ESTUDIO FITOQUIMICO DE HOJAS DE LA ESPECIE VEGETAL...
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1 ESTUDIO FITOQUIMICO DE HOJAS DE LA ESPECIE VEGETAL Piper catripense (PIPERACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD ANTIOXIDANTE. ALISON YINETH MONTERO COLLAZOS. UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA Bogotá D.C, 2017
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ESTUDIO FITOQUIMICO DE HOJAS DE LA ESPECIE VEGETAL Piper catripense
(PIPERACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD ANTIOXIDANTE.
ALISON YINETH MONTERO COLLAZOS.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
Bogotá D.C, 2017
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ESTUDIO FITOQUIMICO DE HOJAS DE LA ESPECIE VEGETAL Piper catripense
(PIPERACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD ANTIOXIDANTE.
ALISON YINETH MONTERO COLLAZOS
Proyecto de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Licenciado en Química.
Director:
WILLIAM FERNANDO CASTRILLÓN CARDONA.
Químico, Especialista En Edumatica, Magister en Ciencias Ambientales.
Codirector:
JAVIER ANDRÉS MATULEVICH PELÁEZ.
Licenciado En Química, Especialista En Análisis Químico Instrumental, Magister En
Ciencias Biológicas Con Énfasis en Fitoquímica.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
Bogotá D.C, 2017
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AGRADECIMIENTOS
Le agradezco a Dios por haberme acompañado y guiado a lo largo de mi carrera, por ser
mi fortaleza, mi luz y apoyo en los momento de debilidad.
Le doy gracias a mis padres Elizabeth y Jaime por apoyarme en todo momento y por los
valores que me han inculcado.
A mis hermanos por ser parte importante de mi vida, por llenar mi vida de alegría y
apoyarme en los momentos de necesidad
A Dany por ser una parte muy importante de mi vida, por haberme apoyado en las buenas
y en las malas
Le agradezco al profesor Javier Matulevich por la confianza, apoyo, esfuerzo y
dedicación, quien con sus conocimientos, su experiencia y su paciencia ha logrado que
pueda terminar esta tesis
Gracias al profesor Willian Castrillon por todo su apoyo
A la fundación universitaria Juan N. Corpas, por el préstamo de instalaciones y equipos
empleados en la determinación de la capacidad antioxidante.
A los integrantes del Grupo de Investigación Productos naturales vegetales por su apoyo
incondicional
A mis amigos por confiar y apoyarme siempre
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TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ......................................................................................................................13
1. INTRODUCCION ....................................................................................................15
2. JUSTIFICACION........................................................................................................16
2.1. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN .............................................................................. 17
3. OBJETIVOS ...............................................................................................................18
3.1. OBJETIVO GENERAL................................................................................................... 18
3.2. OBJETIVOS ESPEIFICOS .......................................................................................... 18
4. ESTADO ACTUAL DEL TEMA ..............................................................................19
4.1. FAMILIA PIPERÁCEAE ............................................................................................... 19
4.1.1. Características morfológicas de la familia Piperáceae ........................................ 19
4.1.2. Distribución de la familia Piperácea ...................................................................... 20
4.1.3. Uso de la familia Piperácea ................................................................................... 20
4.1.4. Actividades biológicas de la familia Piperácea .................................................... 21
4.1.5. Estudios químicos de la familia Piperácea ........................................................... 22
4.2 GENERO PIPER ............................................................................................................. 24
4.2.1. Características morfológicas del género Piper .................................................... 24
4.2.2. Distribución del género Piper ................................................................................. 25
4.2.3. Uso del género Piper .............................................................................................. 26
4.2.4. Actividades biológicas del género Piper ............................................................... 26
4.2.5. Estudios Quimicos del género Piper ..................................................................... 28
4.3. ESPECIE Piper catripense........................................................................................... 31
4.3.1. Características morfológicas de la especie Piper catripense ............................. 31
4.3.2. Distribución de la especie Piper Catripense ......................................................... 32
4.3.3. Uso de la especie Piper Catripense ...................................................................... 32
4.3.4. Actividades biológicas y estudios químicos de la especie Piper Catripense..... 32
4.4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE .................................................................................... 33
4.4.1. Antioxidantes ........................................................................................................... 33
4.4.2. Modelos de evaluación de la capacidad antioxidante ......................................... 33
4.4.3. Método 1,1-difenil-pricrilhidrazil (DPPH) .............................................................. 35
5. METODOLOGIA ........................................................................................................36
5
5.1. GENERALIDADES ........................................................................................................ 36
5.2. METODOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRAFICA .............................................. 36
5.2.1 Técnicas de elucidación estructural y caracterización de los metabolitos
secundarios aislados ......................................................................................................... 37
5.3. RECOLECCION DE LA MUESTRA ............................................................................. 37
5.4. MARCHA FITOQUÍMICA PRELIMINAR ..................................................................... 38
5.5. EXTRACCIÓN CON ETANOL, FRACCIONAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE es
METABOLITOS SECUNDARIOS PRESENTES EN HOJAS ............................................ 39
5.6 OBTENCION DE FRACCIONES ................................................................................... 40
5.5.2. Fracción hexano de hojas de Piper catripense (Fx.Hex.Pc.H) ........................... 40
5.5.3. Fracción diclorometano de hojas de Piper catripense (Fx.DCM.PcH) ............... 40
5.5.4. Fracción acetato de etilo de hojas de Piper catripense (Fx.AcOEt.Pc.H) ......... 41
5.6. EXTRACCION Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE LOS ACEITES ESENCIALES
................................................................................................................................................ 42
5.6.1 Obtención de aceites esenciales (AE) de hojas de Piper catripense .................. 42
5.6.2 Identificación de los compuestos de AE de Piper catripense .............................. 42
5.8. EVALUACION DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE .............................................. 43
5.8.1 Preparación de la solución DPPH .......................................................................... 43
5.8.2 Preparación de la curva de referencia .................................................................. 43
5.8.3. Cuantificación de la capacidad antioxidante ........................................................ 43
6. RESULTADOS Y ANALISIS ....................................................................................45
6.1. MARCHA FITOQUÍMICA PRELIMINAR ...................................................................... 45
6.2 METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS ............................................................. 47
6.2.1. Elucidación estructural del compuesto PcH.1 ...................................................... 47
6.2.2. Composición de la mezcla PcH.2 .......................................................................... 49
6.2.3. Composición de la mezcla PcH.3 .......................................................................... 53
6.2.4. Composición de la mezcla PcH.4 .......................................................................... 56
6.3 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE HOJAS DE Piper
Catripense .............................................................................................................................. 59
6.4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS HOJAS DE Piper
Catripense .............................................................................................................................. 63
6.4.1 Curva de calibración para el ensayo DPPH .......................................................... 63
7. CONCLUSIONES ......................................................................................................68
6
8. RECOMENDACIONES .............................................................................................69
9. BIBLIOGRAFIA .........................................................................................................70
7
INDICE DE FIGURAS
Figura 4-1 Características morfológicas de la familia Piperácea. (Naturalista, 2009) ....... 19
Figura 4-2 Distribución geográfica de la familia Piperáceae ............................................. 20
Figura 4-3 Características morfológicas de especies del género Piper. (Naturalista, 2009)
........................................................................................................................................ 25
Figura 4-4 Distribución geográfica del género Piper ......................................................... 26
Figura 4-5 Características morfológicas de la especie Piper catripense. .......................... 31
Figura 4-6 Distribución de la especie Piper catripense. .................................................... 32
Figura 4-7 Esquema de reacción DPPH. ........................................................................ 35
Figura 5-1 Mapa de localización del área de recolección de la especie. Colombia,
Departamento Choco ....................................................................................................... 38
Figura 5-2 Diagrama Marcha Fitoquímica Preliminar para las Hojas de la especie Piper
catripense ........................................................................................................................ 39
Figura 5-3 Diagrama Obtención de extractos fracciones de la especie Piper catripense. 40
Figura 5-4 Diagrama Obtención de mezclas PcH.3 y PcH.4 de la fracción Diclorometano
especie Piper catripense .................................................................................................. 41
Figura 6-1 Corriente iónica total (TIC) de la Compuesto PcH.1. ....................................... 47
Figura 6-2 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el compuesto Pc.H1.
........................................................................................................................................ 48
Figura 6-3 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el acetaminofén .................. 49
Figura 6-4 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla PcH.2. .............................................. 50
Figura 6-5 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el β- Eudesmol ...... 50
Figura 6-6 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el β- Eudesmol ................... 51
Figura 6-7 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Cedrane-8,13-diol51
Figura 6-8 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Cedrane-8,13-diol ........... 52
Figura 6-9 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Veridiflorol ......... 52
Figura 6-10 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Veridiflorol ..................... 53
Figura 6-11 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla PcH.2. ............................................ 54
Figura 6-12 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Piperonal ........ 54
8
Figura 6-13 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Piperonal ....................... 55
Figura 6-14 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Tetratetracontane
........................................................................................................................................ 56
Figura 6-15 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Tetratetracontane .......... 56
. Figura 6-16 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla PcH.4. ......................................... 57
Figura 6-17 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el 3 –
butilindolizidina ................................................................................................................ 57
Figura 6-18 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el 3 – butilindolizidina ........ 58
Figura 6-19 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Cubebinolide .... 58
Figura 6-20 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Cubebinolide ................. 59
Figura 6-21 Perfil cromatografico de los AE de las hojas de Piper catripense .................. 60
9
LISTA DE TABLAS
Tabla 4-1 Actividad biológica de algunas especies de la familia Piperáceae.................... 22
Tabla 4-2 Actividad biológica de algunas especies del género Piper. .............................. 27
Tabla 4-3 Clasificación de la especie vegetal Piper catripense. ....................................... 31
Tabla 4-4 Clasificación de los modelos de ensayo in vitro (Tovar del Rio & Mosquera,
2013) ............................................................................................................................... 34
Tabla 6-1 Marcha fitoquímica preliminar del extracto etanólico de las hojas de la especie
Piper catripense ............................................................................................................... 45
Tabla 6-2 Composición química relativa del aceite esencial de las hojas de la especie
Piper catripense ............................................................................................................... 60
Tabla 6-3 Promedio de absorbancias, % inhibición, IC50 del Ácido Gálico ..................... 64
Tabla 6-4 % inhibición, IC50 del extracto y fracciones de las hojas de la Piper catripense
........................................................................................................................................ 67
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TABLA DE GRAFICAS
Grafica 6-1 % Compuestos AE ........................................................................................ 62
Grafica 6-2 Curva de calibración patrón Acido Gálico ...................................................... 63
Grafica 6-3 curva de IC 50 patrón ácido gálico ................................................................ 65
Grafica 6-4 % capacidad antioxidante extracto y fracciones de las hojas de Piper
catripense ........................................................................................................................ 65
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LISTA DE ABREVIATURAS
AcOEt Acetato de etilo
AE Aceites esenciales
CC Cromatografía en columna
CCD Cromatografía en capa delgada
CF Cromatografía flash
CG-EM Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
DCM Diclorometano
DPPH 1,1-difenil-2-2picril-hidrazilo
E.EtOH.Pc.H Extracto etanolico de las hojas de la Piper catripense
EM Espectrometría de masas
EtOH Etanol
Fx.AcOEt.Pc.H Fracción Acetato de etilo de las hojas de la Piper catripense
Fx.DCM.Pc.H Fracción diclorometano de las hojas de la Piper catripense
Fx.Hex.Pc.H Fracción hexano de las hojas de la Piper catripense
Hex Hexano
IE Ionización electrónica
IR Índice de retención
m.s.n.m metros sobre el nivel del mar
Mezcla PcH2 Mezcla 2 hojas Piper catripense
Mezcla PcH24 Mezcla 4 hojas Piper catripense
12
Mezcla PcH3 Mezcla 3 hojas Piper catripense
MFP Marcha fitoquimica preliminar
PcH1 Compuesto 1 hojas Piper catripense
Ppm Partes por millón
SD Desviación edtandar
TIC Corriente iónica total
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RESUMEN
Piper catripense es una especie vegetal perteneciente al género Piper de la familia
Piperaceae conocida comúnmente como desvanecedora, siendo el género Piper uno de
los más amplios, el cual tiene una distribución de más de 1200 especies. Teniendo en
cuenta la importancia y la gran cantidad de especies vegetales del género Piper que se
utilizan en la medicina popular para aliviar diferentes dolencias, este trabajo de
investigación presenta los resultados del estudio químico y biológico, haciendo una
contribución importante a la familia Piperaceae y a la especie Piper Catripense ya que no
cuenta con reportes científicos.
