentra
de 5 a 10 veces el volumen inicial de leche y se agrega tampón al tanque de alimentación de UF. Esto
elimina la mayoría de las proteínas, azúcares y minerales de pequeño peso molecular. Actualmente,
esta operación está diseñada para procesar hasta 500 litros de permeado clarificado por día con una
duración de 2,5 a 3,5 horas [7].
En este caso, siguiendo la ecuación 3.2, el área de filtro necesaria es igual a:
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
15
𝐴 =1500 𝐿
145 𝐿 · 𝑚−2 · ℎ−1 · 3,5 ℎ= 2,96 𝑚2 (3.3)
Teniendo en cuenta de que la concentración es de unas 7,5 veces el volumen inicial de leche [7] la
cantidad a tratar en la cromatografía de afinidad es de:
7,5 ·600 𝑔
375 𝐿= 12 𝑔/𝐿 (3.4)
Por lo que teniendo en cuenta que tras esta primera etapa del proceso se obtiene un rendimiento del
81%:
2000 𝑔 ·1 𝐿
12 𝑔· 0,81 = 135 𝐿 (3.5)
3.1.1.3. Cromatografía de afinidad
El sorbente de cromatografía Pall Heparin HyperD ™ M es un sorbente de afinidad diseñado para la
purificación de moléculas biológicas que se unen a la heparina, como factores de coagulación, factores
de crecimiento, lipoproteínas, ... El sorbente proporciona una alta capacidad de unión a altos caudales
[8].
El sorbente de heparina HyperD "gel-in-a-shell" está compuesto por una perla mineral rígida porosa
que contiene poros rellenos de hidrogel unidos a heparina. La heparina HyperD M tiene un tamaño de
partícula promedio de 80 µm y se usa para la purificación a escala preparativa de Antitrombina. El
sorbente se puede envasar en tamaños de columna desde ml hasta más de cien litros y funcionar a
altos caudales con baja contrapresión. La fuga de heparina se minimiza debido al enlace químico
estable de la molécula de heparina al sorbente [8].
Memoria
16
La columna Heparin-Hyper D se lava y luego se eluye con un tampón de cloruro de sodio 2,5 M. Una
vez que se obtiene el eluato de heparina-Hyper D, se transfiere a un área de procesamiento aguas
abajo [7].
Figura 3.4. Cromatografía de la elución de la columna [9]
Con una capacidad de retención mayor a 25 g/L [8] el volumen necesario de columna es:
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝐶𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎 = 135 𝐿 ·12 𝑔
𝐿·
𝐿
30 𝑔= 54 𝐿 𝐶𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎 (3.6)
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
17
Para la elución de la antitrombina:
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝐵𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟 𝑒𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑡𝑟 · 𝐹 (3.7)
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝐵𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟 𝑒𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 30 𝑚𝑖𝑛 ·1 ℎ
60 𝑚𝑖𝑛·
54 𝐿
ℎ= 27 𝐿 (3.8)
De manera que la concentración obtenida es de:
2000 𝑔 · 0,81
27 𝐿= 60 𝑔/𝐿 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑡𝑟𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎 (3.9)
3.1.2. Filtración eliminación vírica
Los cartuchos de filtro de eliminación de virus Ultipor® VF Grade DV20 son adecuados para la
eliminación de virus por exclusión de tamaño de tan solo 20 nm de soluciones biológicas. La innovadora
membrana microporosa PVDF hidrofílica DV20 también permite> 95% de transmisión de proteínas
hasta 160 kiloDaltons. Utilizando un diseño de cartucho de estilo sanitario AB de extremo abierto (SOE)
estándar, los filtros de eliminación de virus Ultipor VF Grado DV20 logran flujos prácticos y caídas de
presión en la purificación a escala de proceso de productos biofarmacéuticos, derivados de tejidos y
plasma y aditivos proteicos [10].
