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Resumen: Se exploró un método de secuenciación por cercenamiento químico, analizable en un solo carril electroforético, que tiene perspectivas para ser adaptable al análisis mediante espectrometría de masas en la modalidad de MALDI-TOF. Un oligodesoxirribonucleótido de 32 bases, conteniendo los cuatro diferentes tipos de base, radiomarcado con P-32 en su terminal 5’, fue sometido por una hora a 110°C a solvólisis en solución acuosa de diversas aminas al 0.5 M y en diferentes concentraciones de sal. Luego de electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida y autorradiografía, se evaluaron los autorradiogramas en cuanto a la claridad del patrón de bandas obtenidos y la interpretabilidad de estos patrones en términos de la secuencia del oligonucleótido inicial. Las aminas u otras bases que se investigaron fueron amoniaco, 1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano, dietilamina, etilamina, etilendiamina, morfolina, piperidina, pirrolidina, trietilamina, quinuclidina (todos a 0.5 M), así como hidróxido de sodio (a 0.01 M). Se observó que las diferentes aminas se distinguen en su reactividad general para con el oligonucleótido, teniendo generalmente las aminas más básicas una reactividad mayor. En cunato a la comparación de las intensidades de las bandas a lo largo de un determinado carril electroforético, las intensidades para las bandas que representan los diferentes tipos de bases se ordenan como A > G > C > T para las aminas fuertemente básicas, y G > A > C > T para las bases más débiles. El efecto de sal sobre las intensidades de las bandas se da ante todo para las bandas G, las cuales tienden a disminuir en intensidad al aumentar la concentración de sal en la solución de solvólisis. Las escaleras de bandas en los autorradiogramas mostraban una separación aproximadamente pareja entre bandas sucesivas, pero evidenciaban cierta diferencia dependiendo del tipo de banda: bandas G ostentaban una separación relativamente grande hacia la siguiente banda en el carril, mientras que para bandas C esta separación era pequeña. Los hidrolisatos que se obtienen por solvólisis en piperidina acuosa producen autorradiogramas que se pueden analizar en términos de secuencia, de acuerdo a los siguientes criterios: bandas A, intensidad fuerte; bandas T: intensidad débil; bandas G: intensidad mediana, con paso largo hacia la siguiente banda; bandas C: intensidad mediana, con paso corto hacia la siguiente banda. Para evaluar el potencial de analizar estos tipos de hidrolisatos por el método de espectrometría de masas MALDI-TOF en lugar de electroforesis/autorradiografía se calcularon espectros de masa que se obtendrían del 32-mero por solvólisis en solución acuosa de amoniaco. Se dedujo que espectros de masa experimentales debieran de ser interpretables en términos de secuencia, a pesar de que estos espectros contendrán, de manera superpuesta, dos conjuntos anidados de fragmentos. También se dedujo que a nivel de oligonucleótidos de una longitud de veinte bases, el ensanchamiento de bandas originado por la heterogeneidad isotópica de los fragmentos no dificultaría la interpretabilidad de los espectros.

