RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Verificar la calidad de los alimentos haciendo uso de los parámetros coliformes totales y coliformes fecales

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar el número de colonias formadas de coliformes totales y fecales en los diferentes medios de cultivo como ser PDA, PCA, MC

Verificar el crecimiento de coliformes totales y fecales en los caldos verde bilis brillante y caldo E.C. respectivamente

INTRODUCCION

Coliformes Totales

La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos.

Hábitat del grupo coliforme

Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales.

Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.

Los coliformes como indicadores

Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano en razón de que, en los medios acuáticos, los coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y

porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriológicamente segura.

Asimismo, su número en el agua es proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces.

Los coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comúnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos. En general, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. Por su amplia diversidad el grupo coliformes ha sido divido en dos grupos: coliformes totales y coliformes fecales.

Bacterias que integran el grupo

El grupo coliforme está formado por los siguientes géneros:

1.Escherichia

2.Klebsiella

3.Enterobacter

4.Citrobacter

FUNDAMENTO TEORICO

Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP).

El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces

de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están

formados por Escherichia coli y ciertas especies deKlebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales.

La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.

En alimentos, la identificación de una concentración elevada de Coliformes Fecales en un alimento es indicador de su contaminación y por tanto su mala manipulación, de ser esto así, se debe declarar al alimento en cuestión como No Apto para el Consumo Humano.

La Organización Mundial de la Salud indica que la problemática de la contaminación de mares y ríos por aguas servidas y desagües a puesto en alto riesgo a la población acuática de directo consumo humano, estando entre ellos los peces. La contaminación producida también contamina la carne de dichos animales, estando por tanto contaminados en su mayor parte desde su fuente de extracción. Es por tanto de mucha importancia en la actualidad pruebas que descarten la presencia de microorganismos contaminantes tan peligrosos como son los Coliformes Fecales

El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan lalactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC.

Este grupo esta conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativascapaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli.

La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarsemediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con característicasselectivas y diferenciales.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas.

Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. colienterotoxigénica (ETEC) E. coli enteropatógena (EPEC)

E. coli enterohemorrágica (EHEC) E. coli enteroinvasiva (EIEC) E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC).

Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados.

Escherichia coli enterotoxigénica ETEC La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetalesfrescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sidocalculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser más baja.

Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los países en vías de desarrollo.

Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 106 microorganismos.

Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentraestrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedadsimilar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños depaíses subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIECprovoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las célulasepiteliales de la mucosa intestinal.

La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir ydestruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en losfagolisosomas.

Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada asípor su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales demonoverde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. LaECEH se ha asociado con colitis hemorrágica

La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne

MATERIALES

Reactivos Materiales y Equipos

Violeta Rojo Bilis Lactosado (VRBL) 8Cajas Petrie desechables

Plate Country Agar (PCA)

Papa Dextrosa Agar (PDA) 8 Tubos de Ensayo Caldo E.Coli (CEC) 5 Pipetas Volumétricas de 1mL y 10 mL

Caldo Verde Bilis Brillante (CVBB) 1 Matraz Erlenmeyer 250 mL

Agua Peptona 1 Mechero 1 Asa de Aguja

Muestra 1 Agitador

Queso menonita 1 Estufa

PROCEDIMIENTO

Protegerse adecuadamente antes de comenzar la práctica es decir colocándose barbijo, gorro y guantes, para posteriormente desinfectar el area de trabajo

Tritura lo mas posibles la muestra de queso menonita Pesar 25 gramos de queso y agregar a 225 mL de agua peptonada, agitando

vigorosamente Agregar 9 mL. De agua peptonada a 4 tubos de ensayo los cuales tendrán una

concentración de 10-2, 10-3, 10-4, 10-5

Enumerar las concentraciones con las que se va a trabajar en las placas petry PCA: 10-3, 10-4, 10-5

PDA: 10-2, 10-3

MC : 10-3, 10-4, 10-5

Para el medio PCA se pipetea 1mL de la solución madre y se vierte al primer tubo de concentración 10-2

Del tubo de concentración 10-2 es extraído 1mL con otra pipeta , la cual es depositada en el tubo de concentración 10-3

De la misma manera que la anteriores del tubo de concentración 10-3 se extrae 2 mL. con una nueva pipeta y es vertido 1 ml al tubo de concentración 10-4 y el 1 mL. Restante a la caja petry de concentración 10-3 TENIENDO SIEMPRE EN CUENTA QUE EN TODAS LAS DILUCIONES SE TRABAJA DETRÁS DEL MECHERO Y QUE PARA CADA DILUCION DE HACE USO DE OTRA PIPETA