Con un rendimiento de un 97% en esta etapa:
1620 𝑔 · 0,97
27 𝐿= 58,2 𝑔/𝐿 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑡𝑟𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎
(3.10)
Memoria
18
3.1.3. Columna interacción hidrofóbica
La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) separa las moléculas en función de su hidrofobicidad.
HIC es una técnica de separación útil para purificar proteínas mientras se mantiene la actividad
biológica debido al uso de condiciones y matrices que operan en condiciones menos desnaturalizantes
[11].
1571,4 𝑔 · 0,8
27 𝐿= 46,56 𝑔/𝐿 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑡𝑟𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎
(3.11)
La columna en este caso tendrá un volumen igual a la cantidad a tratar de 27 L.
Posteriormente se envasa en viales de 25 mg/mL y se liofilizan para una última eliminación de posibles
cargas víricas.
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
19
4. Metodología tradicional
Los pasos principales del proceso de obtención se describen a continuación. Plasma humano congelado
combinado se descongela a baja temperatura y se centrifuga para eliminar el crioprecipitado. Se añade
etanol al plasma pobre en crioprecipitado hasta aproximadamente el 8%, y la solución se mezcla a baja
temperatura para precipitar la Fracción I y generar el efluente I. Posteriormente, se añade más etanol
al Efluente I a aproximadamente el 20% para precipitar la Fracción II+III y generar efluente II+III. El
efluente II+III se procesa adicionalmente agregando más etanol para precipitar la Fracción IV-1, la cual
contiene antitrombina [13].
Figura 4.1. Diagrama de flujo de los procesos de fabricación originales y modernizados de antitrombina [13]
Memoria
20
La pasta de Fracción IV-1 rica en antitrombina se suspende en una solución ligeramente básica. La
antitrombina se purifica de la suspensión por adsorción de afinidad a una matriz de heparina. La
antitrombina capturada se lava para eliminar las impurezas y luego se eluye en alto contenido de sal.
El intermedio de antitrombina se trata luego con calor (se pasteuriza) en presencia de citrato, seguido
de una segunda etapa de purificación por afinidad con heparina para eliminar más las impurezas y la
antitrombina desnaturalizada durante la pasteurización. En un nuevo paso en el proceso modernizado,
la solución de antitrombina altamente purificada se filtra utilizando un nanofiltro de poro pequeño
diseñado para eliminar virus potencialmente contaminantes de hasta 20 nm. Posteriormente, el
material se concentra mediante ultrafiltración y diafiltración, se formula, se adsorbe con resina DEAE,
se filtra y se liofiliza para generar el producto final [13].
4.1. Especificaciones Método plasma sanguíneo
Para saber la cantidad de plasma sanguíneo necesario, teniendo en cuenta de que la sangre, tal y como
es captada, en bolsas cuádruples regularmente, sin fraccionar, con un volumen total de 500 𝑐𝑚3aprox.
(430cc de sangre + 70cc de anticoagulante) en las que la cantidad de antitrombina que se encuentra
en plasma es de 17-30 mg/dL [15], por lo que se toma la media como base de cálculo: 23,5 mg/dL
plasma sanguíneo.
Para obtener un kilogramo de antitrombina se necesita:
1𝐾𝑔 𝐴𝑛𝑡𝑖𝑡𝑟𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎 ·1 𝑑𝐿 𝑃𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎
23,5 𝑚𝑔 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑡𝑟𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎·
1000000 𝑚𝑔
1 𝐾𝑔·
0,1 𝐿
1 𝑑𝐿= 4255,32 L (4.1)
4.1.1. Centrifugación
El primer paso para la obtención del plasma es la centrifugación, con el objetivo de eliminar el
crioprecipitado del plasma [13].
