Estudio Quimico de La Fraccion Insaponificable de Shiitake Maestria Quimica

7/25/2019 Estudio Quimico de La Fraccion Insaponificable de Shiitake Maestria Quimica

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ESTUDIO QUMICO DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE DEL

HONGO MACROMICETO Lentinula edodes (Shiitake)

OLGA LUCA BENAVIDES CALVACHE

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE POSGRADO EN QUMICA

BOGOT

2004


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ESTUDIO QUMICO DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE DEL

HONGO MACROMICETO Lentinula edodes (Shiitake)

OLGA LUCA BENAVIDES CALVACHE

Ing. Qumica. Universidad Nacional de Colombia - Sede Manizales, 2001

Tesis como requisito parcial para optar al ttulo de

Magster en Ciencias - Qumica

DIRECTOR

Dr. AUGUSTO RIVERA UMAA

Universidad Nacional de Colombia - Sede Bogot

ASESOR

Ing. Nelson Rodrguez

Cenicaf

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIAFACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE POSGRADO EN QUMICA

BOGOT

2004


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AGRADECIMIENTOS

A mi Director Dr. Augusto Rivera Umaa, por su incondicional apoyo, sus valiosas

enseanzas y gran dedicacin, durante el transcurso para la ptima culminacin de mis

estudios de maestra.

Al profesorJaime Alberto Rosdel Departamento de Qumica de la Universidad Nacional

de Colombia, por su tiempo, sus explicaciones y absoluta colaboracin.

A CENICAF y al Ingeniero Nelson Rodrguez por la asesora y el suministro de la

muestra deLentinula edodesobjeto de estudio en esta tesis.

A mi profesor Dr. Luis Enrique Cuca Surezpor sus apreciables enseanzas.

A la Universidad Nacional de Colombia por haberme permitido la realizacin de esta

Maestra en la Sede de Manizales.

A la Qumica Maril Laverde por la toma de los espectros CG-EM.

A mi familia, por su ayuda, paciencia y completa colaboracin.

A mis amigos, por su constante apoyo.


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CONTENIDO

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1. INTRODUCCIN 122. MARCO TERICO 143. TCNICAS GENERALES UTILIZADAS 333.1 CROMATOGRAFA EN COLUMNA (C.C) 333.2 CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (CCF) 333.3 CROMATOGRAFA PREPARATIVA 33

3.4 CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADA AESPECTROMETRA DE MASAS (CG-EM) 333.5 ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNTICA

NUCLEAR DE HIDRGENO (RMN-1H) Y DE CARBONO 13(RMN-13C)

34

3.6 PUNTO DE FUSIN (p.f) 344. PARTE EXPERIMENTAL 354.1 ADQUISICIN DE LA MUESTRA 354.1.1 METODOLOGA GENERAL EMPLEADA EN CENICAF

PARA EL CULTIVO DEL. edades35

4.1.1.1 Produccin de semilla comercial 35

4.1.1.2 Establecimiento de la formulacin y preparacin del sustrato 364.1.1.3 Etapa de tratamiento trmico 364.1.1.4 Etapa de inoculacin 374.1.1.5 Etapa de incubacin 374.1.1.6 Etapa de fructificacin, cosecha y postcosecha 374.2 TRATAMIENTO PRELIMINAR DE LA MUESTRA 384.3 OBTENCIN DEL EXTRACTO ETANLICO 384.4 OBTENCIN DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE 394.5 OBTENCIN DE LA FRACCIN DE CIDOS GRASOS 394.6 FRACCIONAMIENTO DE LA FRACCIN

INSAPONIFICABLE40

4.7 ANLISIS POR CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADAA ESPECTROMETRA DE MASAS (CG-EM)

45

4.7.1 FRACCIN INSAPONIFICABLE 454.7.1.1 FRACCIN LE2 504.7.1.1.1 FRACCIN LE2-F1 504.7.1.1.2 FRACCIN LE2-F2 504.7.1.2 FRACCIN LE4 51


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4.7.1.3 FRACCIN LE5 534.7.2 FRACCIN DE CIDOS GRASOS 565 DISCUSIN DE RESULTADOS 585.1 FRACCIN LE2 58

5.1.1 Ergosterol 585.1.2 -dihidroergosterol 585.1.3 Fungisterol 495.1.4 ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3

-ol 605.1.5 Neoergosterol 615.2 FRACCIN LE4 615.2.1 ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 625.2.2 ergosta-7,22-dien-3,5-diol-6-ona 715.3 FRACCIN LE5 725.3.1 ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona 725.3.2 Compuesto Z 72

5.4 FRACCIN DE CIDOS GRASOS 745.4.1 cido palmtico 745.4.2 cido linolico 755.4.3 Anlisis RMN 756. CONCLUSIONES 767. BIBLIOGRAFA 77

ANEXOS 80


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LISTA DE FIGURAS

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Figura 1. Cromatograma de Gases de la Fraccin de cidos Grasos 40Figura 2. Cromatograma de Gases de la Fraccin LE2 41Figura 3. Cromatograma de Gases de la Subfraccin LE2-F1 42Figura 4. Ampliacin del Cromatograma de Gases de la Subfraccin

LE2-F2, en tR21.13 22.04 min43

Figura 5. Cromatograma de Gases de la Fraccin LE4 43

Figura 6. Cromatograma de Gases de la Fraccin LE5 44Figura 7. Espectro de masas de ergosterol 46Figura 8. Espectro de masas de -dihidroergosterol 47Figura 9. Espectro de masas de fungisterol 48Figura 10. Espectro de masas de ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3-ol 49Figura 11. Espectro de masas de neoergosterol 50Figura 12. Espectro de masas de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 51Figura 13. Espectro de masas de ergosta-7,22-dien-3,5-diol-6-ona 52Figura 14. Espectro de masas de Compuesto Y 53Figura 15. Espectro de masas de ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona 54

Figura 16. Espectro de masas de Compuesto Z 55Figura 17. Espectro de masas de cido linolico 56Figura 18. Espectro de masas de cido palmtico 57Figura 19. Espectro de masas de alta resolucin a 70 eV de perxido de

ergosterilo66

Figura 20. Espectro de masa por ionizacin qumica de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol

68

Figura 21. Espectro de masas de alta resolucin por inyeccin directa deergosta-5,22-dien-3,5,8-triol.

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7

LISTA DE ESQUEMAS

pag

Esquema 1. Sntesis de lanosterol a partir de escualeno 16Esquema 2. Ruta biosinttica para la produccin de ergosterol en los hongos,

a partir de lanosterol17

Esquema 3. Patrn de fragmentacin de ergosterol 59Esquema 4. Ion diagnstico ncleo 7 60Esquema 5. Fragmentos diagnsticos para perxido de ergosterilo 66Esquema 6. Mecanismo de fragmentacin para ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 70Esquema 7. Ion a m/z 251 caracterstico del ncleo ergostano

pentainsaturado73

Esquema 8. Estructuras propuestas para el Compuesto Z 73Esquema 9. Rearreglo de Mc.Lafferty para cidos grasos 74


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8

LISTA DE TABLAS

pag

Tabla 1. Anlisis bromatolgico de algunos hongos comestibles comunes 24Tabla 2. Composicin de aminocidos esenciales en algunos hongos

comestibles y en huevo de gallina25

Tabla 3. Desplazamiento qumico () para los 28 tomos de carbono deergosta-6,22-dien-3,5,8-triol

63

Tabla 4. Asignacin de las seales de desplazamientos qumicos en RMN-1H yRMN-13C para ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol

64

Tabla 5. Iones con relacin m/z cercanos al ion molecular paraperxido de ergosterilo

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LISTA DE ANEXOS

pag

ANEXO 1. Espectro de RMN-1H a 400 MHz de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 81ANEXO 2. Ampliacin espectro de RMN-1H a 400 MHz de ergosta-6,22-dien-

3,5,8-triol82

ANEXO 3. Experimento COSY de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 83ANEXO 4. Ampliacin experimento COSY de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 84ANEXO 5. Espectro de RMN-13C a 100 MHz de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 85

ANEXO 6. Experimento DEPT 45 de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 86ANEXO 7. Ampliacin experimento DEPT 45 de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 87ANEXO 8. Experimento DEPT 90 de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 88ANEXO 9. Experimento DEPT 135 de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 89ANEXO 10. Experimento HMQC de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 90ANEXO 11. Ampliacin experimento HMQC de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 91ANEXO 12. Experimento HMBC de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 92ANEXO 13. Ampliacin experimento HMBC de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 93ANEXO 14. Ampliacin experimento HMBC de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 94ANEXO 15. Espectro de RMN-1H de perxido de ergosterilo 95

ANEXO 16. Espectro de RMN-

13

C de perxido de ergosterilo 96ANEXO 17. Espectro de RMN-13C a 100 MHz de cido palmtico 97ANEXO 18. Espectro de RMN-1H a 100 MHz de cido palmtico 98


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LISTA DE ABREVIATURAS

L. edodes Hongo macromicetoLentinula edodes(Shiitake)CC Cromatografa en columnaCCF Cromatografa en capa finaCG-EM Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masasC Grados Celsiusmin Minutocm-1 Frecuenciad Dobletes Singulete

m Multipletem.s.n.m Metros sobre el nivel del marm/z Relacin masa cargaHz Hertzp.f Punto de fusinppm Partes por millnTMS Tetrametil silanou.m.a Unidades de masa atmicaIDH Indice de deficiencia de hidrgenoMe MetiloA Anillo A

B Anillo BC Anillo CD Anillo DIsop IsopropiloCL Cadena lateralM+ Ion molecular Desplazamiento qumicoJ Constante de acoplamientoPM Peso moleculareV Electrn-voltio

AcOEt Acetato de etiloRMN1H Resonancia magntica nuclear de hidrgenoRMN13C Resonancia magntica nuclear de carbono 13DEPT Distortion less enhancement by polarization transferCOSY Correlation spectroscopyHMBC Heteronuclear magnetic bond coherenceHMQC Heteronuclear magnetic quantum coherence


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RESUMEN

El hongo macromicetoLentinula edodestambin conocido como Shiitake, pertenece a losbasidiomicetos comestibles y es el segundo ms cultivado en el mundo despus delchampin debido a sus propiedades nutricionales y medicinales. L. edodes se cultivadesde hace ms de un milenio en China y Japn. En Colombia casi es desconocido, sinembargo su cultivo en subproductos del Caf es objeto de estudio en el Centro Nacional deInvestigaciones de Caf (Cenicaf). Se conoce que las propiedades medicinales de L.edodesse deben a la generacin de metabolitos secundarios que pueden aislarse y evaluarsecomo potenciales productos farmacolgicos.