Terminado de depositar las diluciones se procede a vaciar el PCA mas o menos que tenga 3-5 mm de espesor y realizar movimientos leves en forma de 8 y 5

Se procede de la misma manera para el medio PDA y MC con la varienta de que las concentraciones en las placas petry son distintas

del tubo de concentración 10-4 se pipetea 2 mL. con la pipeta ya descontaminada y es vertido a la caja petri de concentración 10-4 y el otro 1 ml al tubo de concentración 10-5

Finalmente del tubo de concentración 10-5 se pipetea 1 mL. Y se lo vierte a la caja petry de concentración 10-5

Una vez que las muestras son depositadas en las cajas petri se proceden a destaparlas no por completo y a verter el agar (agua en esta práctica) lentamente hasta que tenga un espesor de 2 cm., luego se tapa la caja y se realizan movimientos en forma de 8 unas 5 veces verticalmente y 3 veces horizontalmente , este procedimiento se realiza con todas las muestras depositadas

SEGUNDA PARTE

Una vez que se hubiesen formado las colonias en el medio MC se verifica la presencia de coliformes totales y coliformes fecales en el caldo verde bilis brillante y caldo EC respectivamente

Para ello se elige una placa petri la cual se encuentre dentro del rango y se toman 2 colonias enumerando cada una, a partir de ahí se elige una colonia para hacer la inoculación en el caldo EC y Caldo verde bilis brillante

Después de haber transcurrido 24 horas después de la siembra se procede con la inoculación de la siguiente manera

Se esteriliza todo el medio con el que se va a trabajar es decir mesones y se protege uno adecuadamente (barbijo , guantes y gorro)

Posterior a ello se esteriliza el asa en un mechero se deja enfriar y se destapa la placa petry de concentración 10-3 se pincha la colonia uno y se le agrga al tubo de ensayo verde bilis brillante teniendo el cuidado de calentar la boquilla en el mechero antes y después de la inoculación

Se vuelve a esterilizar el asa en el mechero dejando que enfrie por unos segundos y se vuelve a pinchar la colonia 1 se destapa el tubo de ensayo que contiene el caldo EC y se lo agrega se agita levemente y se tapa el tubo teniendo el cuidado de calentar la boquilla antes y después de la inoculación

De la misma manera se procede con la colonia # 2 inoculando en los 2 tubos

CALCULOS Y RESULTADOS

MEDIO: PCA

Dilución 10-3 Dilución10-4

Dilución10-5

24 HORAS Incontable IncontableIncontable

48 HORAS Incontable Incontable341

Debido a que los datos obtenidos en nuestras diluciones en caja petry sobrepasan el rango se trabajara con estos por motivos de practica

RTBAM: 3.4*107 UFc/g

MEDIO: PDA

M y L= 4.2*105

MEDIO: MC

VERIFICACION

Dilución 10-2 Dilución10-3

24 HORAS Incontable Incontable

48 HORAS Incontable 420

Dilución 10-3 Dilución10-4

Dilución10-5

24 HORAS 96 3 0

COLONIA #1 COLONIA #2

CALDO VERDE BILIS BRILLANTE (Presencia de CT )

Positivo Positivo

CALDO E.C.(Presencia de CF)

Positivo Positivo

MEDIO : MC

PARAMETRO: Coliformes totales

CT = 96*(2/2)* 103 = 9.6 * 104 UFc

PARAMETRO: Coliformes fecales

CF= 96*(2/2)* 103 = 9.6 * 104 UFc

MEDIO: PCA

10-2 10-3

24 HORAS

48 HORAS

24 HORAS

48 HORAS

MEDIO: PCA

MEDIO MACONKEY

10-3 10-4 10-5

24 HORAS

OBSERVACIONES

Las colonias típicas de coliformes presentan un halo rojo

En el medio PCA hubo crecimiento de mohos En los medio PCA y PDA los microorganismos no se encontraban dentro del rango

de la ISO para hacer el recuento correspondiente Los caldo VBB presentan turbidez Los caldos EC inicialmente eran de color amarillo tenue después de la inoculación

se tornan de un blanco lechoso con presencia de precipitado El caldo EC inicialmente tiene una coloración verde

CONCLUSIONES

La muestra de queso tiene 9.6 * 104 UFc/g en coliformes totales como coliformes fecales lo cual nos indica que no es apta para el consumo

El medio utilizado en la practica es el MC que es una medio selectivo diferencial para la detección de organismos coliformes y patógeno entéricos.