El crioprecipitado usualmente tiene un volumen de 15 a 20 𝑐𝑚3[13].De manera que la cantidad a
eliminar será de media 17,5 𝑐𝑚3 por cada 500 𝑐𝑚3 de plasma, es decir el 3,5 % del plasma
De tal manera que después de la centrifugación suponiendo una eficacia del 98%, centrifugando
durante 20 min a 2000 rpm [14]:
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
21
4255,32 𝐿 · 0,96 · 0,98 = 4003,40 L (4.2)
4.1.2. Precipitación
Posteriormente a la centrifugación, se añade etanol al plasma pobre en crioprecipitado hasta
aproximadamente el 8%, y la solución se mezcla a baja temperatura para precipitar la Fracción I y
generar el Efluente I [13]. Para este primer paso la cantidad de Etanol necesaria es:
4003,40
0,92= 4351,52 𝐿 𝐸𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑡𝑒 𝐼 (4.3)
De los 4351,52 L totales la cantidad de etanol necesaria es de:
4351,52 𝐿 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 − 4003,40 𝐿 𝑃𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 = 348,12 𝐿 𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 (4.4)
Una vez obtenido el Efluente 1, con la primera fracción precipitada, es necesario añadir más etanol,
hasta el 20%, para precipitar la fracción II+III obteniendo el efluente II+III [13]:
4003,40
0,80= 5004,25 𝐿 𝐸𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑡𝑒 𝐼𝐼 + 𝐼𝐼𝐼 (4.5)
En esta segunda precipitación la cantidad de etanol necesaria es de:
5004,25 𝐿 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 − 4003,40 𝐿 𝑃𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 − 348,12 𝐿 𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
= 652,73 𝐿 𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 2ª 𝑓𝑎𝑠𝑒 (A2.6)
Memoria
22
Al añadir más etanol, hasta el 30% y posteriormente realizando un cambio de pH, mediante amoníaco,
se obtiene la fracción IV-1 en la cual se encuentra la antitrombina precipitada [13].
4003,40
0,70= 5719,14 𝐿 𝐸𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑡𝑒 𝐼𝑉 − 1 (4.7)
Por lo que se necesitan:
5719,14 𝐿 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 − 4003,40 𝐿 𝑃𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 − 1000,85 𝐿 𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
= 714,89 𝐿 𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 3ª 𝑓𝑎𝑠𝑒 (4.8)
Para cambiar de pH asumiendo que el pH de la disolución es aproximadamente neutro, con amoniaco
al 30%, con un peso molecular de 17 g/mol y densidad del 0,987kg/L, con 100 L de amoníaco:
100𝐿 · 0,3 ·0,897𝐾𝑔
𝐿·
1000𝑔
1𝐾𝑔= 26910𝑔 𝐴𝑚𝑜𝑛í𝑎𝑐𝑜 (4.9)
Para la concentración de Amoníaco:
[𝑁𝐻3] =26910𝑔
17 𝑔 · 𝑚𝑜𝑙−1 · 4004,40 · 0,9𝐿 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎= 0,44 𝑚𝑜𝑙/𝐿 𝐴𝑚𝑜𝑛í𝑎𝑐𝑜 (4.10)
Mediante la ecuación de equilibrio:
𝑁𝐻3(𝑎𝑐) + 𝐻2𝑂 (𝑙) →←
𝑁𝐻4+ + 𝑂𝐻− (4.11)
1,8 · 10−5 =[𝑁𝐻4
+] · [𝑂𝐻−]
[𝑁𝐻3]=
𝑥2
0,44 − 𝑥
(A2.12)
Despejando:
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
23
𝑥 = 0,002824 → −log 0,002824 = 2,55 (4.13)
De tal manera que el pH de la mezcla:
𝑝𝐻 = 14 − 2,55 = 11,45 (4.14)
Con la adición del amoníaco como se comentó con anterioridad se obtiene la fracción IV-1, en la que
se encuentra la proteína de interés, antitrombina precipitada [13].
4.1.3. Cromatografía de afinidad
La antitrombina precipitada se separa mediante cromatografía de afinidad a heparina. La interacción
entre la heparina y la ATIII se debe a una secuencia pentasacarídica específica [13].