Del extracto etanlico de una muestra de L.edodes suministrada por Cenicaf, se obtuvopor particin, el extracto de acetato de etilo, el cual se saponific. Por particinclorofrmica de la muestra saponificada se obtuvo la fraccin insaponificable y la faseacuosa se dej para el estudio de cidos grasos. La fraccin insaponificable fue sometida acromatografa en columna, eluyendo con mezclas variables de benceno: acetato de etilo enpolaridad creciente, controlando por cromatografa de capa fina y revelando con reactivo deLiebermann-Burchard, obtenindose as, 5 fracciones denominadas: LE1, LE2, LE3, LE4y LE5.

La fraccin LE1 por ser la menos polar no se estudi. El resto de fracciones fueronanalizadas por CG-EM, y como resultado se reuni la fraccin LE2 y LE3 en una solafraccin denominada en forma general como LE2. Del estudio de los espectros de masasde las diferentes fracciones por comparacin con patrones y anlisis de fragmentacin, seidentificaron 8 esteroles tipo ergostano: ergosterol, ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3

-ol, -dihidroergosterol, fungisterol, neoergosterol, ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol,ergosta-7,22-dien-3,5-diol-6-ona , y ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona . El compuestoergosta-6,22-dien-3,5,8-triol, es la primera vez que se asla de L. edodes, segn laliteratura consultada empleando SciFinder, adems su presencia confirma la variacin en lacomposicin de esteroles polihidroxilados cuandoL. edodesha sido cultivado en desechosdel caf. No se aisl en ninguna fraccin perxido de ergosterilo. La fraccin de cidosgrasos fue analizada por CG-EM y RMN de lo cual se elucid la estructura de dos cidosgrasos, uno de cadena saturada (cido palmtico) y el segundo insaturado (cido linolico).


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1. INTRODUCCIN

Actualmente el problema de la resistencia de muchos patgenos a los antibiticos comunes

(de origen biolgico o sinttico) y las enfermedades incurables son el principal incentivo

para la bsqueda de nuevos compuestos bioactivos. La industria farmacutica ha sintetizado

millones de productos qumicos activos farmacolgicamente empleando como modelos

productos naturales provenientes de plantas y hongos. Con respecto a los ltimos, se ha

aislado un buen nmero de metabolitos secundarios con gran inters cientfico dadas las

actividades biolgicas y medicinales que han presentado1.

El hongo macromiceto Lentinula edodesque es conocido tradicionalmente en las culturas

orientales como nutracutico debido a sus propiedades nutricionales y medicinales, se

utiliza como droga segn la farmacopea oriental y varios de los metabolitos que han sido

aislados, han presentado actividad biolgica aplicable en el campo de la medicina2. Ms

an, los antiguos miembros de las cortes japonesas lo consideraban como afrodisaco y los

emperadores de China lo consuman para retardar el envejecimiento3.

Este hongo es casi desconocido en Colombia. Sin embargo, en el Centro de

Investigaciones del Caf (Cenicaf) se ha estudiado su cultivo en desechos del caf, en

bsqueda de la diversificacin de cultivos para los caficultores, lo que origina empleo, una

nueva fuente de alimentos y una alternativa para disminuir la contaminacin ambiental 4.

Como se dijo anteriormente, varios metabolitos de L. edodes han sido estudiados para

aplicaciones mdicas, sin embargo hongos de este gnero contienen metabolitos terpnicos

tipo esterlico, que podran presentar alguna actividad biolgica de inters, como es el caso

de algunos esteroles aislados de otros macromicetos. Algunos compuestos esterlicos

aislados del hongoL. edodesson polihidroxilados, lo que en la relacin estructura-actividad

puede significar de manera previa, que presentan alguna actividad biolgica. Surge

entonces, la pregunta si vara la composicin de esteroles polihidroxilados del hongo


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Lentinula edodes, cuando el macromiceto ha sido cultivado en mezcla de aserrn de tallo y

borra de caf, pues el Shiitake (L. edodes) no solo presenta propiedades alimenticias y

medicinales comprobadas sino que es tema de investigacin de gran inters segn las

polticas de fomento de cultivos alternativos entre los caficultores del Departamento deCaldas, haciendo de proyectos como ste, un claro ejemplo del papel de la Universidad en

la solucin de problemas socioeconmicos de una regin del pas.


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14

2. MARCO TERICO

El Shiitake fue clasificado como Lentinus edodes5 por Singer en 1941 y Pegler en 1975propuso denominarloLentinula edodes, nombre que conserva a la fecha tras haber sufrido

15 cambios de su nombre desde que fue descrito como Agaricus edodes en 1877 por

Berkeley5. Muchos taxnomos estn de acuerdo con la clasificacin de Pegler

principalmente debido a la naturaleza de la putrefaccin blanca causada por este hongo,

aunque tambin se han generalizado el nombre deLentinus edodesy los nombres comunes

Shiang-gu originario de China y Shiitake de Japn6. El trmino Shiitake significa

hongo negro del bosque debido a sus caractersticas fsicas y a su crecimiento natural en

los rboles de los bosques7.

L. edodes es el segundo hongo ms comercializado en el mundo despus del conocido

Champin (Agaricus bisporus), y se ha mantenido en el centro de la investigacin desde

finales de los aos sesenta7. Es uno de los hongos ms extensamente cultivados en China y

Japn, desde que fue cultivado por primera vez en China por Wu San Kwung en el condado

de Qingyuan durante la dinasta Sung, utilizando la tcnica de cultivo sobre troncos de

madera7. En esta tcnica, los troncos de madera se perforan y los huecos formados se

inoculan con tapones que contienen esporas o micelio del hongo. Posteriormente los leos

se acomodan en pilas y constantemente se irrigan con agua. Tras 6 a 12 meses, se obtienen

los primeros cuerpos fructferos del hongo. Aunque este mtodo de cultivo es muy tardo

en presentar los primeros cuerpos fructferos, segn los orientales es un mtodo simple y

natural, y no necesita la esterilizacin del sustrato ni el conocimiento de tcnicas de

laboratorio8.

Desde 1987 China se convirti en el principal productor deLentinus edodes, desplazando a

Japn, y desde entonces domina el mercado, as, el condado de Qingyuan present una

produccin de 106.500 toneladas de hongo fresco en 19978. Actualmente, el cultivo en

troncos naturales representa el 20% de la produccin en el condado de Qingyuan, mientras


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15

que el 80% restante, proviene de cultivos usando el mtodo del aserrn sinttico, causando

as menos dao ambiental que el ocasionado por el mtodo tradicional. Es tan importante

econmicamente el hongo L. edodes, que el condado de Qingyuan fue nombrado por el

gobierno chino, como la ciudad del hongoLentinula7.

En la investigacin cientfica los hongos han sido de gran inters desde el punto de vista del

aislamiento, caracterizacin qumica y pruebas biolgicas de los metabolitos que generan,

pues stos pueden tener aplicacin biolgica, mdica, agrcola e industrial, como es el caso

de los antibiticos (penicilina, cido itacnico, cefalosporina), enzimas (lipasa, pectinasa,

celulasa, entre otras), insulina, etanol, cido ctrico, alcaloides, giberelinas, ergosterol,

vitaminas, etc9.

Los compuestos terpnicos son metabolitos caractersticos de los vegetales. Sin embargo,

muchos de ellos estn presentes en los hongos y tienen importancia significativa al

presentar actividad farmacolgica9. Los esteroles hacen parte de los esteroides (triterpenos

modificados) y se encuentran ampliamente distribuidos en los hongos, entre los ms

comunes se encuentran el ergosterol (24-metilcolesta-5,7,22-trien-3-ol) 1, el cual es un

derivado del ergostano que presenta dos grupos metilo en posicin angulares en los

carbonos 10 y 13 y posee un grupo hidroxilo en posicin en el tercer carbono, ste ltimo

caracterstico para todos los esteroles. Los hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10),

sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterterpenos (C25), triterpenos (C30), tetraterpenos

(C40), y terpenoides superiores pueden describirse de acuerdo al incremento en el nmero

de unidades de isopreno10. El isopreno es un compuesto hemiterpnico producido

naturalmente en las plantas y hongos, sin embargo, las unidades de isopreno

bioqumicamente activas: dimetilalil difosfato (DMAPP) e isopentenil difosfato (IPP) son

las responsables de la formacin de muchos terpenoides y esteroides. El triterpeno

denominado escualeno es el precursor natural de los esteroides. La ciclacin del escualeno

requiere la presencia de los cofactores Q2y NADPH, para dar origen al intermediario 2,3-

xido de escualeno. La protonacin del grupo epxido origina la apertura del anillo y se

genera el carbocatin terciario, el cual, despus de sufrir una nueva adicin electroflica


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16

genera el prosteril catin terciario (Esquema 1). Este catin sufre luego una serie de

intercambios 1,2 de tipo Wagner-Meerwein, inicialmente migrando a hdrido y generndose

as un nuevo catin, a partir del cual hay una nueva migracin hacia el metilo hasta que se

presenta la prdida de un protn, originndose el doble enlace caracterstico del lanosterol.

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3 CH3

CH3

Escualeno O2, NADPH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

O

CH3

CH3

CH3

xido de escualeno

Ciclaciones

C

+

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

HCH3

H

OH

HH

CH3

CH3

Protosteril catin

CH3

CH3

CH3

HCH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

H

Lanosterol

Esquema 1. Sntesis de lanosterol a partir de escualeno10.

El lanosterol es un triterpeno muy comn, y es el precursor del colesterol y otros esteroles

en animales y hongos. En el Esquema 2se presenta la ruta biosinttica para la produccin

de ergosterol en los hongos, a partir de lanosterol10.


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17

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

OH

CH3

CH3CH3

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

OH

CH3

CH3CH3

CH2

Alquilacin C-24

Lanosterol

Eburicol

DesmetilacinC-14

CH3

CH3

CH3CH3

OH

CH3

CH3CH3

H

4,4-dimetilfecosterolDesmetilacin en C-4

CH3

CH3

OH

CH3

CH3CH3

H

CH2

Fecosterol

CH3

CH3

OH

CH3

CH3CH3

H

CH3

H

Modificaciones en cadena lateral y anillo B

Ergosterol

Esquema 2. Ruta biosinttica para la produccin de ergosterol en los hongos, a partir de

lanosterol10.


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18

La irradiacin de ergosterol con luz ultravioleta produce pre-ergocalciferol 29.