Se realizó la colecta del material vegetal en el departamento del Choco municipio Bajo
Baudó, y se extrajo mediante la técnica de maceración en frio con etanol al 96%
obteniéndose 60g de extracto total (E.EtOH.PcH), donde mediante el estudio fitoquímico
preliminar se determinó cualitativamente la presencia de diferentes metabolitos
secundarios, tales como flavonoides, taninos, cardiotonicos, carotenoides, alcaloides,
esteroides y triterpenos.
Mediante el fraccionamiento liquido-liquido continuo al extracto etanólico (E.EtOH.PcH)
con solventes de polaridad creciente, se obtuvieron las diferentes fracciones: fracción de
hexano (Fx.Hex.Pc.H), fracción de diclorometano (Fx.DCM.Pc.H) y fracción de acetato de
etilo (Fx.AcOEt.Pc.H), las cuales fueron sometidas a separación continua utilizando
técnicas de cromatografía, tales como cromatografía en capa delgada (CCD) y
cromatografía en columna (CC). La elucidación estructural de los compuestos aislados se
llevó a cabo mediante las técnicas de cromatografía de gases acoplada a masa (CG-EM)
permitiendo obtener un compuesto identificado como acetaminofén y tres mezclas de
compuestos tipo sesquiterpenos, aldehídos, hidrocarburo alifático, alcaloide y lactona
compuesta por β-Eudesmol, Cedran-8,13-diol, Veridiflorol, Piperonal, Tetratetracontano, 3
– butilindolizidina y Cubebinolide, respectivamente
Se obtuvieron los aceites esenciales por la técnica de arrastre de vapor de hojas frescas,
la identificación de los componentes se hizo mediante CG-EM, comparando los índices de
retención y los espectros de masas de las respectivas señales con los de la librería
14
NIST08, permitiendo identificar 29 componentes, en su mayoría sesquiterpenos siendo el
Isolongifolan-8-ol (30,98) el compuesto mayoritario dentro del aceite.
Se evaluó la capacidad antioxidante del extracto etanolico (E.EtOH.PcH) y las fracciones
de hexano (Fx.Hex.Pc.H), diclorometano (Fx.DCM.Pc.H) y acetato de etilo
(Fx.AcOEt.Pc.H) utilizando el método de DPPH, donde se permitió establecer que el
extracto etanolico y la fracción de acetato de etilo presentan un alto potencial de
eliminadores de radicales libres, ya que son capaces de neutralizar el 50% de radicales
libres.
PALABRAS CLAVE: Piper catripense, capacidad antioxidante, metabolitos fijos,
metabolitos volátiles.
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1. INTRODUCCION
Colombia es conocida por su inmensa riqueza en recursos naturales y se le atribuyen una
alta expresión de biodiversidad debido a que el país se encuentra a 1.600 km de la costa
del Caribe, costa del Pacífico y la selva amazónica colombiana. Por otra parte, la variedad
de climas que se pueden experimentar desde los desiertos áridos hasta las montañas
cubiertas con nieve, generando así condiciones apropiadas para el crecimiento de más de
130.000 especies vegetales. (Off2Colombia, 2012). Gracias a la gran variedad de
especies presentes en el país se ha incrementado el estudio de las plantas con el fin de
buscar diferentes tipos de sustancias biológicas como lo son antioxidantes cuyo consumo
nos protegen frente a los radicales libres que pueden llevar a desarrollar enfermedades
cardiovasculares y tumorales (NewYork-Presbyterian, 2009).
Debido al aumento en la utilidad terapéutica de las plantas, la industria farmacéutica y la
investigación química se han propuesto el descubrir los componentes activos de las
diferentes especies vegetales con el fin de combatir la gran variedad de enfermedades
que hoy afectan a la humanidad, generando el aumento del uso de producto para el
control de enfermedades. (Portalfarma.com, 2012)
Actualmente la familia Piperaceae, presenta un gran número de especies que se localizan
en las zonas tropicales y subtropicales del mundo siendo el género Piper el más
estudiado, ya que cuenta con el mayor número de especies con diferentes actividades
biológicas comprobadas, como antimicrobianas, antifungica, antibacteriana,
antinflamatorio, anticarcinogénico, antioxidante entre otras. Químicamente, se han
encontrado alcaloides, amidas, lignanos, neolignanos y Terpenos. ( Parmar, y otros, 1997)
De esta manera, el presente trabajo de investigación realizó un aporte al conocimiento
químico y biológico de la familia Piperáceae en Colombia, por medio del estudio
fitoquímico de metabolitos fijos y la evaluación de la capacidad antioxidante de su extracto
y fracciones, así como el estudio de los componentes volátiles del aceite esencial de las
hojas de la especie vegetal Piper catripense.
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2. JUSTIFICACION
En nuestra cotidianidad, las diferentes actividades que realizamos y sus diversas
condiciones, hacen que día a día nuestro cuerpo sufra daños a las células que pueden
conducir a padecer enfermedades del corazón o cáncer.
Los antioxidantes son capaces de estimular el sistema inmunológico para ayudar a
combatir las infecciones, alteraciones del organismo, previene el daño celular y proteger
la piel del envejecimiento prematuro; los antioxidantes son sustancias naturales que se
encuentran en muchos alimentos, incluyendo frutas y verduras. Debido a estos beneficios,
se ha aumentado el uso de la medicina natural, lo cual nos ha favorecido ya que uno de
los recursos con el que contamos en nuestro país es la gran biodiversidad de flora,
permitiendo el estudio fitoquímico de diferentes especies vegetales. Una de las plantas
conocidas comúnmente en las regiones tropicales de Colombia como ¨desvanecedora¨
Piper catripense es utilizada con fines curativos, principalmente como antiinflamatorio,
ayuda a adelgazar y eliminar los quistes de ovario, a pesar de su uso popular en estas
regiones, no se tiene antecedentes científicos que comprueben su propiedad antioxidante
y su composición; por esta razón se hace meritorio realizar este estudio.
La especie Piper catripense, pertenece a la familia Piperáceae y al género Piper, esta
planta se encuentra distribuida en diferentes partes del mundo especialmente en
Colombia, algunas especies con características similares a esta planta han sido
estudiadas y se han caracterizado por producir una gran variedad de metabolitos
secundarios que han contribuido a diferentes estudios fitoquímicos, para la familia
Piperáceae los estudios científicos han demostrados la presencia de metabolitos
procedentes del ácido mevalónico entre ellos monoterpenos y sesquiterpenos,
metabolitos que provienen del ácido acético como los flavonoides y del ácido shikímico se
han encontrado existencias de metabolitos como lignoides, arilpropanoides, amidas, entre
otros. Los metabolitos más frecuentes aislados en esta familia y género son: amidas tales
como (piperidina y pirrolidina); aristolactamas y otros alcaloides, flavonoides como
flavonas, dihidroflavonas, dihidrochalconas y o-metilflavonoides. Estos metabolitos
anteriormente mencionados, han sido utilizados en la industria y en la medicina como
antifúngicos, analgésicos, antiinflamatorios, anticancerígenos, anti-parasitarios, entre
otros (Aricapa, 2011). De acuerdo con esto el género Piper constituye una fuente
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importante de especies vegetales con actividades biológicas, razón por la cual, resulta
meritorio contribuir al estudio químico y biológico de las hojas de la especie Piper
catripense ya que esta cuenta con escasos reportes científicos a nivel nacional.
2.1. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
La propuesta de grado titulada estudio fitoquímico de hojas de la especie vegetal Piper
catripense (Piperáceae) y evaluación de su capacidad antioxidante, plantea la siguiente
pregunta de investigación.
¿Cuál es la composición química de los metabolitos fijos y volátiles de las hojas de la
especie vegetal Piper catripense y presentan capacidad antioxidante sus extractos o
fracciones?
18
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Contribuir al estudio fitoquímico de las hojas de la especie vegetal Piper catripense
(Piperáceae) y evaluar su capacidad antioxidante.
3.2. OBJETIVOS ESPEIFICOS
Obtener extractos y fracciones de diferentes polaridades provenientes de hojas de la
especie Piper catripense.
Aislar, purificar y determinar la estructura química de los metabolitos secundarios
mayoritarios presentes en las hojas de la especie vegetal Piper catripense
Determinar la composición química del aceite esencial de hojas de la especie Piper
catripense.
Evaluar la capacidad antioxidante de extractos y fracciones obtenidos de hojas de la
especie Piper catripense.
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4. ESTADO ACTUAL DEL TEMA
4.1. FAMILIA PIPERÁCEAE
4.1.1. Características morfológicas de la familia Piperáceae
La familia Piperáceae comprende un número extenso de especies entre árboles, arbustos,
hierbas, lianas o bejucos que se encuentran en lugares oscuros y frescos de todo el
mundo, algunas especies son trepadoras, pueden presentar hojas simples, alternas,
olorosas en ocasiones salen en parejas o en grupos de más de dos en el mismo punto de
la rama, presentado una gran variación es en su forma y en el tamaño. Su tallo forma una
red de túbulos tendida por el vegetal en todas las direcciones, llamado sistema libero-
leñoso. Su reproducción puede ser bisexual o unisexual, presenta inflorescencia de tipo
espiga con raras excepciones, terminal, axilares o frente a las hojas. Su fruto es carnoso
que contiene varias semillas (Baya) o presenta una sola semilla (Drupa) y sus flores
pueden estar unidas al eje de la inflorescencia (pedúnculo) o pueden estar situadas en la
base de la inflorescencia (bráctea), no presenta pétalo. Tal como se observa en la figura
4-1 Ejemplar típico de la familia Piperáceae (Naturalista, 2009)
Figura 4-1 Características morfológicas de la familia Piperácea. (Naturalista, 2009)
20
4.1.2. Distribución de la familia Piperácea
La familia Piperaceae comprende unas 1.300 especies de los trópicos húmedos y cálidos
de todo el mundo, pero con centros de radiación en Sudamérica y Malasia como se
muestra en la figura 4-2. Constituida por 10 a 12 géneros entre los que se incluyen: Piper,
Peperomia, Trianaeopiper, Ottonia, Arctottonia, Macropiper, Manekia, Pothomorphea,
Sarcorhachis, Verhuellia y Zippeli.