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Introducción Oligodesoxirribonucleótidos de secuencia definida son imprescindibles para diversas aplicaciones centrales en el ámbito de las ciencias de la vida, como son la secuenciación del ADN, estudios de diversas índoles por medio de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), y detección o identificación de secuencias específicas de ácidos nucleicos por métodos de hibridación (ya sea en la modalidad de sonda soluble como en el Southern blot o en el Northern blot, o sea con sondas ancladas en superficies fijas, como en el caso de las microplantillas). Estas aplicaciones son de importancia central para el estudio de genes y genomas, para pruebas de identidad en los ámbitos cívico y forense, para estudios genealógicos y para el diagnóstico molecular tanto de enfermedades infecciosas como de predisposiciones genéticas. Estos oligonucleótidos se obtienen de manera rutinaria por síntesis en soporte sólido efectuada de manera automatizada en máquinas especializadas. La automatización de esta síntesis hace que los oligonucleótidos sean asequibles a un costo moderado y con un alto grado de confiabilidad en cuanto a la secuencia de las bases que las componen. Sin embargo, debido al papel central que estos materiales desempeñan en varias aplicaciones de importancia crítica, es de interés disponer de una metodología rápida, económica y confiable para la secuenciación de oligodesoxirribonucleótidos, para confirmar, en un sentido de control de calidad, la secuencia que se le había dictado a la máquina sintetizadora. Tales métodos aún no existen para oligonucleótidos, a diferencia de la situación que impera en el caso de los polinucleótidos, donde se han registrado avances importantes en metodología que ahora permiten la secuenciación rutinaria y relativamente económica de genomas enteros. Las mejoras metodológicas para la secuenciación de polinucleótidos, basadas en general en el método de extensión enzimática originalmente descrito por el grupo de Sanger (Sanger y col., 1977), no son aplicables al caso de oligonucleótidos, que requieren de técnicas diferentes para su secuenciación, generalmente basadas en un cercenamiento químico del oligonucleótido muestra, como originalmente fue descrito por Maxam y Gilbert (1977). El abordamiento propuesto por Maxam y Gilbert (1977, 1980) y posteriormente enriquecido por la contribución de otros grupos científicos (Friedman y Brown, 1978; Rubin y Schmid, 1980; Krayev, 1981; Simoncsits y Török, 1982, Sverdlov y Kalinina, 1983; Iverson y Dervan, 1987) involucra la marcación del oligonucleótido muestra en uno de sus extremos (normalmente con una marca radioisotópica) seguida de cuatro tratamientos químicos en paralelo, de los cuales cada uno es específico o selectivo para atacar una de las cuatro bases que componen el ADN, luego la resolución de las mezclas de productos obtenidas en cuatro pistas electroforéticas en paralelo y finalmente la evaluación autorradiográfica de los electroferogramas obtenidos. Un abordamiento más simple y por ende más atractivo para la secuenciación confirmatoria de oligonucleótidos ha sido explorado por los grupos de Pless (Ambrose y Pless, 1985, 1987; Ambrose y col., 1986, 1988; Testoff y Pless, 1991) y de Di Mauro (Negri y col., 1991, 1994, 1996; Ferraboli y col., 1993; Di Mauro y col., 1994), quienes utilizaron una sola reacción de cercenamiento (ya sea aminólisis o solvólisis en solución acuosa de formamida, en ambos casos a alta temperatura), seguida del análisis en una única pista electroforética. En el afán de desarrollar un procedimiento confiable para la secuenciación confirmatoria de oligonucleótidos por este tipo de cercenamiento químico se procedió ahora a examinar en detalle el efecto de diferentes aminas y de diferentes condiciones de sal sobre la calidad y la interpretabilidad del autorradiograma final obtenido, con el fin de definir condiciones óptimas para la reacción de cercenamiento. Utilizando el ejemplo de un oligodesoxirribonucleótido de 32 bases, radiomarcado con P-32 en su extremo 5’, como material a secuenciar, se examinaron las siguientes aminas u otras bases: amoniaco, 1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano, dietilamina, etilamina, etilendiamina, morfolina, piperidina, pirrolidina, trietilamina, quinuclidina (todos a 0.5 M), así como hidróxido de sodio (a 0.01 M). Varias de estas aminas fueron probadas a diferentes concentraciones de sal: 0.3 M de NaCl, 1 M de NaCl o de LiCl, o 3 M de LiCl. Los resultados obtenidos se detallan en el presente informe. Con la idea de que este tipo de secuenciación de oligonucleótidos también se pudiera prestar a una evaluación rápida e incluso automatizable por espectrometría de masas en la

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modalidad de MALDI-TOF, se calcularon los espectros de masa que se producirían en la amonólisis del mismo, para delinear la probabilidad de éxito de tal abordamiento y para identificar posibles problemáticas.

Métodos y materiales:

Oligonucleótidos: Los oligodesoxirribonucleótidos utilizados en el presente trabajo fueron obtenidos por el proveedor Operon Biotechnologies, Inc. Huntsville, Alabama, EE.UU, y fueron usados sin purificación especial. Las secuencias de estos oligonucleótidos se dan a seguir:

I: (Un 32-mero) d-GGT TAT TTA GTT TTA TGA CGC GTG CCT TTC CC (5'-3') II: (un 19-mero) d-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G (5'-3') (SP6 Promoter Primer) III: (un 20-mero) d-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG (5'-3') (T7 Promoter Primer) IV: (un 18-mero) d-ATG AAC TTA GGT CCA GCT (5'-3') (T3 Promoter Primer) Reactivos: Etilamina acuosa 70%, 1,6-diaminohexano 98%, etanolamina 99%, N,N,N’,N’-tretrametiletilendiamina (TEMED), todos de Aldrich, y amoniaco acuoso de Mallinckrodt, fueron usados sin ningún tratamiento. Piperidina y etilendiamina, ambos de Fisher Scientific Co., dietilamina de J.T. Baker, así como morfolina y pirrolidina, ambos de Aldrich, fueron purificados por destilación a presión atmosférica. DABCO (1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano, de Aldrich, fue sublimado bajo vacío. Quinuclidina de Aldrich fue recristalizada con éter etílico. Trietilamina fue purificada por reflujo con cloruro del ácido p-toluensulfónico seguido de doble destilación. El NaOH utilizado fue adquirido de Merck, grado analítico. Marcaje en la terminal 5´: Los oligonucleótidos fueron provistos de marca isotópica en la términal 5' usando métodos rutinarios. Típicamente 10 nmol de oligonucleótido, que llevaba el término 5' abierto (es decir: 5'-OH), fueron fosforilados, en 10 µL de amortiguador para cinasa (70 mM Tris.HCl, pH 7.6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1mM 2-mercaptoetanol), con 3 µCi de [γ-32P] ATP, en presencia de 10 unidades de cinasa de polinucleótidos del fagoT4 (de Invitrogen) por 30 min a 37°C. La mezcla fue sometida a electroforesis, en un gel (40 cm de largo, 0.8 mm de espesor) de poliacrilamida al 12% con 5% de entrecruzamiento con N,N'-metilenbis(acrilamida) en un amortiguador de 100 mM Tris, 100 mM de ácido bórico, 2 mM de Na2EDTA, pH 8.3, por 130 minutos a 700 V. Después de la electroforesis, la banda radioactiva en el gel fue localizada por autorradiografía en película de rayos X. El material de la banda fue aislado por escisión de la franja del gel, trituración y extracción con agua por 16 horas a 37°C. Luego de una microcentrifugación, el sobrante fue adicionado con acetato de amonio hasta 0.8 M, se añadió un 250% en volumen de etanol absoluto, se mezcló y se enfrió por 30 min a -70°C. Después de una microcentrifugación, de dos lavados en frío con etanol-agua (7:3, v/v), y de un secado en vacío, el precipitado fue redisuelto en 20 µL de agua destilada. Amonólisis de los oligonucleótidos marcados: Una muestra de 4 µL de la solución de oligonucleótido marcado con 32P fue mezclada con una solución acuosa de la amina de interés y con solución acuosa de NaCl o de LiCl, para obtener 30 µL de solución final que contenía 0.5 M de piperidina y NaCl al 0.3 M o 1 M, o LiCl al 1 M o 3 M. La solución fue sellada en un tubo capilar de vidrio de borosilicato, y el tubo fue calentado a 110°C por 60 min en un baño de aceite de silicón. El tubo capilar fue fracturado en uno de los extremos, el contenido fue transferido a un tubo Eppendorf, y a la solución se le adicionó acetato de sodio ajustado a pH 5.2 hasta 0.3 M y tRNA total de levadura hasta 0.3 mg/mL. Tras añadidura de 3 volúmenes de etanol absoluto, se mezcló, se mantuvo a -70°C por 72 horas y se precipitó por micro centrifugación. Se eliminó el sobrenadante por micropipeteo, y se lavó el residuo dos veces con etanol absoluto en frío. Tras secado en vacío, el residuo fue redisuelto en 6 µL de agua destilada. Electroforesis en gel de poliacrilamida: Para el análisis de los aminolisatos por electroforesis, se mezcló un volumen de 2 µL de la muestra con 4 µL de solución de carga (formamida que

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contenía los tintes XC y BPB), y la mezcla resultante fue cargada en un pozo de carga de un gel de secuenciación (40 cm de largo y 0.4 mm de espesor) de poliacrilamida al 20% con 5% de entrecruzamiento con Bis, en 100 mM Tris, 100 mM ácido bórico, 2 mM de Na2EDTA, pH 8.3, con urea al 7 M, y se sometió a electroforesis por 2 horas a 2500 V, hasta que el XC y el BPB hayan migrado distancias de 5.7 cm y 10.8 cm, respectivamente. Tras abrir la caseta de vidrio, el gel fue cubierto con una folia de Saran, y puesto en contacto con una película Kodak XAR-5, para su autorradiografía a -70°C, con pantalla intensificadora (Cronex Lightning Plus, DuPont), por 20 horas. Evaluación visual de bandas electroforéticas: Las autorradiografías fueron examinadas a trasluz sobre una mesa de luz. Para cada carril, se estimaron las intensidades relativas de las bandas correspondientes a las diversas bases. Para ubicarse dentro de cada escalera de bandas se utilizó la secuencia conocida de los oligonucleótidos sintéticos, así como la distribución de las bandas de diferentes intensidades en el carril correspondiente a la piperidinólisis, para los cuales las reglas de interpretación se conocían de trabajos anteriores (Ambrose y Pless, 1985, Ambrose y Pless, 1987). Evaluación de bandas electroforéticas por densitometría: Las autorradiografías fueron escaneadas, con la cara de la emulsión hacia la luz, en un escáner HP modelo 4300C con una resolución de 600 puntos por pulgada. Para la densitometría se evaluaron, con un algoritmo en MATLAB, los datos a lo largo de la línea central del carril electroforético. El algoritmo en MATLAB es el siguiente: Begin, Read image Shave image Select empty places Get empty places average→ EPA Select the beginning and end point where laid interesting data Begin line tracking Absorbance (i) = Log 10 (intensity/EPA) End tracking Plot (absorbance) End.

