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ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTOINMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO

HIDROALCOHÓLICO DE CAPSICUMANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA

EN RATAS

MINISTERIO DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUDCENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA

2005

Q.F. DIANA VERGARA NÚÑEZ

IVÁN LOZADA-REQUENA

SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº36

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

CÓDIGO OGITT: 2-01-04-02-093

Título en castellano del artículo:

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO

HIDROALCOHÓLICO DE CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

Título en inglés del artículo:

EXPERIMENTAL STUDY OF EFFECT INMUNOMODULADOR OF EXTRACT

HIDROALCOHOLICO OF CAPSICUM ANNUNM ON ARTHRITIS INDUCED IN RATS

Título corto:

EFECTO DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA

ARTRITIS.

INVESTIGADORES:

Diana Vergara Núñez1, Iván Lozada-Requena2,

1 Centro Nacional de Control de Calidad. Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú2 Sección Inmunología. Facultad de Ciencias y Filosofía. Universidad Peruana CayetanoHeredia. Lima, PerúQ.F. Diana Mabel Vergara Núñez, Analista de Certificación. - Dirección Ejecutiva deCertificación – Centro Nacional de Control de Calidad – Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.Dirección: Av. Defensores del Morro No. 2268 (ex Huaylas) Chorrillos- Lima 9.Teléfono: (511) 467-6696 Anexo 589Correo electrónico: [email protected]


RESUMEN

Objetivos: El propósito de este trabajo es obtener el extracto hidroalcoholico del Capsicum

annum y comprobar el efecto inmunomodulador en ratas con Artritis rematoidea (AR) inducidas

por colágeno. Material y Métodos: Se realizaron ensayos analíticos de identificación para

detectar la presencia de alcaloides mediante reacción de color, aislamiento y determinación del

principio activo de la capsaicina por cromatografía en capa delgada del extracto

hidroalcoholico, utilizando estándar de capsaicina con pureza de 97% (SIGMA). Se realizó una

prueba piloto utilizando un test de ELISA para la determinación de TNF-αen suero de ratas

Sprague-Dawley y determinar el efecto inmunomodulador. Resultados: A partir del extracto

hidroalcohólico se logró identificar los alcaloides mediante la marcha fotoquímica por reacción

de color, y mediante cromatografía capa delgada (CCD) identificamos el principio activo de

capsaicina. La prueba piloto no evidenció cambios significativos en los niveles de TNF- α

respecto al control positivo. Conclusiones: La purificación e identificación del principio activo

(capsaicina) del extracto hidroalcohólico, debido a que las ratas Sprague-Dawley no

desarrollaron completamente la inducción por colágeno la artritis reumatoidea (AR) es

necesario obtener ratas con cepas susceptibles (AR), ratas específicamente con cepas LEWIS.

Palabra clave: Capsicum annuum L., extracto hidroalcohólico, antiinflamatorio.

SUMMARY

Objectives: The intention of this work is to obtain the extract hidroalcoholico of the Capsicum

annum and to verify the effect inmunomodulador in rats with Arthritis rematoidea (AR) induced

for colágeno. Material and Methods: Analytical essays of identification were realized to detect

the presence of alkaloids by means of reaction of color [olga Lock], isolation and determination

of the active beginning of the capsaicina for cromatografía in thin layer of the extract

hidroalcoholico, using standard of capsaicina with purity of 97 (SIGMA). A test was realized I

pilot using a test of ELISA for the determination of TNF - αin whey of rats Sprague-Dawley and

to determine the effect inmunomodulador. Results: From the extract hidroalcohólico one

managed to identify the alkaloids by means of the march fitoquímica for reaction of color, and by

means of cromatografía thin layer (CCD) we identify the active beginning of capsaicina. The test


pilot did not demonstrate significant changes in the levels of TNF - αwith regard. Conclusions:

The purification and identification of the active beginning hidroalcohólico, anti-inflammatory. to

the (capsaicina) of the extract hidroalcohólico, because the rats Sprague-Dawley did not

develop completely the induction for colágeno the arthritis rheumatoid (AR) is necessary to

obtain rats with capable vine-stocks (AR), rats specifically with vine-stocks LEWIS.

Key word: Capsicum annuum L., hidroalcohólico, antiinflammatory extract.

INTRODUCCIÓN

Las plantas con acción medicinal son popularmente utilizadas debido a sus propiedades

tradicionalmente atribuidas, los cuales han mostrado validez científica de alguna de sus

propiedades tradicionales atribuidas.

