EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE EXTRACTOS …evaluaciÓn de la actividad citotÓxica de...

$: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE EXTRACTOS …evaluaciÓn de la actividad citotÓxica de extractos y fracciones de isertia laevis empleando lÍneas celulares derivadas de$
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE EXTRACTOS Y

FRACCIONES DE Isertia laevis EMPLEANDO LÍNEAS CELULARES

DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS.

SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ.

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

BIÓLOGA.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BIOLOGÍA

BOGOTÁ, D.C.

2006

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques

personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la

verdad y la justicia”.

Bogotá, 3 de octubre 2006. Señores PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA. Ciudad Estimados Señores: Yo (nosotros) Alba Nohemí Téllez Alfonso y Sandra Liliana Castro Diaz, identificado(s) con C.C. No. 23. 556. 606 y 52. 776. 154, autor(es) del trabajo de grado titulado Evaluación de la Actividad Citotóxica de Extractos y Fracciones de Isertia laevis Empleando Líneas Celulares Derivadas de Tumores Humanos, presentado como requisito para optar al título de Bióloga en el año de 2006; autorizo(amos) a la Universidad Javeriana a:

a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrónico con el fin de ofrecerlo para la consulta en la Biblioteca General. Si.

b) Poner a disposición para la consulta con fines académicos, en la página web de la Facultad, de la Biblioteca General y en las redes de información con las cuales tenga convenio la Universidad Javeriana. Si.

c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea seleccionado para participar en concursos de trabajos de grado. Si.

d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades educativas con las que la facultad tenga convenio de intercambio de información, para que este sea consultado en las bibliotecas y centros de documentación de las respectivas entidades. No.

e) Todos los usos, que tengan finalidad académica. Si. Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la obra, mediante cita bibliográfica se debe dar crédito al trabajo y a su(s) autor(es) Este documento se firma, sin perjuicios de los acuerdos que el autor(es) pacte con la Unidad Académica referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que puedan surgir de la actividad académica. Alba Nohemí Téllez Alfonso. 23. 556. 606 Sandra Liliana Castro Diaz. 52.776.154





APROBADO

--------------------------------------- ALBA NOHEMÍ TÉLLEZ, Ph. D. DIRECTORA --------------------------------------- ---------------------------------- CLEMENCIA DE CASTRO JULIO PEDROZO, Ph.D. JURADO JURADO





APROBADO

--------------------------------------- -------------------------------------- ÁNGELA UMAÑA, M. Phil. ANDREA FORERO DECANA ACADÉMICA DIRECTORA CARRERA DE BIOLOGÍA

AUTOR O AUTORES

Apellidos Nombres Castro Diaz Téllez Alfonso

Sandra Liliana Alba Nohemí

DIRECTOR(ES)

Apellidos Nombres Téllez Alfonso Alba Nohemí TRABAJO PARA OPTAR EL TÍTULO DE: Bióloga. TÍTULO COMPLETO DEL TRABAJO: Evaluación de la Actividad Citotóxica de Extractos y Fracciones de Isertia laevis Empleando Líneas Celulares Derivadas de Tumores Humanos. FACULTAD: Ciencias Básicas. PROGRAMA: Carrera: x NOMBRE DEL PROGRAMA: Biología. CIUDAD: BOGOTÁ. AÑO DE PRESENTACIÓN DEL TRABAJO: 2006. NÚMERO DE PÁGINAS: 68 TIPO DE ILUSTRACIONES: Mapas. Tablas, gráficos y diagramas. Fotografías. DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES: Actividad citotóxica, Isertia laevis, Extractos hojas. RESUMEN DEL CONTENIDO: Las fracciones y subfracciones de Isertia laevis del extracto Petrol y EtOH, mostraron actividad citotóxica frente a líneas celulares tumorales humanas de cáncer de seno (MCF-7 y CSC 1595) y de cólon (colo 205). Las fracciones fueron probadas a una concentración de 100 µg/ml, la fracción MeOH del extracto Petrol presentó un 7% de viabilidad sobre la línea celular 1595 y fue la fracción más activa, del extracto EtOH la fracción 3 con 27% de viabilidad para la línea MCF-7 y 23% de viabilidad en la línea 1595 fueron las fracciones que mostraron mejores resultados. Para la línea celular colo 205 las fracciones más

activas fueron la 4 y 5 del extracto EtOH con un 41% de viabilidad. Las pruebas fitoquímicas cualitativas mostraron que las fracciones de petrol y las de EtOH contienen esteroles y/o triterpenos.

DEDICATORIA

A mis padres por la paciencia que han tenido durante estos años.

A mis hermanos por su apoyo en todo momento.

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Alba Nohemí Téllez por ser una verdadera maestra y por el apoyo en la

dirección del trabajo.

A la Dra. Clemencia de Castro y Tulia de Murcia por proporcionarme las líneas

celulares y por su preciada colaboración en todo el desarrollo del trabajo.

A los profesores del Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Javeriana por

su cooperación.

Al Laboratorio de Virología e Inmunología de la Universidad Javeriana por

permitir usar sus instalaciones en el desarrollo del proyecto.

A Andrea y Ángela por su ayuda.

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN 2

2. MARCO TEÓRICO 4

2.1 LAS PLANTAS, FUENTE DE NUEVAS SUSTANCIAS 4

2.2 FAMILIA RUBIACEAE 6

2.3 CONCEPTOS GENERALES DEL GÉNERO ISERTIA. 7

2.3.1 ISERTIA LAEVIS 8

2.3.2 FITOQUÍMICA DEL GÉNERO ISERTIA 10

2.4 PLANTAS MEDICINALES CON TRITERPENOS, SAPONINAS

TRITERPÉNICAS Y SU ACTIVIDAD CITOTÓXICA Y ANTITUMOR 13

2.4.1 ACCIÓN CITOTÓXICA DE ESPECIES DE LA FAMILIA

RUBIACEAE 16

2.5 CULTIVO CELULAR 18

2.5.1 LÍNEAS CELULARES 19

2.6 ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO 20

2.6.1 MÉTODO DEL MTT 22

2.7 EL CÁNCER, ENTRE LAS PRINCIPALES CAUSAS DE

MORTALIDAD 23

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 25

3.1 FORMULACIÓN DE PROBLEMA 25

3.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 25

3.3 JUSTIFICACIÓN 26

4. OBJETIVOS 27

4.1 OBJETIVO GENERAL. 27

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27

5. MATERIALES Y MÉTODOS 28

6. RESULTADOS Y DISCUSION 34

6.1 RESULTADOS 34

6.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 45

7 CONCLUSIONES 48

8 RECOMENDACIONES 50

9 BIBLIOGRAFÍA 51

10 ANEXOS 57

INDICE DE TABLAS

TABLA No 1. METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE ESPECIES

DEL GÉNERO ISERTIA. 12

TABLA NO 2. PLANTAS MEDICINALES CON SAPONINAS

TRITERPÉNICAS, TRITERPENOS Y SU ACTIVIDAD CITOTÓXICA Y

ANTITUMOR. 15

TABLA 3. PRUEBAS FITOQUÍMICAS DE LAS FRACCIONES DEL

EXTRACTO PETROL. 34

TABLA 4. PRUEBAS FITOQUÍMICAS DE LAS FRACCIONES DEL

EXTRACTO ETOH. 35

TABLA 5. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS PARA LOS

EXTRACTOS ETOH Y PETROL FRENTE A LAS LÍNEAS CELULARES

PROBADAS. CONCENTRACIÓN 300 µg/ml. 37

TABLA 6. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS PARA LAS

FRACCIONES PETROL, CH2CL2, ACOET, MEOH DEL EXTRACTO

PETROL. CONCENTRACIONES APLICADAS A 100 µg/ml. 37


FRACCIONES 1 – 10 DEL EXTRACTO ETOH. CONCENTRACIONES

APLICADAS A 100 µg/ml. 39

TABLA 8. PRUEBAS FITOQUÍMICAS DE LAS SUBFRACCIONES DE LA

FRACCIÓN MEOH DEL EXTRACTO PETROL. 41


SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN MEOH DEL EXTRACTO PETROL.

CONCENTRACIONES 50 µg/ml, ALCALOIDE 25 µg/ml. 42


MEZCLAS DE LAS SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN MEOH DEL

EXTRACTO PETROL CONCENTRACION 50 µg/ml. 43

TABLA 11. PRUEBAS FITOQUÍMICAS DE LA FRACCIÓN 3 DEL

EXTRACTO ETOH. 43


SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO ETOH.

CONCENTRACIONES APLICADAS A 50 µ g/ml. 44

TABLA 13. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE

PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. 57

TABLA 14. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3

DE ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. 57

TABLA 15. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIONES 4-6 DE ETOH SOBRE

LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. 58

TABLA 16. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIONES 7-10 DE ETOH

SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. 58

TABLA 17. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE

PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO 205. 58

TABLA 18. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 DE

ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO 205. 59


SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO 205. 59


SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO 205. 59

TABLA 21. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES

PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7. 60

TABLA 22. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3

DE ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7. 60


SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7. 60


SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7. 61

TABLA 25. EFECTO CITOTÓXICO DEL ALCALOIDE SOBRE LA LÍNEA

CELULAR CSC 1595. 61

TABLA 26. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIÓN MEOH DEL

EXTRACTO PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. 61

TABLA 27. EFECTO CITOTÓXICO DE LAS SUBFRACCIONES MEOH DEL

EXTRACTO PETROL SOBRE 1595. 62

TABLA 28. EFECTO CITOTÓXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA

FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC

1595. 62

TABLA 29. EFECTO CITOTÓXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA

FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC

1595. 62

TABLA 30. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DEL

EXTRACTO Y FRACCIONES PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC

1595. (300 µg/ml), (100 µg/ml). 63


EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC

1595. (300 µg/ml), (100 µg/ml). 63

TABLA 32. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE

FRACCIONES ETOH SOBRE LA LÍNEA CSC 1595. (100 µg/ml). 63


FRACCIONES ETOH SOBRE LA LÍNEA CSC 1595. (100 µg/ml). 64


EXTRACTO Y FRACCIONES PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO

205. (300 µg/ml), (100 µg/ml). 64


EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR

COLO 205. (300 µg/ml), (100 µg/ml). 64


FRACCIONES ETOH 4-6 SOBRE LA LÍNEA COLO 205. (100 µg/ml). 65


FRACCIONES ETOH 7-10 SOBRE LA LÍNEA COLO 205. (100 µg/ml). 65


EXTRACTO Y FRACCIONES PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-

7. (300 µg/ml), (100 µg/ml). 65


EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR

MCF-7. (300 µg/ml), (100 µg/ml). 66


FRACCIONES ETOH 4-6 SOBRE LA LÍNEA MCF-7. (100 µg/ml). 66


FRACCIONES ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7. (100 µg/ml). 66


SÓLIDO ALCALOIDE SOBRE LA LÍNEA CSC 1595. (25 µg/ml). 67

TABLA 43. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE LA

FRACCIÓN MEOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. (50 µg/ml). 67


SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN MEOH DEL EXTRACTO PETROL

SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. (50 µg/ml). 67


SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO ETOH SOBRE

LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. (50 µg/ml). 68

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. DISTRIBUCIÓN DE I .laevis. 9