Análisis de movilidades de las bandas: Las movilidades de las bandas a lo largo de cada carril fueron evaluadas visualmente en la autorradiografía trasiluminada sobre la mesa de luz, midiendo con una escala milimétrica las distancias entre el pozo de carga y la parte central de cada banda, estimando décimas de milímetros. Cálculos: Los cálculos para las composiciones teóricas de las mezclas de fragmentación de oligonucleótidos se realizaron en la computadora con el programa Origin versión 6.1. Reacciones de aminólisis de oligonucleótidos para su posterior análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF: Como recipientes para llevar a cabo las reacciones a alta temperatura se utilizaron tubos capilares de vidrio de borosilicato de 1.5 a 1.8 mm de diámetro exterior, cerrados en un extremo. Micropipetas de vidrio fueron preparadas a partir de tubos capilares de vidrio de borosilicato de 1.5 a 1.8 mm de diámetro externo, abiertos en los dos extremos. Estos dos cabos fueron pulidos al calor de un mechero de gas, y finalmente la parte central del tubo fue estirada al calor del mechero, para crear dos puntas finas que se podían introducir al interior de los tubos capilares semiabiertos antes mencionados. Estas micropipetas se usaron para el vertido de

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pequeños volúmenes de líquido acuoso (en el intervalo de 5 a 30 μL), utilizando un micropipetador para capilares (Drummond, EE. UU.). Las mezclas para las reacciones de aminólisis se realizaron en tubos Eppendorf sobre hielo. A 29 μL de agua desionizada se le añadió 1 μL de solución de oligonucleótido al 0.01 M y 10 μL de solución de amoniaco o de amina al 2 M. Se mezcló bien, para obtener soluciones con 0.5 M de amoniaco o 0.5 M de amina, respectivamente. De cada una de estas soluciones se transfirieron tres alícuotas de aproximadamente 10 μL a sendos tubos capilares, sobre hielo. Las capilares fueron selladas al calor del mechero de gas e incubadas por 20 min, 60 min, o 180 min a 110°C en un heat block (marca Lab Line). Las capilares fueron limpiadas en su superficie externa con etanol y abiertas por fractura en un extremo. El contenido líquido de cada una de estas capilares fue transferido por micropipeta de vidrio de borosilicato, a un tupo Eppendorf. Éstos fueron almacenados en forma destapada, en un disecador de vidrio a temperatura y presión ambiente, sobre silicagel, por 2 días. Finalmente fueron tapados y almacenados a -20°C en espera de su análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF. Los experimentos de MALDI-TOF aún esperan a que se componga el equipo con el cual se había contado para estos estudios, en el CINVESTAV de Irapuato. La Figura 1 muestra la autorradiografía, fotografiada a trasluz, de las electroforesis correspondientes a reacciones de cercenamiento químico del 32-mero marcado con P-32 en su terminal 5’. Estas reacciones de fragmentación se llevaron a cabo mediante solvólisis por 1 hora a 110°C, en solucíon acuosa de amoniaco o de amina al 0.5 M. También se incluyó en el trabajo con solución acuosa de hidróxido de sodio al 0.01 M. En todos los casos la reacción de solvólisis incluía cierta concentración de cloruro de sodio: 0.3 M en los carriles 1-10, y 1 M en los carriles 11-20. La dirección de la electroforesis es hacia abajo en la imagen. La interpretación de las bandas está indicada por letras en la columna centra de la imagen. En cada caso se nota, en la parte superior del carril, una banda intensa que representa el material mayoritario, que es el 32-mero intacto. En posiciones inferiores en el carril se observa una sucesión de bandas de menor intensidad, que representan los fragmentos que resultaron del cercenamiento del 32-mero en diferentes posiciones de la cadena. Simple interpretación visual indica que las aminas varían en cuanto a su reactividad general con el oligonucleótido inicial. Se observa que los tratamientos con amoniaco, etilamina, etilendiamina, dietilamina, piperidina, quinuclidina y NaOH (este último a concentración de 0.01 M) producen bandas de producto de intensidades medianas, mientras que los tratamientos con morfolina, trietilamina y DABCO resultan en bandas producto de intensidad menor. Esto significa que, de una manera general, estas últimas tres aminas son notablemente menos reactivas con el oligonucleótido. Una comparación de los carriles correspondientes a la misma amina, pero a diferentes concentraciones de sal, muestra que la reactividad general de las minas no cambia de manera importante entre las condiciones de 0.3 M de NaCl y 1 M de NaCl. Evaluando visualmente la intensidad de las bandas a lo largo de cada carril electroforético se observa que estas intensidades pueden variar de manera significativa entre las diferentes bandas. Generalmente, para las bandas indicativas del mismo tipo de base, las intensidades dentro de un dado carril electroforético son paracticamente iguales. Así, para el carril 5 (tratamiento con piperidina, con NaCl al 0.3M) se observa que todas las bandas indicativas de posiciones de timinas (bandas T) son débiles y de intensidad semejante, las bandas A son todas fuertes y parecidas entre sí en su intensidad, mientras que las bandas G y C tienen una intensidad intermedia. Comparando estas secuencias de intensidad para diferentes carriles, se nota que estas secuencias se pueden dar de manera diferente para los diferentes tratamientos. Por ejemplo, se observa que el tratamiento con amoniaco en presencia de NaCl al 0.3 M (carril 1) produce fuertes bandas para posiciones G, bandas de intensidad mediana para posiciones A, mientras que las bandas C son débiles y las bandas T más débiles aún (es decir, la secuencia de intensidades es G > A > C > T), mientras que la secuencia de intensidades de bandas para el tratamiento con piperidina es las mismas condiciones de sal (carril 5), ya arriba

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enunciada (A > G = C > T), es claramente diferente. Esto significa que la susceptibilidad relativa de las bases al ataque químico por las diferentes aminas puede ser diferente.