En América del sur se encuentra Ecuador donde este se distribuyen aproximadamente 4
géneros y 400 especies, en Argentina se cuenta con 2 géneros y 30 especies
aproximadamente, en Perú se encuentran 3 géneros y alrededor de 830 especies, en
Brasil hay 5 géneros y cerca de 500 especies y en Colombia existen cerca de cuatro
géneros y 2500 especies. (Jara Beltrán, 2013)
Figura 4-2 Distribución geográfica de la familia Piperáceae
Los puntos verdes hacen referencia a la distribución de la familia Piperáceae (Trópicos, 2014)
4.1.3. Uso de la familia Piperácea
La familia Piperáceae es una fuente importante en el descubrimiento y desarrollo de
nuevos agentes antitumorales, antibacterianos y compuestos bioactivos novedosos,
donde estos tienen gran importancia económica, ecológica y medicinal, podemos
encontrar que esta gran variedad de plantas son utilizadas para enfermedades asociadas
21
con: las vías respiratorias (asma, bronquitis, y tos), el tracto digestivo (diarrea y dolor
abdominal), también se han diagnosticado que la composición de estas plantas cuenta
con ciertas actividades como: antiinflamatoria (reumatismo), antimicrobiana
(antibacteriana, antifúngica y la cicatrización de heridas) y antileucémica. (Aricapa, 2011)
Una de las especies más representativas de la familia Piperácea es la Piper nigrum más
conocida comúnmente como la Pimienta Negra donde es utilizada como condimento por
sus frutos aromáticos y picantes gracias a la presencia de piperina (Ciccio, 1996).Otras
especies de esta familia han sido motivo de estudio fitoquímico tanto en Colombia como
en otras partes del mundo por contener gran variedad usos entre estas estudios podemos
hablar de la raíz de Piper methysticum la cual es usada como bebida ya que esta posee
una acción sedante, pero hay que tener en cuenta que en altas cantidades es anestésica
e hipnótica esta bebida es utilizada en Asia (Novara, 1998)
En las islas del Pacífico a las raíces de Piper methysticum se les conoce comúnmente
como kava, allí preparan una bebida refrescante, que es consumida habitualmente como
tranquilizante para combatir la ansiedad.
Otra de las especies más conocidas es la Piper auritum kunth de esta especie vegetal sus
hojas son de gran utilidad por ejemplo para las afecciones de la piel; también se emplea
para padecimientos como inflamación vaginal, infección de la matriz y para acelerar el
parto, para este último lo preparan utilizando las hojas remojadas en alcohol. Así mismo
se usa para enfermedades asociadas con el aparato digestivo, como dolor de estómago
falta de apetito, diarrea e inflamación de estómago, se dice además que es un buen
agente para la bronquitis, tos y para bajar fiebre. (Plantas Colombianas, 2010)
4.1.4. Actividades biológicas de la familia Piperácea
Algunos usos explorados y reportados en la literatura para especies de la familia
Piperáceae son: antioxidante, antibacteriano, antifúngico, antiparasitario, anti
cancerígeno, analgésico, antiinflamatorio, antiasma, hipotensor, insecticida.
Adicionalmente, varias especies de la familia Piperáceae han presentado actividad contra
protozoos del género Leishmania. En la tabla 4-1 se presentan algunas actividades
biológicas de especies pertenecientes a la familia Piperaceae. (Cardona Galeano, y otros,
2013)
22
Tabla 4-1 Actividad biológica de algunas especies de la familia Piperáceae.
Referencias Actividad biológica Órgano de la
planta y/o
extracto
metabolito
evaluado
Especie
(Portet B, 2008)
Actividad contra
Plasmodium
falciparum
Extracto de n-
Hexano de las
hojas
Piper
hostmannianum
var. Berbicense
(Soo, Eun , Sik , Yoon ,
Song, & Yun, 2002)
Actividad insecticida Hojas, tallos y
espigas maduras
(con frutos y
semillas)
Piper
tuberculatum
(Alvaro, Mendoza,
Pachon, Cardona,
Delgado, & Cuca, 2008)
Actividad antifúngica
contra cepas hongos
Cladosporium
sphaerospermun
Hoja,s frutos y
tallos
Piper
Arboreum
(Nakamura, y otros, 2006) Actividad
antimicrobiano,
antileishmaniasis y
antitripanossoma
raíces y hojas Piper regnellii
4.1.5. Estudios químicos de la familia Piperácea
Dentro de la familia Piperáceae, los metabolitos mayoritarios más destacados son
polifenoles como chalconas, flavonas y flavononas, además de alcaloides, amidas,
lignoides, terpenos y esteroides.
De acuerdo con estudios realizados se han aislado metabolitos pertenecientes a
diferentes géneros como lo son: Sarmentosina (1), Chavibetol (2), Asaricina (3),
Sarmentina (4), Decurrenal (5), Eupomatenoide 5 (6), Sakuranetina (7), Galgravin (8),
Ácido crasinervico (9), Hostmaniane (10), piperina (11), aduncamida (12), piplartina (13),
23
N
O
O
CH3
CH2
OH
O
(1) (2)
O
O CH3
OCH3
NCH3
O
(3) (4)
OH
O
CH3
O
H
CH3
O
OH
CH3
(5) (6)
CH3
O O
O
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
O
O
O
O
CH3
CH3
(7) (8)
O OCH3
CH3
CH3CH3OOH
O OCH3
OH
CH3
CH3
OH
(9) (10)
24
O
ON
O
(11)
OH
OCH3
NH
O
OH
OCH3
CH3
CH3O
OCH3
ON
O O
(12) (13)
4.2 GENERO PIPER
4.2.1. Características morfológicas del género Piper
Estas plantas son comúnmente arbustos, enredaderas, hierbas o árboles, en general
menores de 2 metros distribuidas a lo largo de los trópicos, con cerca de 1000 especies,
caracterizadas por presentar una madera suave, hojas simples, alternas con la base de
los pecíolos (órgano de la hoja que la une a la rama que la sostiene) envolviendo el tallo,
nerviación generalmente ascendente, con o sin indumento e inflorescencias en amentos
(forma de racimo) pedúnculo o erectos de color blanco (UNAD, 2016). Los tallos de la
mayoria de las especies presentan nudos, engrosados y prominentes; su fruto es una
drupa a menudo carnosa, y que contiene una semilla de variada forma y tamaño. La
forma del fruto y la presencia o ausencia de un estilo son también caracteres del genero.
Las flores se organizan en inflorescencias espiciformes (aspecto de espiga),
generalmente opuestas a las hojas y raramente agrupadas en la inflorescencia en la que
todas las flores se insertan en un mismo punto de su eje (Biblioteca Digital rjd, 2016)
25
Figura 4-3 Características morfológicas de especies del género Piper. (Naturalista, 2009)
4.2.2. Distribución del género Piper
A este género pertenecen alrededor de 800 especies en el neotrópico, principalmente en
5 áreas del continente americano: la Costa Pacífica de Colombia y Ecuador, el oeste de la
Amazonía del Perú y Ecuador, la Costa atlántica del Brasil y los Andes de Venezuela.
(Aricapa, 2011). En Ecuador este género está ampliamente distribuido, pero no se
conoce el número de especies representadas; sobre 2400 m.s.n.m se han registrado 43
especies, (Ulloa & Moller, 1994) Colombia es uno de los países con mayor distribución de
especies pertenecientes a este género como se puede evidenciar en la figura 4-4, pues se
han encontrado en gran parte del territorio Colombiano, en la región Andina,
principalmente en bosques húmedos y tropicales y el norte del Perú, el sur de México y la
península de Yucatán.
26
Figura 4-4 Distribución geográfica del género Piper
Los puntos verdes hacen referencia a la distribución de la genero Piper (Trópicos, 2014)
4.2.3. Uso del género Piper
las especies del género Piper son utilizadas para el tratamiento de las enfermedades
parasitarias, específicamente en la malaria y la leishmaniasis en la medicina tradicional
bolivariana, también son usadas estas plantas como bebida refrescante y relajante, Las
raíces y frutos son útiles para tratar el asma, la bronquitis, el dolor de abdomen, como
estimulante y para curar afecciones hemorroidales, En América Latina, la especie Piper
amalago es usada para aliviar ciertos dolores de pecho y se usa como agente
antiinflamatorio.
Estudios han demostrado que las raíces y frutos de Piper chaba son útiles para tratar el
asma, la bronquitis, el dolor de abdomen, como estimulante y para curar afecciones
hemorroidales; en China utilizan varias de las especies de este género como la especie
vegetal Piper brachystachyum presenta propiedades insecticidas y los tallos de la Piper
futukadsura, son ampliamente usados para el tratamiento del asma. (Flores Quisbert,
2007)
4.2.4. Actividades biológicas del género Piper
27
En el chocó y en toda Colombia son muchas las especies del género Piper que son
utilizadas como medicinales con actividad antiinflamatoria o antibiótica y antimicrobiana.
(Pino, 2008). Algunos usos explorados y reportados en la literatura para diversas especies
de Piper son: antimutagenico, antioxidante, antibacteriano, antifúngico, antiparasitario,
anticancerígeno, analgésico, antiinflamatorio, anti-asma, hipotensor, insecticida como se
observa en la Tabla 4-2. Adicionalmente, varias especies del género Piper han presentado
actividad contra protozoos del género Leishmania los cuales son biológicamente activos
contra agentes patógenos que afectan el bienestar del hombre, (Cardona Galeano, y
otros, 2013)
Tabla 4-2 Actividad biológica de algunas especies del género Piper.