La Figura 1 presenta el cromatograma de antitrombina estandar obtenida por cromatgrafia de afinidad
por heparina. El tiempo de retención del pico máximo de antitrombina es igual a 7,33 minutos y la zona
donde la antitrombina comienza a aparecer es aproximadamente 6,7 minutos después de su
introducción en la columna. Considerando el cromatograma en la Figura 1, la separación de
antitrombina puede llevarse a cabo en un tiempo corto usando una concentración de NaCl baja (2M)
[14].
Memoria
24
Figura 1.2. Elución de antitrombina humana III de una columna empaquetada con el sorbente compuesto de
heparina unida químicamente a una capa de dextrano inmovilizada en CPG [14].
La columna de afinidad se preequilibra con tampón inicial (fosfato disódico 0,02 M, pH 7,4) a
temperatura ambiente y a un caudal de 125 L/min. La antitrombina adsorbida se eluye utilizando un
gradiente de sal (fosfato disódico 0,02 M, cloruro de sodio 2 M, pH 7,4) [14].
Para el producto Heparin Sepharose®, la capacidad de captura es de 0,4 g/L [16]. De modo que para
tratar un volumen de 5819,14 L de disolución con una concentración de anti trombina del 17,18 %:
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝐶𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎 = 5819,14 𝐿 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 ·0,1718 𝑔
𝐿·
𝐿
0,4 𝑔
= 2499,32 𝐿 𝐶𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎
(4.15)
Las otras sustancias presentes en el plasma sanguíneo no perturban la elución de antitrombina [14].
Para la Elución de antitrombina:
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝐵𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟 𝑒𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑡𝑟 · 𝐹 (4.16)
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
25
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝐵𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟 𝑒𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 20 𝑚𝑖𝑛 ·1 ℎ
60 𝑚𝑖𝑛·
125 𝐿
ℎ= 41,6 𝐿 (4.17)
4.1.4. Pasteurización
La pasteurización de la antitrombina III (AT III) durante 10 horas a 60 ° C es necesaria para reducir el
riesgo de hepatitis por transfusión. La adición de estabilizadores apropiados puede evitar en gran
medida la pérdida de actividad antitrombina que de otro modo se produce durante la pasteurización.
Los estudios del mecanismo de desnaturalización y estabilización se han facilitado mediante el uso de
1,8-anilinonaftalenosulfonato (SNA) que se une débilmente al inhibidor y cuya fluorescencia
experimenta una respuesta sigmoidal al aumento de la temperatura a medida que la proteína se
desarrolla. La extensión del aumento en la fluorescencia de ANS se correlacionó aproximadamente con
la pérdida de actividad antitrombina y con la extensión de la agregación de proteínas determinada por
cromatografía de exclusión de alta presión. El punto medio, Td, de la curva de desnaturalización
térmica aumentó en 13 y 19 ° C en presencia de citrato de sodio 0,5 M y 1,0 M, respectivamente [17].
Muestras pasteurizadas durante 10 horas a 60 ° C en presencia de citrato 0.5 M y 1.0 M retuvieron la
actividad antitrombina completa, pero exhibieron evidencia de alteraciones menores en la capacidad
de unirse a la heparina [17].
4.1.5. Nanofiltración
La nanofiltración de los productos de plasma se actualizó a escala industrial a principios de la década
de 1990 como complemento de otros tratamientos de reducción viral, como los disolventes y los
tratamientos con calor y detergentes, especialmente para la inactivación del virus de la
inmunodeficiencia humana, la hepatitis B y la hepatitis C. La razón principal de La introducción de NF
fue la necesidad de mejorar la seguridad del producto contra virus y proporcionar una posible
protección contra nuevos agentes infecciosos que potencialmente ingresen al grupo de plasma
humano [18] [19] [20].
La Nanofiltración puede ser el único método que permite la eliminación eficiente de virus donde se
recupera el 90-95% de la actividad de la proteína [19].