FIGURA 2. INFLORESCENCIA DE I. laevis. 10

FIGURA 3. METABOLIZACIÓN DE MTT A SALES DE FORMAZÁN POR

CÉLULAS VIABLES 23

FIGURA 4. MARCHA FITOQUÍMICA I. laevis. 30 FIGURA 5. SIEMBRA DE CÉLULAS Y EXTRACTOS EN PLACAS DE 96

POZOS. 33

FIGURA 6. CROMATOGRAFÍA EXTRACTO PETROL Y FRACCIONES. 35

FIGURA 7. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL EXTRACTO ETOH

TOTAL Y FRACCIONES 1-8. 36

FIGURA 8. CROMATOGRAFÍA FRACCIONES 8-10 EXTRACTO ETOH 36

FIGURA 9 EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE

PETROL EN LÍNEA CELULAR MCF-7 38

FIGURA 10. EFECTO CITOTÓXICO DEL EXTRACTO Y FRACCIONES

PETROL EN LÍNEA CELULAR 1595. 38

FIGURA 11. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE

PETROL SOBRE LÍNEA CELULAR COLO 205. 38


ETOH EN LÍNEA CELULAR MCF7. 39

FIGURA 13. EFECTO CITOTOXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE

ETOH EN LÍNEA CELULAR 1595. 40


ETOH EN LÍNEA CELULAR COLO 205. 40

FIGURA 15. CROMATOGRAFÍA SUBFRACCIONES MEOH DEL

EXTRACTO PETROL 41

FIGURA 16. EFECTO CITOTÓXICO DEL ALCALOIDE Y

SUBFRACCIONES DEL EXTRACTO PETROL SOBRE LÍNEA CELULAR

1595. 42

FIGURA 17. CROMATOGRAFÍA SUBFRACCIONES DEL EXTRACTO

ETOH 43

FIGURA 18. EFECTO CITOTÓXICO DE SUBFRACCIONES DE ETOH EN

LÍNEA CELULAR 1595 44

ÍNDICE DE ANEXOS

EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTOS Y FRACCIONES. (TABLAS). 57

ANÁLISIS ESTADÍSTICO (TABLAS). 63

INDICE DE ABREVIATURAS

AcOEt: acetato de etilo.

CCD: cromatografía en capa delgada.

CH2Cl2: diclorometano

CSC-1595: línea celular colombiana de cáncer de seno

Colo 205: línea celular de cólon.

DMSO: Dimetil Sulfoxido

EtOH: etanol

MCF-7: línea celular comercial de cáncer de seno

MeOH: metanol

MTT: (metil tiazol tetrazolio) ó (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil tetrazolio

bromuro)

Pf: punto de fusión

RESUMEN Colombia presenta una gran diversidad de plantas vasculares, pero un número

reducido de éstas han sido estudiadas en su composición química y actividad

farmacológica. Más del 50 % de las drogas de uso clínico derivan de productos

naturales, por lo tanto los bosques de Colombia tienen un gran potencial

medicinal.

El presente trabajo evaluó la actividad citotóxica de la especie Isertia laevis de la

familia Rubiaceae que es la cuarta familia de plantas vasculares con más especies.

Esta planta es reportada en etnobotánica por ser anticancerígena y para curar

infecciones de la piel; en Colombia presenta una buena distribución, va de los

300 a los 1700 m.s.n.m.

Entre los compuestos que han sido reportados para otras especies del género se

encuentran alcaloides indólicos, glicósidos triterpénicos, esteres y saponinas

triterpénicas. Todos estos metabolitos han sido evaluados en otras familias

botánicas y en diferentes especies de la familia rubiaceae y han presentado una

buena respuesta en ensayos de citotoxicidad sobre líneas celulares derivadas de

tumores.

En este trabajo se evaluó la actividad citotóxica de extractos y fracciones de la

especie I. laevis sobre las líneas celulares de cáncer de seno MCF-7, CSC-1595 y

de cólon Colo 205 mediante el método in vitro MTT (metil tiazol tetrazolio) ó (3-

(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil tetrazolio bromuro), un ensayo colorimétrico

rápido, cuantitativo, que se utiliza para medir la viabilidad celular

Los resultados indican que la fracción MeOH del extracto Petrol presentó un

efecto citotóxico moderado con 32 y 7 % de viabilidad en las líneas celulares de

cáncer de seno, las fracciones 2, 3, 4, 7, 8 y 9 del extracto EtOH también

presentaron porcentajes de viabilidad menores al 50% para estas dos líneas. La

línea celular Colo 205 tuvo un comportamiento diferente al de las otras dos líneas,

siendo las fracciones 4 y 5 las más activas con un porcentaje de viabilidad de 41%

para el resto de fracciones tuvo un efecto proliferativo con porcentajes entre 79 y

162% de viabilidad. La línea celular que presentó mayor sensibilidad frente a los

extractos y fracciones fue la línea 1595 seguida de la línea MCF-7.

La mezcla de las subfracciones de la fracción MeOH mostró cierto grado de

sinergismo al potenciar la acción citotóxica de SF-1 y SF-3.

1. INTRODUCCIÓN.

El estudio de las propiedades curativas de la gran diversidad de plantas vasculares

colombianas es hasta el momento incipiente, siendo el más bajo el de las especies

con posible actividad antineoplásica. Las plantas superiores han sido una fuente

útil de compuestos antitumorales de importancia clínica, en consecuencia, es

importante rastrear los productos de origen natural mediante modelos in vivo y/o

in vitro, entre los que se destacan los ensayos de citotoxicidad como uno de los

indicadores de actividad antitumoral inicial.

Si se tiene en cuenta que la tercera causa de muerte en Colombia es debida a las

neoplasias malignas y que por ejemplo el cáncer de mama en nuestro país tiene

una tasa de incidencia en las mujeres de 30 por cada 100 000, se deben enfocar

los estudios en la búsqueda de nuevas sustancias con efecto citotóxico sobre

diferentes líneas celulares tumorales. De acuerdo a bancos de información

etnobotánica, Isertia laevis se utiliza como anticancerígena, hacen una decocción

de las hojas y se dice cura el cáncer de estómago. García Barriga (1992).

Isertia laevis pertenece a la familia Rubiaceae, esta familia es una de las más

numerosas, se encuentra representada en todos los ecosistemas, en la región

Andina se registra el mayor número de especies. El género Isertia presenta

catorce especies en América, sólo siete de ellas conocidas en Colombia, es un

grupo al que se le debe prestar atención ya que la actividad farmacológica de sus

metabolitos secundarios no ha sido estudiada.

Las especies del mismo género: Isertia pittieri, Isertia haenkeana e Isertia

hypoleuca, producen alcaloides indólicos, triterpenos y saponinas triterpénicas,

metabolitos secundarios que pueden contribuir al desarrollo y descubrimiento de

nuevos fármacos al igual que productos de interés biológico en general.

Igualmente los estudios revelan que estos metabolitos obtenidos de otras familias

botánicas han mostrado tener un potencial importante de actividad citotóxica y

anticancerígena.

El trabajo que aquí se presenta evaluó la actividad citotóxica de extractos y

fracciones de la especie Isertia laevis sobre dos líneas celulares de cáncer de seno

MCF-7 y CSC-1595 y la línea celular de cólon Colo 205, mediante el método de

“fraccionamiento bioguiado por bioensayo MTT” un ensayo colorimétrico,

rápido, versátil y cuantitativo. Es parte del programa de investigación “La

biodiversidad colombiana como fuente de nuevos fármacos en oncología” que

viene desarrollando el Grupo de Investigación Fitoquímica de la Pontificia

Universidad Javeriana.

2. MARCO TEÓRICO.

2.1 Las plantas, fuente de nuevas sustancias.

Según Samper (2000), cuando nos referimos a la flora, se habla de la diversidad

de las plantas a nivel global y se calcula que en la actualidad hay cerca de 270 000

especies de plantas vasculares. Pero esta riqueza no está distribuida

uniformemente alrededor del globo y de hecho conocemos que hay ciertas

regiones, entre ellas Colombia, que se caracteriza por tener una alta concentración

de especies.

Se estima que en Colombia existen entre 35 000 y 50 000 especies de plantas

vasculares. La gran variabilidad de climas, paisajes, grandes regiones e historias

evolutivas, ha permitido que podamos hablar de Colombia como un país

megadiverso. Sin embargo, tenemos megadiversidad en la medida en que lo

reconozcamos y lo comprobemos y para eso se requiere de estudios básicos

como los inventarios biológicos. Gast, F en Mendoza et al (2004).

La forma alarmante en la que progresa el exterminio de especies vegetales en

ciertas áreas, incluso antes de que dichas plantas hayan sido registradas y mucho

menos, estudiadas químicamente, viene también a incrementar la necesidad de

realizar cada vez mayores esfuerzos, respecto a la conservación genética de las

plantas medicinales utilizadas en determinadas zonas. Pese a la rápida expansión

de la literatura fitoquímica, sólo un pequeño porcentaje de la totalidad de las

especies se ha estudiado y queda, por tanto, un amplio campo de investigación

futura. Los investigadores se enfrentan al problema de realizar una investigación

sistemática entre miles de especies aún no estudiadas y de muchas de las cuales no

se conoce ninguna indicación inmediata de su actividad farmacológica. Pedrozo

(2004).

El descubrimiento de nuevas sustancias a partir de plantas con actividad

terapéutica constituye una meta de la humanidad. El reino vegetal contiene un

enorme potencial de moléculas por descubrir; se estima que más del 90 % de las

especies no han sido estudiadas. La naturaleza ha demostrado ser una fuente

importante de compuestos anticancerígenos efectivos; por ejemplo drogas

derivadas de microorganismos y de plantas. Los productos naturales representan

el 50 % de las drogas de uso clínico en países desarrollados, el 25 % de los cuales

derivan de plantas superiores. Téllez et al (2004), Mongelli et al (2002). En los

países en desarrollo el uso de las plantas medicinales representa el 80 % del

arsenal terapéutico. Sharapin (2000).

Un 57% de las fórmulas médicas vendidas en Estados Unidos están basadas en

productos naturales, esto es, son productos naturales en sí o son derivados

sintéticos o análogos de productos naturales. De 1983 a 1995, más del 60% de las

nuevas drogas aprobadas para el tratamiento del cáncer e infecciones estuvieron

basadas en productos naturales. Los bosques tropicales por lo tanto representan

una reserva con potencial medicinal. Setzer et al (2003).

Las plantas tienen una larga historia de uso en el tratamiento del cáncer, aunque

muchas de las demandas para la eficacia de tal tratamiento deben verse con algún

escepticismo porque el cáncer es definido pobremente en la medicina tradicional.

Los primeros agentes de uso clínico fueron los llamados alcaloides de vinca

vinblastina y vincristina aislados de Catharanthus roseus la cual es usada por

varias culturas para el tratamiento de diabetes. Esta droga fue descubierta durante

una investigación de la planta como un recurso potencial como agente

hipoglicemiante; por consiguiente, su descubrimiento puede ser atribuido

indirectamente a la observación de un uso medicinal de la planta. Cragg et al

(2003).

Dos agentes con actividad clínica epidoside y teniposide son derivados

semisintéticos del producto natural epipodophyllotoxin, que es relacionado

originalmente a una planta usada para el tratamiento del cáncer.

Epipodophyllotoxin es un isómero de podophyllotoxin el cual fue aislado como el

agente anti-tumor activo de las raíces de varias especies del género

Podophyllum. Estas plantas poseen una larga historia de uso medicinal por parte

de las culturas americanas y asiáticas, incluso en el tratamiento de cáncer de piel y

verrugas. Cragg et al (2003).