Especie
Órgano de la planta
y/o extracto
metabolito evaluado
Actividad biológica Referencias
Piper hispidum extracto etanolico de
las inflorescencias
Anti-fúngico contra
ciadosporium
sphaerospernum
(Navickiene HM,
2000)
Piper
tuberculaturn
Extractos acuoso,
DCM:MeOH, y EtOH de
hojas, tallos y espigas
maduras (con frutos y
semillas)
Anti-fúngico contra
ciadosporium
sphaerospernum
(Navickiene HM,
2000)
Piper
sarmentosum
Extracto acuoso de
hojas
Analgésico,
antiinflamatorio
anticarcinogeno
(Zakaira,
Patahuddin,
Mohamad, Israf,
& Sulaiman,
2009)
Piper cápense Hojas y tallos Antiparasitario (Mohamed, y
otros, 2009)
Piper dilatatum Hojas Anti-fúngico contra
ciadosporium
(Terreaux,
Gupta, &
28
Especie
Órgano de la planta
y/o extracto
metabolito evaluado
Actividad biológica Referencias
sphaerospernum Hostettmann,
1998)
Piper longum Frutos secos Insecticida-acaricida (Soo, Eun , Sik ,
Yoon , Song, &
Yun, 2002)
Piper Holtonii Extracto etanolico de
hojas
Antiplasmodica (Rojas , Garavito
, & Rincón, 2013)
4.2.5. Estudios Quimicos del género Piper
La química de las especies de este género ha sido ampliamente investigada a nivel
mundial. Los resultados encontrados han permitido reconocer al género Piper como el
más bioactivo de la familia Piperáceae, se han identificado cerca 667 compuestos
diferentes, distribuidos en 49 ligninas, 79 neoligninas, 97 terpenos, 39 propenilfenoles, 15
esteroides, 18 kawapirones, 17 chalconas/dihidrochalconas, 16 flavonas, 6 flavononas, 4
piperolidas, y 146 miscelaneos (Dyer Lee et al., 2004) y recientemente en 2012 se
reportaron 277 alcaloides/amidas; (Nascimento, Paula, David, & David, 2012)
De acuerdo con estudios realizados se han aislado gran diversidad de metabolitos
pertenecientes a diferentes géneros Piper como los son pelitorina (15) y guineensina (16),
isobutilamidas como Piperovatina (17) y Piperlonguminina (18) Piperina (19), kawaina
(20), dihidrokawaina (21), yangonina (22), demetoxiyangonina (23), metisticina (24), y
dihidrometisticina (25), (Parmar, y otros, 1997)
CH3
O
NH
CH3
CH3
CH3
OO
NH
CH3
CH3
(15) (17)
29
O
O
O
NH
CH3
CH3
(16)
O
ONH
O
CH3
CH3
O
ON
O
(18) (19)
O
OCH3
O
O
OCH3
O
(20) (21)
CH3
O
OCH3
O
O
O
OCH3
O
(22) (23)
30
O
OCH3
OO
O
O
OCH3
OO
O
(24) (25)
La mayoría de las especies del género Piper pueden presentar algunos terpenos en sus
aceites esenciales, principalmente del tipo monoterpenos y sesquiterpenos que varía en
sus núcleos. Se pueden encontrar en estos aceites los siguientes metabolitos como el
dilapiol (26), Miristicina (27), Peperitona (28), Apiol (29), germacreno D (30), fenaldreno
(31), linalol (32). (Parmar, y otros, 1997)
O
OCH2
O
O
CH3
CH3
O
OCH2
OCH3
CH3 CH3
CH3
O
(26) (27) (28)
O
O
OCH3
CH3
CH2
CH2
CH3
CH3
CH3
CH3 CH3
CH2
(29) (30) (31)
CH3
CH3 CH2
CH3
OH
(32)
31
4.3. ESPECIE Piper catripense
4.3.1. Características morfológicas de la especie Piper catripense
Esta especie se encuentra comúnmente como hierba o arbusto, sus hojas son
compuestas, opuestas (dos hojas por nudo); presenta un tallo leñoso, con protuberancias
de donde salen las ramas o las hojas (nudos), tiene haces vasculares, Las flores se
organizan en inflorescencias espiciformes (aspecto de espiga), caracterizadas por el
crecimiento indefinido o indeterminado, no presenta frutos como se observa en la figura 4-
5.
Figura 4-5 Características morfológicas de la especie Piper catripense.
Su clasificación taxonómica se muestra en la tabla 4-3.
Tabla 4-3 Clasificación de la especie vegetal Piper catripense.
REINO PLANTAE
División Angiospermae
Clase Magnoliopsida
Orden Piperales
Familia Piperáceae
Género Piper
Especie Piper catripense
32
4.3.2. Distribución de la especie Piper Catripense
La especie vegetal Piper catripense se encuentra distribuida en Colombia en los
departamentos de Antioquia, Caldas y Choco como se ilustra en la figura 4-6.
Figura 4-6 Distribución de la especie Piper catripense.
Los puntos negros hacen referencia a la localización de la especie Piper catripense.
4.3.3. Uso de la especie Piper Catripense
La planta desvanecedora Piper catripense es ampliamente usada en el tratamiento de
procesos inflamatorios, contusiones, tumores generales y cáncer. (Ochoa A. M., 1998)
sus hojas son usados tradicionalmente en el tratamiento de procesos inflamatorios,
contusiones, varices, reumatismo y heridas. Además, es un excelente descongestionante
y activador del sistema circulatorio, muscular y articular (Ecojardin, 1999)
4.3.4. Actividades biológicas y estudios químicos de la especie Piper Catripense
Esta especie no cuenta con estudios químicos ni biológicos excepto por los usos descritos
anteriormente; razón por la cual se hace meritoria para realizar este estudio fitoquímico y
biológico.
33
4.4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
4.4.1. Antioxidantes
Las moléculas oxidadas y fragmentos moleculares más corrientes son los radicales libres.
Todos los radicales libres llevan una innumerable cantidad de electrones que les hacen
inestables y altamente reactivos. Para estabilizarse, les quitan electrones a otras
moléculas. Esto hace que haya más moléculas inestables, provocando una reacción
dañina en cadena de radicales libres, oxidando muchas estructuras biológicas,
dañándolas. Es lo que llamamos el daño oxidativo, importante causa del envejecimiento,
el cáncer, la ateroesclerosis, los procesos inflamatorios crónicos y las cataratas, que son
las más características. (Casa Piá, 2016).
Un antioxidante es una molécula que es capaz de retrasar o prevenir el deterioro, daño o
destrucción provocados por una oxidación (Youngson, 2003). Se encuentran naturalmente
en el organismo y en ciertos alimentos pueden bloquear parte de este daño debido a que
estabilizan los radicales libres, actuando algunos a nivel intracelular y otros en la
membrana de las células, siempre en conjunto para proteger a los diferentes órganos y
sistemas. Existen diferentes tipos de oxidantes:
Antioxidantes endógenos: mecanismos enzimáticos del organismo (superóxido dismutasa,
catalasa, glutatión peroxidasa, glutatión y la coenzima Q-). Algunas enzimas necesitan
cofactores metálicos como selenio, cobre, zinz y magnesio para poder realizar el
mecanismo de protección celular.
Antioxidantes exógenos: son introducidos por la dieta y se depositan en las membranas
celulares impidiendo la lipoperoxidación (vitaminas E y C y del caroteno) (Federación
Española del Café, 2012)
4.4.2. Modelos de evaluación de la capacidad antioxidante
La capacidad antioxidante de un compuesto puede evaluarse in vitro por medio de
experimentos sencillos que examinan directamente dicha habilidad y que a la vez evalúan
el posible efecto prooxidante sobre diferentes moléculas. (Martinez Vasquez, Salas
Coronado, & Cardador Martinez, 2007)
34
En la práctica se realizan muchos modelos de test in vitro, para evaluar la actividad
antioxidante de la muestra de interés; sin embargo, es necesario considerar que los
modelos presenten diferentes variaciones que puede dificultar un poco la comparación de
los resultados entre un método y otro.
Con base a las reacciones químicas, la gran mayoría de los ensayos para determinar de
capacidad antioxidante pueden ser divididos en dos categorías:
Ensayos basados en la reacción por transferencia de átomos de hidrógeno
Ensayos basados en la reacción por transferencia de electrones
Tabla 4-4 Clasificación de los modelos de ensayo in vitro (Tovar del Rio & Mosquera, 2013)
ENSAYO CATEGORIA
Acido 2,2′-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico ( ABTS)
Ensayos basados en la transferencia de electrones
1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH)
Poder de reducción antioxidante del hierro (FRAP)
N,N- dimetil-p-fenilendiamina (DMPD)
Capacidad de reducción antioxidante del cobre (CUPRAC)
Capacidad de absorción del radical oxígeno (ORAC)
Ensayos basados en la transferencia de átomos de hidrógeno
Parámetro antioxidante de captura de radicales (TRAP)
Inhibicón de la oxidación del ácido linoleico
Inhibición de la oxidación de los lipido de baja densidad (LDL)
35
4.4.3. Método 1,1-difenil-pricrilhidrazil (DPPH)
El ensayo DPPH permite evaluar la capacidad de sustancias frente al radical libre estable
2,2-difenil-1- picrilhidracilo (DPPH) en una solución metanólica que tiene un color violeta
intenso que se pierde progresivamente cuando se añade la muestra que contiene
antioxidantes. Así, el grado de decoloración de la solución indica la eficiencia de la
capacidad secuestrante de la sustancia agregada. La decoloración del radical se
determina a 517 nm y la cuantificación se realiza empleando soluciones patrón de ácido
gálico o ácido ascórbico. En la Figura 4-7 se observa la reacción del DPPH con un agente
antioxidante.
Figura 4-7 Esquema de reacción DPPH.
El DPPH no reacciona con flavonoides que no contengan grupos –OH en el anillo B al
igual que con los ácidos aromáticos que solo contiene un grupo –OH. Pese a sus
limitaciones, es un método adecuado para medir la capacidad antioxidante en alimentos y
extractos vegetales, mientras que no es adecuado para la determinación de la capacidad
antioxidante del plasma o suero, ya que las proteínas precipitan con el metanol del medio
de reacción. (Giraldo Vasquez, 2011)
36
5. METODOLOGIA
El presente trabajo de investigación se basó en tres etapas extracción, aislamiento e
identificación de los metabolitos secundarios mayoritarios de hojas de Piper catripense, la
determinación de la composición química del aceite esencial de las hojas y se evaluó la
capacidad antioxidante de algunas fracciones obtenidas.
5.1. GENERALIDADES
En el estudio fitoquímico de las hojas de la especie Piper catripense se emplearon
métodos cromatográficos, espectroscópicos y espectrométricos convencionales utilizados
en el aislamiento, purificación y elucidación estructural de metabolitos secundarios.
5.2. METODOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRAFICA
Las fracciones obtenidas fueron separadas empleando las técnicas de cromatografía en
columna (CC), cromatografía en columna flash (CF) y cromatografía en capa delgada
(CCD) desarrolladas con diferentes sistemas de fase móvil; para cada una de las
subfracciones obtenidas se monitorearon por CCD utilizando cromatoplacas de aluminio
en sílica gel 60G F-254 Merck, empleando como reveladores luz ultravioleta y vainillina en
ácido sulfúrico y para la CC se utilizó sílica gel 60 Merck (60-200 Mesh).