Figura 1: Autorradiograma obtenida tras solvolisis del 32-mero marcado en su terminal 5' con 32P, durante 1 h, a 110°C, 0.5 M para las aminas y NaOH 0.1 M, en presencia de NaCl 0.3 M carriles 1-10 y NaCl 1M carriles 11-20. Carriles: 1 y 11: amoniaco; carriles 2 y 12: etilamina; carriles 3 y 13: etilendiamina;carriles 4 y 14: dietilamina; carriles 5 y 15: piperidina; carriles 6 y 16: morfolina; carriles 7 y 17: trietilamina; carriles 8 y 18: DABCO; carriles 9 y 19: quinuclidina; carriles 10 y 20: NaOH. En la columna central esta indicada la secuencia de bandas. Una comparación minuciosa de los patrones de intensidad obtenidos para la misma amina en las dos condiciones de sal muestra en algunos casos que el tratamiento con la misma amina puede resultar en diferentes secuencias de intensidad, dependiendo de la concentración de sal presente durante la reacción de solvólisis. Así, una inspección del carril 15 mustra que, a 1 M de NaCl, la secuencia de intensidades producida por piperidinólisis es A > C > G > T, mientras que, como ya se había mencionado, en condiciones de NaCl al 0.3 M, este tratamiento había producido patrones que obedecían la secuencia A > G = C > T (carril 5). Esto demuestra que la susceptibilidad relativa de los diferentes tipos de base del ADN al cercenamiento químico por aminólisis depende no sólo de la amina particular empleada, sino también de la concentración de sal presente durante la reacción. Los resultados de estas evaluaciones visuales están resumidos en la Tabla 1. Generalizando estos resultados, se concluye que la susceptibilidad de las posiciones de adenina, citosina y timina sigue en todos los casos el orden A > C > T. La colocación de la susceptibilidad de las guaninas dentro de este orden de vulnerabilidades depende de las condiciones exactas del experimento y parece correlacionarse ante todo con la basicidad de la amina empleada y con la concentración de la sal durante la solvólisis. Se nota que para el amoniaco, una base relativamente débil entre las que fueron ensayadas, los sitios ocupados por guaninas son los más frecuentemente cercenados, en todas las fuerzas iónicas examinadas (0.3 M, 1 M, 3 M). Otras aminas de baja basicidad (1,6-diaminohexano, TEMED, etanolamina)

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ostentan el mismo orden de intensidades (G > A > C > T), aunque a menor intensidad general de señal (Figura 2, carriles 3-5). Para las aminas más fuertemente básicas (dietilamina, piperidina, trietilamina, quinuclidina) los sitios de adenina son los más vulnerables en todas las concentraciones de sal ensayadas, y las guaninas descienden en el orden de reactividades al aumentar la concentración de sal. Por ejemplo, para aminólisis con quinuclidina, las bandas G aventajan a las bandas C en intensidad con NaCl al 0.3 M, son aproximadamente iguales a las bandas C con NaCl al 1 M, y son más débiles que las bandas C con LiCl al 3 M. Una disminución similar en la intensidad de las bandas G acompaña el aumento en concentración de sal para aminólisis con piperidina y dietilamina. Tabla1. Susceptibilidad diferencial con las diferentes aminas

Susceptibilidad diferencial de las bases observada en la solvólisis con diferentes aminas, a 110°C, en presencia de 3 diferentes concentraciones de sal. Para una consideración más cuantitativa de estos efectos se presentan en la Tabla 2, en orden ascendente, los valores de pKa para las formas protonadas de varias aminas empleadas en el presente trabajo, publicados en la literatura para soluciones acuosas de aminas, para 25°C, a alta dilución y baja fuerza iónica. Estos valores de pKa van de 8.49 (para morfolina) hasta 11.30 (para pirrolidina). La Tabla 2 también lista, para soluciones acuosas de estas aminas al 0.5 M, los valores de pH calculados para 25°C; estos van de 11.09 (para morfolina) hasta 12.48 (para pirrolidina). Por supuesto, el punto de verdadero interés es la comparación de los valores de pKa para estas aminas en solución acuosa a 110°C, es decir en las condiciones que se emplearon en las aminólisis que son el tema del presente trabajo. Es probable que la secuencia de basicidades de estas aminas a 25°C que se muestra en la Tabla 2 también se mantenga, al menos de una manera aproximada, a la temperatura de 110°C. Para las aminas para las que se han publicado datos termodinámicos fehacientes (generalmente para el intervalo de 0°C hasta 50°C), se calcularon los valores de pKa a 110°C; estos valores calculados están listados en la Tabla 2. Se observa que al menos estas aminas siguen a 110°C el mismo orden de basicidad que ostentan a 25°C. Con esto se puede concluir que la reducción en la tasa relativa de cercenamiento en posiciones G sigue de manera aproximadamente monótona la serie de basicidad de las aminas.