Otros ejemplos son la homoharringtonine que ha mostrado eficacia contra las

varias leucemias, aislado del árbol chino Cephalotaxus harringtonia var

drupacea y el elliptinium, un derivado de ellipticine, comercializado en Francia

para el tratamiento de cáncer de seno, aislado de especies de la familia de

Apocynaceae, incluida Bleekeria vitensis una planta medicinal de Fiji con

reputadas propiedades anticáncer; las hojas de Taxus baccata usadas en la

medicina tradicional de la India (ayurveda), con un uso reportado en el

tratamiento del cáncer. El flavopiridol es totalmente sintético, pero la base para su

estructura es un producto natural, el rohitukine, aislado de Dysoxylum

binectariferum. El combretastatins, derivado de Combrettum cajfrunn, actúa

causando el cierre vascular en el tumor y produciendo la necrosis. Cragg et al

(2003).

2.2 Familia Rubiaceae.

A lo largo de la historia taxonómica de Rubiaceae la definición de tribus ha

presentado variaciones y en la actualidad aún no se cuenta con una clasificación

ampliamente aceptada. Al nivel de géneros, la mayoría son estables y sólo en

pocos casos se presentan segregaciones o diferencias entre especialistas. Mendoza

et al (2004).

Rubiaceae es una de las familias de plantas vasculares más grandes, con 659

géneros y un número estimado de 10 700 especies alrededor del mundo, solo

Asteraceae, Orchidaceae y Poaceae tienen más especies. Aproximadamente 80 %

de los géneros son leñosas. Se han registrado 75 géneros y 729 especies de

Rubiaceae en los Andes por encima de los 1000 m de altitud, Palicourea el

género más grande con 164 especies. Andersson (1995).

Es una familia cosmopolita, pero con mayor presencia en las regiones tropicales

y subtropicales. En el neotrópico, Rubiaceae generalmente figura entre las

primeras familias con mayor número de especies cuando se realizan inventarios

locales y en Colombia no sólo es una de las más diversas sino con mayor número

de individuos en las regiones Andina, Amazónica y del Chocó biogeográfico, la

mayor diversidad se registra en la región Andina. Presenta una amplia cobertura

de ecosistemas, que van desde las zonas costeras y de los manglares hasta las

zonas de páramo Mendoza et al (2000), (2004).

De los géneros de Rubiaceae presentes en Colombia, cerca del 68% tienen

especies de hábito arbustivo o arbóreo. Se encuentran en bosques, rastrojos,

potreros o pantanos. Para Colombia se registran 105 géneros nativos o

naturalizados distribuidos en 25 tribus. Adicionalmente se documentan cuatro

géneros introducidos y cultivados como ornamentales o alimenticios. Mendoza et

al (2004). En Cundinamarca está representada por 46 géneros y 115 especies.

García Kirkbride (1986).

El mayor oficio que cumplen es alimentar la fauna silvestre Mahecha (1997);

presenta especies con importancia económica ya sea en la producción de tintes,

sustancias médicas, productos comestibles, maderables y ornamentales. Mendoza

et al (2004). La familia tienen importancia económica principalmente por el café

que es uno de sus integrantes, también son conocidas la quina, que sirvió para

extracción de alcaloides y drogas para curar el paludismo y la ipecacuana que es

emitizante. García Kirkbride (1986).

2.3 Conceptos generales del género Isertia.

Isertia se distribuye desde Centroamérica hasta el norte de Suramérica, en el

caribe solo en el extremo occidente de Cuba y Guadalupe. Es característica de

bosques secundarios o sucesionales. Boom (1984). El género presenta catorce

especies en América, para Colombia se conocen siete especies distribuidas en

áreas bajas del Chocó biogeográfico, Caribe, Llanos orientales, Amazonas y

piedemonte de los Andes en donde asciende hasta los 1.700 m de altitud.

Mendoza et al (2004).

Entre los nombres comunes y usos de las especies del género, en el Amazonas se

conoce como “tefé-capacira” a Isertia coccinea var hypoleuca (Benth.) K. Schum,

que tiene propiedades medicinales. Isertia haenkeana DC. es conocida en Bolívar

como “pava”; los Karijonas la llaman “cuyarocrí”; las hojas se emplean contra el

reumatismo, el paludismo y las úlceras. En Nariño se conoce a Isertia pittieri

(Standl.) Standl. como “tabaquillo” y “flor de quinde”. García Barriga (1992),

Mendoza et al (2004). Los indígenas miraña utilizan la corteza de Isertia sp que al

secarla y pulverizarla aplican sobre la zona que presenta heridas y granos para

acelerar la cicatrización. La Rotta (1988).

A Isertia laevis (Triana) B.M. Boom se le llama “asaquiro” y “asaquirú”

(Vaupés), “vara santa” (Tolima); las hojas se emplean como anticancerígenos y

para curar infecciones de la piel. García Barriga (1992), Mendoza et al (2004). En

Perú la madera de esta especie se utiliza en construcción y se conoce con el

nombre de “asaquiro”, “caaynum”, “tsagnum”, y “cagnum”. Boom (1984).

2.3.1 Isertia laevis (Triana) B.M. Boom

La clasificación taxonómica de Isertia laevis es:

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta.

Clase: Magnoliopsida.

Subclase: Asteridae.

Orden: Rubiales

Familia: Rubiaceae.

Subfamilia: Cinchonoideae

Tribu: Isertieae

Género: Isertia

Especie: Isertia laevis

En la base de datos W3 TROPICOS del Missouri Botanical Garden se encuentra

que la sinonimia de esta especie es: Cassupa laevis Triana; Cassupa panamensis

Standl; Creatantha peruviana Standl; Isertia alba Sprague; Isertia panamensis

(Standl.) Standl.; Isertia parvifolia Standl; e Isertia weberbaueri Standl.

En Colombia presenta una distribución entre los 300-1700 m de altitud. Se

encuentra en los departamentos del Amazonas, Antioquia, Boyacá, Chocó,

Caldas, Cauca, Caquetá, Casanare, Cundinamarca, Huila, Meta, Putumayo y

Tolima. Mendoza et al (2004); en los Andes se puede encontrar en elevaciones

que van desde los 100 hasta los 2000 m.s.n.m y se extiende desde el norte de

Costa Rica y de oriente a occidente de la Amazonía. Boom (1984). Figura 1.

Figura 1. Distribución de I. laevis. (Tomada de Boom (1984)).

Son arbustos o árboles pequeños de 12 metros de alto, ramas cuadrangulares.

Hojas membranáceas a subcoriáceas, elípticas, 29-43 cm de largo, 14-20 cm de

ancho, ápice agudo o cuspidado de 1-2 cm de largo, base aguda a redondeada,

haz glabro, envés blanco, pubescente. Pecíolo 40-120 mm de largo, 2-5 mm de

ancho. 4 estípulas, interpeciolares, triangulares, 5-13 mm de largo. Inflorescencia

en panícula. Cáliz en forma de copa, 5-6 mm de largo, 3-4 mm de ancho, dentro

glabro o ciliado, 5-6 lóbulos. Corola blanca, tubular, 32-53 mm de largo, con

pubescencia alrededor de la boca, lóbulos 5 a 6. Estambres 6 o 7, anteras

oblongas, 7-9 mm de largo. Ovario 2 a 3 locular. Estilo ciliolado, 32-47 mm de

largo, estigma con 2 lóbulos oblongos, 3-5 mm de largo. Fruto en baya, elipsoidal,

8-11 mm de diámetro. Semillas 0.7-1 mm de largo. Boom (1984). Figura 2.

Figura 2. Inflorescencia de I. laevis. (Tomado de www.mobot.mobot.org)

Las hojas se usan como anticancerígenas, hacen una decocción de dos hojas para

una taza, lo cual se toma dos veces al día. Se dice que cura el cáncer de

estómago; otro uso es el de los indios Cholos del Chocó que toman la decocción

de las hojas para curarse las infecciones de la piel, especialmente las “úlceras

malignas”; García Barriga (1992).

2.3.2 Fitoquímica del género Isertia.

Algunos de las compuestos químicos que han sido reportados para otras especies

de Isertia según Bohlmann et al (1969); García Barriga (1992); Bruix et al

(1993) y Soto et al (2001) son alcaloides de tipo indólico y fueron encontrados

por Arriaga et al (1990) y Rumbero et al (1990), triterpenos y saponinas

triterpénicas por Um et al (2001).

Dos especies de este género han sido estudiados previamente: Isertia hypoleuca

de la cual se aislaron alcaloides del tipo quinamina, esteroles y triterpenos; en

Isertia haenkeana, aislaron secoiridoides, glicósidos triterpénicos, esteres de

ácido quínico. Bruix et al (1993); Rumbero- Sánchez et al (1991).

Alcaloides 2,2´- Indolylquinuclidine son encontrados generalmente en tallos y

hojas de especies de Cinchona y Remijia. Sin embargo recientemente, bases

semejantes han sido aisladas de I. hypoleuca e I. haenkeana. Dihidroquinamina y

epidihidroquinamina de I. hypoleuca; de las hojas de I. haenkeana también se ha

aislado el segundo compuesto. En I. haenkeana fue encontrado un alcaloide

derivado del ácido nicotínico que había sido aislado previamente de la especie

Nauclea diderrichii. Bruix et al (1993).

Según Bruneton (2001), la distribución de este amplísimo grupo de alcaloides

indolmonoterpénicos está prácticamente limitado a tres familias: Apocynaceae,

Loganiaceae y Rubiaceae. La diversidad estructural de este grupo cuenta con más

de 2 000 compuestos diferentes. Menos de un 10% de los géneros que

componen la familia Rubiaceae elaboran alcaloides a partir de una unidad

monoterpénica, se trata de géneros pertenecientes a las tribus más primitivas de

la subfamilia de las Rubioideae (Psychotrieae: Cephaelis) y de los

Cinchonoideae (Naucleae: Andina, Nauclea; Cinchoneae: Remijia, Mitragyna,

Uncaria, etc).

La relación entre Rubiaceae, Apocynaceae y Loganiaceae, en lo concerniente a

alcaloides, ha sido reconocida extensamente. Entre las especies que dieron

positivo para el test de alcaloides indólicos, estuvieron I. haenkeana e I. laevis.

Soto- Sobenis et al (2001).

Se aisló y determinó de Isertia pittieri la estructura de dos nuevos 27-nor

bidesmósidos glicosidos triterpenos junto con dos glicosidos triterpénicos

conocidos, los 27-nor-triterpenos tienen un esqueleto C35 ese esqueleto deriva del

esqueleto normal C30 y su distribución está restringida a unas pocas familias

botánicas. Ácidos glicosidos pirocincólicos han sido aislados solo de la familia

Rubiaceae, cuatro de Adena rubella y uno de I. haenkaena Um et al (2001).

Además muchos glicosidos interesantes de ácido quinóvico y cincholic han sido

aislados de la familia Rubiaceae. Arriaga et al (1990). Tabla 1.

Tabla 1 Metabolitos secundarios aislados de especies del género Isertia.

Especie Estructuras Nombres Parte

planta I. hypoleuca Alcaloides

* Dihydrocinchonamine

* Isodihydroquinamine Hojas

I. haenkeana Alcaloides

* Epidihydroquinamine

*Apodihydrocinchonami

ne

Hojas

y

corteza

I. haenkeana Glicósidos triterpénicos

* Ácido quinóvico

3β-O-6deoxy-D-

glucopyranoside-28-O-β-

D-glucopyranoside.

* Cincholic acid 3β-O-β-

6-deoxy-D-


D-glucopyranoside.

Hojas

I. haenkeana

* Pyrocincholic acid 3β-

O-6-deoxy-D-


D-glucopyranoside.

Hojas

I. pittieri Glicósidos triterpénicos

Pyrocincholic acid 3β-O-

β-D-quinovopyranosyl-

28-β-D-

glucopyranosyl(1-6)-β-D-

glucopyranosyl ester.