Mediante una reaccin sigmatrpica trmica, el pre-ergocalciferol 2 se convierte en

vitamina D2(ergocalciferol) 39.

El ergosterol 1, puede transformarse en perxido de ergosterilo 4por la accin del oxgeno

y la irradiacin ultravioleta9.

Tanto el ergosterol como el perxido de ergosterilo presentan accin antiviral y

antitumoral, adems de una fuerte actividad anticomplementaria11. Adems, el perxido de

CH 3

CH 3

OH

CH3

CH 3

CH 3

H

CH 3

2CH 2

CH 3

OH

CH3

CH3

CH3

CH 3

3

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

H

CH3

1

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

O O

4

O2 hv

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

H

CH3

21

hv

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

H

CH3


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19

ergosterilo ha presentado valores de concentraciones IC50 en humanos contra clulas

tumorales gstricas (SNU-1), clulas de hematoma (SNU-354), clulas de tumor colorectal

(SNU-C4) y sarcoma-180 de 18.7, 158.2, 84.6 y 74.1 M respectivamente12.

A continuacin se presentan algunos metabolitos terpenoides aislados de algunos

basidiomicetos y que exhiben una comprobada actividad biolgica:

Algunos lanostanoides aislados del hongo Ganoderma applanatum, entre los que se

encuentran los cidos ganodricos A 5, F 6, G 7, H 8, I 9y el cido furanoganodrico 10,

han presentado actividad contra clulas cancerosas en ratones13.

Los lanostanoides 5-lanosta-7,9(11),24-trieno-3-hidroxi-26-al 11, 5-lanosta-7,9(11),24-

trieno-15-26-dihidroxi-3-ona 12, 8,9,epoxi-4,4,14-trimetil-3,7,11,15,20-pentaoxo-

5-pregnano 13 se aislaron del macromiceto Ganoderma concinna. Estos compuestos

inducen apoptosis en las clulas HL-60 de leucemia promieloctica humana, como lo

indicaron las caractersticas morfolgicas de las clulas y la deteccin en la fragmentacin

de ADN14.

CH3

CH3

O

CH3CH3

OH

O

CH3

OH

O

COOH

CH3

10

CH3

CH3

CH3

CH3

COOR1

R1

CH3CH3

R2

O

CH3 R3

O

R1 R2 R3 R45 O OH OH H6 O O O H7 O O OH H8 OH O O Me9 OH O OH Me


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20

Los compuestos como cido 3-hidroxi-5-lanosta-8,24-dien-21-oico 14, cido 3-oxo-5-

lanosta-8,24-dien-21-oico 15, ergosta-7,22-dien-3-ol 16 y los cidos tsugrico A 17 y

tsugrico B 18, fueron aislados de G. tsugae, los cuales en combinacin con 2, 3, 9-

trihidroxi-ergosta-7,22-dieno 19 aislado de G. amboinense y aldehdo ganodrico A 20

aislado de G.lucidum, presentan inhibicin in vitrode clulas KB y de clulas PCL/PRF/5

de humanos15.

R1

CH3

CH3CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

R3

R2

11 R1 = OH,H R2= H R3= CHO

12 R1= O R2= OH R3= CH2OH

O

CH3

CH3CH3

CH3

CH3

CH3

O

O

O

O

O

13


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21

Estructuras nor-sesquiterpnicas de tipo drimanos, caracterizadas por su accin antibitica,

antifngica y antimicrobial, se han encontrado como metabolitos secundarios de los hongos

Marasmius oreades, Alternaria brassicae y Lactarius noidus. El compuesto 5-(hidroxi-

metil)-1,1,4-trimetil-6-metilendecahydronaftalen-2-ol 21, aislado del hongo Polyporusauricularius es un intermediario en la biosntesis de sesquiterpenos y presenta actividad

antimicrobiana16.

CH3

CH3

CH3

COOR 1

R

CH3CH3

CH3

HOOC

R

14 OH

15 O

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

16

CH3

CH3

CH3

COOR 1

OAc

CH3CH3

HOOC

CH3

17

CH3

CH3

CH3

COOR1

OAc

CH3CH3

HOOC

CH3

OH

18

19 20

CH3

CH3

COOR1HOOC

HO

HO

HO

CH3

CH3

CH3

CH3

OAc

CH3CH3

HOOC

CH3

O

CHO


22/98

22

Dos cidos triterpnicos tetracclicos como son: cido 4, 14-dimetil-3-nor-5-pregn-8-

en-4, 20-dicarboxlico 22, conocido como cido javerico y el cido 4, 14-dimetil-20-

oxo-3-nor-5-pregn-8-eno-4-carboxlico 23, tambin denominado cido phellnico,

fueron aislados del hongoPhellinus pomaceus17.

En lo que respecta a compuestos aislados de hongos del gnero Lentinus seleccionados

debido a que presentan actividad biolgica, se pueden mencionar:

Del medio de cultivo del hongo Lentinus adhaerens se aisl el compuesto 2-metoxi-5-

metil-1,4-benzoquinona 24, el cual presenta inhibicin sobre la agregacin plaquetaria1.

22HOOC

CH3

CH3

CH3

CH3

COOH

CH3

HOOC

CH3

CH3

CH3

CH3

O

CH3

23

O

OCH3

O

CH3

24

HO

CH3CH3

CH3

CH2OH

CH2

21


23/98

23

El compuesto panepoxidona 25, se extrajo en el proceso de fermentacin del hongo

Lentinus critinus. Este compuesto es altamente oxigenado y exhibe efectos txicos en

ratones a una concentracin LD50de 23 mg/kg1.

Del medio de fermentacin deL. crinitusse aislaron compuestos como: hipnophilina 26, 1-

desoxihipnophilina 27 y sus correspondientes alcoholes hipnophilol 28 y 1-

desoxihipnophilol 29, los cuales presentan actividad antimicrobiana1.

CH3

O

CH3

CH3

O

CH3

CH3OH

25

26 27

O

CH2

H

CH3

CH3

OH

H

O

CH3

O

CH2

H

CH3

CH3

H

H

O

CH3

HO

CH2

H

CH3

CH3

OH

H

O

CH3

28

HO

CH2

H

CH3

CH3

H

H

O

CH3

29


24/98

24

Se cree comnmente que los hongos no tienen valor calorfico, que son insignificantes

nutricionalmente o en el peor de los casos se consideran inertes o intiles. Estas creencias

son errneas, ya que los hongos contienen cantidades razonables de protena y

carbohidratos, as como un porcentaje menor de otros nutrientes importantes y en elesquema de valor nutritivo, estn sobre las verduras y legumbres, pero estn por debajo de

la protena de primera clase referida a carne, pescado y pollo18.

El anlisis bromatolgico de algunas especies entre las que se encuentra el hongoL. edodes

puede observarse en la Tabla 1.

Tabla 1.Anlisis bromatolgico de algunos hongos comestibles comunes18.

Especie Agua Protena Grasa CHOtotal

CHON-libre

Fibra Cenizas Energa(Kcal)

Agaricus bisporus

Auricularia species

Boletus edulis

Cantharellus cibarius

Coprinus comatus

Lentinus edodesMorchella esculenta

Tuber melanosporum

8990879192

909077

275302225

172023

28353

842

6090606559

756366

5175525451

705438

998117

7828

106

7.58.512.5

3108

350360360350345

390350270

Valores expresados como g/100 g de peso seco, excepto el contenido de agua expresada comog/100g de peso hmedo.

En la Tabla 2 se presenta la composicin de aminocidos esenciales en algunos hongos

comestibles, entre los que se encuentra el hongo L. edodes, as como la composicin de

aminocidos esenciales en el huevo de gallina18.


25/98

25

Tabla 2.

Composicin de aminocidos esenciales en algunos hongos comestibles y en huevo de

gallina18.

AminocidoAgaricus

bisporus

Lentinus

edodes

Pleurotus

florida

Pleurotus

ostreatus

Pleurotus

sajor-caju

Volvarielladiplasia

Volvariella

volvacea

Huevogallinaa

Leucina 7.5 7.9 7.5 6.8 7.0 5.0 4.5 8.8Isoleucina 4.5 4.9 5.2 4.2 4.4 7.8 3.4 6.6

Valina 2.5 3.7 6.9 5.1 5.3 9.7 5.4 7.3Triptfano 2.0 nd 1.1 1.3 1.2 1.5 1.5 1.6

Lisina 9.1 3.9 9.9 4.5 5.7 6.1 7.1 6.4Treonina 5.5 5.9 6.1 4.6 5.0 6.0 3.5 5.1

Fenilalanina 4.2 5.9 3.5 3.7 5.0 7.0 2.6 5.8Metionina 0.9 1.9 3.0 1.5 1.8 1.2 1.1 3.1Histidina 2.7 1.9 2.8 1.7 2.2 4.2 3.8 2.4

Total b 38.9 36.0 46.0 33.4 37.6 48.5 32.9 47.1

Datos presentados como g de aminocido / 100 g de protena cruda. nd: no determinado. a: porcomparacin. b: excluyendo arginina y cistina.

Los datos del contenido nutricional y composicin de aminocidos esenciales deL. edodes,

corroboran que este hongo puede ser consumido por humanos y por animales como fuente

de protena, carbohidratos y grasas.

Las sustancias qumicas que contienen los hongos, pueden denominarse adaptgenos,cuando cumplen una accin especfica, e inmunoestimulantes o inmunopotenciadores,

cuando son modificadores de la respuesta biolgica de un organismo (MRB) debido a la

estimulacin del sistema inmunolgico, lo que puede generar diferentes efectos

teraputicos 3.

Se conoce queL. edodespresenta propiedades medicinales que son debidas a la generacin

de metabolitos secundarios, varios de los cuales han sido aislados y evaluados comocompuestos con actividad farmacolgica tales como actividad antitumoral, antiviral,

antibacterial, antitrombtica, antiparasitaria, etc 9,3.

Entre las drogas de comprobada accin medicinal, obtenidas deL. edodesestn:


26/98

26

Lentinn

Es un polisacrido -D-glucano obtenido del extracto acuoso del cuerpo fructfero de

Lentinula edodes, el cual no presenta toxicidad para las clulas tumorales, pero inhibe su

crecimiento mediante un efecto carcinosttico, debido a la estimulacin que realiza sobre el

sistema inmunolgico, especficamente sobre un tipo de clulas blancas de la sangre

llamadas linfocitos T. Este compuesto incrementa la resistencia biolgica a las

enfermedades infecciosas, incluido el SIDA 3.