Para la determinación de las mezclas se utilizó un cromatógrafo con detector selectivo de
masas SHIMADZU QP2010 plus, ubicado en el laboratorio de química de la Universidad
Distrital Francisco José de Caldas. Las mezclas fueron diluidas en cloroformo y se
insertaron en el sistema; empleando una columna capilar SHRXi – 5MS de 30 metros con
una longitud x 0,25 mm x 0,25 µm y una inyección en modo Split (10:1), el gas de arrastre
utilizado fue helio (grado 5.0) con flujo constante de 1,2mL/min. La temperatura inicial de
la columna fue de 50 °C por 2 minutos, luego se incrementó 15°C por minuto hasta llegar
a 200°C manteniéndose por 2 minutos, incrementando 10°C por minuto hasta llegar
finalmente a 300°C manteniéndose por 10 minutos para un tiempo total de análisis de 34
minutos, la temperatura de la línea de transferencia fue de 275°C y de la cámara de
ionización de 230°C.
37
La determinación de la composición química relativa del aceite esencial se realizó por
cromatografía de gases acoplada a masas (CG-EM), el aceite fue diluido en cloroformo,
empleando una columna capilar SHRXi-5MS de 30 metros de longitud x 0,25 mm x 0,25
μm con una inyección en modo Split (10:1), el gas de arrastre utilizado fue helio (grado
5.0) con flujo constante de 1,2mL/min. La temperatura inicial de la columna fue de 40 ºC
manteniéndose por 5 minutos, luego incremento 4 ºC por minuto, hasta llegar a 160 ºC,
aumentado 2,50 ºC por minuto, hasta llegar a 220 ºC aumentando 8 ºC por minuto, hasta
llegar finalmente a 280 ºC manteniéndose por 4 minutos para un tiempo total de análisis
de 70.5 minutos. Los espectros de masas se obtuvieron por ionización electrónica (IE) de
energía de 70 eV. Las temperaturas de la cámara de ionización y de la línea de
transferencia fueron de 230 y 275 ºC, respectivamente. El gas de arrastre utilizado fue
helio (grado 5.0), con flujo constante de 1,2 mL/min.
5.2.1 Técnicas de elucidación estructural y caracterización de los metabolitos
secundarios aislados
La elucidación estructural y caracterización de los compuestos aislados se llevó a cabo
mediante el uso de la técnica de espectrometría de masas (EM) con el fin de poder
identificar el tipo de metabolito secundario presente en la especie vegetal Piper
catripense, Los espectros de masas de los compuestos aislados, se tomaron en el equipo
SHIMADZU MS QP2010 plus, ubicado en el laboratorio de Universidad Distrital Francisco
José de Caldas, el cual se encuentra dotado con una sonda de inserción directa y un
analizador de masas cuadrupolar. Utilizando un modo de ionización electrónica (IE) a 70
eV y una temperatura de la cámara de ionización de 230 ºC mediante la comparación de
sus espectros con los existentes en la base de datos de la librería NIST 08 y los datos
reportados en la literatura.
5.3. RECOLECCION DE LA MUESTRA
Como se muestra en la Figura 5-1, la especie vegetal Piper catripense se encuentra
distribuida en el departamento del Chocó (04º00’50’’ y 08º41’32’’ de latitud norte y los
76º02’57’’ y 77º53’38’’ de longitud oeste), Lugar en donde se realizó la recolección del
material vegetal para la investigación. Se recolectaron 3 kilogramos de hojas de la
especie Piper catripense, se secaron a temperatura ambiente y fueron reducidas de
tamaño para su posterior extracción.
38
Figura 5-1 Mapa de localización del área de recolección de la especie. Colombia, Departamento Choco
Tomado de. https://prezi.com/7kexec7s7zvm/copy-of-el-choco/
5.4. MARCHA FITOQUÍMICA PRELIMINAR
Para el estudio y caracterización de los principales metabolitos secundarios presentes en
las hojas de las especies Piper catripense, se preparó un extracto etanólico por
maceración en frío con 50 ml de etanol al 96% y 10 g de hojas secas pulverizadas de la
especie vegetal Piper catripense. A partir de este extracto se efectuaron las diferentes
pruebas de identificación utilizando controles positivos para cada grupo de metabolitos
presentes en la especie vegetal. El análisis se basó en el Manual de prácticas de
laboratorio de farmacognosia de la Universidad de Antioquia y la guía de pruebas
preliminares cualitativas de acuerdo al protocolo modificado de Antonio Sanabria
(Sanabria, Lopez, & Gualdrón, 1997). Como lo muestra la Figura 5-2
39
Figura 5-2 Diagrama Marcha Fitoquímica Preliminar para las Hojas de la especie Piper catripense
5.5. EXTRACCIÓN CON ETANOL, FRACCIONAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE es
METABOLITOS SECUNDARIOS PRESENTES EN HOJAS
Para extraer los diferentes metabolitos secundarios presentes en las hojas de la Piper
Catripense, se realizó la preparación del extracto con 400 g de hojas secas y trituradas en
molino empleando 700 ml de EtOH al 96% durante varios días y agitación en tiempos
parciales utilizando la técnica de maceración en frio. En la preparación de este extracto se
obtuvieron 0.0167 g de un sólido color blanco el cual se denominó compuesto PcH.1.
El extracto etanolico obtenido (E.EtOH.Pc.H) fue floculado con H2O en una relación 1:1
(H2O: E.EtOH.Pc.H) por un tiempo de 24 horas con el fin de eliminar interferencias e
impurezas, se filtró y concentro a presión reducida a 40°C, posteriormente se realizó el
fraccionamiento continuo liquido-liquido. El porcentaje de rendimiento neto que presento
la extracción por maceración en frio con EtOH fue del 12 % a partir del material vegetal
seco.
40
5.6 OBTENCION DE FRACCIONES
El extracto etanólico (E.EtOH.Pc.H) fue empleado para el fraccionamiento continuo
liquido-liquido, utilizando solventes de polaridad creciente; a partir de esto se obtuvieron la
fraccion de hexano (Fx.Hex.Pc.H 0,5672g 0,94%), diclorometano (Fx.DCM.Pc.H 1,1601g
1.93%), acetato de etilo (Fx.AcOEt Pc.H 1,5327g 2.61%) y un residuo hidroalcoholico
(94,52%).El proceso de fraccionamiento y los porcentajes de rendimiento para cada
fracción se observan en la Figura 5-3
Figura 5-3 Diagrama Obtención de extractos fracciones de la especie Piper catripense
5.5.2. Fracción hexano de hojas de Piper catripense (Fx.Hex.Pc.H)
A partir del extracto etanolico (E.EtOH.Pc.H) se realizó el fraccionamiento continuo
liquido-liquido con hexano, del cual se obtuvo 0,3 g de un sólido de color amarillo claro de
la Fx.Hex.Pc.H el cual fue monitoreado por CCD, empleando cromatoplacas de aluminio
en sílica gel 60G F-254 Merck, como fase móvil se utilizó Hex:AcOEt 9:1 y se empleó
como revelador vainillina en H2SO4 y Luz ultravioleta, debido a su baja complejidad se
analizó la fracción por (CG-EM), la cual fue denominada Mezcla PcH.2.
5.5.3. Fracción diclorometano de hojas de Piper catripense (Fx.DCM.PcH)
0,7 g de la Fx.DCM.Pc.H fueron separados empleando el método de CC, como fase móvil
se utilizó DCM:AcOEt 8:2 obteniendo 9 fracciones. De la fracción numero 1
41
(Fx1.DCM.Pc.H) se obtuvieron 0,566 g de un sólido el cual fue denominado Mezcla PcH.3
y de la fracción 3 (Fx3.DCM.Pc.H), se obtuvieron 0,289 g de un sólido el cual se
denominó Mezcla PcH.4. El procedimiento se ilustra en la figura 5-4
Figura 5-4 Diagrama Obtención de mezclas PcH.3 y PcH.4 de la fracción Diclorometano especie Piper catripense
5.5.4. Fracción acetato de etilo de hojas de Piper catripense (Fx.AcOEt.Pc.H)
0,3 g de la Fx.AcOEt.Pc.H, fueron separados utilizando el método de CC, como fase
móvil se empleó AcOEt:DCM 9:1, obteniendo 7 fracciones. Las sub-fracciones número 2 y
número 5 se separaron cada una por el método CC, empleando diferentes fases móviles,
sin embargo a través de este método no se logró purificar la fracción.
Se tomaron 0,2 g de la Fx.AcOEt.Pc.H fueron separados por el método CF utilizando el
equipo isolera ubicado en el laboratorio de química de la Universidad Distrital Francisco
José de Caldas. Empleando como eluyente AcOEt:DCM 7:3 y cartucho de sílica RP18,
obteniendo 35 fracciones las cuales fueron monitoreadas por CCD, se empleó
cromatoplacas de aluminio en sílica gel RP18 Merck como fase móvil se utilizó
42
AcOEt:DCM 7:3 y empleando como revelador Luz ultravioleta, debido a su complejidad no
se continuo con el estudio de esta fracción.
5.6. EXTRACCION Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE LOS ACEITES ESENCIALES
5.6.1 Obtención de aceites esenciales (AE) de hojas de Piper catripense
El aceite esencial fue obtenido a partir de hojas frescas de la especie vegetal Piper
catripense (232 g) por extracción por arrastre de vapor, obteniéndose finalmente 7 mL de
aceite con un porcentaje de rendimiento total del 3,0%. La composición química de los AE
se determinó a partir de CG-EM y la identificación se hizo mediante el cálculo de los
índices de retención (IR) y comparación con los espectros de masas de la base de datos
de la librería NIST 08.
5.6.2 Identificación de los compuestos de AE de Piper catripense
La identificación de los AE se realizó por medio del calculó de los IR experimentalmente,
los IR se calcularon teniendo en cuenta los tiempos de retención de una serie homologa
de patrones de hidrocarburos desde C7 hasta C24, analizados por CG-EM bajo las
mismas condiciones que los AE.
Los valores se calcularon aplicando la Ecuación 1:
Ecuación 1. Cálculo de IR
(Goodner, 2008)
Dónde:
IR: Índice de retención del compuesto de interés X.
n: Número de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés
X.
N: Número de átomos de carbono del n-alcano que eluye después del compuesto de
interés X.
tRX: Tiempo de retención del compuesto de interés X.
tRN: Tiempo de retención del n-alcano que eluye después del compuesto de interés X.
43
tRn: Tiempo de retención del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés X.
5.8. EVALUACION DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
5.8.1 Preparación de la solución DPPH
Para el ensayo se preparó la solución del radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH•)
a una concentración de 10 mM en metanol grado analítico. La solución fue protegida
totalmente de la luz para evitar su degradación.
5.8.2 Preparación de la curva de referencia
A partir de un stock de 100 mM, se tomó un volumen 16 ml de solución DPPH y se diluyó
con metanol hasta alcanzar una concentración de 10mM y una absorbancia cerca a 1,00.
Posteriormente se tomaron alícuotas de 2.5 µL, 5 µL, 10 µL, 15 µL, 20 µL, 25 µL, 30 µL,
35 µL del extracto etanolico y de las fracciones respectivamente, despues se llevó a un
volumen de 50 µL el cual fue completado con metanol, finalmente se tomaron 170 µL de
DPPH y se colocó en cada uno de los pozos, las medidas se realizaron por triplicado a
una longitud de onda de 520 nm, y el porcentaje de inhibición se calculó con base en la
ecuación 2. Las absorbancias se registraron a los 30 minutos respectivamente, después
de agregar el compuesto antioxidante DPPH.