Tallo

I. pittieri Esteres

4,5-di-O-caffeoylquinic

acid butyl ester.


acid.


acid


acid.

Tallo

2.4 Plantas medicinales con triterpenos, saponinas triterpénicas y su actividad

citotóxica y antitumor.

Los triterpenos, 4 000 compuestos basados en más de 40 esqueletos diferentes,

son compuestos en C30 procedentes de la ciclación del 3S-2,3-epóxido-2,3-

dihidroescualeno más raramente del mismo escualeno. Casi siempre hidroxilados

en C3. Bruneton (2001).

Las saponinas son producidas principalmente por plantas pero también por

animales marinos inferiores y algunas bacterias. Constan de un azúcar,

usualmente contienen glucosa, galactosa, xilosa, rhamnosa o metil pentosa,

glicosidicamente enlazada a una aglicona hidrofóbica (sapogenina) la cual puede

ser terpenoide o esteroide. La aglicona puede contener uno o más enlaces C-C

insaturados. La cadena oligosacárida está unida normalmente a la posición C3

(monodesmósido) pero muchas saponinas tienen un azúcar adicional en la

posición C26 o C28 (bidesmósido). Francis et al (2002).

Según Bilbao (1997), las saponinas triterpénicas se aíslan principalmente de

dicotiledóneas; son un grupo de glicósidos solubles en agua, que tienen las

propiedades de hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial del agua

formando espuma abundante.

Las saponinas son comunes en un gran número de plantas y productos de plantas

que son importantes en la nutrición humana y animal. Muchos efectos biológicos

han sido atribuidos a las saponinas. Experimentos han demostrado las

propiedades fisiológicas, inmunológicas y farmacológicas de las saponinas lo que

ha provocado un considerable interés clínico en estas sustancias. Francis et al

(2002).

Según Sparg et al (2004), muchas saponinas son usados en fitoterapia y en la

industria cosmética. Ellas son los constituyentes de muchas drogas de plantas

populares y son consideradas responsables de numerosas propiedades

farmacológicas. Entre las propiedades biológicas y farmacológicas de las

saponinas se pueden enumerar: actividad antiparasitaria, citotóxica y antitumoral,

antiviral, antiinflamatorio, antifúngico. Numerosos reportes destacan las

propiedades citotóxicas de muchas saponinas. Sin embargo las saponinas con

gran citotoxicidad no siempre tienen propiedades antitumor.

Las saponinas aisladas de diferentes plantas y animales han demostrado inhibir el

crecimiento de células cáncer in vitro. La búsqueda de las sustancias naturales

capaces de controlar células malignas ha conducido a la investigación

considerable sobre esta característica de las saponinas. El efecto depresivo de las

saponinas contra las células de cáncer puede ocurrir a través de mecanismos

diversos y complejos. Más claridad en cuanto a la especificidad de las saponinas

sobre diferentes tipos de cánceres podría ser conveniente en el diseño de

preparaciones terapéuticas. Francis et al (2002).

Tabla 2. Plantas medicinales con saponinas triterpénicas, triterpenos y su

actividad citotóxica y antitumor.

Nombre planta. Modelo

experimental.

Compuesto

utilizado.

Respuesta Referencia

Aralia dasyphylla

Miq.

(Araliaceae)

Células KB,

HeLa-S3

Saponinas

triterpénicas

Actividad citotóxica Xiao et al., 1999

Panax ginseng

C.A.Meyer

(Araliaceae)

Células carcinoma

de próstata LNCaP

Saponinas

triterpénicas

Actividad antitumor

Inhibe el crecimiento

y la proliferación

celular.

Lee et al., 1999

Liu et al., 2000

Pulsatilla

chinensis (Bunge)

Regel

(Ranunculaceae)

Saponinas

triterpénicas

Actividad citotóxica Mimaki et al.,

1999

Trevesia palmata

(Roxb. Ex Lindl.)

Vis. (Araliaceae)

Líneas celulares

J774, HeK-293 y

WEHI-164

Saponinas

triterpénicas

Inhibe la

proliferación celular

De Tommasi et al.,

2000

Acanthophyllum

squarrosum Boiss.

(Caryophyllaceae)

Linfocitos Saponinas

triterpénicas

Actividad citotóxica Gaidi et al., 2000

Nigella sativa L.

(Ranunculaceae)

Saponinas

triterpénicas

Actividad antitumor Kumara & Huat.,

2001

Silene fortunei

Vis.

(Caryophyllaceae)

Células tumorales

de cólon

Saponinas

triterpénicas

Actividad citotóxica Gaidi et al., 2002

Acacia tenuifolia

(L.) Willd.

(Leguminosae)

Línea celular de

cáncer de pulmón

M109

Saponinas

triterpénicas

Actividad citotóxica Abdel-Kader et al.,

2001

Acacia victoriae

Benth

(Leguminosae)

Células humanas

de leucemia T.

Saponinas

triterpénicas

Actividad citotóxica Mujo et al., 2001

Acacia concinna

Wall.

(Leguminosae)

Células de

fibrosarcoma

humano HT-1080

Saponinas

triterpénicas

Actividad citotóxica Tezuka et al., 2000

Pittosporum

viridiflorum Sims

(Pittosporaceae)

Líneas celulares de

cáncer de ovario

A2780

Saponinas

triterpénicas

Actividad citotóxica Seo et al., 2002

Chysanthemum

morifolium

(Composite)

Células Raji Triterpeno

pentacíclico

dioles y

trioles

Efecto inhibitorio

sobre virus Epstein-

Barr

Ukiya et al., 2002

Clinopodium

vulgara L.

(Lamiaceae)

Melanoma

metastático

humano,carcinoma

epidermoide

humano

Glucósidos,

triterpenos

y saponinas

triterpénicas

Inhibe el crecimiento

de células tumorales.

Dzhambazo et al.,

2002

2.4.1 Acción citotóxica de especies de la familia Rubiaceae

Entre las especies de rubiaceae con estudios de actividad citotóxica, se puede

nombrar a Palicurea ovalis, a esta planta le evaluaron los alcaloides que

presentaba en extractos y fracciones frente a células VERU-YARU, se encontró

que la CL50 para el extracto EtOH fue de 112 ± 26.9 µg/ml, calicantina (alcaloide)

125.8 ± 25.6 µg/ml y uno de los alcaloides (no identificado todavía) 71 ± 37.6

µg/ml, concluyeron que la citotoxicidad del extracto fue debida en gran medida a

uno de los alcaloides presentes. Arteaga et al (1997).

El género Uncaria ha sido una de los más estudiados, se descubrieron dos esteres

triterpenos tetracíclicos y ácidos uncarínicos de la especie U. rhynchophylla. Estos

compuestos inhibieron la fosfolipasa Cγl (PLCγl) con CI50 de 35.66 y 44.55 µM

respectivamente. Los compuestos también inhibieron el crecimiento de las líneas

celulares de cáncer A-549, HCT-15, MCF-7 y HT-1197. Otros seis compuestos

encontrados en esta especie fueron reportados porque también inhibieron tanto la

PLCγl y el crecimiento de células de cáncer, con una CI50 de 9.5-4.6 µM y 0.5 –

6.5 µg/ml respectivamente. Estos compuestos incluían nuevos ácidos uncarínicos

y otros tres esteres triterpenos pentacíclicos. Heitzman et al (2005).

Los extractos acuosos de U. tomentosa inhibieron la proliferación de células

HL60 y Raji y afectó solo de forma moderada a las células K562. Ácidos

ursólicos aislados de esta misma especie han sido citotóxicos en las líneas

celulares SK_MEL, KB, BT-549, SK-OV-3 y VERO con CI50 entre 30 y 40

µg/ml en todas las líneas celulares. Heitzman et al (2005).

De Mitragyna inermes se han reportado alcaloides indólicos y saponinas

triterpénicas que poseen una 27-nor-triterpenoide aglycona poco común la cual ha

sido solo reportada aislada de Adina rubella e Isertia haenkeana. El extracto

MeOH fue probado en las líneas celulares HL-60, Bel-7402, 293 y KB, presentó

la fracción I como la única citotóxica para línea celular Bell-7402 inhibiendo

>50% a una concentración de 102 µg/ml, esta fracción fue purificada y se aisló el

componente citotóxico 3-O-(β-D-6-deoxy-glucopiranosil)-ácido quinóvico,

inhibiendo 43,01% y 91,74% el crecimiento de las células Hela en un a una

concentración de 102 y 103 µg/ml . Cheng et al (2002).

Otras especies estudiadas han sido Chiococca alba, Hamelia patens, Posoqueria

latifolia, Psychotria parvifolia, P. elata y Randia matudae, se utilizaron células

Hep G2, RatH-4-II-E, MDA-MB-231, Hs 578T, 5637. Ch. alba actuó mejor en la

línea celular Hs 578T con un porcentaje de células muertas de 100%, en las líneas

celulares Hep G2 y MDA-MB-231 no presentó actividad citotóxica y en la línea

celular 5637 tuvo un porcentaje de 6.44%;

H. patens presentó un 10.56% de células muertas en la línea MDA-MB-231 y sin

citotoxicidad en Hep G2; Posoqueria latifolia tuvo un 27.69% de células muertas

en Hs 578T y un 0% en Hep G2 y MDA-MB-231 P. parvifolia tuvo un 70% de

células muertas en la línea 5637, 44% en Hs 578T , 20% en MDA-MB-231 y 10%

para Hep G2 P. elata presentó porcentajes entre el 88 y 98% en todas las líneas

celulares. Setzer et al (2003).

2.5 Cultivo celular.

El cultivo de células tiene su origen en el siglo XIX, cuando se comenzaron a

estudiar con cierto detalle los tejidos y órganos en vasos de vidrio. Tras la

incorporación de modificaciones que dieron lugar a medios más sofisticados, se

hizo posible el cultivo de células tumorales procedentes de muestras de tejidos

malignos tanto del hombre como animales. En un principio el objetivo principal

era el estudio de las propias células, cómo crecen, qué necesitan para su

crecimiento, cómo y cuándo dejan de crecer. Este tipo de estudios todavía tiene

hoy un gran interés científico, por ejemplo, en relación con investigaciones sobre

el ciclo celular y el control del crecimiento de células tumorales. Morgan &

Darling (1995).

El cultivo de células tiene el objetivo de mantener vivas, fuera de su organismo

de origen, células animales para estudiar su comportamiento sin el control normal

ejercido por el organismo vivo; para observarlas, bajo un ambiente experimental

controlable. Freshney (2000).

El cultivo de células, es la mejor manera de establecer nuevas líneas celulares en

cultivo para estudiar la morfología celular y para comparar el efecto de diferentes

agentes, o diferentes concentraciones de un agente sobre el crecimiento y

metabolismo.

2.5.1 Líneas celulares.

Las líneas celulares son células de origen animal o humano que se han adaptado a

vivir en cultivo, poseen capacidad de proliferación ilimitada, debido a que han

sufrido un proceso de transformación, que puede ocurrir espontáneamente, ser

inducido por compuestos químicos, radiaciones o virus; que implica la alteración

de las características de crecimiento. Freshney (2000).

Las líneas celulares establecidas se pueden dividir en dos tipos principales:

adherentes (células en monocapa) que se fijan al material plástico de un frasco o

placa y por lo tanto tienen que desprenderse de esa superficie antes de utilizarlas y

no adherentes (células en suspensión) que normalmente no se fijan a la superficie

del recipiente de cultivo. Morgan & Darling (1995).