Teniendo en cuenta que la antitrombina tiene un peso de 65 KDa, su radio aproximado es de unos 2,5
nm.
Memoria
26
Si se considera un flujo de 0,042 𝑚3/ℎ con una diferencia de presiones de 100 psi, y asumiendo 𝑅𝑚 =
1010 y 𝜂 = 32 mPa · s, según la ecuación:
𝐴 =𝑑𝑉
𝑑𝑡·
𝜂𝑅𝑚
𝛥𝑃 (4.17)
El área necesaria para la ultrafiltración es de:
𝐴 =2,5 𝑚3
ℎ·
1ℎ
3600𝑠·
32 𝑚𝑃𝑎 𝑠 · 1010𝑚−1
689476 𝑃𝑎·
1 𝑃𝑎
1000 𝑚𝑃𝑎= 0,054 𝑚2 (4.18)
Con una recuperación del 90% del volumen se obtienen 37,44 L de disolución con una concentración
de 26,71 g/L a tratar en etapas posteriores.
4.1.6. Ultrafiltración/diafiltración
La diafiltración es una técnica que utiliza membranas de ultrafiltración para eliminar, reemplazar o
reducir por completo la concentración de sales o solventes de soluciones que contienen proteínas,
péptidos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas. El proceso utiliza selectivamente filtros de membrana
permeables (porosos) para separar los componentes de las soluciones y suspensiones en función de
su tamaño molecular. Una membrana de ultrafiltración retiene moléculas que son más grandes que
los poros de la membrana, mientras que moléculas más pequeñas como sales, solventes y agua, que
son 100% permeables, pasan libremente a través de la membrana [21].
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
27
Figura 4.3. Esquema del proceso [22]
Según Millipore los porcentajes de rendimiento real y balance de masa deben estar cerca del 100% y /
o rendimiento teórico [22]. Si se producen pérdidas significativas, los parámetros del proceso (incluido
el tipo de membrana) pueden tener que cambiarse y luego volverse a optimizar.
De tal manera que siguiendo las indicaciones de Millipore el área de membrana necesaria es:
𝐴 =𝑉
𝐹· 𝑡 (4.19)
De manera que con un Flujo F de 2 L /min/m2 durante 20 minutos:
𝐴 = 37,44 𝐿 𝑚𝑖𝑛 · 𝑚2
2 𝐿·
1
20 𝑚𝑖𝑛= 0,936 𝑚2 (4.20)
Obteniendo un producto 100% antitrombina de 1000 g aproximadamente.
Memoria
28
Conclusiones
Una vez realizados los cálculos pertinentes para el dimensionamiento de los equipos para ambos
métodos de obtención y también, a partir de estos, los cálculos económicos de los mismos (ver
apartado siguiente). Se obtiene un coste estimado de 578.797,85 € para la producción de 1 kilogramo
de antitrombina a partir de leche de cabras modificadas genéticamente, frente a un coste estimado de
948.321,14 € para la producción de un kilogramo de antitrombina a partir de plasma sanguíneo.
Esto indica que el uso de los nuevos métodos biotecnológicos, en este caso, supone una mejora frente
a los métodos tradicionales que se venían empleando desde hace más tiempo.
Una vez analizados ambos, métodos antes del análisis económico y solamente desde un punto de vista
productivo era presumible espera que el nuevo método fuera más económico, ya que la cantidad de
pasos para obtener el producto final se ve reducido.
Además, cabe resaltar que el uso de leche de cabra como método de obtención a priori es más seguro
desde el punto de vista de la carga viral que puede presentar frente al uso de sangre humana.
Por último, este estudio económico no ha tenido en cuenta consideraciones previas como las fases de
estudios en ninguno de los casos hasta poder escalar el proceso a escala industrial. Meramente se
refiere a la comparación de los procesos industriales. Así mismo en el método de obtención a partir de
leche de cabra no se han tenido en cuenta los costes de crecimiento, alimentación, … del rebaño de
cabras necesario para obtener la cantidad requerida.