5.8.3. Cuantificación de la capacidad antioxidante
Se evaluó de forma cuantitativa la capacidad de los antioxidantes para neutralizar los
radicales libres que tiene el extracto etanólico y las fracciones de las hojas de la Piper
catripense, en este caso el compuesto DPPH presenta una intensa coloración violeta, el
cual absorbe radiación a 520 nm, permitiendo determinar las concentraciones optimas de
la inhibición mediante métodos espectrofotométricos. Se utilizaron microplacas con un
total de 96 pozos de 300 μL c/u. Se prepararon soluciones del extracto y fracciones secos
a una concentración 25 mg/mL., para cada ensayo se realizaron diluciones en serie a (3,
6, 11, 17, 23, 28, 34 y 40 ppm respectivamente), posteriormente se leyó la absorbancia a
520 nm en un equipo Accu Reader 2000 ubicado en el laboratorio de química de la
Fundación Universitaria Juan N. Corpas, después de un periodo de incubación de 30
minutos y en la oscuridad. Se utilizó como control de ácido gálico en solución metanólica a
las mismas condiciones de lectura, protocolo modificado y estandarizado en el laboratorio
44
de química de la Fundación Universitaria Juan N. Corpas (Sharma et al, 2010; Martínez,
2014). El porcentaje de inhibición del radical DPPH, se calculó utilizando la siguiente
ecuación:
100*%BlancoA
MuestraABlancoADPPHdelinhibiciónde
Ecuación 2. Cálculo % de inhibición DPPH
Dónde:
A: corresponde a la absorbancia.
45
6. RESULTADOS Y ANALISIS
A continuación se presenta los resultados obtenidos del trabajo de investigación
denominado “ESTUDIO FITOQUIMICO DE HOJAS DE LA ESPECIE VEGETAL Piper
catripense (PIPERACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD ANTIOXIDANTE” de
acuerdo al estudio químico y biológico realizado.
6.1. MARCHA FITOQUÍMICA PRELIMINAR
La MFP se realizó teniendo en cuenta patrones de comparación de diferentes tipos de
metabolitos secundarios para este estudio. Los resultados se encuentran consignados en
la Tabla 6-1.
Tabla 6-1 Marcha fitoquímica preliminar del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper catripense
METABOLITOS SECUNDARIOS
ANÁLISIS PATRÓN DE CONTROL
RESULTADO
FLAVONIODES
Shinoda
Quercetina
+
Rosenhein +
Leucoantocianidinas -
TANINOS
Cloruro férrico Digitalis purpurea
+
Acetato de plomo -
Gelatina – sal +
QUINONAS
Borträger-Kraus
Antrona
-
Comportamiento ante ácido y donador de
electrones -
Rodamina y amoniaco -
Hidrosulfito de sodio +
CUMARINAS
Hidroxamato férrico
7-Hidroxicumarina
-
Erlich -
Fluoresencia +
46
METABOLITOS SECUNDARIOS
ANÁLISIS PATRÓN DE CONTROL
RESULTADO
SESQUITERPENLACTONAS
Hidroxamato férrico Manzanilla -
SAPONINAS Espuma
Quinua -
Rosenthaler -
CARDIOTONICOS
Balijet
Diente de león
+
Tollens -
Antrona +
Molish +
CAROTENOIDES Salkowski Zanahoria +
ALCALOIDES
Valser
Cinconina
+
Mayer -
Dragendorrf +
Schleiber +
Wagner +
ESTERIODES Y TRITERPENOS
Liebermann – Burchard
Colesterol
+
Dienos homoanulares +
*(-) resultado negativo (+) resultado positivo
Como se observan en la tabla 6-1, el extracto etanolico de las hojas de la especie Piper
catripense, presento prueba positiva para los metabolitos secuandarios de tipo
flavonoides, taninos, cardiotonicos, carotenoides, alcaloides, esteroides y triterpenos. Por
el contrario y presento prueba negativa a los siguientes metabolitos secundarios:
quinonas, cumarinas, sesquiterpenlactonas y saponinas.
Los resultados obtenidos están de acuerdo con reportes para las especies que ha
mostrado que la P.crassinervium, P. pesaresanum (Aricapa, 2011), P. tenuistylum, P.
lagenaebaccum (Orbe Saavedra & Tuesta Pinedo, 2013), P. aequaleii ( Garcia Paz ,
2011) P. bogotensis, P.tuberculatum jacq, P. rediculata, P. mariquitense L. y P. aduncum
L (Calle, 2017) presentan los resultados obtenidos en la identificacion de los metabolitos
secuandarios de las hojas de la especie Piper catripense
47
El genero piper se caracteriza por la presencia de diferentes tipos de metabolitos
secundarios, entre los que se destacan las amidas, flavonoides, kavapirona, lignanos,
neolignanos, piperolidos, propenilfenoles y terpenos. Algunos metabolitos aislados como
isobutilamidas pelitorina y guineensina fueron aisladas de la especie Piper nigrum que
presento actividad insecticida contra Culex pipiens, Aedes aegypti y A. togoi (Samuel,
Oliver, coetzee, & Brooke, 2016). De la especie P. hostmannianum var. Berbicense, se
han aislado flavonas como Metillinderina que presentaron actividad antimalarica (Portet et
al., 2007).
6.2 METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS
La purificación por cromatografía en columna CC del extracto etanolico y las fracciones de
hexano, diclorometano y acetato de etilo, obtenidas a partir del extracto etanolico total de
las hojas de la Piper catripense condujeron al aislamiento e identificación de un
compuesto amino fenólico (Compuesto PcH.1) el cual fue identificado como
acetaminofén y tres mezclas, la primera conformada por 3 sesquiterpenos (Mezcla
PcH.2). β-Eudesmol, Cedran-8,13-diol y Veridiflorol La segunda mezcla está conformada
por un aldehído y un hidrocarburo (Mezcla PcH.3) Piperonal y Tetratetracontano La
tercera mezcla compuesta por 3 – butilindolizidina y Cubebinolide (Mezcla PcH.4) un
alcaloide y un lignano.
6.2.1. Elucidación estructural del compuesto PcH.1
Se obtuvo 0,167 g de un compuesto (PcH.1) sólido de color blanco, soluble en acetato de
etilo y cloroformo. La correspondiente comparación de los espectros de masas con la
librería NITS08, permitió la identificación del compuesto acetaminofén con un porcentaje
de coincidencia de 95%, la corriente iónica total (TIC) del compuesto muestra un señal
con un tiempo de retención de 17.723 minutos, como se observa en la figura 6-1
48
Figura 6-1 Corriente iónica total (TIC) de la Compuesto PcH.1.
El espectro de masas y las posibles rutas de fragmentación del acetaminofén, se ilustran
en la figura 6-2 y 6-3 respectivamente. El ion molecular 151 m/z presenta una intensidad
relativa del 45%, un pico base de 109 m/z, y formula molecular C8H9NO2
35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 100.0 105.0 110.0 115.0 120.0 125.0 130.0 135.0 140.0 145.0 150.00.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
109
151
43 8053
51 65 7968 135107 120 122949137
HO NH
O
Figura 6-2 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el compuesto Pc.H1.
49
Figura 6-3 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el acetaminofén
El pico base m/z 109 del espectro del acetaminofén es generado por la pérdida del grupo
carbonilo que en este caso es una cetona, de igual manera se genera la pérdida del grupo
amino y agua característico en los alcoholes
El acetaminofén ha sido reportado en el género Lycoperdon, específicamente en la
especie L. lividum, el cual se encontró presente en el extracto etanolico a partir del
análisis del GC-MS. (Kerem , Ergin Mura, Ilgaz , Yavuz , & Ugur , 2016). No cuenta con
reportes en otras familias
6.2.2. Composición de la mezcla PcH.2
Se obtuvo 0,4672 g de un sólido amarillo. La comparación de los espectros de masas de
las respectivas señales con los de la librería NIST08, permitió la identificación de los tres
compuestos presentes en la mezcla PcH.2: β- Eudesmol (33) Cedrane-8,13-diol (34) y
Veridiflorol (35) con porcentajes de coincidencia de 97, 95 y 98 %, respectivamente, la
corriente iónica total (TIC) del análisis por CG-EM de la mezcla se observa en la figura 6-
50
4, la cual muestra tres señales con tiempos de retención de 17.377, 19.178 y 19.542
minutos respectivamente.
Figura 6-4 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla PcH.2.
CH3
CH2CH3
CH3
OH
OH
CH3
CH3 OH
CH3
CH3CH3
CH3OH
CH3
(33) (34) (35)
El espectro de masas y las posibles rutas de fragmentación del compuesto identificado
como β- Eudesmol (33), se ilustran en la figura 6-5 y 6-6 respectivamente, el ion
molecular a m/z 222, un pico base de 59 m/z con una intensidad relativa del 100% y
formula molecular C15H26O
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 2200.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
59
149
1081649379 81 12241 67
13511939 189 204
HO
Figura 6-5 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el β- Eudesmol
51
Figura 6-6 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el β- Eudesmol
Inicialmente este metabolito presenta una ruptura heterolitica del obteniendo dos
productos el primero que es el pico base m/z 59 y el segundo con una m/z 164, posterior
se realiza una pérdida de un metil por medio de una ruptura homolitica, quedando un
compuesto con un m/z 149
El sesquiterpeno β- Eudesmol fue identificado en los aceites esenciales de varias
especies del genero Piper como la Piper patulum, (Álvarez, Rosales de Zea, & Cáceres,
2014), Piper hispidum Kunth, (Delgado Avila & Cuca Suárez, 2007) y Piper Sw Hispidum
(Pino, Marbot, Bello, & Urquiola, 2002).
El espectro de masas y las posibles rutas de fragmentación de Cedrane-8,13-diol (34), se
ilustran en la figura 6-7 y 6-8 respectivamente, con un ion molecular m/z 238, un pico
base en 43 m/z con una intensidad relativa del 100% y formula molecular C15H26O2
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 2200.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
43
189
93107 14955 81
79 11920767 133
161177
OH
OH
Figura 6-7 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Cedrane-8,13-diol
52
Figura 6-8 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Cedrane-8,13-diol
el ion molecular del espectro del Cedrane-8,13-diol sufre la pérdida de un CH2O, que
conduce a la formación del ion con m/z 207, el cual pierde de H2O característico de los
alcoholes, sucesivamente se conduce a la eliminación de radicales metilo, CH y el
reordenamiento de hidrógeno.
El compuesto Cedrane-8,13-diol fue identificado en las hojas de la especie Ipomea pes-
caprae como aceite esencial, no se encontró reporte en la familia Piperaceae (Dejanb,
Marie, & Quetin Leclercq, 2007)
El espectro de masas de Veridiflorol (35), se ilustran en la figura 6-9 y 6-10 con un ion
molecular m/z 222, un pico base en 43 m/z con una intensidad relativa del 100% y formula
molecular C15H26O.