Las células que crecen en cultivo, ya sean adherentes o en suspensión, suelen

clasificarse en primarias, inmortales o transformadas. Las células primarias son

aquellas recientemente aisladas a partir de tejidos u órganos y suelen tener una

duración limitada de cultivo. Las células inmortales o transformadas presentan

ambas la propiedad de crecer en forma ilimitada en cultivo (es decir, no mueren).

Las células transformadas están integradas por células que derivan de tumores o

que han sido manipuladas de algún modo. Morgan & Darling (1995).

La demostración de que las células y los tumores sólidos humanos pueden dar

origen a líneas celulares continuas, fomentó su empleo en investigación sobre

cáncer e impulsó su implementación como método complementario de

“screening” o tamizaje previo a los ensayos in vivo, en el Grupo de Desarrollo de

Fármacos del Instituto Nacional de Cáncer de los Estados Unidos. Cordero

(2002).

La propagación de líneas celulares requiere que el número de células aumente

continuamente, las condiciones de cultivo han sido seleccionadas para favorecer

al máximo la proliferación celular. Estas condiciones son: baja densidad celular,

baja concentración de Ca2+ y la presencia de factores de crecimiento. Dentro de

los requerimientos generales de un cultivo de líneas celulares se cuentan: el medio

de cultivo nutritivo, condiciones de pH, temperatura y ambiente controlado. El

medio nutritivo básicamente debe ser un medio líquido, que contenga una fuente

de carbono, aminoácidos esenciales, oligoelementos, un sistema regulador de pH,

iones y factores de crecimiento aportados por el suero fetal bovino (FBS) con el

que generalmente se suplementa el medio. Adicionalmente los medios de cultivo

celular contienen rojo de fenol como indicador de pH, para permitir un constante

monitoreo de esta variable. Freshney (2000).

Después de preparar el medio básico deben ser añadidos otros suplementos, de

modo que pueda utilizarse en el cultivo celular, como por ejemplo antibiótico para

disminuir el riesgo de contaminación por microorganismos y suero que

proporciona una serie de nutrientes importantes para las células. Alvarado et al

(2002).

Entre las ventajas de las línea celulares que citan Morgan & Darling (1995) se

encuentran que suelen ser más sencillas de manejar que las células primarias,

crecen continuamente y puede obtenerse un mayor número de células. Además

son más fáciles de obtener y existe una información relativamente abundante

sobre ellas.

2.6 Ensayos de citotoxicidad in vitro.

La definición de citotoxicidad tiende a variar dependiendo de la naturaleza del

estudio, si las células mueren o simplemente tienen su metabolismo alterado.

Estos ensayos son empleados porque son baratos, fácilmente cuantificables y

reproducibles. Muchos experimentos in vitro, tienen el propósito de determinar la

potencial citotoxicidad de los compuestos estudiados, porque ellos van a ser

usados como fármacos, cosméticos y deben demostrar que no son tóxicos o

porque van a ser usados como agentes anticáncer y la citotoxicidad es crucial

para su acción. Freshney (2000).

La configuración de los modelos experimentales empleados in vitro para valorar

la toxicidad de los compuestos químicos se fundamenta en dos pilares básicos,

que son el sustrato biológico y los indicadores de toxicidad. El sustrato es el

material generalmente orgánico, vivo o no, sobre el que se aplica in vitro el

xenobiótico. Estas alteraciones se valoran mediante indicadores de toxicidad, que

son los parámetros que se determinan para cuantificar las modificaciones

producidas en la estructura o fisiología de los componentes del sustrato de

ensayo. Repetto (1995).

Según Cragg & Newman. (2003), en la década de los 90´s el descubrimiento de

agentes antitumor de origen natural estuvo basado en tests de actividad citotóxica

contra líneas celulares de cáncer usando modelos in vitro o in vivo. Muchos

agentes anti-cáncer descubiertos usando tales ensayos han mostrado ejercer su

acción citotóxica a través de la interacción con la tubulina o de la inhibición de la

topoisomerasa. Con la identificación de un número creciente de blancos

moleculares asociados con cánceres particulares, el descubrimiento de drogas

anti-cáncer está basado ahora en el alto rendimiento de tamizar compuestos

contra un rango de tales blancos.

En Monks et al (1991) se muestra como por ejemplo el Instituto Nacional de

Cáncer de los E.U. ha implementando nuevas investigaciones in vitro para el

descubrimiento de nuevas drogas contra la enfermedad. Con el propósito de

examinar esto se proporcionaría una evaluación inicial de más de 10 000 nuevas

sustancias por año para la actividad citotóxica y/o la inhibición del crecimiento

contra una gran diversidad de tipos de tumores y permitir la detección de la

sensibilidad que un tumor puede tener a determinada droga. El objetivo es testar

nuevas sustancias contra un amplio panel representativo de líneas celulares de

tumores humanos.

Según Fresney (2000), los ensayos de citotoxicidad se pueden clasificar en

ensayos de viabilidad y ensayos de supervivencia, los primeros se emplean para

determinar la proporción de células que inmediatamente después de un

tratamiento potencialmente traumático, se mantienen intactas. Mediante estos

ensayos se puede evaluar la citotoxicidad de un tratamiento en términos de

concentraciones letales (LC).

La concentración letal 50 (LC50) es la concentración de la sustancia de tratamiento

que causa la muerte al 50% de las células presentes, evaluadas inmediatamente

después del tratamiento. Cordero (2002).

Para Freshney (1995), (2000), algunos ensayos de citotoxicidad como los de

viabilidad que se basan en la capacidad que tienen las células para excluir

sustancias a las que son impermeables, ofrecen una interpretación instantánea,

Estos tests de viabilidad son para medir la tasa de supervivencia directamente, las

células que al ser expuestas al colorante no se tiñen, se consideran viables y son

de particular importancia para agentes tóxicos los cuales ejercen sus efectos

primarios sobre la integridad de la membrana.

2.6.1 Método del MTT.

Muchos ensayos biológicos requieren medir la supervivencia y/o proliferación de

las células de mamífero, esto puede lograrse por varios métodos, para esto se

desarrollo un ensayo colorimétrico rápido, versátil y cuantitativo, basado en una

sal de tetrazolio MTT (metil tiazol tetrazolio) ó (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5

difenil tetrazolio bromuro),mide sólo células vivientes y puede medirse

espectofotométricamente leyendo la absorbancia entre 540–570 nm. Mosmann

(1983).

El MTT es una sal de tetrazolio color amarillo que se utiliza para medir la

actividad y viabilidad celular por el rompimiento causado por la reducción

(aceptación de un H+) del anillo de la sal de tetrazolio MTT por acción de las

enzimas deshidrogenasas mitocondriales: succinato–deshidrogenasas, para

formar unos cristales azules de formazan insolubles en agua, pero solubles en

dimetil sulfóxido (DMSO). La viabilidad celular es proporcional a la absorbancia,

que presentan los cristales de formazán en solución. Angel (1999). Figura 3.

Figura 3. Metabolización de MTT a sales de formazan por células viables.

Este método está basado en la capacidad de las enzimas mitocondriales de las

células viables de transformar la sal de tetrazolio MTT en cristales de formazan.

El método ha sido usado exitosamente para monitorear la sensibilidad de células

de tumores humanos a agentes quimioterapéuticos. Ferrari et al (1990).

2.7 El Cáncer, entre las principales causas de mortalidad.

Para Pardo et al (2003) el país no tiene aún conocimiento certero acerca del

comportamiento de la enfermedad en nuestro medio, después de las enfermedades

cardiovasculares y las muertes violentas, las neoplasias malignas son la tercera

causa de mortalidad en Colombia, para el 2000, el cáncer de cuello uterino fue el

más común en las mujeres (23,4%), seguido por el de mama (19,7%) y el de piel

(11,8%).

Según los datos de la International Agency for Research in Cancer (IARC), en el

2002, en el mundo, el cáncer de mama representó 22,8% de todos los cánceres en

las mujeres, estimándose más de 1 millón de casos nuevos por año. En los países

desarrollados, el cáncer de mama es muy superior en incidencia a los otros tipos

de cáncer, mientras que, en los países menos desarrollados, la magnitud es

variable. En Colombia, la tasa de incidencia estimada es de 30 por 100.000

mujeres, muy similar a la de cáncer de cuello uterino que es de 33 por 100.000

mujeres. Díaz et al (2005).

En Colombia, la mortalidad por cáncer de mama muestra una clara tendencia al

incremento en la última década. Para el año 2000, el cáncer de mama ocupó el

tercer lugar como causa de muerte por cáncer entre mujeres (con 1.542 muertes

registradas), después del cáncer de estómago y el de cuello uterino. Díaz et al

(2005).

Según Cordero (2002), dentro de la propuesta de programas de bioprospección

nacional se ha planteado como uno de los objetivos, el seleccionar e implementar

una serie de ensayos económicos, rápidos, reproducibles, sensibles e indicativos,

para someter a los extractos naturales y sus fracciones a esta batería de pruebas,

con el propósito de evaluar su potencialidad de aplicaciones en campos

terapéuticos con alto impacto sobre la economía y la calidad de vida.

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1 Formulación del problema.

En este trabajo de grado se planteó evaluar el posible efecto citotóxico frente a

líneas celulares tumorales de extractos obtenidos de una especie vegetal

perteneciente a la familia Rubiaceae.

En la parte de los Andes tropicales por encima de los 1000 m.s.n.m, el registro de

géneros de Rubiaceae que se tiene es de 75 y 729 especies, el género Isertia, tribu

Isertieae, aunque presenta una buena distribución es un género poco conocido.

Aunque Isertia es un género pequeño, se encontró entre sus metabolitos

secundarios nuevas saponinas triterpénicas, triterpenos y alcaloides indólicos,

dichas sustancias han sido estudiadas en otras familias botánicas y se sabe que

presentan actividad citotóxica y anticancerígena, haciendo que esta planta

medicinal se convierta en una alternativa para estudiar preliminarmente su

citotoxicidad.

El cáncer es un problema relevante dentro del perfil epidemiológico de Colombia.

Datos generales muestran que, después de las enfermedades cardiovasculares y las

muertes violentas, las neoplasias malignas son la tercera causa de mortalidad en

Colombia (Dane) y la incidencia estimada para el 2000 fue de 60.883 casos, con

33.178 muertes. Pardo et al (2003).

3.2 Pregunta de investigación

¿Tendrán algún efecto citotóxico frente a las líneas celulares de cáncer de seno

CSC-1595 y MCF-7 y la línea de cólon Colo 205 los extractos y fracciones

obtenidos de Isertia laevis?

3.3 Justificación.

Las plantas son una fuente de drogas medicinales que podrían ser aprovechadas en

un uso clínico para atacar muchas de las enfermedades que no tienen opciones de

tratamiento; en los bosques colombianos un gran número de especies vegetales

no han sido estudiados, esta clase de trabajos son convenientes si se tiene en

cuenta la rápida destrucción que están sufriendo estas zonas de vida.

Hacia finales de la década de los ochenta, resurge el interés de la industria

farmacéutica mundial, por las plantas medicinales y otros recursos naturales como

fuentes de principios con actividad biológica, como alternativa a las estrategias de

diseño de fármacos como la química combinatoria y la simulación por

computador, que resultaron de difícil aplicación y atendiendo a las

recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud de promover el uso de

plantas medicinales y sus derivados en el tratamiento de patologías de alto

impacto social. Asebey (1996).