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
29
Análisis Económico
Índice de costes Marshall & Swift
Para el cálculo de los costes de los equipos se utiliza el índice de costes MSI (Marshall & Swift Index).
El índice de costes Marshall & Swift Index se creó para hacer comparaciones de costes de equipos entre
años anteriores. Los índices de costos de equipos Marshall y Swift se basan en un promedio nacional
para 47 industrias diferentes. Representa una estimación de las tendencias en los costes de equipos
instalados desde 1914 hasta la fecha.
Por ello basándose en un precio base y ecuaciones predefinidas para cada tipo de equipo en función
de las dimensiones de las operaciones unitarias [23].
El valor más actual para el índice MSI encontrado se corresponde al del año 2018 con un valor de
1638,2 [24] a fecha de enero del mismo año. Para la actualización de los costes del dólar a euro el valor
se toma en la página web del banco central europeo a día 30 septiembre de 2019 con un valor de 1 €
= 1,0889 $ [25].
Los equipos utilizados en el trabajo se enumeran a continuación con sus respectivas ecuaciones,
posteriormente se presentará el coste total para cada método, donde además se sumarán los costes
de soluciones y eluyentes calculados.
Tanques de retención:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ =𝑀𝑆𝐼
800· 8800 · 𝑉0,55 (A.1)
Utilizando el volumen en metros cúbicos.
Memoria
30
Filtros:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 1620 ·𝑀𝑆𝐼
300· (0,25 · 𝐴)0,63 (A.2)
Donde el área se expresa en pies cuadrados.
Ultrafiltros:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 1468 ·𝑀𝑆𝐼
800· 𝐴0,89 (A.3)
Área expresada en metros cuadrados
Columnas de Cromatografía:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 200000 + 200 · 𝑉 (A.4)
El área se expresa en metros cuadrados, en las columnas de cromatografía la longitud y el ratio de
elución se conservan de manera que conociendo el volumen se puede obtener el área de la misma.
Centrífugas:
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
31
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 65 ·𝑀𝑆𝐼
800· 𝑄0,73 (A.5)
Donde el flujo se expresa en litros por hora.
Obtención vía leche de cabra
Para el método de obtención de antitrombina vía leche de cabra el coste de los equipos es el siguiente:
Tanque de dilución de 2500 L utilizando la ecuación A.1:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ =1638,2
800· 8800 · 2,50,55 = 29.828,17 $
Para el microfiltro de 8,33 𝑚2 se utiliza la ecuación A.2:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 1620 ·1638,2
300· (0,25 · 89,66)0,63 = 67.748,03 $
El Ultrafiltro de 2,96 𝑚2 utilizando la ecuación A.3:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 1468 ·1638,2
800· 2,960,89 = 7.896,83 $
El coste de la columna de cromatografía de afinidad de 54 L mediante la ecuación A.4
Memoria
32
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 200.000 + 200 · 54 = 210.800 $
Para el Filtro Pall de eliminación vírica de 4 𝑚2siguiendo las especificaciones del fabricante siguiendo
la ecuación A.2:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 1620 ·1638,2
300· (0,25 · 43,055)0,63 = 39.527,35 $
Y por último el coste de la columna de interacción hidrofófica, siguiendo la ecuación A.4:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 200.000 + 200 · 27 = 205.400 $
A continuación, se presenta tabla resumen de los costes de los principales equipos del método
actualizados a euros:
Coste en $ Coste en €
Tanque Dilución $29.828,17 27.392,94 €
Microfiltro $67.748,03 62.216,94 €
Ultrafiltro $7.896,83 7.252,12 €
Columna Cromatografía $210.800,00 193.589,86 €
Filtro Pall $39.527,35 36.300,26 €
Columna interacción hidrofóbica $205.400,00 188.630,73 €
TOTAL $561.200,38 515.382,85 € Tabla 1. Costes equipos método de leche de cabra
A continuación, se establecerán los valores de los reactivos, eluyentes y demás soluciones necesarias
en función de los precios de proveedores:
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
33
Cantidad Unidades Precio Coste
Tampón EDTA 1250 L 48,95 61.187,50 €
Tampón de cloruro de sodio 2,5 M 27 L 82,5 2.227,50 €
TOTAL 63.415,00 € Tabla 2. Costes Soluciones y eluyentes método leche de cabra
El montante total estimado para este método en euros es de 578.797,85 €.