La actividad antitumoral del lentinn es significativamente ms fuerte que la de otros

polisacridos obtenidos de otros hongos, lquenes o plantas superiores. En un caso desarcoma 180 inducido a 10 micos, el lentinn present inhibicin completa del tumor en 6

de ellos, en dosis de 0,2 mg/kg durante 10 das y al utilizar dosis de 1 mg/kg de lentinn

durante 10 das se inhibi completamente el crecimiento tumoral en los 10 micos 3,19.

KS2

El compuesto KS2 es un -manan-pptido que contiene aminocidos como serina, treonina,

alanina y prolina, cuya extraccin puede hacerse con agua caliente seguida de una

precipitacin con etanol. Este compuesto result ser efectivo contra el sarcoma 180 y el

carcinoma de Ehrlich en micos, presentando un valor LD50superior a 12500 mg/kg cuando

se administra oralmente. En experimentos realizados in vitro con clulas de ratn, la

actividad antitumoral fue mayor. El compuesto KS2 presenta actividad antitumoral cuando

se incuba in vitrocon interfern 3.

Eritadenina

Es un compuesto denominado tambin lentinacina o lenticina. Tiene la capacidad de

reducir el colesterol en el suero de la sangre y lpidos en animales. Su modo de accin no

inhibe la biosntesis del colesterol, sino que acelera la excrecin del colesterol consumido y


27/98

27

adems acelera su descomposicin metablica. Chivata3 en 1969, adicion 0.005% de

eritadenina en el alimento para ratas, observando una disminucin del 25% del colesterol

total, en tan slo una semana. Rokujo y colaboradores3, en 1969 concluyeron que la

actividad de la eritadenina es mayor si se tiene una dieta alta en grasas. Kimoto ycolaboradores3en 1976, as como Kabir y Kimura3en 1989, llegaron a la conclusin que

una dieta alimenticia con Shiitake reduce el colesterol libre en el plasma sanguneo, reduce

la presin arterial y remueve los lpidos del sistema circulatorio.

Extractos LEM y LAP

LEM es el extracto del micelio pulverizado del hongo y LAP es el precipitado obtenido de

una solucin alcohlica de LEM. Los compuestos LEM y LAP son glicoprotenas que

contienen glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa, manosa y fructosa. El compuesto LEM

tambin puede contener derivados de los cidos nuclicos, vitamina B1, vitamina B2 y

ergosterol. Estos extractos han presentado una fuerte actividad antitumoral en animales y

humanos, as como la disminucin del nivel de infeccin causado por hepatitis B crnica.

Su mecanismo de accin es la activacin del sistema inmunolgico3.

En 1990 Susuki y colaboradores3, obtuvieron la sustancia inmunoactiva EP3 por

fraccionamiento de LEM. El compuesto EP3 contiene aproximadamente 80% de lignina,

10% de carbohidratos y 10% de protena 3.

Compuestos de cidos nuclicos

Pueden presentar una fuerte actividad antitrombtica, debido a que inhiben la aglutinacin

de las plaquetas3

.


28/98

28

Otros metabolitos aislados deL.edodesson:

Bases nitrogenadas

cido 4-(6-amino-9H-purin-9-il) propinico20,30.

Esteroles

Estos compuestos han sido objeto de estudio continuo en muchas especies de hongos,

debido a sus perspectivas de utilidad biolgica o industrial, por ejemplo, el ergosterol y

perxido de ergosterilo, como agentes antivirales y antitumorales11, as como esteroles

derivados del ergosterol como es el caso de los ergostadientrioles, los cuales presentan una

fuerte actividad anticolesterolmica y antioxidante21. De los estudios realizados por

Yokokawa H. y Mitsuhashi T.22, a diez hongos entre los que se encuentraLentinus edodes,

se elucidaron dos esteroles mayoritarios de este hongo, cuyos nombres y estructuras se

indican a continuacin:

ergosterol22,1 y ergosta-5,7-dien-3

-ol22,31

N

NN

N

NH2

COOH30

CH3

CH3

OH

CH 3

CH3

CH3

CH 3

31


29/98

29

Igualmente, de cinco hongos comestibles:Lentinula edodes, Pholiota nameko, Flammulina

velutipes, Hypsizigus marmoreus y Pleurotus ostreatus23, se aislaron varios esteroles

polioxigenados, entre los que figuran:

5,8-epidioxy-(22E,24R)-23-metilergosta-6,22-dien-3-ol 23, 32

3,5,9-trihidroxi-(22E,24R)-23-metilergosta-7,22-dien-6-ona 23, 33

3,5,9-trihidroxi-(24S)-ergosta-7-en-6-ona 23, 34

32

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

O

O

CH3

HO

CH3

33

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

HO

CH3

HO

OH

O

34

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

HO

OH

HO

O

CH3


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30

3,5,9,14-tretrahidroxi-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-ona 23, 35

(22E,24R)-ergosta-7,22-dieno-3

,5

,6

,9

-tetrol 23, 36

5,9-epidioxi-3-hidroxi-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-ona 23, 37

5,9-epidioxi-3-hidroxi-(24S)-ergosta-7-en-6-ona 23, 38

35

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

HO

OH

HO

O

OH

CH3

36

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

HO

OH

HO

OH

CH3

37

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

HO

O

O

O

CH3

38

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

HO

O

O

O

CH3


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31

5,6-epoxi-(22E,24S)-ergosta-7,22-dieno-3,7,14-triol 23, 39

Los seis esteroles que se presentan a continuacin fueron aislados de los hongos: Amanita

pantherina, Amanita virginoides, Lactarius piperatus, Lyophyllum shimeji, Tricholoma

portentosum,HypsizigusmarmoreusyLentinula edodes24

.

5,6; 8,9-diepoxi-(22E,24R)-ergosta-22-eno-3,7-diol 24, 40

5

,6

; 8

,9

-diepoxi-(22E,24R)-ergosta-22-eno-3

,7

-diol 24, 41

5,6-epoxi-(22E,24R)-ergosta-8,22-dieno-3,7-diol 24, 42

39

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

HO

O

OH

CH3

OH

R

40 -OH

41 -OH

CH3

CH3

CH3

CH3

RO

O

CH3

CH3

CH3

42

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

CH3

OHO OH


32/98

32

(22E,24R)-23-metilergosta-7,22-dieno-3,5,6-triol 24, 43

(22E,24R)-23-metilergosta-7,22-dieno-3,5,6,9-tetrol 24, 44

(24S)-ergosta-7-eno-3,5,6,9-tetrol24

, 45

El siguiente esterol fue aislado del hongo comestibleLentinula edodes25.

(22E)-23-metilergosta-5,7,22-trien-3beta-ol 25, 46

R

43 H

44 -OH

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

CH3

HO

R

CH3

HO

OH

45

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

CH3

HO

OH

HO

OH

46

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

CH3

CH3

HO


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33

3. TCNICAS GENERALES UTILIZADAS

3.1 CROMATOGRAFA EN COLUMNA (C.C)

Las columnas fueron empacadas con slica gel 60 Merck (Dimetro 0.063 0.200 mm),

siguiendo la tcnica seca. Se emple la relacin slica: muestra de 50:1. Como solventes

de elucin se utilizaron benceno y mezclas benceno acetato de etilo en diferentes

proporciones, tal como se indica en Parte Experimental.

3.2 CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (CCF)

Se usaron cromatoplacas de slica gel 60 F254 de la casa Merck (Dimetro 0.02 mm, espesor

0.2 mm) de 20 x 20 cm. Como reveladores se emplearon vapores de yodo y el reactivo de

Liebermann-Burchard modificado. Igualmente, se observaron los cromatogramas en luz

UV despus de ser revelados.

3.3 CROMATOGRAFA PREPARATIVA

Se emplearon cromatoplacas de 20 x 20 cm de slica gel 60 F254(Espesor 1 mm) de la casa

Merck. Los solventes de elucin se especifican en cada caso.

3.4 CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRA DE

MASAS (CG-EM)

Los anlisis por la tcnica combinada (CG-EM) se realizaron en un cromatgrafo de gasesHewlett- Packard 6890 acoplado a un espectrmetro de masas Hewlett-Packard 5973. Para

los anlisis, se utiliz una columna capilar HP-5MS, 30 m x (250 micrmetros d.c. x 0.25

micrmetros d.i.), empleando el siguiente programa: temperatura inicial del horno 270C

por 5 min, con una velocidad de calentamiento de 5C/min hasta 310C durante 10 min,


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34

manteniendo el detector a 320C y el detector a 280C. Como gas de arrastre se us helio

con un flujo de 1 ml/min y presin de 8.8 psi. Los espectros de masas se obtuvieron por

impacto electrnico a 70 eV.

3.5 ESPECTROSCOPA DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR DE

HIDRGENO (RMN-1H) Y DE CARBONO 13 (RMN-13C)

Los espectros de RMN-1H y RMN-13C se obtuvieron utilizando un aparato BRUKER

Modelo AMX-500. La frecuencia del equipo para el ncleo de hidrgeno fue de 400 MHz

y para el ncleo de carbono fue de 100 MHz. Se emple cloroformo deuterado CDCl3

como disolvente y tetrametilsilano (TMS) como estndar interno.

3.6 PUNTO DE FUSIN (p.f)

Los puntos de fusin se determinaros en un Fusimetro Ernst Leintz GMBH Wetzlar. Se

expresan sin correccin.


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35

4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1 ADQUISICIN DE LA MUESTRA

Los carpforos del hongo Lentinula edodes fueron aportados por el Centro Nacional de

Investigaciones de Caf, Cenicaf, los cuales se cosecharon del cultivo realizado por el

Ingeniero Nelson Rodrguez, en la estacin experimental La granja, Cenicaf, Chinchin

(Caldas). Lugar ubicado a 5 00 de latitud norte y 75 36 de longitud oeste, a una altitud

de 1310 m.s.n.m. y el cual presenta temperatura promedio anual de 21.4C, humedad

relativa media de 81.0%, precipitacin anual de 2399.9 mm con 240 das lluviosos en el

ao y brillo solar de 1825.4 horas anuales26, 27.