El ají de trueno (Capsicum Annuum), familia Solanacea, de la Selva de Bagua, su principal

principio activo capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida; C18H27NO3), sustancia que

pertenece a la familia de los vaniloides, grupo de sustancias con actividad irritante natural

(Wekh J M, Simon S A, Reinhart P H. 2000; 97(25):13889-13894) (Johnston J J, Goldade D A,

Chipman R B 2002; 21:1109-1112.), ocasiona la pungencia y es capaz de irritar cualquier tejido

con el que se ponga en contacto. Se ha encontrado que la capsaicina es capaz de reducir la

"sustancia P", un químico que lleva los mensajes de dolor desde las terminales nerviosas de la

piel al sistema nervioso central. Las investigaciones clínicas han demostrado que el 75 % de

los pacientes a los que se ha aplicado crema de capsaicina en sus zonas enfermas

experimentaron una disminución sustancial del dolor, con solo una ocasional sensación de

quemadura. Por esta propiedad está siendo investigado el uso de la capsaicina en otros

problemas de la piel que ocasionan dolor, (Keville, 1992: 57-58).

En el Perú se aconseja el consumo en las comidas por sus efectos digestivos, colagogos y

carminativos. Para aprovechar las propiedades analgésicas y rubefacientes, el fruto y las

semillas deben ser macerados en alcohol de 70%, y el líquido resultante se debe aplicar como

linimento en las zonas del cuerpo afectadas (Palacios Vaccaro 1992: 4).

Externamente se usa como revulsivo en pomadas y linimentos contra los dolores reumáticos y

las neuralgias.


La capsaicina es un alcaloide natural derivado de la guindilla, que cuando se aplica de forma

tópica actúa deplecionando el contenido de sustancia P en las terminaciones nerviosas

periféricas responsables de la transmisión del impulso nervioso. La sensación álgica se

transmite a través de impulsos dolorosos donde la sustancia P y otros neurotransmisores

tienen un papel determinante. La interrupción en la transmisión del impulso doloroso se

conseguiría con una disminución en el contenido de estos neurotransmisores. En esta acción

actúan diversos mecanismos: bloqueo de los canales del calcio, inhibición del receptor

específico de membrana, acumulación intracelular de iones que producen cambios osmóticos y

activación de procesos enzimáticos proteolíticos. El dolor crónico tiene como base una

hiperexcitabilidad de impulsos sobre las fibras C. La capsaicina reduce esta actividad por lo

que actuaría impidiendo la perpetuación del estado doloroso. La aplicación tópica de

capsaicina a concentración de 0,025% provoca una vasodilatación cutánea en el lugar de la

aplicación que se traduce en dolor ardiente, sensación que disminuye después de la aplicación

repetida. No debe utilizarse sobre la piel lesionada, ni sobre áreas inflamadas (herpes zóster en

fase aguda) ni en conjuntivas ni mucosas. Debe observarse una limpieza cuidadosa de las

manos después de cada aplicación. Debe aplicarse tres o cuatro veces al día ya que su efecto

es de corta duración, obteniéndose un alivio del dolor entre las dos y cuatro semanas, con una

respuesta máxima entre las cuatro y seis semanas. Se ha comprobado que cuando cesa la

aplicación de capsaicina los niveles de sustancia P se normalizan, lo que justifica que su efecto

analgésico sea reversible.(CAPÍTULO XIII Tratamiento Farmacológico del Dolor: 149)

Es en este contexto TNF- α se convierte en una citokina “pívot” durante el desarrollo de la AR,

la producción de moléculas bloqueadoras de TNF- α, como el caso de los anticuerpos

monoclonales anti-TNF- α, como Infliximab y Adalimumab o los receptores solubles de TNF- α,

como Etanercept (Berg L, Lampa J, Rogberg S, van Vollenhoven R and Klareskog L. 2001:60

133-139) (Gotlieb D. 2001.) Consecuentemente, los agentes terapéuticos que se dirijan a

actuar sobre la expresión del gen que codifica el TNF- αel mismo TNF- αo sobre el NF-kB

tienen una gran probabilidad de combatir la artritis (Aguilar J, Rojas P, Marcelo A, Plaza A,

Bauer R, Reininger E, Cristoph A K and Merfort I. 2002.)


OBJETIVOS

Objetivos Generales:

Identificar y aislar del extracto hidroalcohólico de Capsicum annum.