A las especies de Isertia se les atribuyen propiedades etnobotánicas para

diferentes enfermedades como úlceras, reumatismo, paludismo y cáncer de

estómago. La valoración preliminar de la potencial actividad citotóxica de los

extractos y fracciones de Isertia laevis servirá para avanzar en la búsqueda de

principios que tengan actividad farmacológica y para la generación de beneficios

sociales y económicos para la comunidad a través del acercamiento a nuevas

alternativas terapéuticas del cáncer que pueden ser aplicadas en el país.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general.

Determinar la viabilidad de líneas celulares tumorales de cáncer de seno MCF-7,

CSC-1595 y cólon Colo 205, tratados con extractos y fracciones obtenidos de

Isertia laevis.

4.2 Objetivos específicos.

Identificar los extractos y fracciones de hojas de Isertia laevis citotóxicamente

activas.

Realizar la identificación y caracterización química cualitativa de la fracción o

principio activo citotóxico obtenido de Isertia laevis.

Demostrar la acción sinérgica o antagónica de los posibles componentes del

extracto y/o fracción citotóxica más activa de la especie Isertia laevis, frente a la

línea celular más sensible.

5. MATERIALES Y MÉTODOS.

Material vegetal:

Se colectó el material vegetal en el municipio de Medina departamento de

Cundinamarca, a una altura de 550 m.s.n.m. La clasificación taxonómica de la

planta fue realizada por M. Gutiérrez del Instituto de Ciencias Naturales de la

Universidad Nacional de Colombia como Isertia laevis (Triana) B. M. Boom, de

la familia Rubiaceae. Un ejemplar se encuentra depositado en el Herbario

Nacional Colombiano con el No. COL: 506495.

La planta se limpió, se separó en sus partes, (hojas, tallo, flores y frutos), el

material vegetal se secó a la sombra en un lugar con buena corriente de aire.

Después se pulverizó en un molino de cuchillas para que las partículas pequeñas

tuvieran una mayor superficie de contacto con el solvente, se pesó (2.6 Kg) y se

guardó en un recipiente limpio y seco para utilizarlo posteriormente.

Obtención de extractos:

En el Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Javeriana se obtuvieron los

extractos y fracciones de las hojas de Isertia laevis.

El material vegetal seco y molido se extrajo en Soxhlet con Petrol, durante 72

horas con el fin de desengrasar el material, el extracto en Petrol se concentró en

un rotaevaporador a presión reducida, posteriormente se floculó con MeOH-agua

por 24 horas, se filtró y se llevó a sequedad.

El marco desengrasado se extrajo por maceración en frío con EtOH, el extracto se

concentró a presión reducida en rotavapor.

Obtención de fracciones:

A (5g) del extracto en petrol floculado, se le hizo una cromatografía en columna

tipo flash con sílica gel G-60, eluída con Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH. A cada

fracción se le realizó cromatografías en placas de sílica gel corridas en Petrol:

AcOEt (7:3), reveladas con ácido perclórico.

(2g) del extracto etanólico, se percoló en una columna cromatografía tipo flash

con RP-18 y eluída con mezclas de MeOH:H2O (10:2), MeOH, MeOH:CH2Cl2

(8:2) y CH2Cl2, se obtuvieron 10 fracciones de 50 mL cada una. Las primeras

fracciones se monitorearon en CCD de RP-18 corridas en MeOH:H2O (10:2),

para el resto de fracciones CCD sílica gel corridas en Petrol:AcOEt (7:3),

reveladas con ácido perclórico.

La fracción MeOH del extracto petrol se pasó por cromatografía en columna de

Sephadex, se obtuvieron 3 subfracciones se realizó cromatografía en placas de

RP-18 corridas en MeOH:H2O (10:2), y revelada con ácido perclórico; a la

fracción 3 del extracto EtOH se le hizo cromatografía en columna de Sephadex, se

obtuvieron 2 fracciones, se realizó cromatografía en placas de RP-18 corridas en

MeOH:H2O (10:2), y revelada con ácido perclórico. Figura 4.

A los extractos totales de EtOH y Petrol, a las fracciones y subfracciones se les

realizaron pruebas fitoquímicas cualitativas de terpenos: liebermann burchard,

salkwoski; glicósidos: molish, antrona; saponinas: prueba de espuma;

Flavonoides y fenoles: shinoda, cloruro férrico; alcaloides: dragendorff.

Material vegetal Hojas

(1.5 Kg)

Extracción en Soxhlet con petrol

Marco I Extracto Petrol (41.34g) Maceración en frío con EtOH Flocular Extracto EtOH Extracto (2g) (5g)

Cromatografía columna flash

sílica gel Cromatografía en columna tipo flash RP-18 F1............. F3…. ... F10 petrol CH2Cl2 AcOEt MeOH (580mg)(2980mg)(1112mg) (3708mg) Cromatografía columna Sephadex sephadex Sf3.1 Sf3.2 Sf1 Sf2 Sf3 (352mg) (130mg) (223mg) (438mg) (162mg) Figura 4. Marcha fitoquímica I. laevis.

Para aislar alcaloides se utilizaron 20g de material vegetal y fueron extraídos en

maceración en frío con MeOH, se concentró en el rotavapor. El extracto MeOH

se acidificó con HCl al 10%, después de filtrado se neutralizó con NH4OH a pH 9.

Se extrajo con AcOEt en embudo de separación, la fase orgánica se concentró

en el rotavapor. En el balón se formó un precipitado que se sacó con EtOH, este

precipitado formó un sólido con Pf: 221º C.

Fraccionamiento guiado por bioensayo:

La evaluación de la actividad biológica se realizó siguiendo el método:

"fraccionamiento guiado por bioensayo”. El cual consiste en la aplicación de

técnicas de separación y aislamiento sobre un determinado extracto, con el objeto

de hacer un seguimiento de la actividad biológica de las fracciones y compuestos

puros obtenidos, para finalizar con la identificación de los principios activos

responsables de la actividad citotóxica demostrada por el extracto original,

determinar el posible efecto sinérgico o antagónico entre las sustancias que están

presentes en la fracción que contiene el posible principio activo.

Bioensayos:

Los ensayos citotóxicos se realizaron en el laboratorio de Virología de la

Universidad Javeriana. La viabilidad celular fue determinada por la técnica del

MTT, ensayo que se encuentra ampliamente referenciado en la literatura

Studzinski (1999). Se tomó como control negativo del solvente empleado el

DMSO 0.2%.

Solubilización y preparación de muestras:

Los extractos se solubilizan en Dimetil Sulfoxido (Merck) al 0.2% concentración

inocua para las células, se realizaron los ensayos de los extractos a la

concentración de 300 µg/ml, las fracciones a 100 µg/ml y subfracciones a 50

µg/ml.

Líneas celulares:

Se utilizaron las líneas celulares neoplásicas suministradas por el Instituto

Nacional de Cáncer de EEUU: MCF -7 (seno) y Colo 205 (cólon) y la línea de

cáncer de seno obtenida y caracterizada en el Instituto Nacional de Cáncer de

Colombia CSS-1595 con las siguientes características:

MCF-7. Tumor de una paciente de 69 años con adenocarcinoma de glándula

mamaria, hipotetraploide, células epiteliales.

CSC 1595. Línea celular colombiana obtenida en el laboratorio de biología

experimental del INC del tumor de una paciente de 77 años con cáncer de seno

ductal infiltrante avanzado, características: aneuploide, 70 cromosomas,

hormonodependiente, sensible a antraciclinas y 5-fluoracilo. Téllez et al (2006).

Colo 205. Tumor de un paciente de 70 años, caucásico, con carcinoma de cólon

(adenocarcinoma), hipertriploide.

Cultivo celular:

Se utilizaron cajas de 96 pozos para el cultivo de las células con medio de cultivo

L-15 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 µl/10ml, penicilina

estreptomicina y neomicina (5000U, 5mg estreptomicina y 10 mg neomicina/ml).

Las líneas celulares fueron resuspendidas en medio de cultivo L-15 (±40 000

células por pozo) en 100 µl por pozo. Las cajas se incubaron a 37º C y 5% de CO2

por 24 horas, tiempo para la formación de la monocapa de células. Después de la

formación de la monocapa, se colocaron 20 µl de cada una de las soluciones de

extractos y fracciones a las concentraciones definidas (300 µg/ml de extractos y

100 µg/ml de fracciones), en los pozos de la caja, cada concentración de los

extractos y fracciones tenían seis réplicas, se incubaron por 24 horas, tiempo

para que las células puedan incorporar las sustancias. Pasado este periodo las

soluciones de extractos y sus respectivas fracciones son retiradas y a cada pozo se

le adicionaron 100 µl de medio L-15, por 24 horas para establecer si las células se

recuperan.

Posteriormente el medio es retirado y a cada pozo se le agregaron 100 µl de

medio Dulbecco modificado y 50 µl de MTT, las cajas se incubaron por 4 horas a

37º C. Pasadas las 4 horas se retiraron los 150 µl de medio Dulbecco y MTT y se

adicionaron en los pozos 100 µl de isopropanol para disolver los cristales de

formazan producidos, a continuación se leyó la absorbancia en espectrofotómetro

a una longitud de onda de 540 nm. Figura 5.

Cultivo de líneas celulares MCF-7, CSC-1595, colo 205 en placas de 96 pozos

100 µl x pozo con medio L-15

suero fetal bovino antibiótico

Incubar por 24h, a 37º C, con 5% de CO2

Adición de 20 µl de tratamiento por pozo Incubar por 24h, a 37º C, con 5% de CO2

300 µg/ml extractos 100 µg/ml fracciones

50 µg/ml subfracciones Retiro de tratamientos

Adición de 100 µl de L15 x pozo Incubar por 24h, a 37º C, con 5% de CO2

Retiro de medio L-15 Adicionar 100 µl de medio Dulbecco modificado y 50 µl de MTT

Incubar 4h

Retirar medio Dulbecco modificado y MTT

Adicionar 100 µl de isopropanol

Lectura de placas en espectofotómetro a 540nm

Figura 5. Siembra de células y extractos en placas de 96 pozos.

El análisis estadístico entre los valores de controles y ensayos fueron

interpretados mediante la prueba t (Student), con un nivel de significancia de

(p<0.05). Tablas 30-45.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 RESULTADOS.

Para las fracciones Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH del extracto en Petrol, las

pruebas fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos en

las fracciones CH2Cl2, AcOEt, MeOH, tabla 3.

Tabla 3. Pruebas fitoquímicas de las fracciones del extracto Petrol.

Fracción Cloruro

Férrico

Shinoda Liebermann

Burchard

Salkwoski Antrona Molisch

1 Petrol - - - - - -

2 CH2Cl2 - - + + - +

3 AcOEt - - + + - +

4 MeOH - - + + + -

Estas fracciones se monitorearon mediante una CCD en sílica gel G-60 corrida en

Petrol: AcOEt (7:3) y revelada en ácido perclórico como se observa en la figura

6. Los Rf para el extracto Petrol fueron 0.25; 0.38; 0.52, los Rf para la fracción

Petrol fueron: 0.48; 0.55; 0.63 y 0.76. Rf fracción CH2Cl2: 0.14; 0.36; 0.51 y

0.66 Rf fracción AcOEt: 0.14; 0.39. Rf fracción MeOH: 0.69 y 0.80.

Figura 6. Cromatografía Extracto Petrol y fracciones 1-4.

Las fracciones obtenidas del extracto EtOH mostraron en las pruebas

fitoquímicas cualitativas la presencia de flavonoides, esteroides y/o triterpenos y

saponinas ver tabla 4.

Tabla 4. Pruebas fitoquímicas de las fracciones del extracto EtOH.