4.1.1 METODOLOGA GENERAL EMPLEADA EN CENICAF PARA EL

CULTIVO DEL. edodes 26,27:

4.1.1.1 Produccin de semilla comercial26, 27

A partir del micelio de una cepa coreana deL. edodescodificada como L4055 se realiz la

transferencia a tubos de ensayo con los medios de cultivo: agar extracto de malta (EMA) y

agar papa dextrosa (PDA). Del micelio crecido en los tubos de ensayo se tomaron

fragmentos de agar/micelio y se resembraron en cajas petri y botellas planas con los

mismos medios de cultivo, incubados en el laboratorio de Biodigestin anaerobia de

Cenicaf. Cuando el micelio invadi el 90% del medio, ste se refriger a 4C hasta el

momento de su utilizacin. En frascos de vidrio se agregaron 200g de trigo (lavado e

hidratado, hasta una humedad final entre 40 y 45%), los cuales fueron esterilizados enautoclave. Cuando alcanzaron la temperatura ambiente fueron sembrados en cmara de

flujo laminar con fragmentos de agar/micelio crecidos en cajas petri o botellas planas. Los

frascos con trigo se llevaron a incubacin durante el tiempo necesario para que el micelio


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36

invadiera el grano, para luego ser utilizado como inculo en la elaboracin de la semilla

comercial.

La produccin de semilla comercial se realiz adicionando 500g de trigo (lavado ehidratado, a una humedad final entre 40 y 45%) en bolsas de polipropileno de 9 x 18 cm

calibre 1.5, a las cuales se les implement un aro de PVC y un tapn de algodn en la parte

superior, posteriormente se esterilizaron en autoclave a 121C durante 20 minutos, y

cuando el material alcanz la temperatura ambiente se inocularon a una tasa del 3% con la

semilla obtenida en los frascos. Seguidamente fueron llevadas a incubacin hasta que

alcanzaran una completa invasin micelial.

4.1.1.2 Establecimiento de la formulacin y preparacin del sustrato26, 27

La formulacin del sustrato se estableci teniendo en cuenta la composicin qumica de las

materias primas y las necesidades nutricionales del hongo (relacin C/N entre 40 y 60):

Aserrn de tallo de caf (40%)

Borra de caf (44%)

Salvado de trigo (13%)

Carbonato de calcio (1%)

Yeso (1%)

Azcar (1%)

Despus de pesadas y mezcladas las materias primas, se empac 1 Kg de sustrato en bolsas

de polipropileno perforadas con un orificio de 2 cm de dimetro, el cual tenia como filtro

un cuadro de tela interln, para la inoculacin.

4.1.1.3 Etapa de tratamiento trmico26, 27

Las bolsas con sustrato fueron llevadas a un tratamiento trmico al vapor empleando un

sistema comn de esterilizacin a la temperatura de ebullicin del agua. El tiempo de

tratamiento trmico fue de 6 horas.


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37

4.1.1.4 Etapa de inoculacin26, 27

El material expuesto al tratamiento trmico (bloques), se dej enfriar hasta alcanzar la

temperatura ambiente y luego se llev al laboratorio de Biodigestin anaerobia donde serealiz la siembra con semilla comercial, a una tasa de inoculacin del 3%, luego las bolsas

de sustratos fueron selladas al calor y amarradas con fibra plstica.

4.1.1.5 Etapa de incubacin26, 27

Esta etapa se realiz a 85% de humedad relativa y finaliz despus de 60 das cuando el

micelio cubri completamente el sustrato presentndose un cambio de coloracin de blanco

a caf rojizo. sta es una de las etapas ms largas e importantes dentro del cultivo ya que

es aqu donde se presenta la asimilacin del sustrato, producindose altas cantidades de

metabolitos fungales, y enzimas activas que rompen complejos sustratos (celulosa,

hemicelulosa y lignina) en pequeas molculas, las cuales pueden ser absorbidas por el

micelio como nutrientes adecuados para su crecimiento.

4.1.1.6 Etapa de fructificacin, cosecha y postcosecha26, 27

En el momento en que el abrigo micelial se torn blando y los primordios empezaron a

aparecer en algunos bloques, se realiz una estimulacin para la aparicin de los hongos en

los otros bloques y al mismo tiempo hacer que la produccin fuera ms homognea, la cual

es denominada choque trmico.

Esta labor (choque trmico) consisti en disminuir aproximadamente en 9C la temperatura

de los bloques, condicin que se efectu llevndolos en la noche desde el cuarto deincubacin a la caseta de fructificacin (las temperaturas ambientales disminuyen en la

noche).


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38

Para los choques trmicos posteriores (despus de que se realiza la primera cosecha) la

estimulacin para la formacin de nuevos primordios se llev a cabo sumergiendo los

bloques en agua durante la noche.

.En el cuarto de fructificacin los bloques son remojados constantemente para ayudar al

crecimiento de los hongos. Despus de realizada la primera cosecha (aparicin y corte de

los hongos) los bloques se alejaron del sitio de fructificacin en un lugar seco, en una etapa

llamada dormitacin (descanso de los bloques) durante 8 das y luego se llevaron a un

segundo choque trmico, el cual se realiz sumergindolos en agua con hipoclorito de sodio

al 0.2% durante 24 horas. Cuando los bloques fueron sacados del agua, se colocaron en las

estanteras lavadas y secas durante 3 das. Para la tercera y cuarta cosecha se sigui el

mismo procedimiento de dormitacin y choque trmico.

La cosecha de los hongos se realiz haciendo torsin en la base del pie o cortndolos,

teniendo cuidado de no dejar residuos en el bloque ya que estos pueden inducir a la

contaminacin.

4.2 TRATAMIENTO PRELIMINAR DE LA MUESTRA

Los carpforos deL. edodesse limpiaron y lavaron con agua corriente para retirar cualquier

adherencia de material extrao (tierra, insectos, sustrato, etc), se cortaron en pequeos

fragmentos y se secaron en una estufa de aire circulante a 60C hasta peso constante.

Posteriormente, el material seco se llev a molienda en un molino elctrico. Se obtuvieron

270 g de material. Este tratamiento preliminar de la muestra se llev a cabo en el

Laboratorio de Biodigestin del Centro Nacional de Investigaciones de Caf, CENICAF.

4.3 OBTENCIN DEL EXTRACTO ETANLICO

Se emple el mtodo descrito por Blig y Dyer para el aislamiento de esteroles y

triterpenos28. El material seco y molido (270 g) deL. edodesfue sometido a un proceso de


39/98

39

extraccin por maceracin en fro con etanol al 96%, protegido de la luz y con renovacin

peridica (3 das) del disolvente (400 ml) durante 20 das. Cada vez se filtr, y se recuper

el disolvente a presin reducida. Al final, una vez reunidos los diferentes extractos

etanlicos tras retirar el alcohol, se obtuvieron 11 g de extracto, de aspecto resinoso y colorcaf oscuro.

4.4 OBTENCIN DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE

El extracto etanlico fue sometido a reparto entre agua y acetato de etilo 1:1, se separ la

fase orgnica, se sec con Na2SO4anhidro y se concentr a presin reducida, obtenindose

3 g de extracto de acetato de etilo, el cual se saponific en caliente con KOH al 10% en

solucin etanol-agua (3:2), por un periodo de dos horas29. Posteriormente, se realiz una

dilucin con agua y se extrajo la fraccin insaponificable con cloroformo. La fase orgnica

se lav con agua hasta neutralidad, se sec con sulfato de sodio anhidro y se llev a

sequedad a presin reducida. La fraccin insaponificable seca pes 0.8 g.

La fase acuosa saponificada se guard para estudiar los cidos grasos.

4.5 OBTENCIN DE LA FRACCIN DE CIDOS GRASOS

La fase acuosa saponificada se acidific con cido clorhdrico 6N hasta pH cido al papel

indicador universal y se realiz una particin con cloroformo. La fase clorofrmica se lav

con agua hasta neutralidad, se sec con sulfato de sodio anhidro, se filtr, se concentr a

presin reducida y se obtuvo la fraccin de cidos grasos, la cual pes 0.7 g y se analiz por

CG-EM. Su cromatograma de gases evidencia 2 compuestos mayoritarios (Figura 1).

Posteriormente la fraccin de cidos grasos se analiz por la tcnica espectroscpica de

RMN-1H y RMN-13C.


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40

Figura 1. Cromatograma de Gases de la Fraccin de cidos Grasos

4.6 FRACCIONAMIENTO DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE

La composicin aproximada de la fraccin insaponificable se estableci por cromatografa

de capa fina empleando diferentes solventes o sus mezclas y comparando con patrones

conocidos de esteroles. Se concluy que la mezcla benceno: acetato de etilo 7:3 es la ms

adecuada, pues dio origen a la aparicin del mayor nmero de manchas cromatogrficas.

Entonces, la fraccin insaponificable se purific por C.C, iniciando la elucin con benceno

y finalizando con mezcla benceno: acetato de etilo 70:30. Se recogieron fracciones de 4 ml

cada una, que se monitorearon por C.C.F frente a un patrn correspondiente a la muestraaplicada y se revel con reactivo de Liebermann-Burchard. Se reunieron aquellas

fracciones cuyo comportamiento cromatogrfico fue similar, con lo cual se obtuvieron 5

fracciones menos complejas enriquecidas en sus componentes, que se denominaron: LE1,

LE2, LE3, LE4 y LE5.

cidoPalmtico

cidoLinolico


41/98

41

FRACCIN LE1:Est constituida por compuestos de muy baja polaridad que por no ser

de inters en este trabajo, se decidi no estudiarla.

FRACCIN LE2: Esta fraccin (0.08g), al someterla a anlisis por CG-EM mostr lapresencia de 5 compuestos mayoritarios, identificados tal como se indica en la Figura 2. La

fraccin LE3 (0.02g), ha pesar de exhibir un perfil cromatogrfico en CCF diferente a la

fraccin LE2, con el anlisis por CG-EM se puso en evidencia que tena la misma

composicin de la fraccin LE2, razn por la cual estas dos fracciones fueron unidas en una

sola y nombrada en forma general como LE2. Esta fraccin se someti a purificacin por

cromatografa preparativa, eluyendo con mezcla benceno: acetato de etilo 7:3. Se

obtuvieron 3 bandas, correspondientes a las subfracciones LE2-F1 a LE2-F3. Todas estas

nuevas fracciones menos complejas, se analizaron por CG-EM, de las cuales, se decidi

estudiar las LE2-F1 y LE2-F2, por ser las nicas que exhibieron compuestos mayoritarios,

pues la tercera subfraccin result ser una mezcla de compuestos minoritarios. Los

cromatogramas de gases de las subfracciones LE2-F1 y LE2-F2 evidencian cada uno, dos

compuestos mayoritarios como puede observarse en las Figuras 3 y 4 respectivamente.

