eterminacin de Coliformes Totales y Fecales. Mtodo de recuento por dilucin en tubo: NMPEnviado pormireya

1. Introduccin2. Materiales3. Procedimiento4. Resultados5. Conclusiones6. Preguntas7. ReferenciasPRCTICA N 05IntroduccinExisten diversosmtodospara cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de lastcnicasms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, as como losprocedimientosbasados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos enmediosde cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias(UFC) o la estimacin por elmtododel Nmero Ms Probable (NMP).El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras dealimentosy aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos ysueloscontaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras desueloyagua, tanto parabacteriasaerobias como anaerobias.Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales.Aproximadamente el 95% delgrupode los Coliformes presentes en heces estn formados porEscherichia coliy ciertas especies deKlebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de losanimalesdesangrecaliente, se considera que reflejan mejor la presencia decontaminacinfecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas demateriaorgnica,pH, humedad. Desde hace muchotiempose han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica queel aguao el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores deenfermedades. I.Objetivos: Familiarizarse con los mtodos de recuento, especialmente con el de NMP. Detectar bacterias coliformes totales y fecales. Detectar si lamuestratrada es apta para elconsumohumano.Materiales Muestra: Leche Medios de cultivo: Caldo Brilla (presuntivo), agar MacConkey, agar Endo, EMB, CB. Caldo EC Tubos de dilucin Pipetas Bombilla de aspiracin Placas de Petri Mechero Bunsen Bao Mara Estufa Gradillas Anzas microbiolgicas calibradasProcedimiento a.Mtodo para coliformes totales: Preparamos diluciones hasta 10-3. Sembramos dos, tres o cinco tubos por cada dilucin, segn sea el caso. Los resultados se dan en por gr o mL

En el caso de agua se sigue de la otra forma: Cuando se trate de aguas, los resultados se darn por 100 mL. Luego, incubar a 35 C 1 por 24 h. Realizar la 1ralectura(determinar la presencia degas). sta se observa en las campanas. Los tubos que no sean positivos se incuban por otras 24 h ms. b.Mtodos para coliformes fecales: Para coliformes fecales se utilizan dos mtodos: En elPrimer Mtodose cogen los tubos positivos del caldo Lauril Sulfato Triptosa y se lleva una asada al caldo EC utilizando una asa que tenga 3 mm de dimetro. Luego, estos tubos se incuban a 45.5 C 0.2, en bao Mara con agitacin constante por 24 h. Si hay gas a las 24 o 48 h. es positivo para coliformes fecales. ElSegundo Mtodoes la llamada prueba de Mackenzie. En esta se usa el caldo Brila mas agua Peptonada. Se parte del caldo MacConkey, los tubos positivos de la prueba de coliformes totales se siembran en este caldo, si aqu vuelve a salir positivo se le realizan las dospruebassgtes: Slo se tomar esta prueba como positiva si los dos tubos (caldo Brilla y caldo Peptonado) resultan positivos. Al tubo con caldo peptonado se le agrega el reactivo de Kovacs para hacer la prueba de Indol. Para ver coliformes termorresistentes, de los tubos que hayan salido positivos se siembra una asada en agar MacConkey y se aslan las colonias caractersticas. De los tubos positivos se los siembra en otros tubos en caldo EC con campana de Durham.

Resultados De los tubos sembrados en el caldo Brilla (prueba presuntiva), se obtuvo los sgtes. resultados (a las 24 horas) para coliformes totales:

Para realizar la prueba confirmativa se sembr en agar MacConkey, luego de la incubacin por 24 horas, se obtuvo los sgtes. resultados:

Por lo tanto, se puede decir que el resultado del nmero ms probable es: 222. Para este resultado las tabla de NMP con un lmite de confianza de 95% para la prueba defermentacinutilizando 3 diluciones con dos repeticiones (2 tubos), nos da unvalorde>1100 bacterias/mLdeleche.Conclusiones Losvaloresmnimos permisibles usados enMxico, por ejemplo, nos dan los sgtes. valores de referencia para diversos alimentos:Especificaciones microbiolgicas establecidas para diversos alimentos.

*NOM-093-SSA1-1994 ; ** NOM-121-SSA1-1994; ***Lmitesmicrobiolgicos de la ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods). La muestra trada por nuestro grupo fue de leche cruda. Al hacer un comparativo de nuestros resultados vemos, por ejemplo, que "La Norma Venezolana paraLcteos" da como valores lmites los sgtes. valores:

Vemos que el lmite dado para Coliformes Totales en leche cruda est dada enUFC/ml, entonces, comparando nuestra muestra de leche, trada de un puesto lechero del sector Santa Rosa Chiclayo con las muestras dadas en el cuadro, la podemos calificar como una leche DE TERCERA.RESULTADOS COLIFORMES FECALES Para la prueba de coliformes fecales se utiliz como mtodo la prueba de Mackenzie, aunque, al no tener todos los medios necesarios, se hicieron algunas modificaciones. De los tubos positivos del Caldo Brilla si inocul, de cada uno, a tubos con Caldo E-C. Luego se incub los tubos a 44 C 0.1 por 24 h. Pasado el tiempo seley los resultados. De los tubos positivos se pas a placas con agar MacConkey, estas se incubaron por 24 h a 37 C (se debi pasar a dos tubos uno con caldo peptona y otro con caldo Brilla). Pasado el tiempo, se leen las placas y se realizan las pruebas bioqumicas para las colonias lactosa positivas (L+).RESULTADOS: Como todos los tubos del caldo Brilla salieron positivos, se sembraron en tubos con caldo EC (seis tubos). Despus de la incubacin de los tubos con caldo EC se obtuvieron los sgtes. resultados:

De los tubos positivos se sembr en agar MacConkey, de ellas todas salieron lactosa positivas:

De las colonias lactosa positivas se escogi una y se le realiz las sgtes. pruebas bioqumicas: IMViC + descarboxilacin de la lisina (LIA) + prueba de fermentacin decarbohidratos(TSI). Se obtuvieron los sgtes. resultados:

De los resultados obtenidos se puedo identificar aKlebsiella azaenae. Entonces, comoKlebsiellapertenece al grupo de las coliformes fecales, podemos decir que la muestra tratada (leche cruda) tenia presencia de estas en un nmero de (resultado NMP2-2-0):NMP de coliformes fecales = 210 bacterias/ mL.

Algunas sp. delgneroKlebsiellajunto con otras de los gnerosCitrobacteryEnterobarterse cree que son las causantes de enfermedades gastrointestinales agudas y crnicas. Estos microorganismos pueden ser recolectados de ambientes naturales tales como los bosques, el agua fresca as como tambin de losproductosprovenientes de laagricultura(vegetales) donde residen normalmente como microflora.Tambin pueden ser recolectados de las heces de individuos saludables que no presentan sntomas de la enfermedad. Tambin pueden ser recolectadas a partir de los productos lcteos, los mariscos crudos y los vegetales frescos y crudos. Estos organismos al contaminar las aguas pueden estar presentes en el suelo usado para laproduccinde cultivos y en las aguas depescade mariscos; como resultado stos pueden constituir un peligro para lasalud.Preguntas Cules son los diferentes mtodos para coliformes totales? Para el conteo de coliformes totales se tienen tres mtodos principalmente. Elprimerose basa en la tcnica del nmero ms probable (NMP), utilizando caldo Lauril Sulfato Triptosa seguido de la confirmacin de los tubos positivos de formacin de gas en caldo Lactosa Bilis Verde Brillante. La incubacin es a 35 C. El segundo mtodo emplea nicamente el caldo McConkey. La incubacin es a 37 C. El tercer mtodo usa el caldo Lactosa Bilis Verde Brillante a 35 37 C, seguido de confirmacin en agar Bilis Rojo-Violeta o en agar Endo. Qu caractersticas tienen las colonias de coliformes en agar Endo y en agar Eosina Azul de Metileno? El medio Eosina Azul de Metileno (EMB) es un medio de plaqueo diferencial que puede usarse en lugar del agar MacConkey en el aislamiento y deteccin deEnterobacteriaceaeo de bacilos coliformes de muestras con bacterias mixtas. Los colorantes anilnicos (eosina y azul de metileno) inhiben a las bacterias Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. Se combinan para formar un precipitado a pH cido y, de este modo, sirven tambin comoindicadoresde laproduccinde cido. Las colonias lactosa (+) dan colonias decolorvioleta, las deE. colipresentan un caracterstico brillo verde metlico, las deEnterobacterpresentan un color violeta sin brillo metlico (ojo de buey). Las colonias deKlebsiellason siempre mucosas, grande y ligeramente rosadas. El medio Endo es un medio selectivo para demostracin deE. colifecal y coliformes en los ms diversosmateriales. El sodio sulfito y la fucsina inhiben a las bacterias Gram (+).E. coliy coliformes utilizan lactosa con formacin de aldehdo y cido. Por otra parte, el aldehdo libera fucsina a partir de la combinacin: fucsina sulfito, lo que da lugar a la coloracin roja de las colonias. En este medio las colonias lactosa (+) presentan una coloracin roja, p.ej.E. colies de color rojo con brillo metlico estable.Enterobacter aerogenesy otros presentan colonias rojas hasta rojizas, semiesfricas y mucosas.Referencias ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA (2005) Obtenido el 07 de febrero de 2008 enhttp://www.ubu.es/investig/aulavirtual/trabajos_05/Analisis_microbiologico_del_agua.pdf ANALISIS MICROBIOLOGICOS (2004) Obtenido el 07 de febrero de 2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf FACULTAD DECIENCIASBIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo enMicrobiologa:ManualdeLaboratorio. Editora Tricelm S.A. 3 Edic. Lima. FUENTES, A. F. y otros (2005).CalidadSanitaria de Alimentos Disponibles al Pblico de la Ciudad de Sonora, Mxico.RevistaSalud PblicayNutricin. Vol. 6 N 3. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www.respyn.uanl.mx/index.html L. ORTIZ, M. (2003) Material didctico de Microbiologa de Alimentos: Recuento de enterobacterias. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006) Coliformes totales y Fecales en agua de consumo humano. Obtenido el 07 de febrero de 2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993)AnlisisMicrobiolgico de los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza. VARGAS, T. (2005) Calidad de la Leche: Visin de laIndustriaLctea. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/xcongreso/P297_CalidadLeche.pdfTABLA NMERO MS PROBABLE PARA COMBINACIONES DE 2 TUBOSNmero de tubos positivos con el inculo indicadondice NMP

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Adaptado de Ortiz, 2003 yFuentes, 2005.Autor:Rmulo Aycachi IngaASIGNATURA : Microbiologa de los Alimentos IDOCENTE :Dra. Graciela Albino CornejoCICLO :2007 - IIEnviado por:Mireya

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGALambayeque, 14 de febrero de 2008.

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