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Tabla 2. Basicidad de diferentes aminas

Para una evaluación más cuantitativa de las intensidades relativas de las bandas producidas por las diferentes aminas cada uno de los carriles mostrados en la Figura 1 fue evaluado densitometricamente. Los resultados confirman las generalizaciones mostradas en la Tabla 1. La Figura 3 muestra el resultado que se obtuvo del carril de piperidina/NaCl 0.3 M. Se puede observar que el orden de las intensidades de las bandas es A > G = C > T, es decir el mismo que se había deducido en el simple análisis visual. En la Figura 4 se comparan los perfiles densitométricos obtenidos por aminólisis con amoniaco, dietilamina y piperidina (carriles 1,4 y 5 en la Figura 1), en presencia de NaCl al 0.3 M. En el caso del amoniaco, las bandas G son dos veces más intensas que las bandas A, mientras que en el caso de la dietilamina y de la piperidina las bandas G son 2/3 tan fuertes como las bandas A. Todas las bases examinadas en este trabajo producen un patrón característico en la imagen de autorradiográfica. La Figura 1 muestra que, en los diferentes carriles, los fragmentos correspondientes comigran. Esto propone que todos tienen la misma estructura análoga, que sería una estructura de oligonucleótido rematado en un fosfomonoéster radiomarcado en su terminal 5’ y un fosfomonoéster sin marca isotópica en su terminal 3’. Esta conclusión se basa en la comparación previamente hecha (Ambrose y Pless, 1985) entre fragmentos obtenidos mediante piperidinólisis directa con fragmentos obtenidos mediante métodos clásicos de cercenamiento a la manera de Maxam y Gilbert. Sin embargo, vale enfatizar que algunas de las aminas ensayadas difieren en su capacidad de producir un conjunto anidado limpio, compuesto unicamente de fragmentos radioactivos que difieran en sus tamaños por unidades nucleotídicas enteras. Esto es una consideración importante para definir condiciones para un procedimiento para la secuenciación confiable de oligonucleótidos. A manera de ejemplo, la evaluación de diferentes carriles en la Figura 1, con un enfoque en los carriles donde la intensidad de las bandas es generalmente fuerte, indica que la piperidinólisis produce los padrones de fragmentación más limpios, mientras que la solvólisis con dietilamina es ligeramente peor en este respecto. Para este último tratamiento, la Figura 4.b muestra una banda muy tenue, justo encima de la banda G en la secuencia TTTAGTTTT, que está prácticamente ausente en el perfil densitométrico de los productos de piperidinólisis (Figura 4.c). Por otra parte, para los

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tratamientos con amoniaco, etilamina, dietildiamina, etilendiamina, quinuclidina y NaOH al 0.01 M se constata la presencia de bandas supernumerarias significativas (para el caso de

amoniaco, véase la densitometría en la Figura 4.a, con una banda falsa muy notoria justo encima de la banda G). Este fenómeno se observa de manera reproducible, y parece ser independiente de la concentración de sal, puesto que una inspección de la Figura 1 muestra que las bandas supernumerarias se presentan de la misma manera para determinada amina tanto a 0.3 M como a 1 M de NaCl. Estas bandas probablemente se deben a que con estas aminas la segunda eliminación β dentro de la cadena oligonucleotídica se verifica sólo en una medida incompleta, con lo que permanecerían fragmentos con movilidad menor, ya que sin la segunda eliminación β el producto es ligeramente más largo y además tiene menor carga negativa total, puesto que en este caso el grupo fosfato más cercano a la terminal 3’ se encuentra en forma de un fosfodiéster con carga negativa de unidad, mientras que un fosfomonoéster terminal ostentaría, en las condiciones de la electroforesis, una carga negativa mayor. Para confirmar la validez de las conclusiones derivadas del estudio del 32-mero, para oligonucleótidos de menor tamaño, como comunmente se usan de cebadores para la reacción de PCR o para secuenciación por el método de terminadores, se evaluaron también los patrones de fragmentación de dos oligonucleótidos producidos comercialmente y ampliamente usados, a saber el SP6 Promoter Primer y el T7 Promotor Primer, marcados con P-32 en sus terminales 5’, y sometidos a solvólisis a alta temperatura en piperidina 0.5 M/LiCl 1 M o en amoniaco 0.5 M/NaCl 0.3 M. Estas condiciones fueron seleccionadas debido a que piperidinólisis produce los patrones de fragmentación más limpios y porque aminólisis es el modo de solvólisis más prometedor para su posterior análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF. Para estos dos oligómeros, la Figura 5 muestra intensidades de bandas en el orden A > G = C > T en el caso de

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solvólisis en piperidina 0.5 M/LiCl 1 M, y en el orden G > A > C > T para solvólisis en amoniaco 0.5 M/NaCl 0.3 M.