Obtención vía plasma sanguíneo
Para el método de obtención de antitrombina vía plasma sanguíneo el coste de los equipos es el
siguiente:
Para el cálculo del coste del equipo de centrifugación con un caudal de 14.184,4 L/h se emplea la
ecuación A.1:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 65 ·1638,2
800· 14.184,4 0,73 = 142.893,44 $
La precipitación requiere un tanque de 5719,14 L, con lo que mediante la ecuación A.1:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ =1638,2
800· 8800 · 5,720,55 = 47.024,85 $
La columna cromatográfica de 2499,32 L según la ecuación A.4 constituye un coste de:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 200.000 + 200 · 2.499,32 = 699.864 $
Memoria
34
Para la pasteurización se requiere un tanque de 41,6 L con un coste estimado según la ecuación
A.1:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ =1638,2
800· 8800 · 0,0420,55 = 3135,17 $
El equipo de nanofiltración de 0,054 𝑚2tiene según la ecuación A.2:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 1620 ·1638,2
300· (0,25 · 0,58)0,63 = 2620,73 $
Por último, el equipo de ultrafiltración de 0,936 𝑚2 según la ecuación A.3:
𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑛 $ = 1468 ·1638,2
800· 0,9360,89 = 2.834,25 $
A continuación, se presenta tabla resumen de los costes de los principales equipos del método
actualizados a euros:
Coste en $ Coste en €
Centrífuga $142.893,44 131.227,33 €
Tanque Precipitación $47.024,85 43.185,65 €
Columna Cromatografía $699.864,00 642.725,69 €
Tanque Pasteurización $3.135,17 2.879,21 €
Nanofiltro $2.620,73 2.406,77 €
Ultrafiltro $2.834,25 2.602,86 €
TOTAL $898.372,44 825.027,50 € Tabla 3. Costes equipos método plasma sanguíneo
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
35
A continuación, se establecerán los valores de los reactivos, eluyentes y demás soluciones
necesarias en función de los precios de proveedores:
Cantidad Unidades Precio Coste
Etanol Precipitación I 348,12 L 70,6 24.577,27 €
Etanol Precipitación II 652,73 L 70,6 46.082,74 €
Etanol Precipitación III 714,89 L 70,6 50.471,23 €
Amoníaco 100 L 21 2.100,00 €
Fosfato disódico 0,02 M, cloruro de sodio 2 M 41,6 L 1,5 62,40 €
TOTAL 123.293,64 € Tabla 4. Costes soluciones y eluyentess método plasma sanguíneo
El montante total estimado para este método en euros es de 948.321,14 €.
Estudio económico sobre la producción de antitrombina en planta vs animales
37
Bibliografia
1. Fernando Atmella, Francisco Hevia y Zulma Koon. Estudio de antitrombina III y tiempo de
protrombina en diferentes trastornos hepáticos.
2. GTC Biotherapeutics, Inc. Antithrombin (Recombinant) US Package Insert ATryn for Injection
February 3, 2009
3. ATryn EMA/403685/2016
4. Jörg Knäblein. Modern Biopharmaceuticals. Chapter 1, Wiley-VCH, 2005.
5. EMBL3. In: Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics. Springer, Dordrecht
6. https://www.institutoroche.es/recursos/glosario/adnc
7. Patente US20070037192A1. Method of purifying recombinant human antithrombin to enhance the
viral and prion safety profile. Carol Ziomek, Christopher Hendry.