Figura 2. Cromatograma de Gases de la Fraccin LE2

Ergosterol

-dihidroergosterol

Fungisterol

Ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3-ol

Neoergosterol


42/98

42

Figura 3. Cromatograma de Gases de la Subfraccin LE2-F1


Ergosterol


43/98

43

Figura 4. Ampliacin del Cromatograma de Gases de la Subfraccin LE2-F2, en tR21.13 -

22.04

FRACCIN LE4: Esta fraccin, que al controlar su pureza individual, en CCF se

comport como un compuesto puro, se recristaliz en metanol obtenindose agujas de color

blanco (0.1g)cuyo punto de fusin se encontr en el rango de 178 a 179C. Posteriormente

se analiz por CG-EM. Su cromatograma de gases exhibi una mezcla de varias sustancias(Figura 5) con un compuesto notoriamente mayoritario. Posteriormente, esta fraccin es

analizada por RMN.

-dihidroergosterol Fungisterol


44/98

44

Figura 5. Cromatograma de Gases de la Fraccin LE4.

FRACCIN LE5: Esta fraccin (0.01g) fue sometida a estudio espectroscpico por CG-

EM, y se obtuvieron 3 compuestos mayoritarios (Figura 6).

Figura 6. Cromatograma de Gases de la Fraccin LE5

Compuesto ZErgosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona

Compuesto Y

Ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol


Ergosta-7,22-dien-3,5-diol-6-ona


45/98

45

4.7 ANLISIS POR CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADA A

ESPECTROMETRA DE MASAS (CG-EM)

4.7.1 FRACCIN INSAPONIFICABLE

Dado las pequeas cantidades obtenidas de las fracciones LE2, LE4 y LE5, hubo necesidad

de analizadas empleando la tcnica combinada CG-EM, en la determinacin estructural y

por tanto, la identificacin de los compuestos se realiz mediante el anlisis de los

espectros de masas, en algunos casos auxiliados de compuestos conocidos, por su

comparacin con los referenciados en la literatura y adems por los tiempos de retencin de

los correspondientes patrones.

4.7.1.1 FRACCIN LE2:

La fraccin LE2 contiene cinco compuestos mayoritarios del tipo monohidroxiesterol:

ergosterol, 1

ergosta-5,7,22-trien-3-ol, C28H44O, tR = 8.868 min (trpatrn = 9.759 min).

Espectro de masas: iones m/z (%): 396[M+ (64.64)]; 381 (2.92); 363 (100); 337 (34.88);

271 (5.31); 253 (20.15); 227 (3.51); 211 (15.21); 158 (5.04); 143 (17.29); 128 (6.71).

Figura 7


46/98

46

Figura 7. Espectro de masas de ergosterol

-dihidroergosterol, 47

ergosta-7,22-dien-3-ol, C28H46O, tR= 9.009 min (trpatrn = 8.902 min).

Espectro de masas: Iones m/z (%): 398[M+ (42.30)]; 383 (22.80); 365 (2.00); 300 (20.00);273 (30.00); 271 (100), 255 (40.00); 253 (12.00); 246 (23.20); 231 (18.00); 229 (20.00);

213 (18.86); 211 (2.00). Figura 8.

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

H 1


47/98

47

Figura 8. Espectro de masas de -dihidroergosterol

fungisterol, 48

ergosta-7-en-3-ol C28H48O, tR= 9.677 min (trpatrn = 9.430 min).

Espectro de masas: Iones m/z (%): 400[M+(100)]; 385 (32.85); 382 (1.78); 367 (5.02); 273

(19.43); 255 (74.48); 246 (6.71); 231 (18.75); 213 (21.26). Figura 9

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

H47


48/98

48

Figura 9. Espectro de masas de fungisterol

ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3

-ol, 49

C28H42O, tR= 8.334 min (trpatrn = 9.301 min).Espectro de masas: Iones m/z (%): 394[M+(20.2)]; 376 (23.30); 361 (6.30); 348 (3.70), 333

(5.33), 269 (6.90); 251 (100), 227 (11.00); 209 (25.00); 195 (23.80); 69 (45.00). (Figura

10).

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

H

48


49/98

49

Figura 10. Espectro de masas de ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3-ol

neoergosterol, 50

C27H40O, tR= 9.106 min.Espectro de masas: Iones m/z (%): 380[M+ (48.21)]; 362 (9.52); 347 (2.38); 319 (8.33);

255 (9.80); 253 (27.98); 237 (100); 213 (37.50); 195(4.40); 142(9.50); 141 (14.88). Figura

11.

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

49


50/98

50

Figura 11. Espectro de masas de neoergosterol

4.7.1.1.1 FRACCIN LE2-F1:

Como se indic con anterioridad esta subfraccin proviene de la cromatografa preparativa

de la fraccin LE2. Se identificaron:

Ergosterol, 1 Espectro de masas: Figura 7

Ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3

-ol, 49 Espectro de masas: Figura 10

4.7.1.1.2 FRACCIN LE2-F2:

De otra banda obtenida de la cromatografa preparativa se aislaron:

Fungisterol, 48 Espectro de masas: Figura 9

-dihidroergosterol, 47 Espectro de masas: Figura 8

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

50


51/98

51

Volviendo a las fracciones iniciales:

4.7.1.2 FRACCIN LE4

ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol [51]

C28H46O3, tR= 24.828 min.

Espectro de masas: Iones m/z (%): 430[M+(1.57)]; 428 (22.38), 413 (14.53); 385 (17.85);

367 (10.47), 349 (10.52), 330 (45.35), 303 (47.96), 301 (100), 285 (27.91), 267 (39.24),

249 (12.79), 191 (22.38). Figura 12.

Figura 12. Espectro de masas de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

OH

51


52/98

52

ergosta-7,22-dien-3,5-diol-6-ona, 52

C28H44O3, tR= 18.968 min.

Espectro de masas: Iones m/z (%): 428[M+(3.77)]; 413 (2.32); 400 (0.87); 385 (12.20), 303(4.65), 285 (4.65), 259 (5.81), 69 (100). Figura 13.

Figura 13. Espectro de masas de ergosta-7,22-dien-3,5-diol-6-ona

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

OHO

52


53/98

53

ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3-ol, 49 Espectro de masas: Figura 10

4.7.1.3 FRACCIN LE5

Compuesto Y, 53

tR= 18.968 min Espectro de masas: Iones m/z (%): M+ 293. Figura 14.

Figura 14. Espectro de masas de Compuesto Y


54/98

54

ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona, 54

C28H40O, tR= 22.847 min.

Espectro de masas: Iones (%): M+ 392 (42.73); 377 (1.45); 359 (2.91); 267 (100), 249(23.84), 225 (12.80), 207 (28.78). Figura 15.

Figura 15. Espectro de masas de ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona

CH3

CH3

O

CH3

CH3

CH3

CH3

54


55/98

55

COMPUESTO Z, 55

tR= 25.174 min.

Espectro de masas: Iones m/z (%): 440[M+(61.05)]; 425 (28.78); 422 (1.74); 407 (100),313 (2.91), 271 (5.81), 269 (14.53), 253 (10.46), 171 (8.14). Figura 16.

Figura 16. Espectro de masas de Compuesto Z


56/98

56

4.7.2 FRACCIN DE CIDOS GRASOS

cido linolico, 56

tR= 17.385 min.

Espectro de masas: Iones m/z (%): 280[M+(59.17)]; 251 (0.88); 237 (1.18); 220 (2.96), 209

(2.37), 122 (15.38), 123 (3.6), 109 (44.38), 95 (80.18), 81 (100), 67 (95.56), 55 (42.61), 41

(27.22). Figura 17.

O

OH

CH3

H

H

H

H

Figura 17. Espectro de masas de cido linolico

56


57/98

57

cido palmtico, 57

tR= 15.566 min.

Espectro de masas: Iones m/z (%): 256[M+ (100)]; 227 (20); 213 (76.3); 199 (18.82), 185(39.41), 171 (37.06), 157 (37.06), 143 (15.29), 129 (78.82), 115 (26.47), 97 (32.94), 83

(32.94), 73 (89.20), 60 (64.70), 43 (43.53) . Figura 18.

O

OHCH3

Figura 18. Espectro de masas de cido palmtico

57


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58

5. DISCUSIN DE RESULTADOS

5.1 FRACCIN LE2

5.1.1 ergosterol, 1

El compuesto 1se identific como ergosterol, uno de los esteroles de mayor abundancia en

los macromicetos30. Su espectro de masas (Figura 7) indica el ion molecular a m/z 396 que

es consistente con la frmula molecular C28H44O, as como los iones caractersticos de los

esteroles hidroxilados en C3. Presenta picos a m/z 381 [M+- Me] y m/z 363 [M+- Me -

H2O]. La prdida de la cadena lateral insaturada en C22 est determinada por una

diferencia de 125 u.m.a entre el ion molecular y el ion a m/z 271. Los iones a m/z 271 [M+

- CL], m/z 253 [M+- CL - H2O] y m/z 211 [M+- CL - D - H - H2O] revelan la presencia de

un esqueleto esteroidal tipo ergostano31,32con dos insaturaciones en el ncleo, las cuales se

localizan en C5 y C7, ya que la ruptura allica del anillo A y los iones generados por la

fisin del anillo C y la perdida consecutiva de uno y dos grupos metilo (m/z 158, m/z 143, y

m/z 128), as lo demuestran. En el Esquema 3 se presenta el patrn de fragmentacin del

ergosterol34, que soporta la investigacin.

5.1.2 -dihidroergosterol, 47

En el espectro de masas de este compuesto (Figura 8) se tiene el ion molecular a m/z 398

que corresponde a la frmula molcular C28H46O, as como un conjunto de iones tpicos

para esteroles del tipo 3-hidroxiergostano insaturado29,30( m/z 383 [M+- Me], m/z 355 [M+

- isoprop], m/z 271 [M+

- CL-2H], m/z 255 [M+

-CL-H2O], m/z 231 [M+

-CL-D-H] y m/z 213[M+-CL-D-H-H2O] ). La insaturacin se presenta en C7 debido a la presencia del ion a m/z

246, el cual es diagnstico del ncleo 7


59/98

59

Esquema 3. Patrn de fragmentacin de ergosterol

(Esquema 4), y la ausencia de los fragmentos a m/z 313 [M+-85] y m/z 287 [M+-111]

confirma que la insaturacin no se encuentra en C5. Los iones a m/z 273 [M+-CL] y m/z

271 [M+-CL-2H] originados en la prdida de 125 y 127 uma respectivamente, indican la


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60

presencia de una insaturacin en la cadena lateral, ciertamente en C22 ya que est presente

el fragmento de m/z 300 [M+- C7H14], resultado de la fragmentacin vinlica de la cadena

lateral32,33.