La Figura 5 también muestra un carril derivado de solvólisis en pirrolidina 0.5M/NaCl 0.3 M (carril 5), donde la intensidad general de las bandas y las intensidades diferenciales para las bases se asemejan a lo que normalmente se observa para tratamiento con piperidina acuosa a baja concentración de sal (A > G = C > T). Esto evidencia que la pirrolidina funge de manera similar a la piperidina en estas secuenciaciones, lo que no es sorprendente dada la similitud de estas dos aminas en cuanto a su basicidad (ver Tabla 2) y su geometría molecular. Los conjuntos anidados que se ven en estos autorradiogramas presentan la correlación normal entre los tamaños de los fragmentos y su movilidad electroforética: cada extensión de la cadena por una unidad nucleotídica redunda en una disminución de movilidad. Estos cambios de movilidad pueden ser diferentes en función de la base involucrada en la extensión. Como ya fue observado por Maxam y Gilbert (1977), las bandas G se caracterizan por una separación grande de la banda que aparace en la posición superior inmediatamente vecina en el gel, mientras que para las bandas C esta separación es corta. Esto significa que, dentro de un conjunto anidado, la extensión de la terminal 3’ por una unidad de desoxiguanilato redunda en una mayor desaceleración electroforética, comparado con el caso de una extensión por una unidad desoxicitidílica. Estas separaciones entre bandas consecutivas deben de ser interpretadas dentro del contexto local, ya que el valor promediado de la separación entre las bandas disminuye de manera sistemática a medida que vamos ascendiendo en el gel. Como fue publicado por Southern (1979), movilidad electroforética (m) y longitud de fragmento (L) guardan una relación aproximadamente inversa: 1/m y L. Esto se aprecia en la Figura 6, donde se graficó m en función de L derivada de los datos del carril 15 de la Figura 1; la gráfica muestra una relación aproximadamente hiperbólica entre estos dos parámetros. Por lo tanto, una gráfica de 1/m vs. L debiera de ser aproximadamente lineal, lo que de hecho se aprecia en la Figura 7, donde los datos fueron regraficados de esta manera. En otras palabras, 1/m, o sea la lentitud del fragmento, es una función lineal del tamaño del fragmento. En superposición sobre esta relación general, se encuentra que el aumento en lentitud para cada extensión dentro del conjunto anidado refleja a la base involucrada, como se observa en la Figura 8, donde se graficaron los aumentos individuales, Δ(1/m), para cada paso, en función de la longitud del

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fragmento. Se observa que los valores de Δ(1/m) para las bandas G son aproximadamente 30% mayores a los valores de Δ(1/m) para las bandas C. Para las bandas T la deceleración es algo menor que para las bandas G, mientras que las bandas A muestran una deceleración ligeramente mayor que las bandas C.

Estos estudios muestran que una manera de secuenciar oligodesoxirribonucleótidos radioamarcados en su termiinal 5’ es la de parcialmente degradar el oligómero por solvólisis en solución acuosa de piperidina, a temperatura de 110°C, y analizar el autorradiograma finalmente obtenido usando los criterios de intensidad relativa y separación de bandas: posiciones A se caracterizan por intensidad de banda fuerte, posiciones T por intensidad baja, bandas del tipo C o G son de intensidad intermedia, pero se distinguen por tener las bandas G una separación grande de la siguiente banda en el gel, mientras que para bandas C esta separación es pequeña.

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Para estimar la posibilidad de adaptar este tipo de análisis interpretación por espectrometría de masas en la modalidad MALDI-TOF, se llevaron a cabo simulaciones matemáticas de las distribuciones de fragmentos que se obtendrían a partir de nuestro 32-mero ejemplo por solvólisis en solución acuosa de amoniaco. A diferencia de la situación que impera en el caso de marcación radioactiva en 5’, y posterior electroforesis y autorradiografía, en el análisis de la mezcla de fragmentación por MALDI-TOF se verán dos conjuntos anidados de fragmentos, uno alineado en la terminal 5’ inicial, y otro anidado en la terminal 3’ inicial. Se estimó, sobre la base de las observaciones que se hicieron en la densitometría en Figura 4.a, que las propensiones para fragmentación en posiciones G, A, C y T se relacionarían como 8:4:2:1. Con eso, si k es la constante de reacción de primer orden para cercenamiento en una posición T, las constantes de reacción correspondientes a posiciones C, A o G tendrían valores de 2k, 4k y 8k, respectivamente. En dependencia del tiempo de solvólisis t, el grado fraccional del cercenamiento en una posición T determinada está dado por : T+ = 1 – exp(-kt), y el grado fraccional del no cercenamiento en una posición determinada de T está dado por: T- = exp(-kt). De manera análoga tenemos, para cercenamiento o no cercenamiento en posiciones ocupadas por los demás tipos de base: C+ = 1 – exp(-2kt); C- = exp(-2kt); A+ = 1 – exp(-4kt); A- = exp(-4kt); G+ = 1 – exp(-8kt); G- = exp(-8kt) A partir de estas expresiones fraccionales se calcula la representación fraccional de un fragmento de interés tras determinado tiempo de solvólisis como el producto de las probabilidades de los varios procesos involucrados, a saber la probabilidad de que se haya dado el corte en la posición que delimita el fragmento, y la probabilidad de que no haya ocurrido cercenamiento en ninguna de las posiciones río arriba de ese corte. Como ejemplo, la representación fraccional del producto heptamérico GGTTATT tras un tiempo t de amonólisis se calcula como: G- x G- x T- x T- x A- x T- x T- x T+ = = exp(-8kt) x exp(-8kt) x exp(-kt) x exp(-kt) x exp(-4kt) x exp(-kt) x exp(-kt) x (1 - exp(-kt)) La Figura 9 muestra, para un tiempo de amonólisis de t x 0.03t1/2, donde t1/2, es el tiempo medio de sobrevivencia de una determinada posición T, la distribución calculada para el conjunto anidado de los fragmentos que contienen la terminal 5’ inicial en la escala que está dada por las masas moleculares de los fragmentos. De manera similar, la Figura 10 muestra la distribución correspondiente al conjunto anidado de fragmentos que contienen la terminal original 3’.