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 2500.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
43
4169
109
8155 16193
121204189135 147
164
OH
Figura 6-9 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Veridiflorol
53
Figura 6-10 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Veridiflorol
El ion molecular del espectro del Veridiflorol sufre la pérdida de H2O característico de los
alcoholes que conduce a la formación del ion con m/z 207, sufre ruptura, obteniendo
C12H17 con un m/z 161 y C3H7 con m/z 43 correspondiente al pico base.
Este compuesto fue identificado en la familia piperaceae en las hojas de la especie Piper
aduncum (Rodríguez, y otros, 2013) Piper retrofactum, Piper maclueri leaf (Hieu, Thang,
Hoi, & Ogunwande, 2014) y en las hojas, frutos y raíces de la especie Ottonia
martiana Miq como aceites esenciales (Cunico, y otros, 2007)
Sin embargo el Veridiflorol está presente en Las hojas de Allophylus edulis, mostro
actividad anti-micobacteriana, anti-inflamatoria y antioxidante. (Trevizan , y otros, 2016)
6.2.3. Composición de la mezcla PcH.3
Se obtuvo 0,4672 g de un sólido verde, el cual presentó manchas de color violeta en
CCD al ser revelado con Vainillina /H2SO4. La correspondiente comparación de los
espectros de masas con la librería NITS08, permitió la identificación de los dos
54
compuestos presentes en la mezcla PcH.3: Piperonal, (36) y tetratetracontano (37) con
porcentajes de coincidencia de 93 y 96% respectivamente, la corriente iónica total (TIC)
de la mezcla muestra un dos señales con tiempos de retención de 13.883 y 23.659
minutos, como se observa en la Figura 6-11
13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
2.75
3.00
3.25
(x1,000,000)TIC
13
.88
3
23
.65
9
Figura 6-11 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla PcH.2.
O
O
O
(36)
CH3
CH3
(37)
El espectro de masas y las posibles rutas de fragmentación del Piperonal (36), se ilustran
en la figura 6-12 y 6-13 respectivamente, con un ion molecular a m/z 150 y una
intensidad relativa de 10%, un pico base en 149 m/z con una intensidad relativa del 100%
y formula molecular C8H6O3
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.00.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
149
12163
916239105
OO
O
Figura 6-12 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Piperonal
55
Figura 6-13 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Piperonal
Partiendo del ion molecular del Piperonal presenta la perdida y trasposición de hidrogeno,
formado el ion pico base m/z 149, sucesivamente se realizó la pérdida del CO
característico de los alcoholes.
El piperonal, es un compuesto el cual existe en varios aceites de flores y tipos de vainilla,
se puede preparar sintéticamente y, debido a su olor dulzaceo, se utiliza en perfumería,
en particular, para perfumar el jabón. El piperonal, se utiliza también como repelente
contra los piojos del cabello. El piperonal, se puede no obstante utilizar como el único
ingrediente activo, en medicamentos previstos para inhibir la inflamación. Ejemplos que
pueden ser mencionados, son medicamentos para tratar inflamaciones, debidas por
ejemplo a dermatitis solares o erupciones cutáneas debidas a panales, para la curación
de heridas y para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, tales como la
psoriasis y el eczema constitucional. (España Patente nº 2 177 188, 2002)
Se encuentra como un compuesto bioactivo de las semillas, hojas y aceites de la especie
Piper nigrum L, (Subba Rao, y otros, 2010)
El espectro de masas y las posibles rutas de fragmentación del tetratetracontano (37), se
ilustran en la figura 6-14 y 6-15 respectivamente, con un ion molecular a m/z 618, un
pico base en 57 m/z con una intensidad relativa del 100% y formula molecular C44H90
56
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.00.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
57
7143
85
97113 127
155 169 197183 211 239225 267
Figura 6-14 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Tetratetracontano
Figura 6-15 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Tetratetracontano
El espectro del Tetratetracontano presenta una ruptura homolitica de los enlaces
carbono-carbono y el reordenamiento de hidrogeno originando los m/z 267 y 57 siendo el
ultimo correspondiente al pico base.
El Tetratetracontano es un oligoetileno presente en algunas plantas medicinales, se
encuentra presente en la esponja marina Callyspongia aerizusa y en las hojas de la
especie del genero chromolaena, no se encontró reportes de la presencia de este
compuesto en la familia piperaceae (Głowacki & Irimia-Vladu, 2012)
6.2.4. Composición de la mezcla PcH.4
Se obtuvo 0,4672 g de un sólido verde, el cual presentó manchas de color violeta en CCD
al ser revelado con Vainillina /H2SO4. La correspondiente comparación de los espectros
de masas con la librería NITS08, permitió la identificación de dos compuesto presentes en
la mezcla PcH.4: 3-butilindolizidina (38) Cubebinolido (39) β- Eudesmol (33) con un
porcentaje de coincidencia de 71, 74 y 91% respectivamente, la corriente iónica total
57
(TIC) del compuesto muestra dos señales con tiempos de retención de 19.029, 19.624 y
23,666 minutos, como se observa en la figura 6-16
18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5(x100,000)
TIC
19
.02
9
19
.62
4
23
.68
6
. Figura 6-16 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla PcH.4.
N
CH3
OO
O
O
O
O
(38) (39)
El espectro de masas y las posibles rutas de fragmentación del 3 - butilindolizidina (38),
se ilustran en la figura 6-17 y 6-18 respectivamente, el ion molecular a m/z 181 presenta
una intensidad relativa del 5%, un pico base en 124 m/z con una intensidad relativa del
100% y formula molecular C12H23N
40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 100.0 105.0 110.0 115.0 120.0 125.0 130.0 135.0 140.0 145.0 150.0 155.0 160.0 165.0 170.00.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
124
4455 12268 81 1109694 152138136108 15051 65
N
Figura 6-17 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el 3 – butilindolizidina
58
Figura 6-18 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el 3 – butilindolizidina
El espectro del 3–butilindolizidina presenta una ruptura de los grupos etilo y el
reordenamiento de hidrogeno originando los m/z 152 y 124 siendo el ultimo
correspondiente al pico base
Este compuesto fue identificado en Fracciones de extracto metanólico de Prosopis
spicigera, identificado a través del espectro de masas, no se encontró reportes de la
presencia del 3–butilindolizidina en la familia piperaceae (Annela, Dey, & De, 2014)
El espectro de masas y las posibles rutas de fragmentación del Cubebinolide (39), se
ilustran en la figura 6-19 y 6-20 respectivamente, el ion molecular a m/z 354, un pico
base en 135 m/z con una intensidad relativa del 100% y formula molecular C20H18O6
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
135
7750 354
10543 162131 19291 173 219206
OO
O
O
O
O
Figura 6-19 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Cubebinolide
59
Figura 6-20 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Cubebinolide
A partir del ion molecular del Cubebinolide se observa una ruptura homolitica obteniendo
dos moléculas la primera con un m/z 219 y la segunda un m/z 135 correspondiente al
pico base.
Este compuesto fue aislado por primera vez por Yoshiki e Ishiguro en 1933 a partir del
extracto etéreo de madera de hinoki (Chamecyparis obtusa Sieb. Y Zucc.) Como un
compuesto cristalino incoloro, (Marcotullio , Pelosi , & Curini, 2014) fue identificado en las
especie Piper cubeba y Piper trichostachyon (Usia, Watabe, Kadota, & Tezuka, 2005)
El espectro de masas y las posibles rutas de fragmentación del β-eudesmol se puede
observar en la figura figura 6-5 y 6-6
6.3 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE HOJAS DE Piper
Catripense
El aceite esencial de las hojas de Piper catripense se obtuvo con un rendimiento del 3,0%.
La identificación de la composición química del aceite esencial se realizó mediante CG-
EM y comparando los índices de retención y los espectros de la librería NITS08. El perfil
60
cromatógrafo se observa en la figura 6-21. Se determinó la presencia de 29
compuestos
Figura 6-21 Perfil cromatografico de los AE de las hojas de Piper catripense
En la tabla 6-2 se presentan los compuestos identificados, se reportaron los compuestos
que por comparación presentaban más de un 80% de coincidencia con el espectro de la
librería, también se presentan las cantidades relativas que corresponden al porcentaje de
abundancia de cada componente dentro del aceite esencial.
Tabla 6-2 Composición química relativa del aceite esencial de las hojas de la especie Piper catripense
Señal Nombre *** %
coincidencia tR
(min) %
área IR
Teorico IR
Cal
1 α –pineno M 98 14,487 0,8 939 941
2 β-pineno M 97 16,333 0,44 980 991
3 δ-Elemene S 95 30,073 0,28 1339 1340
4 β-elemene S 96 31,987 13,79 1391 1401
5 Hexadecanal AL 95 32,26 0,12 1800 1806
6 Cariofileno S 94 32,9 3,97 1404 1406
61
Señal Nombre *** %
coincidencia tR
(min) %
área IR
Teorico IR
Cal
7 α-Cubebeno S 90 33,153 0,47 1351 1360
8 β-farneseno S 89 33,833 0,12 1443 1442
9 α-cariofileno S 95 33,947 1,2 1454 1453
10 β-Chamigrene S 90 34,613 0,33 1475 1484
11 Germacreno D S 95 34,82 2,35 1480 1488
12 β-Selineno S 93 35,007 1,23 1485 1491
13 Isolongifolan-8-ol S 82 35,593 30,98 1618 1611
14 Epiglobulol S 84 35,833 1,23 1530 1534
15 δ-Cadineno S 88 36,02 0,33 1524 1527
16 L-perillyl alcohol M 82 36,613 2,38 1261 1267
17 Elemol S 95 36,847 1,54 1549 1551
18 Nerolidol S 95 37,167 1,01 1564 1566
19 Germacreno D-4-ol S 90 37,753 0,7 1574 1575
20 1,11-Hexadecadieno
HA 86 38,107 1,76 1627 1631
21 α-copaeno-11-ol S 92 38,447 0,3 1584 1586
22 Guai-1 (10) -en-11-ol
S 91 39,533 0,74 1614 1623
23 δ–Cadinol SO 94 40,087 1,42 1580 1582
24 β-eudesmol SO 95 40,34 10,72 1593 1596
25 α-panasinseno S 87 40,54 1,12 1416 1429
26 ϒ-Gurjunenepoxide-(2)
S 89 41,173 0,31 1558 1559
27 (Z,E) Farnesol S 82 41,64 2,05 1697 1697
28 β- Cariofileno S 88 42,1 0,63 1494 1504
29 Farnesal S 95 43,073 0,34 1656 1658
MONOTERPENOS(M) 3,62%
SESQUITERPENO (S) 65,02%
SESQUITERPENOIDE (SO) 12,14%
HIDROCARBURO ALIFATICO (HA) 1,76%
ALDEHIDO (AL) 0,12%
En el aceite esencial fueron identificados 29 compuestos que corresponde 83% de la
composición relativa del aceite esencial, los cuales se identificaron por la comparación
con los índices de retención y con la librería NIST 08. Se determinó la presencia 3
monoterpenos (M), 22 sesquiterpenos (S); 2 sesquiterpenoides (SO), 1 hidrocarburo
alinfatico (HA) y 1 aldehido (AL).