Determinar el efecto inmunomodulador de un extracto hidroalcohólico de Capsicum

annum en la artritis inducida por colágeno en ratas.

Objetivos específicos:

Presentar evidencias para considerar la evaluación del uso de esta planta medicinal

Capsicum annum (Ají de trueno) como tratamiento alternativo en la AR en humanos.

Medir los niveles de Factor de Necrosis Tumoral tipo alfa como indicador del efecto

inhibidor de la respuesta inflamatoria inducida por el extracto hidroalcohólico de

Capsicum annum

MATERIAL Y MÉTODOS

Preparación de la muestra y extracto hidroalcoholico

La muestra de Capsicum Annuum (ají de trueno) se recolecto en la zona de Bagua Chica, se

transporto la planta completa a la ciudad de Lima, la cual fue llevada al Museo de la Historia

Natural de UNMSM, para ser identificada taxonómicamente, mediante la Constancia Nº 079-

USM-02 DE LA Universidad Nacional Mayor de San Marcos, MUSEO DE HISTORIA

NATURAL. (anexo 1)

Así mismo se colecto frutos de la planta las cuales fueron desinfectadas, secadas y preparadas

para la obtención del extracto hidroalcoholico.

Se pulverizo la muestra y luego se peso 50 g agregando 500 mL de Etanol durante 24 horas en

agitación constante.

Para la comprobación de la presencia de alcaloides se ha desarrollado ensayos de coloración y

de precipitación; con la reacción a los reactivos de Dragendorf, Mayer, Warner. (Olga lock

Ugaz 1994:5-7)


Marcha fotoquímica preliminar

Muestra seca molida2-3 g

+ 20 mL etanolcalentar de 5-10 minutos a ebulliciónfiltrar

Extracto

+ 1 gota de HCl

AlcaloidesPositivo al reactivo de DragendorfPositivo al reactivo de MayerPositivo al reactivo de Wagner

TRATAMIENTO DEL ESTANDAR DE CAPSAICINA

La capsaicina fue obtenida de SIGMA-ALDRICH St. Louis Mo, USA, M-2028; con un grado de

pureza mínima de 97%. Se preparó una solución stock (0,1 mg/mL) usando como diluyente

etanol.

AISLAMIENTO DE CAPSAICINA

100 g de semillas pulverizadas son agitadas con 200ml de éter de petróleo a temperatura

ambiente por 24 horas. Se filtra y el sólido es lavado con 25 ml de éter de petróleo.

Se obtiene una solución de color rojo el cual es diluido con el triple de volumen de éter.

Posteriormente se adiciona 100 ml hidróxido de potasio al 30% en metanol la mezcla es

agitada por 8 horas. Las phytoxantinas libres son disueltas en éter: La fase etérea es lavada

después con agua y secada con sulfato de sodio anhidro y concentrada a un volumen de 20 ml

bajo presión reducida a 45 ºC en un rotavapor.

El residuo etéreo es diluido con 60 ml de éter de petróleo y dejado en refrigeración por 24 h. La

capsaicina es filtrada y recristalizada con pequeñas cantidades de metanol.

La purificación de capsaicina que a menudo se obtiene acompañada de otros componentes

(Zeaxantina, capsorubina etc)


MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE LOS COMPONENTES DE MATERIA PRIMA DE

CAPSAICINA

Cromatografía en columna rápida (CCR):

A partir del extracto obtenido por maceración metabólica de los frutos del ají de trueno, fue

controlada por cromatografía en capa fina analítica, detectándose la presencia de alcaloides.

Se fracciono por cromatografía en columna rápida:

Fase fija: Silicagel 40 para cromatografía en columna.

Fase móvil o eluyente: n-hexano, diclorometano, metanol y agua destilada.

Procedimiento: Se realizo una papilla del extracto de silicagel para columna para dispensarlo

homogéneamente y poder sembrarlo en una superficie de la silicagel de columna usada para

fraccionamiento, luego se eluyen con los solventes indicados en forma sucesiva, se evapora los

solventes obteniéndose los cuatro extractos de las fracciones correspondientes, que luego

fueron controladas en capa fina.

Fase fija: Cromatoplaca silicagel 60 F 254 20 x 10 cm

Sistema solvente: eter dietilico: Etanol 39,2 : 2,2 obteniéndose alcaloides mayoritariamente

Reveladores: Solución de 2,6-dibromoquinone-chlorimide in metanol al 0,5 % y camara con

vapores de amoniaco.