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Obviamente, en un análisis de MALDI TOF, los dos conjuntos aparecerán de forma superpuesta, de manera que se verá un espectro del tipo mostrado en la Figura 11a, en dos colores, para poder distinguir los fragmentos contribuidos por cada uno de los dos conjuntos anidados, y en un solo color en la Figura 11b, para indicar cómo en realidad aparecerá la mezcla de fragmentos en el experimento de MALDI-TOF. La pregunta central es si este tipo de espectro será interpretable en términos de la secuencia del oligonucleótido inicial. Nuestra interpretación es que debiera de ser así, dada la alta resolución de esta técnica, pero una

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respuesta definitiva a esta pregunta tendrá que esperar los experimentos de MALDI-TOF con muestras reales.

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Para evaluar la ingerencia que tendrá la heterogeneidad isotópica de los oligómeros sobre el ancho de banda de las señales en el espectro de masas, se efectuaron cálculos modelo, usando como ejemplo el icosímero d-(G)20, es decir un oligodesoxirribonucleótido constituido por veinte bases G. Considerando que esta molécula contiene un total de 200 átomos de carbono, y que la distribución isotópica natural del carbono es de 98.9% de C-12, y 1.1% de C-13, se calcula la distribución de isotopoisómeros que se presenta en la Figura 12, donde se aprecia que a media altura el ancho del multiplete es de aproximadamente cuatro unidades de masa atómica. Esto significa que, a nivel de icosímeros, el ensanchamiento de las bandas causadas por la heterogeneidad isotópicaes módico, y no dificultará la legibilidad de las señales que se obtendrán en un experimento de MALDI-TOF. Impacto El trabajo desarrollado dentro de este proyecto ha dado pie a una tesis de maestría de alta calidad, que se defenderá en las próximas semanas, así como a un artículo científico en una revista internacional de buen renombre. Los resultados representan una base sólida para el futuro desarrollo del trabajo de espectrometría de masas MALDI-TOF, que definirá el potencial para este abordamiento, es decir, aminólisis a alta temperatura seguido del análisis por MALDI-TOF para elaborar un método rápido y rutinario para la secuenciación confirmatoria de oligodesoxirribonucleótidos. Referencias: Ambrose, B. J. B., and Pless, R. C. (1985) Biochemistry 24, 6194. Ambrose, B. J. B., Castro, M. M., and R. C. Pless (1986) , 24. Ambrose, B. J. B., and Pless, R. C. (1987), , 522. Ambrose, B. J. B., Pless, R. C., and Ayers M. E. (1988) , 151. Di Mauro, E., Costanzo, G., and Negri, R. (1994) , 3811. Ferraboli, S., Negri, R., Di Mauro, E., and Barlati, S. (1993) , 566. Friedman, T., and Brown, D. M. (1978) , 615. González-Jasso, E., Arredondo-Vázquez, G, Martínez, P. and Pless, R. C. (2006), enviado para publicación en . Iverson, B. L., and Dervan, P. B. (1987) , 7823. Krayev, A. S. (1981) , 19. Maxam, A. M., and Gilbert, W. (1977) , 560. Maxam, A. M., and Gilbert, W. (1980) , 499. Negri, R., Costanzo, G., and Di Mauro (1991) , 389. Negri, R., Ferraboli, S., Barlati, S., and Di Mauro, E. (1994) , 111. Negri, R. Costanzo, G., Saladino, R., and Di Mauro, E. (1996) , 910. Rubin, C. M., and Schmid, C. W. (1980) , 4613. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) , 5463. Sato, K., Hosokawa, K., and Maeda, M, (2005) , e4. Simoncsits, A., and Török, I. (1982) , 7959. Sverdlov, E. D., and Kalinina, N. F. (1983) , 1696. Testoff, M. A., and Pless, R. C. (1991) , 316.