62
Los monoterperos encontrados representan un 3,62% de la composición del aceite
esencial de los cuales el componente mayoritario fue L-perillyl alcohol (2,38%), en los
sesquiterpenos se encuentra el primer y segundo compuesto mayoritario que
corresponde al Isolongifolan-8-ol (30,98%) y el β-elemeno (13,79%), en los
sesquiterpenoide se encuentra el tercer compuesto mayoritario β-eudesmol (10,72%), el
hidrocarburo 1,11-hexadecadieno (1,76%) y el aldehído hexadecanal (0,12%).
En la Figura 6-1 se representa el porcentaje de los compuestos identificado los cuales en
primer lugar fueron sesquiterpenos (76%), seguidos de los monoterpenos (10%), en tercer
luagar están los sesquiterpenoides (7%) y finalmente con menor cantidad están los
hidrocarburos alifáticos y aldehídos (3%)
Grafica 6-1 % Compuestos AE
Teniendo en cuenta que el rendimiento fue alto de 3,0%, se puede considerar que las
hojas de la especie Piper catripense, es un espeice vegetal rica en aceites esenciales, ya
que se caracterizan por producir gran cantidad de monoterpenos y fenilpropanoides, lo
cual está de acuerdo con los componentes volátiles determinados, como se puede
observar en la gráfica anterior.
63
Reportes en la literatura demuestran que los compuestos volátiles determinados en los
aceites esenciales analizados ya habían sido previamente reportados para varias
especies del género Piper ( Parmar, y otros, 1997). Como las especies P. auritum, donde
se identificaron como constituyentes principales monoterpénos, sesquiterpénos y
compuestos oxigenados (Sánchez, Pino, Correa, Naranjo, & Iglesia, 2009), en la especie
P. marginatum fueron identificados β-cubebeno, β-elemeno, Germacreno D y Germacren-
D-4-ol. (Jaramillo-Colorado, Julio-Torres, Duarte-Restrepo, Gonzalez-Coloma, & Julio-
Torres, 2015) en la especie Piper aduncum, donde fueron identificados sesquiterpenos
como el β-cariofileno, α –pineno, β-elemene, δ-Elemene, α-Cubebeno, β- Cariofileno,
Germacreno D y Germacren-D-4-ol (Scalvenzi, Yaguache-Camacho, Cabrera- Martínez, &
Guerrini, 2016)
También se tiene reporte que el compuesto L-perillyl alcohol se estudio con fines de
quimioprevencion dentificado como agente potencial quimiopreventivo (Division of Cancer
Prevention, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2002)
.
6.4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS HOJAS DE Piper
Catripense
6.4.1 Curva de calibración para el ensayo DPPH
Para la interpretación de los valores obtenidos durante el ensayo DPPH como estándar de
comparación de la capacidad antioxidante del extracto etanólico y las fracciones de las
hojas de la especie Piper catripense. Como se observa en la grafica 6-2 curva de
calibración del Ácido Gálico, se estimó que los datos de la regresión lineal establecen
que la función matemática que relaciona las variables del porcentaje de inhibición y
concentración (ppm) con un coeficiente de correlación de 0,99134454, el cual nos indica
que existe una buena relación lineal, en el grado de asociación entre las dos variables
cuantitativas, generando una relación directamente proporcional.
Grafica 6-2 Curva de calibración patrón Acido Gálico
64
Como se observa en la tabla 6-3, se muestran el promedio de las absorbancias, el % de
inhibición y el IC50 del control positivo (Ácido Gálico + MeOH), se realizo un stock de 500
ppm de ácido gálico y ocho (8) diluciones en serie (3, 6, 11, 17, 23, 28, 34, 40 ppm),
finalmente se midieron a una absorbancias a 520 nm, en tiempos de 0 y finalizando a los
30 minutos.
Tabla 6-3 Promedio de absorbancias, % inhibición, IC50 del Ácido Gálico
POZOS PROMEDIO ABSORBANCIAS % INHIBICIÓN IC50
3 ppm 0,573 45,38
3,661
6 ppm 0,332 68,35
11 ppm 0,259 75,36
17 ppm 0,164 84,41
23 ppm 0,108 89,70
28 ppm 0,092 91,28
34 ppm 0,084 92,04
40 ppm 0,075 92,90
Posterior al cálculo de los porcentaje de inhibición antioxidante de la muestra patrón, se
determinó la concentración máxima de la media inhibitoria (IC50) mediante una regresión
en el programa estadístico GraphPad Prism. Como se observa en la grafica 6-3 su IC50
es considerando de alto potencial ya que se presenta un valor de más de 90 de %
65
inhibicion y un IC50 de 3,661 µg/mL presentando un buen grado en la respuesta biologíca
y química de la capacidad antioxidante, para disminuir en un 50% la concentración inicial
del radical DPPH
Grafica 6-3 curva de IC 50 patrón ácido gálico
0 .5 1 .0 1 .5
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
L o g C o n c e n tra c ió n
AG
IC 5 0 A G
En la figura 6-4 se evidencia que en el extracto etanolico (E. EtOH. Pc.H) las
concentraciones de 28, 34 y 40 ppm, presentan un % de capacidad antioxidante mayor a
50%, de la fracción de hexano (Fx. Hex. Pc.H) la concentración 40 ppm, presentan un %
de capacidad antioxidante mayor a 50%, la fracción de diclorometano (Fx.DCM.Pc.H) no
registra un % de capacidad antioxidante significativo ya que están por debajo del 40 % y
la fracción de acetato de etilo (Fx. AcOEt.Pc.H), presento un % de capacidad antioxidante
mayor a 50% en las concentraciones de 17,23, 28, 34 y 40 ppm, esto debido a que esta
fracción debe presentar compuestos fenólicos ya que estos compuestos son susceptibles
a la oxidación, por lo tanto, actúan como antioxidantes
Grafica 6-4 % capacidad antioxidante extracto y fracciones de las hojas de Piper catripense
66
E tO H H e x D C M Ac O E t
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
1 0 0
M u e s tra s
% C
ap
ac
ida
d a
nti
ox
ida
nte
C a p a c id a d
E tO H
Hex
D C M
A c O E t
En la tabla 6-4 se observa los porcentaje de inhibición y el IC50 del extracto etanolico (E.
EtOH. Pc.H), la fracción de hexano (Fx. Hex. Pc.H), la fracción de diclorometano
(Fx.DCM.Pc.H) y la fracción de acetato de etilo (Fx. AcOEt.Pc.H), se consideraron como
extractos activos, aquellos que presentaron un porcentaje de actividad antioxidante
superior al 50%; valor que se usó como referencia considerando que equivale a la mitad
de la actividad antioxidante presentada por el Ácido Gálico, utilizado como control
positivo.
Tambien se muestra que el E. EtOH. Pc.H presento un IC50 de 22,57 µg/mL y la Fx.
AcOEt.Pc.H presento un IC50 21,03 µg/mL lo cual indica que tiene un alto potencial de
eliminadores de radicales libres, ya que es capaz de neutralizar el 50% de radicales libres.
La fracción de Fx. Hex. Pc.H presento un IC50 36,92 µg/mL y la Fx. DCM. Pc.H presento
un IC50 92,79 µg/mL, lo cual indica que tiene potencial moderado para neutralizar los
radicales libres.
Se reportaron criterios de selección para extractos vegetales con base en el IC;
considerando de alto potencial antioxidante aquellos con valores menores a 30 µg/mL,
con moderado potencial ubicados en un rango entre 30 µg/mL y 100 µg/mL y de bajo
potencial antioxidante aquellos con un IC por encima de 100 µg/mL (Ramos, y otros,
2002) (Tovar del rio, 2013)
67
Los valores de la deviacion estandar (sd), ns indican que los datos menos dispersos son
los de la fraccion de diclorometano Fx.DCM.Pc.H y los datos más dispersos son los de la
fracción de hexano Fx. Hex. Pc.H
Tabla 6-4 % inhibición, SD, IC50 del extracto y fracciones de las hojas de la Piper catripense
POZOS E. EtOH. Pc.H Fx. Hex. Pc.H Fx.DCM.Pc.H Fx. AcOEt.Pc.H
3 ppm 14,76 1,289 7,821 14,118
6 ppm 34,07 1,904 9,11 12,097
11 ppm 38,64 3,251 22,144 35,149
17 ppm 40,39 15,173 21,09 53,779
23 ppm 40,6 27,739 25,454 52,197
28 ppm 57,09 34,417 33,656 61,863
34 ppm 60,72 38,928 34,534 54,892
40 ppm 63,44 58,817 31,898 63,415
IC50 22,57 36,92 92,79 21,03
reportes en la literatura demuestran que el genero Piper presentan un alto potencial
antioxidante con IC50 por debajo de 30 µg/mL, como se evidencia las hojas y tallos de la
especie Piper pseudochurumayo con IC50 de 10 µg/mL (Cuenca Alvarado, 2015) y las
hojas de la especie Piper imperiale con un IC50 de 27,3 µg/mL (Diaz, y otros, 2012)
68
7. CONCLUSIONES
Se realizó el aislamiento e identificación de las hojas de la especie Piper catripense,
mediante diferentes técnicas cromatográficas y espectroscópicas, obteniendo un
compuesto identificado como acetaminofén el cual no tiene reportes presentes en el
género Piper y tres mezclas, la primera mezcla compuesta por 3 sesquiterpenos β-
Eudesmol, Cedran-8,13-diol y Veridiflorol encontrados en aceites esenciales, la segunda
muestra compuesta por un aldehído Piperonal y un hidrocarburo Tetratetracontano y la
tercera mezcla compuesta por un alcaloides y una lignano 3 – butilindolizidina y
Cubebinolide. En las pruebas fitoquímicas preliminares se obtuvieron pruebas positivas
para la presencia de compuestos flavonoides, taninos, cardiotonicos, carotenoides,
alcaloides, esteroides y triterpenos.
Se permitió identificar por primera vez la composición química de los aceites esenciales
de las hojas de la especie Piper catripense. Un total de 29 compuestos fueron
identificados, los cuales representan un 83% de la muestra total, constituidos
principalmente por sesquiterpenos, encontrando que el compuesto mayoritario es un
sesquiterpeno identificado como Isolongifolan-8-ol, también se encontraron compuestos
como el β-elemene y sesquiterpenoides como β-eudesmol
Los resultados de actividad biológica indican que el extracto etanolico y la fracción de
acetato de etilo de las hojas presentan un un alto potencial de eliminadores de radicales
libres, ya que son capaz de neutralizar el 50% de radicales libres.
69
8. RECOMENDACIONES
Dentro de este proyecto se desea que haya una mejora continua, se recomienda
continuar con el estudio fitoquímico de la especie Piper catripense
Estudiar la fracción de acetato de etilo ya que se observó una complejidad metabólica
importante
Utilizar otros modelos para determinar la capacidad antioxidante
Realizar el estudio de otras actividades biológicas en la especie
Estudiar otros órganos de la especie vegetal
70
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