Esquema 4. Ion diagnstico ncleo 7

5.1.3 fungisterol, 48

Este compuesto se identific como ergosta-7-en-3-ol. El anlisis de su fragmentacin

indica un ion molecular a m/z 400 el cual es consistente con la frmula molecular C 28H48O,

y algunos iones caractersticos de esteroles hidroxilados en C3 ( m/z 385 [M+-Me], m/z 367

[M+-Me-H2O], m/z 255 [M+-CL-H2O] y m/z 213 [M

+-CL-D-H-H2O]. Est presente el

pico a m/z 246, el cual es diagnstico de ncleo 7(Esquema 2), y la diferencia de 127 uma

(C9H19) entre el ion molecular y el ion a m/z 273 que es originado por la prdida de la

cadena lateral, implica que la cadena lateral est saturada.

5.1.4 ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3

-ol, 49

El espectro de masas de este compuesto (Figura 10) muestra un ion molecular a m/z 394

que es consistente con la frmula molecular C28H42O, para la cual se tiene un IDH de 8. La

presencia de los iones a m/z 376 [M+-H2O] y m/z 361 [M+-H2O-Me] permiten inferir que es

un esterol tetracclico tipo ergostano, hidroxilado en C3 y por lo tanto el cierre de los

anillos disminuye a 4 el nmero de insaturaciones del compuesto. La existencia de los

picos a m/z: 251 [M+-CL-H2O], 227 [M+-CL-D], 225[M+-CL-D-2H] y 209 [M+-CL-D-

H2O], indica que el ncleo bsico contiene 3 insaturaciones y por consiguiente, la cuarta


61/98

61

insaturacin debe encontrarse en la cadena lateral, probablemente en C22, corroborndose

por la presencia, del in de baja intensidad a m/z 267 [M+-CL-2H], ocasionado por la

prdida de 127 uma.

5.1.5 neoergosterol, 50

El anlisis de la fragmentacin de este compuesto indica un ion molecular a m/z 380 el cual

es consistente con la frmula molecular C27H40O. Estn presentes algunos iones

caractersticos de esteroles hidroxilados en C3 ( m/z 362 [M+-H2O], m/z 347 [M+-Me-

H2O], as como el ion a m/z 319 [M+-ISOP-H2O], el cual, adems es confirmatorio de la

insaturacin de la cadena lateral en C-22, por lo tanto, los picos a m/z 255 [M+-CL], m/z

253 [M+-CL-2H] y m/z 237 [M+-CL-H2O] implican una cadena lateral insaturada en C22.

La fragmentacin es parecida a la de los esteroles 5,7,9(11), sin embargo el compuesto no

contiene este tipo de ncleo ergostano pues la prdida de la cadena lateral y una molcula

de agua genera un ion a m/z 237 uma, 14 uma menor que el fragmento a m/z 251 indicando

as, la ausencia de uno de los metilos del ncleo ergosta-5,7,9,-trieno. La similitud de los

espectros a m/z correspondientes a los fragmentos de fisin del anillo D, fisin del anillo C

(209 y 156), as como la presencia en ambos espectros del fragmento a m/z 141 indica que

el metilo faltante es C-19 y no C-18, por lo cual se identifica este compuesto como

neoergosterol.

5.2 FRACCIN LE4

El perfil cromatogrfico para esta fraccin (Figura 5) muestra una composicin de un

esterol mayoritario a un tR24,828 min y dos esteroles minoritarios a tRiguales a 18,968 y

20,350 min. Los espectros de masas de estos tres compuestos presentan iones molecularesa m/z = 430, 428 y 394 respectivamente. Este ltimo esterol corresponde al ergosta-

5,7,9,(11),22-tetraen-3-ol. Los otros dos compuestos presentan un aspecto en su

distribucin de seales que recuerdan al patrn de fragmentacin del perxido de

ergosterilo 4, un metabolito comn en esta clase de hongos, pero, tras un anlisis detallado,


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62

se pudo verificar que el ion molecular no es 428 uma sino 430 uma y que algunos

fragmentos tpicos del perxido de ergosterilo 4 no estn presentes. La muestra fue

recristalizada en MeOH obteniendo un compuesto cuya espectroscopia de resonancia

magntica nuclear se presenta en los anexos, puesto que la cantidad obtenida permitirealizar una mejor caracterizacin.

5.2.1 ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol, 51

El anlisis de la espectroscopia de resonancia magntica nuclear: RMN-1H, RMN-13C;

experimentos: DEPT, COSY, HMBC y HMQC indicaban un anillo ergostano con

desplazamientos qumicos en la espectroscopia de RMN-1H como en la de 13C similares a

la del peroxido de ergosterilo, creando una confusin dado que en masas se descartaba la

presencia de este perxido.

El espectro de 13C y los experimento DEPT indicaron la presencia de veintiocho (28)

tomos de carbono; cuatro de ellos con desplazamientos qumicos a campo bajo (130 ppm o

superiores), correspondientes a carbonos con hibridacin sp2 (135,42; 135,25; 132,31 y

130,75 ppm). El experimento DEPT-90 puso en evidencia que se trata de carbonos

vinlicos u olefnicos, permitiendo deducir que no se trata de carbonos en sistema olefnico

Terminal, tetrasustituido o exocclico. Adicionalmente, este mismo experimento present

en la regin de los carbonos alifticos otros siete metinos (66,46; 56,19; 51,68; 51, 08;

42,77; 39,74 y 33,07). El carbono a 66,46 ppm indica la presencia de un heterotomo

sobre este tomo de carbono. Los experimentos DEPT45, DEPT 90 y DEPT 135

permitieron establecer los desplazamientos qumicos para tomos de carbono (Tabla 3).

Los carbonos presentes a 82,18 y 79,44 son de especial inters dado que indican que estoscarbonos cuaternarios se hallan unidos a heterotomos o presentan un efecto electroatractor

muy fuerte. Cabe anotar que en la literatura qumica estos desplazamientos corresponden a

los C-5 y C-8 del perxido de ergosterilo 4o compuestos con el grupo 5,8-epidioxy34-37.

Nuevamente, este hecho experimental crea una confusin, ya que no estn acordes con los


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63

datos obtenidos en la espectrometra de masas, pues en dicho espectro no se observa el pico

ocasionado por la prdida de 32 uma, tpicas de los ergostaperxidos. Dada esta

discrepancia, se realiz un anlisis exhaustivo de la resonancia magntica nuclear del

slido aislado y se encontr un espectro de RMN-1H y de RMN-13C casi idntico alespectro del perxido de ergosterilo 4 (Ver Anexos). Al comparar los espectros del

compuesto aislado con los de un patrn de peroxido de ergosterilo 4, se crea la confusin

dada la similitud tan fuerte que presentan los espectros de estos dos compuestos. Indicando

que el esqueleto de los dos esteroles en comparacin son sino idnticos muy similares.

Desplazamiento

qumico (ppm)DEPT

Desplazamiento

qumico (ppm)DEPT

135,42 CH 36,97 C- cuaternario

135,20 CH 36,92 CH2

132,31 CH 34,70 CH2

130,75 CH 33,07 CH

82,18 C- cuaternario 30,10 CH2


66,47 CH 23,40 CH2

56,20 CH 20,88 CH351,69 CH 20,63 CH2

51,09 CH 19,95 CH3


42,78 CH 18,18 CH3

39,74 CH 17,57 CH3

39,34 CH2 12,88 CH3

Tabla 3. Desplazamiento qumico () para los 28 tomos de carbono de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol


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Haciendo uso de los experimentos COSY, HMQC y HMBC y comparando con los datos

encontrados en la literatura se realiz la asignacin inequvoca para la estructura del

policiclo tipo ergostano. Los datos de esta asignacin se encuentran en la Tabla 4.

No 13C 1H DEPT COSY HMBC1 34.69 1.96 m H; 1.69 m H CH2 CH3-19

2 39.31 1.99 m ; 1.24 t CH2

3 66.47 3.97 m CH

4 36.91 2.11 ddd 14 Hz, 1.92 t 14 Hz CH2

5 82.17 --- --- --- CH3-19; H-4; H-5; H-6

6 135.42 6.33 d J 8.5 Hz H-6 H 6-7 H-4

7 130.75 6.60 d J 8.5 Hz H-7 H 7-6

8 79.44 --- --- --- H-5; H-6

9 51.68 1.59 m CH

10 36.97 --- --- CH3-19

11 20,63 1,62 m CH2

12 30,10 1,82 m; 1,55 m CH2

13 44.56 --- ---

14 5.19 1.19 m CH

15 23,40 1,22 m CH2

16 28,65 1,33 m CH2

17 33.07 m CH CH3-21; CH3-1818 12.87 0.82 s CH3

19 18.18 0.89 s CH3

20 42.70 1.82 m CH CH321; H-22 CH3-18

21 17.57 0.92 d CH3

22 132.30 5.18 dd H-22 H-23; H-21 CH3-21

23 135.20 5.22 dd H-23 H-22; H24 CH3-25

24 39.74 2.02 m CH CH3-28; H-23

25 51.09 1.48 m CH CH3-27; CH3-28

26 19.95 0.85 d CH3

27 19.64 0.82 d CH3

28 20.88 1.01 d CH3

Tabla 4. Asignacin de las seales de desplazamientos qumicos en RMN-1H y RMN-13C

para ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol


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65

Esta asignacin permite establecer un ncleo ergostano con dos instauraciones en C6 y

C22, adicionalmente la presencia de heterotomos en los carbonos C-5 y C-8, dado el

desplazamiento qumico de estos tomos de carbono a campo bajo. La estructura parcial

propuesta 51(a),se presenta a continuacin:

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

X

X

51(a)

El ncleo esteroidal presenta una frmula condensada C28H44O y 396 uma. La cul

contiene treinta y dos unidades de masa menos que el posible in molecular presente en el

espectro de masas, lo que indicara errneamente que el compuesto corresponde al perxido

de ergosterilo 4.

De acuerdo a la literatura qumica34-37 y al espectro de masas de alta resolucin de un

patrn de perxido de ergosterilo 4(Figura 19), se puede observar que en los ncleos tipo

ergosta-5-8-epidioxi se caracterizan por presentar fragmentaciones muy especficas para

este tipo de compuestos. De gran inters es la perdida de 32 uma correspondiente a la

eliminacin del grupo peroxido, generando el in a m/z 396, adicionalmente se generan los

iones a m/z 337 producto de la escisin del anillo A y los iones a 253 y 251; fragmentos

caractersticos de ncleos 5,7generados a partir de la prdida de la cadena lateral y una

molcula de agua y prdida de la cadena lateral, agua y 2 H. (Esquema 5).


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66

Figura 19. Espectro de masas de alta resolucin a 70 eV de perxido de ergosterilo 4.