Fracción Cloruro

Férrico

Shinoda Liebermann

Burchard


1 + + + + + +

2 + - + + + +

3 - - + + + +

4 - - + - - -

5 - - + - - -

6 - - + - - -

7 - - + - - -

8 - - + - - -

9 - - + - - -

10 - - + - - -

En la figura 7 se muestra la CCD de RP-18 del extracto EtOH total y fracciones 1

a 8, corrida en MeOH:H2O (10:2), revelada con ácido perclórico. Rf extracto

EtOH total: 0.21 y 0.95. Rf fracción 1: 0.92. Rf fracción 2: 0.62; 0.675; 0.76;

0.9; 0.9625. Rf fracción 3: 0.37; 0.4. Rf para la fracción 4 fueron: 0.21. Rf

fracción 5: 0.08 y 0.21. Rf fracción 6: 0.075.

Figura 7. Cromatografía en capa fina del extracto EtOH total y fracciones 1-8.

En la figura 8 se muestra la cromatografía de las fracciones 8-10 del extracto

EtOH en placa de sílica gel, corrida con Petrol: AcOEt (7:3) y revelada con ácido

perclórico. Rf subfracción 9: 0.23. Rf subfracción 10: 0.23; 0.36; 0.5.

Figura 8. Cromatografía fracciones 8-10 extracto EtOH.

Los resultados obtenidos en la evaluación citotóxica siguiendo el método:

"fraccionamiento guiado por bioensayo (MTT)”, se consideraron activos los

extractos y las fracciones que presentaron porcentajes de viabilidad igual ó

inferiores a un 50 %. Los extractos totales petrol y etanólico frente a las líneas

celulares CSC 1595, MCF-7 y Colo 205, demostraron la mayor actividad los dos

extractos frente a línea celular colombiana CSC-1595 con porcentajes de

viabilidad del 50% (50% de citotoxicidad) a la concentración de 300 µg/mL como

se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Porcentaje de viabilidad de las células para los extractos EtOH y Petrol

frente a las líneas celulares probadas. Concentración 300 µg/ml.

% Viabilidad

Extracto Petrol total Extracto EtOH total

MCF-7 82 76

Colo 205 104 101

CSC 1595 50 50

Las fracciones Petrol, CH2Cl2, AcOEt y MeOH se obtuvieron a partir del

extracto total en petrol y se probaron a la concentración de 100 µg/mL, La

fracción MeOH presentó la mayor actividad como se muestra en la Tabla 6 y

figuras 9, 10 y 11; con porcentajes de viabilidad 32% y 7% para las líneas

celulares de cáncer de seno MCF-7 y CSC 1595 respectivamente y no activo para

la línea Colo 205 de colón.

Tabla 6. Porcentaje de viabilidad de las células para las fracciones Petrol, CH2Cl2,

AcOEt, MeOH del extracto petrol. Concentraciones aplicadas a 100 µg/ml.

F. Petrol F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH

MCF-7 66 81 97 32

CSC 1595 64 43 38 7

Colo 205 77 82 97 69

020406080

100

%VI

AB

ILID

AD

Petrol 300ug/mL F. Petrol 100ug/ml F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH

EXTRACTO Y FRACCIONES

EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO PETROL EN LA LÍNEA CELULAR MCF-7

Figura 9. Efecto citotóxico de extracto y fracciones Petrol en línea celular MCF-7

020406080

%

VIA

BIL

IDA

D

P et r ol

300ug/ mL

F. P et r ol

100ug/ ml

F. CH2Cl 2 F. A cOE t F. M eOH


EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO PETROL EN LÍNEA CELULAR 1595

Figura 10. Efecto citotóxico del extracto y fracciones petrol en línea celular 1595.

020406080

100120

% V

IAB

ILID

AD

Petrol 300ug/mL F. Petrol100ug/ml

F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH


EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO PETROL EN LA LÍNEA CELULAR COLO 205

Figura 11. Efecto citotóxico de extracto y fracciones de Petrol sobre línea celular

Colo 205.

Las fracciones F.1 ....F.10 obtenidas a partir del extracto total etanólico se

probaron a la concentración de 100 µg/mL, La fracción F.9 presentó la mayor

actividad frente a la línea celular MCF-7 con un porcentaje de viabilidad del 20%

; La fracción F.3 presentó actividad con porcentajes de viabilidad 27% y 23%

para las líneas celulares de cáncer de seno MCF-7 y CSC 1595 respectivamente y

no activa para la línea de colón Colo 205 con un 162% de viabilidad , sin

embargo sí mostraron actividad para esta línea las fracciones F. 4 y F. 5 con un

41% de viabilidad, como se muestra en la Tabla 7 y figuras 12,13 y 14.

Tabla 7. Porcentaje de viabilidad de las células para las fracciones 1 – 10 del

extracto EtOH. Concentraciones aplicadas a 100 µg/ml.

F.1 F.2 F.3 F.4 F.5 F.6 F.7 F.8 F.9 F.10

MCF-7 93 43 27 44 72 44 29 50 20 55

CSC 1595 130 39 23 48 58 57 35 38 42 104

Colo 205 108 103 162 41 41 115 127 157 152 148

020406080

100

%

VIA

BIL

IDA

D

ETOHtotal

F.2 F.4 F.6 F.8 F-10


EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO EtOH EN LA LÍNEA CELULAR MCF-7

Figura 12. Efecto citotóxico de extracto y fracciones obtenidas del extracto en

EtOH frente a la línea celular MCF7, a una concentración de 100 µg/ml.

020406080

100120140

%

VIA

BIL

IDA

D

ETOHtotal

F.2 F.4 F.6 F.8 F-10


EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO EtOH EN LA LÍNEA CELULAR 1595

Figura 13. Efecto citotóxico de extracto y fracciones de EtOH en línea celular

CSC1595.

0

50

100

150

200

%

VIA

BIL

IDA

DETOHtotal

F.2 F.4 F.6 F.8 F-10


EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO EtOH EN LA LÍNEA CELULAR COLO 205

Figura 14. Efecto citotóxico de extracto y fracciones de EtOH en línea celular

colo 205.

La fracción activa en MeOH se fraccionó percolando en cromatografía en

columna con Sephadex como fase estacionaria y fase móvil MeOH, se obtuvieron

tres subfracciones, se realizó cromatografía en placas de RP-18 corridas en

MeOH:H2O (10:2), y revelada con ácido perclórico. Los Rf para la subfracción 1

fueron: 0.4 y 0.425. Rf subfracción 2 0.25 y 0.4. Figura 15.

Sf1 Sf2 Sf3

Figura 15.Cromatografía subfracciones obtenidas de la fracción MeOH del

extracto en Petrol

Para las subfracciones de la fracción MeOH del extracto en Petrol, las pruebas

fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos, tabla 8.

Tabla 8. Pruebas fitoquímicas de las subfracciones de la fracción MeOH del

extracto Petrol.

Fracción Cloruro

Férrico

Shinoda Liebermann

Burchard


Sf1 - - + + - +

Sf2 - - + + - +

Sf3 - - + + - +

Las subfracciones Sf1, Sf2 y Sf3 obtenidas a partir de la fracción MeOH del

extracto Petrol se probaron a la concentración de 50 µg/ml. La subfracción Sf1

mostró un porcentaje de viabilidad del 100%; La subfracción Sf2 presentó un

porcentaje de viabilidad de 72% y Sf3 83% de viabilidad para la línea celular de

cáncer de seno CSC 1595 como se muestra en la Tabla 9 y figura 16.

Tabla 9. Porcentaje de viabilidad de las células para las subfracciones de la

fracción MeOH del extracto Petrol concentraciones aplicadas a 50 µg/ml,

alcaloide a 25 µg/ml.

% viabilidad

Sf1 Sf2 Sf3 Alcaloide

CSC 1595 100 72 83 83

020406080

100

% V

IAB

ILID

AD

Alcaloide subfr.1 subfr. 2 Subfr.3

ALCALOIDE, SUBFRACCIONES

EFECTO CITOTOXICO DE ALCALOIDE Y SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN MeOH DEL EXTRACTO PETROL EN LA

LÍNEA CELULAR 1595

Figura 16. Efecto citotóxico del alcaloide y subfracciones de la fracción MeOH

del extracto petrol sobre línea celular 1595.

Para probar si las subfracciones actuaban de forma sinérgica o antagónica se

hicieron mezclas de las subfracciones, se probaron a una concentración de 50

µg/ml, las subfracción 1 y 2 fueron las que presentaron un porcentaje de

viabilidad más bajo 68% (32% citotoxicidad) como se muestra en la tabla 10

Tabla 10. Porcentaje de viabilidad de las células para la mezcla de las

subfracciones de la fracción MeOH del extracto Petrol, concentraciones 50

µg/ml.

% viabilidad

Sf1+ Sf2+Sf3

Concentración

16.6 µg/ml

Sf1+ Sf2

Concentración

16.6 µg/ml

Sf2+Sf3

Concentración

25 µg/ml

Sf1+Sf3

Concentración

25 µg/ml

CSC 1595 71 68 92 84

La fracción activa F.3 se paso por una columna con Sephadex, eluída con MeOH,

obteniéndose dos subfracciones, se realizó cromatografía en placas de RP-18

corridas en MeOH:H2O (10:2), revelada con ácido perclórico. Los Rf para la

fracción F.3 y sus subfracciones 1 y 2 presentaron manchas con Rf 0.30; 0.37 y

0.45, figura 17.

F3 S3.1 S3.2

Figura 17. Cromatografía subfracciones de la fracción 3 del extracto EtOH

Las pruebas fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos

en las subfracciones de la fracción 3 del extracto EtOH. Tabla 11.

Tabla 11. Pruebas fitoquímicas de la fracción 3 del extracto EtOH.

Fracción Cloruro

Férrico

Shinoda Liebermann

Burchard


S3.1 - - + + - +

S3.2 - - + + - +

Las subfracciones S3.1 y S3.2 de la fracción 3 del extracto EtOH se probaron a

la concentración de 50 µg/ml. La subfracción S3.1 tuvo un porcentaje de

viabilidad del 60% y la subfracción S3.2 mostró un porcentaje de viabilidad de

61% en la línea celular CSC 1595 como se muestra en la Tabla 12 y figura 18.


fracción 3 del extracto EtOH. Concentraciones aplicadas a 50 µg/ml

subfracciones.

% viabilidad

Sf1 Sf2

CSC 1595 60 61

60

60,5

61

61,5

%

VIA

BIL

IDA

D

subf r .1 Subf r . 2

SUBFRACCIONES

EFECTO CITOTOXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO EtOH DEL EXTRACTO EN LA

LÍNEA CELULAR 1595

Figura 18. Efecto citotóxico de subfracciones de EtOH en línea celular 1595

Los resultados de la prueba estadística t de Student (ver anexos) muestran que el

efecto citotóxico de los extractos y fracciones fue producto de las concentraciones

que fueron probadas y no causado por otros agentes.

6.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los extractos y fracciones obtenidos de Isertia laevis se probaron frente a un

panel de células provenientes de tejido tumoral, una colombiana obtenida del

Laboratorio de Biología Experimental del Instituto Nacional de Cancerología, la

línea CSC-1595 y las líneas comerciales de seno MCF-7 y cólon Colo 205, con el

fin de evaluar su actividad citotóxica.

Los extractos se probaron a una concentración de 300 µg/ml mostrando los

siguientes efectos citotóxicos, la línea tumoral CSC 1595 fue la más sensible a los

extractos totales petrol y etanólico, con un efecto citotóxico del 50% (% de

viabilidad 50%).

En la evaluación de las fracciones petrol, CH2Cl2, AcOEt y MeOH valoradas a

100 µg/mL, se demostró que la más activa fue la fracción MeOH con porcentajes

de viabilidad de 32% y 7% en las líneas tumorales de seno MCF-7 y CSC 1595

respectivamente.