Obtención de extractos oxindólicos:

En un matraz erlenmeyer con tapa esmerilada colocar 1 g de la muestra pulverizada

agregar amoniaco al 10% para humedecer durante una hora y lograr la liberación de los

componentes químicos, dejar que el amoniaco se volatilice y luego agregar 20 mL de agua

destilada, mezclar bien y pasar por un embudo de separación, realizar tres extracciones

con 30 mL de diclorometano, separar por filtración la fase diclorometanica sobre un papel

de filtro que contiene 1 g de sulfato de sodio anhidro, para desecar la solución

diclorometanica que se esta filtrando, se recibe en un beacker, se evapora el solvente

diclometano y se obtiene el extracto diclorometanico que contiene los alcaloides

oxindólicos y otros metabolitos secundarios, fueron controladas en capa fina en la misma

forma que los extractos obtenidos por Cromatografía en columna rápida (CCR).


ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

Ratas hembras Sprague-Dawley de 3 meses de edad, con peso entre 150 – 200 g se

obtuvieron del bioterio de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. El bioterio mantiene

líneas de ratas con parámetros estándar en cuanto a su reproducción y características

adecuadas de mantenimiento de la línea. Los animales fueron alimentados con alimento

balanceado y agua ad libitum.

TOMA DE MUESTRA

Se realizó la toma de muestra a dos ratas para lo cual se tuvo que anestesiarlas.

La toma de muestra se realizó por punción intra-orbital.

Se obtuvo muestras de suero de ambas ratas.

Realización del ensayo de ELISA

Se utilizó el kit Rat TNF-αELISA de BD Biosciences, el cual se basa en el inmunoensayo

asociado a una encima de tipo “sándwich”que determina la presencia de la citokina TNF- α.

El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante y todo el ensayo duro

aproximadamente 6 horas.

Las lecturas se realizaron con equipo de la Sección Inmunología –UPCH.

RESULTADOS

Preparación del extracto hidroalcoholico:

El extracto de Capsicum obtenida tenia el aspecto de un liquido transparente de color

anaranjado rojizo de olor fuerte característico, sabor picante ardiente.

Por cromatografía de capa delgada se obtuvo el perfil del extracto comparándolo con el

estándar, el color azul y el valor del Rf de la mancha principal obtenida a partir de la solución de

prueba corresponde a la propiedad de la mancha principal obtenida a partir de la solucion

estándar. (USP 28 2005:336)


En la tabla 1 se muestran los resultados de las corridas de la cromatografícas en los diferentes

extractos estudiados en relación con el estándar.

Tabla 1. Índices medidos a los diferentes extractos de extractos de C. annuum

Nª demuestra

Extractos Rf Mancha azul

La intensidad y el valor Rf de la

mancha principal obtenida de la

solución prueba corresponden a

los obtenidos en la solución

estándar (USP 28 2005:336)

1 Estándar 0,73 + Corresponde

2 Alcaloides oxindólicos 0,74 + Corresponde

3 Capsaicina aislada 0,73 + Corresponde

4 n-hexano --- - No se evidencia

5 Diclorometano 0,73 + Corresponde

6 Metanol 0,73 + Corresponde

7 Agua destilada --- - No se evidencia

En las fig. 1 se presentan los perfiles cromatográficos obtenidos en las diferentes condiciones y se relacionan los intervalos devalores de Rf y el color para cada una de las bandas detectadas como a continuación se describe detallan.

Estándar Diclorometano Metanol Alcaloides Purificada


Datos y Resultados del ensayo de ELISA

Disposición de estándares y muestras:

1 2 3A Blanco ST1 (2000 pg/ml) RT1*B ST1 (2000 pg/ml) ST2 (1000 pg/ml) RT2*C ST2 (1000 pg/ml) ST3 ( 500 pg/ml) RT2*D ST3 ( 500 pg/ml) ST4 ( 250 pg/ml) RT1E ST4 ( 250 pg/ml) ST5 ( 125 pg/ml) RT1F ST5 ( 125 pg/ml) ST6 ( 62,5 pg/ml) RT2G ST6 ( 62,5 pg/ml) ST7 ( 31,3 pg/ml) RT2H ST7 ( 31,3 pg/ml) RT1* RT1