M+ = 428

.+

CH3

CH3

CL

OH

O

O

m/z = 396

CH3

CH3

CL

OH

+

fisin anillo A

.CH2

CH3

CL

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

m/z = 337

+

+ +

m/z = 253 m/z = 251

-CL-H2O

-2H

Esquema 5. Fragmentos diagnsticos para perxido de ergosterilo 4.


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67

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

H

OH

OH

La ausencia de los iones a 396 (M+-32) y 337 (escincin anillo A) en el espectro del

compuesto aislado descarta la posibilidad de la presencia del perxido de ergosterilo 4en la

fraccin estudiada. Esto conllev a que se realizara un anlisis ms detallado del espectro

de masas de este compuesto, anotando como hecho de gran relevancia haber encontradofragmentos generados por prdidas sucesivas de tres molculas de agua (385 a 367 y 367 a

349; 285 a 267 y 267 a 239). De otra parte, 428 uma no corresponde al peso molecular,

pues no exhibe fragmentaciones lgicas segn el patrn de fragmentacin de este tipo de

compuestos.

Con base en la asignacin inequvoca de las seales presentes en los espectros de RMN- 1H

y de 13C y la similitud de estos espectros con los del perxido de ergosterilo 4, la estructura

propuesta para el compuesto en cuestin debe ser: ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol, que no ha

sido aislado de L. edodes como se demostr con la literatura consultada utilizando

SciFinder, adems su presencia confirma la variacin en la composicin de esteroles

polihidroxilados cuandoL. edodesha sido cultivado en desechos del caf, conjetura que se

considera como el criterio de partida para el desarrollo de esta tesis.

ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol, 51(b)

La estructura propuesta para esta sustancia tiene peso molecular de 430 uma y es el ion

molecular en el espectro de masas pero con una baja abundancia relativa, lo que indicaraque el fragmento a m/z 428 corresponde al M+-2H, prdida de comn ocurrencia en

espectros de sustancias de esta clase, lo que se corrobora fcilmente con la presencia de este

mismo in M+-2, en el espectro de masas de alta resolucin tomado a una muestra autntica

de perxido de ergosterilo (Tabla 5).


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68

Tabla 5. Iones con relacin m/z cercanas al in molecular para perxido de ergosterilo 4.

Para establecer inequvocamente el ion molecular de esta sustancia, se realiz un espectro

de masas por ionizacin qumica con metanol, generando efectivamente un in molecular a

m/z 430, como se observa en la Figura 20

Figura 20. Espectro de masa por ionizacin qumica de ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol

M++1

M+

M+-2


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69

En la Figura 21 se presenta el espectro de masas de alta resolucin obtenido por impacto

electrnico a 70eV por inyeccin directa. A diferencia del espectro de masas tomado por

CG-EM, en este espectro, aunque no se observa la presencia clara del in a m/z 430, si son

evidentes las prdida consecutiva de 3 molculas de agua.

Figura 21.Espectro de masas de alta resolucin por inyeccin directa de ergosta-5,22-dien-

3,5,8-triol.

La configuracin absoluta de los hidroxilos en C-5 y C.8 fue establecida por comparacin

con la asignacin hecha al Me-19 y los hallados en la literatura para este mismo metilo en

otras estructuras23. Por ejemplo para el (22E,24R)-23-metilergosta-7,22-dien-3,5,6-

triol 43, el desplazamiento qumico del Me-19 es asignado a la seal a 1,09 ppm, a

campo ms bajo que el asignado para el compuesto en discusin. Lo que indica que los

hidroxilos presentes en C-5 y C-8 se ubican en posiciones axiales, por lo tanto el compuesto

aislado corresponde al ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol51(c).


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ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol 51(c)

Teniendo en cuenta este anlisis y la necesidad de establecer una estructura polihidroxilada

para el compuesto en mencin, en el Esquema 6, se presenta un mecanismo de

fragmentacin que explica los iones ms representativos presentes en el espectro de masas

de este compuesto:

M+ = 430

.+

CH3

CH3

CL

OH

OH

OH

m/z = 428

CH3

CH3

CL

OHOH

OH

+

+

+

m/z = 285

-2H -CL CH3

CH3

OHOH

OH

m/z = 303

CH3

CH3

OHOH

OH

-2H

+

-H2O

m/z = 301

CH3

CH3

OHOH

m/z = 267

CH3

CH3

OH

+

-H2O

-H2O

CH3

CH3 +

M+-C

3H

7

CH3

CH3

OHOH

OH

CH3CH3

+

m/z = 385

-H2O

-3H2O

-2H2O

m/z = 367m/z = 349

m/z = 331

-Me

CH3

CH3

OHOH

OH

CH3

CH3

CH3

+

CH3

CH3

OHOH

OH

CH+

CH3

.

-C7H

14m/z = 413 m/z = 330

Esquema 6. Mecanismo de fragmentacin para ergosta-6,22-dien-3,5,8-triol

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

H

OH

OH


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71

5.2.2 ergosta-7,22-dien-3,5-diol-6-ona, 52

La fragmentacin de este compuesto revela un in molecular a m/z 428 el cual es

consistente con la frmula molecular C28H44O3. Estn presentes algunos ionescaractersticos de esteroles hidroxilados en C3, tales como: m/z 413 [M+-Me] y m/z 285

[M+-CL-H2O]. Los picos a m/z 303 [M+-CL], m/z 285 [M+-CL-H2O] involucran una

cadena lateral insaturada posiblemente en C22, insaturacin que se confirma por el pico que

aunque de baja intensidad, se presenta a m/z 300. El ion m/z 400 resulta de la prdida de

28 uma a partir del ion molecular, lo que puede significar que la molcula tenga un grupo

carbonlico, as tambin est presente el ion m/z 385 el cual revela la prdida de CO y Me a

partir del ion molecular, lo cual reafirma lo anterior expuesto. El anlisis anterior,

adicional a que el peso molecular del compuesto implicara la frmula molecular C28H44O3,

con un ndice de deficiencia de hidrgeno igual a siete; cuatro de ellas producto del sistema

poli cclico, una a la insaturacin en C-22 otra al grupo carbonilo, quedando una sola

insaturacin por asignar. Esta deficiencia de hidrgeno corresponde a un segundo doble

enlace. De la revisin bibliogrfica se conoce la estructura de un compuesto cetnico que

ha sido aislado en siete hongos, entre ellos L. edodes,24 la cual se propone como el

compuesto correspondiente a la fragmentacin de masas arriba descrita, y que se denomina

ergosta-7,22-dien-3,5-diol-6-ona, 52. Otra estructura que puede proponerse para este

compuesto de la Fraccin LE4 es:

Sin embargo se escogi la estructura correspondiente a ergosta-7,22-dien-3,5-diol-6-ona

debido a que en el espectro de masas se evidencia la prdida de CO.

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

OH58


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72

5.3 FRACCION LE5

En esta fraccin se identific el esterol ergosta-4,6,8,(14),22-tetraen-3-ona 54, por

comparacin con los datos espectrales de masa obtenidos a partir de la literatura y para elcompuesto Z se proponen varias estructuras segn su patrn de fragmentacin. Un tercer

compuesto (Y) 53, no fue identificado dado que este compuesto no presenta patrones de

fragmentacin caracterstico de esteroles, y podra corresponder a un artefacto o

contaminacin de la muestra.

5.3.1 ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona, 54

En el espectro de masas de este compuesto (Figura 15) se tiene un ion molecular a m/z 392,

el cual corresponde a la frmula molecular C28H40O con un IDH de 9. Se presenta una

fragmentacin tpica para un esqueleto tetracclico tipo ergostano (m/z 377 [M+-Me], 267

[M+-CL], 225 [M+-CL-D]), cuya formacin implica cuatro puntos de insaturacin. Los

cinco restantes puntos de insaturacin corresponden a cuatro dobles enlaces carbono-

carbono y uno carbono-oxgeno, como puede corroborarse de la informacin de

espectrometra de masas obtenida de la literatura para el compuesto ergosta-4,6,8(14),22-

tetraen-3-ona38.

5.3.2 Compuesto Z, 55

En el espectro de masas de este compuesto (Figura 16) se tiene un ion molecular a m/z 440.

Se presenta una fragmentacin tpica para un esqueleto tetracclico tipo ergostano (m/z 425

[M+-Me], 301 [M+-CL],) donde la cadena lateral pesara 139 uma y por lo tanto, segn la

biognesis23,25

de los hongos presentara un metilo en posicin C-23. Se presenta el ion m/z251 tpico de un ncleo ergostano pentainsaturado:


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CH3

CH3

Esquema 7. Ion a m/z 251 caracterstico del ncleo ergostano pentainsaturado

De lo anterior pueden ser propuestas varias estructuras para el compuesto Z, como son:

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

O

CH3

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

OHO

CH3

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

OH

CH3

Esquema 8. Estructuras propuestas para el Compuesto Z.

m/z 251

+.


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74

5.4 FRACCIN DE CIDOS GRASOS

Los cidos grasos se caracterizan por presentar en su fragmentacin de masas la prdida

consecutiva de 14 uma, la cual es ocasionada por fragmentaciones del tipo A1(Escisin C-C) y tipo A3 (ruptura allica), tambin se presenta la fragmentacin tipo H (rearreglo de

McLafferty)39, la cual representa una seal diagnstico en los espectros de masas de cido

grasos debido a que involucra al grupo carboxlico, como se observa en el Esquema 9.

O

H

R CH3

CH3CH2

OH CH2

R

+

+.

+.

Esquema 9. Rearreglo de Mc.Lafferty para cidos grasos.

Esta transposicin de McLafferty corresponde al pico a m/z 60, el cual es caracterstico de

los cidos alifticos -metilnicos no sustituidos.

El cromatograma de gases de la fraccin de cidos grasos (figura 1) indica dos compuestosmayoritarios correspondientes al cido palmtico (tR= 15.66) y cido linolico (tR=17.385)

5.4.1 Acido palmtico, 57

El peso molecular de este compuesto es de 256 uma, lo que representa una frmula

molecular C16H32O2, obtenida a partir de la aplicacin de la regla del 13. Tambin se

deduce un IDH de 1, lo cual permite plantear estructuras que tengan presentes dobles

enlaces carbono-carbono, carbono-oxgeno o un ciclo. Los dos tomos de oxgeno de la

frmula molecular pueden ser indicativo de la existencia de funciones alcohol, ter, cido

carboxlico, ster, entre otras.

Estudio Quimico de La Fraccion Insaponificable de Shiitake Maestria Quimica

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