8. Heparin HyperD™ M Affinity Chromatography Sorbent.
(https://shop.pall.com/us/en/biotech/chromatography/sorbents/heparin-hyperd-m-affinity-
chromatography-sorbent-zidgri78l9w)
9. Maheswara Reddy Mallu, Sandeep Vemula, and Srinivasa Reddy Ronda. Efficient single step
chromatographic purification of recombinant human antithrombin (rhAT) from Saccharomyces
cerevisiae. 2016
10. Ultipor® VF Grade DV20 Virus Removal Filter Cartridges.
(https://shop.pall.com/us/en/biotech/viral-clearance/filters-for-specialist-applications/ultipor-vf-
grade-dv20-virus-removal-filter-cartridges-zidgri78ma4)
11. Introduction to Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) (https://www.bio-rad.com/en-
sn/applications-technologies/introduction-hydrophobic-interaction-chromatography-
hic?ID=MWHB53MNI)
12. Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications.
By Larry Schwartz, Senior Technical Manager, Pall Life Sciences and Kevin Seeley, Ph.D., Scientific and
Laboratory Services, Pall Corporation.
Annexos
38
13. Kang Cai, Wendy P Osheroff, Greg Buczynski, JoAnn Hotta, John Lang, Eric Elliott, Douglas C Lee,
Nathan J Roth. Characterization of Thrombate III®, a pasteurized and nanofiltered therapeutic human
antithrombin concentrate. Biologicals: Journal of the International Association of Biological
Standardization 2014, 42 (3): 133-8.
14. Dawidowicz, A. L., Rauckyte, T., & Rogalski, J. (1994). High Performance Affinity Chromatography
for Analysis of Human Antithrombin III. Journal of Liquid Chromatography, 17(4), 817–831.
15. Manual de HEMOTERAPIA. MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL MATERNO PERINATAL
DEPARTAMENTO DE ANATOMIA PATOLOGICA Y PATOLOGIA CLINICA SERVICIO DE PATOLOGIA CLINICA
UNIDAD DE HEMOTERAPIA Y BANCO DE SANGRE. 1° Edición Lima, Mayo 2008.
16. Heparin Sepharose® (ab193268). (https://www.abcam.com/heparin-sepharose-ab193268.html)
17. homas F Busby, Donald H Atha, Kenneth C Ingham. Pasteurization Of Antithrombin III: Stabilization
By Heparin And Lyotropic Anions. Thromb Haemost 1981; 46(01): 374
18. M Shokri Doodeji, MM Zerafat. A Review on the Applications of Nanofiltration in Virus Removal
and Pharmaceutical Industries. March 19, 2018.
19. Burnouf T1, Radosevich M. Nanofiltration of plasma-derived biopharmaceutical products. 2003 Jan.
20. Faro M, Canal JM, Marzo N, Caballero S, Belda F, Gajardo R, Grancha S, Ristol P. STRATEGIES FOR
NANOFILTRATION OF THERAPEUTIC PLASMA PROTEINS. R&D Area, Instituto Grifols S.A.Barcelona,
Spain
21. Larry Schwartz. Diafiltration: A Fast, Efficient Method for Desalting, or Buffer Exchange of Biological
Samples. Pall Life Sciences.
22. A Hands-On Guide to Ultrafiltration/Diafiltration Optimization using Pellicon® Cassettes. Millipore
2013
23. Douglas S. Clark, Harvey W. Blanch. Biochemical Engineering, Second Edition. Marcel Dekker 1996.
24. Index values as published by Marshall Swift Valuation Services 01/2018.
25.BCE.(https://www.ecb.europa.eu/stats/policy_and_exchange_rates/euro_reference_exchange_r
ates/html/eurofxref-graph-usd.en.html)