Donde: ST1-7 : Estándares (Concentración TNF-)RT1 : Rata con Artritis Inducida por ColágenoRT2 : Rata con Artritis Inducida por Adyuvante Completo de Freund* : Sueros que presentaron hemólisis

Lecturas a 450 nm en unidades de Densidad Óptica (DO):

1 2 3A 0,227 1,710 0,218B 1,875 1,011 0,225C 0,995 0,648 0,271D 0,105 0,433 0,234E 0,485 0,357 0,226F 0,360 0,326 0,187G 0,309 0,284 0,201H 0,235 0,197 0,216

Lecturas Corregidas con el Blanco:

1 2 3A 0 1,483 -0,009*B 1,648 0,784 -0,002*C 0,768 0,421 0,044D -0,122* 0,206 0,007E 0,258 0,130 -0,001*F 0,133 0,099 -0,040G 0,082 0,057 -0,026H 0,008* -0,030 -0,011*

* Estos valores no se tomaron en cuenta por presentar error o contaminación.

Curva estándar

Elaborada a partir del promedio de las lecturas de los 7 estándares. Gráfica de regresión linear utilizando logaritmos.

Concentración Estándar(pg/ml)

D.O. a 450 nm

2000 1,5661000 0,776500 0,421250 0,232125 0,13262,5 0,09131,3 0,057


Ecuación de la curva: DO = -2,486 + 0,793(Conc. TNF-en pg/ml)

Muestra D.O. (450 nm) Conc. TNF- α(pg/ml)RT1* -0,030 3,91RT2* 0,044 3.19RT1 0,007 3,14RT2 -0,040 3,08

INMUNIZACION DE RATA (CEPA SPRAGUE-DAWLEY) CON COLAGENO TIPO II DE POLLO

30 40 6 0 8 0 1 00 1 5 0 20 0 3 00 4 0 0 60 0 8 0 01 0 00 1 50 0 2 00 0

0 .0 6

0 .0 8

0 .1 0

0 .1 5

0 .2 0

0 .3 0

0 .4 0

0 .6 0

0 .8 01 .0 0

1 .5 0

X (T NF pg/ml

Y(D

O45

0nm

W = Logt en(Y), Z = Lo gten(X)W = -2. 48589 + 0. 792977 Z

R -S q = 99. 1 %

ELISA para T NF -al fa en s uero d e Ratas


MEDICION DEL ESPESOR DE LA PATA DE LA RATA

CONCLUSIONES

1. Los kits para la determinación de TNF en ratas indican que los niveles de dicha citokina son

muy bajos estando por debajo de la mínima concentración de estándar.

2. Debido a que los sueros presentaron hemólisis es muy probable que esta haya contribuido al

poco nivel encontrado de la citokina TNF-αen las muestras.

3. Se deben tener en cuenta los errores de pipeteo y de material incorrectamente esterilizado.

4. En el caso de las ratas con Artritis Inducida por Colágeno, estas todavía no han concluido su

proceso de inducción por lo que también es probable que esta sea la causa del bajo nivel de

TNF-α.

5. Se volverá a repetir el ensayo en aproximadamente 10 –15 días para dar tiempo a que los

animales se recuperen del traumatizante proceso de toma de muestra.

6. Se utilizará la vía por punción cardiaca en vez de la ocular, ya que esta presenta problemas

de coagulación y no permite obtener el volumen adecuado de la muestra.


RECOMENDACIONES

Ante la dificultad de la adquisición de las ratas cepas lewis, y para cumplir con el objetivo

solicitamos una adenda, donde planteamos el uso de un modelo in vitro en el que se usaran

Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP) humanas para que sean cultivadas,

tratadas con el mismo principio activo del Capsicum annum, capsaicina y luego estimuladas

con Liposacaridos (LPS), el cual es un potente inductor de producción TNF-alfa para luego

evaluar cual fue el efecto inmunomodulador de capsaicina sobre los niveles de citokinas, con

su respectivo presupuesto (excluyendo la compra de las ratas), dicha Adenda fue aprobada

mediante MEMORANDO Nº 675-2004-DG-OGITT-OPD/INS (09-12-2004), pero a la fecha no

se han comprado los materiales solicitados.

Para el cumplimiento de dicho trabajo es necesario contar con el material solicitado.

ANEXO 1


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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capsaicine involves the pore domain and differs from the activation by either acid or heat.

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5. CAPÍTULO XIII TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO DEL DOLOR Dra. C. Busquets Julià

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