La línea celular obtenida de tumor de paciente colombiano CSC 1595 fue la más

sensible al efecto de las fracciones CH2Cl2, AcOEt y MeOH con porcentajes de

viabilidad del 43%, 38% y 7% respectivamente, este resultado es interesante si

se tiene en cuenta que esta línea se considera joven, conservando un buen grado

de similitud entre el tejido tumoral y la línea celular, opuesto a lo que sucede con

la líneas celulares comerciales como lo menciona Téllez et al (2004). Las

fracciones no fueron activas para la línea celular de colón Colo 205. Estos

resultados demuestran cierta selectividad de acción frente a las líneas tumorales de

diversa procedencia y origen.

El comportamiento de las fracciones del extracto de EtOH también fue similar

para las líneas 1595 y MCF-7. Las fracciones 2, 3, 4, 7, 8 y 9 del extracto EtOH

presentaron porcentajes de viabilidad entre 23 y 50% para las líneas celulares

CSC 1595 y MCF-7, la fracción 6 tuvo una viabilidad 44% solo para la línea

celular MCF-7, la línea celular Colo 205 tuvo un comportamiento diferente al de

las otras dos líneas, siendo las fracciones 4 y 5 las más activas con un porcentaje

de viabilidad de 41% como se presenta en la tabla 7, opuesto a lo que mostró la

viabilidad para el resto de fracciones y extractos de petrol y EtOH que tuvieron

un efecto proliferativo con porcentajes de viabilidad entre 79 y 162% en esta línea

celular. Figuras 13.

Las pruebas fitoquímicas cualitativas muestran que las fracciones del extracto

EtOH y del extracto petrol contienen esteroides y/o triterpenos y saponinas

triterpénicas Tablas 3 y 4, concuerda con la química reportada en la literatura

para las especies de Isertia, Arriaga et al (1990), Rumbero et al (1990), Bruix et

al (1993); Um et al (2001).

Los resultados del porcentaje de citotoxicidad para la fracción MeOH a unas

concentraciones de 100 y 50 µg/ml fue de (93% y 35% de efecto citotóxico)

respectivamente lo que indica que la CC50 se debe encontrar entre los 50 y 100

µg/ml; al subfraccionar la fracción MeOH que fue la que presentó el porcentaje

de viabilidad inferior al 7% se quiso determinar el posible efecto sinérgico o

antagónico entre las sustancias que presentaba esta fracción, se obtuvieron tres

fracciones y la fracción que presentó un mayor porcentaje de citotoxicidad fue la

Sf2 (28%), las subfracciones no actuaron de manera similar como la fracción

MeOH, por eso se hicieron mezclas de las subfracciones para observar cual

presentaba un efecto citotóxico moderado, se observó que las mezclas donde se

encontraba la subfracción 2 presentaron una mejor actividad citotóxica explicando

así que las subfracciones 2 y 1 se relacionan de forma sinérgica y la subfracción 3

presenta un efecto antagónico con respecto a las otras subfracciones.

Según las cromatografías y las pruebas fitoquímicas cualitativas, los metabolitos

secundarios esteroides y/o triterpenos posiblemente sean los que están actuando

favorablemente en la actividad citotóxica de las fracciones que presentaron un

porcentaje de viabilidad menor o igual al 50%. A los triterpenos y saponinas

triterpénicas se les ha comprobado propiedades farmacológicas importantes, entre

ellas una buena actividad citotóxica en varias líneas celulares derivadas de

tumores humanos, como lo referencia Sparg et al (2004) para varias familias

botánicas y Cheng et al (2002) y Setter et al (2003) para especies de la familia

rubiaceae.

Uno de los géneros más estudiado ha sido el género Uncaria, en la especie U.

rhynchophylla se encontraron varios esteres triterpenos tetracíclicos y ácidos

uncarínicos, los cuales inhibieron el crecimiento de las líneas celulares de cáncer

A-549, HCT-15, MCF-7 y HT-1197. Heitzman et al (2005).

En el trabajo de Cheng et al (2002) sobre Mitragyna inermes se reportó una 27-

nor-triterpenoide aglycona que había sido aislada solo de Isertia haenkeana y

Adina rubella. El extracto MeOH fue el que mostró ser citotóxico contra un

panel de líneas celulares de cáncer humanos, utilizaron como eluyentes de la

columna de sílica gel CH2Cl2, AcOEt y MeOH, obteniendo tres fracciones. La

fracción I presentó la inhibición del crecimiento de más del 50% en la línea

celular Bel-7402, esta fracción fue sometida a purificación sobre columna de

Sephadex LH-20 y se aisló el componente citotóxico (un ácido quinóvico).

Tanto el género Uncaria como el género Isertia pertenecen a la subfamilia

Cinchonoideae compartiendo caracteres morfológicos, pero sería preciso acudir a

caracteres quimiotaxonómicos que fortalecieran aún más los aspectos

filogenéticos dentro de la subfamilia.

Con la prueba t se comparó el control con cada uno de los extractos y fracciones

evaluadas, los valores de t calculados mostraron ser inferiores a los valores de t

de la tabla. Se rechazó la Ho, es decir sí hay diferencias significativas entre los

tratamientos y el control.

7. CONCLUSIONES

Las líneas celulares de cáncer de seno CSC 1595 y MCF-7 fueron las líneas más

sensibles al exponerlas a los diferentes extractos y fracciones de petrol y EtOH.

La fracción MeOH del extracto en Petrol a la concentración de 100 µg/mL fue la

que presentó mayor actividad citotóxica entre los extractos y fracciones evaluadas

con un 7% de viabilidad (efecto citotóxico de 93%) frente a la línea celular de

cáncer de seno CSC 1595 y con un 32% de viabilidad (68% de efecto citotóxico)

en la línea celular comercial de seno MCF-7.

La subfracción obtenida a partir de la fracción MeOH, (SF-1, SF-2 y SF-3) que

presentó la mayor actividad citotóxica a la concentración de 50 µg/mL fue SF-2.

La fracción SF-1 Presentó un 100% de viabilidad.

La mezcla de las subfracciones de la fracción MeOH demostró cierto grado de

sinergismo al potenciar la acción citotóxica de SF-1 y SF-3.

La fracción más activa de Isertia laevis mediante las pruebas químicas

cualitativas demostró la presencia glicósidos de triterpenos (Glicósidos

esteroidales y/o saponinas). Posiblemente los causantes de la acción citotóxica.

Las fracciones del extracto EtOH presentaron moderada actividad citotóxica para

las líneas celulares CSC 1595 y MCF-7.

Las fracciones y extractos que presentaron un porcentaje de viabilidad menor al

50% pueden ser evaluadas en otras líneas celulares derivadas de cáncer de seno,

para estimar si existe especificidad citotóxica frente a esta clase de líneas

celulares.

Las fracciones y extractos que no presentaron efecto citotóxico pueden ser

probadas en líneas celulares derivadas de tumores de otros órganos para evaluar

que tan inocuas son.

8. RECOMENDACIONES

Se recomienda que todas las fracciones y extractos se prueben en un panel amplio

de líneas celulares tumorales humanas.

Se sugiere hacer pruebas con otras líneas celulares de cáncer de seno.

Es importante seguir evaluando la fracción MeOH del extracto Petrol que

presentó una viabilidad del 7%.

Es recomendable hacer ensayos sobre células normales para poder evaluar el

efecto tóxico que presentan los extractos y fracciones.

Se aconseja utilizar otras partes de la planta para comparar cual presenta mayor

concentración de metabolitos secundarios.

9. REFERENCIAS

Alvarado, A. C. & Mendoza, L. M. 2002. Posibles efectos citotóxicos de

sustancias aisladas de diferentes especies vegetales colombianas. Microbióloga

industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento

de Microbiología Industrial. Bogotá. 89 p.

Andersson, L. 1995. Diversity and Origen of Andean Rubiaceae. Pags. 441-450

en: S. P. Churchill et al (eds.). Biodiversity and conservation of neotropical

montane forests. New York Botanical Garden.

Angel, A. C. 1999. Estudio fitoquímico preliminar, toxicidad y determinación

de la actividad antitumor de extractos etanólicos de Cucumis dipsaceus. Química

farmacéutica. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Química

Farmacéutica. Bogotá. 81 p.

Aquino, R., De Tomáis, N., De Simona, F & Pizza, C. 1997. Triterpenes and

quinovic acid glycosides from Uncaria tomentosa. Phytochemistry 45: 1035-

1040.

Arteaga, L., Tobón, C & Mora, C. 1997. Citotoxicidad de los componentes de

Palicourea ovalis. Revista colombiana de ciencias químico farmacéuticas. 26:

55-57.

Arriaga, F, J., Rumbero-Sanchez, A & Vazquez, P. 1990. Two triterpene

glycosides from Isertia haenkeana. Phytochemistry. 29: 209-213.

Asebey. L. 1996. Biodiversidad, biotecnología y desarrollo sostenible en salud y

agricultura. Conexiones emergentes. Págs. 229-242 en: Organización

Panamericana de la Salud. Publicación científica 560. Washington.

Bilbao, M. 1997. Análisis Fitoquímico Preliminar. Universidad del Quindío.

Armenia.

Bohrmann, H., Lau-Cam, C., Tashiro, J & Youngken Jr. 1969. Constituens of

Isertia hypoleuca Benth. (Rubiaceae)-I. Isolation and characterization of

dihydroquinamine from the leaf material. Phytochemistry. 8: 649-652.

Boom, B. M. 1984. A Revision of Isertia (Isertieae: Rubiaceae). Brittonia 36:

425-454.

Bruix, M., Rumbero, A & Vazquez, P. 1993. Apodihydrocinchonamine, an

indole alkaloid from Isertia haenkeana. Phytochemistry. 33: 1257-1261.

Bruneton, J. 2001. Farmacognosia. Fitoquímica plantas medicinales. 2ª edición.

Editorial Acribia. Zaragoza, España.

Cragg, G. M & D. J. Newman. 2003. Plants as a source of anti-cancer and anti-

HIV agents. Annals of Applied Biology 143: 127-133.

Cheng, Z-H., Yu, B-Y. & Yang, X-W. 2002. 27-nor-triterpenoid glycosides from

Mitragyna inermis. Phytochemistry 61: 379-382.

Cordero, C. C. 2002. Implementación de un método in vitro de evaluación

preliminar de actividad aticáncer de extractos vegetales empleando líneas

celulares derivadas de tumores humanos. Tesis pregrado. Universidad Nacional

de Colombia. Química Farmacéutica.

Díaz, S., Piñeros, M & Sánchez, O. 2005. Detección temprana del cáncer de

mama; aspectos críticos para un programa de tamizaje organizado en Colombia.

Revista Colombiana de Cancerología 9: 93- 105.

Ferrari, M., Fornasiero, M.C & Isetta, A.M. 1990. MTT colorimetric assays for

testing macrophage cytotoxic activity in vitro. Journal of Immunological

Methods. 131: 165-172.

Francis, G., Zohar, K., Harinder, P. S., Becker, M. & Becker, K. 2002. The

biological action of saponins in animal systems: a review. The British Journal of

Nutrition 88: 587-605.

Freshney, R. I. 2000. Culture of animal cell. A manual of basic technique.

Cuarta edición. John Wiley and Sons Inc. New York.

Freshney, R. I. 1995. Animal cell culture. A practical approach. Oxford

University Press.

García Barriga, H. 1992. Flora Medicinal de Colombia. Tomos I, II y II. Tercer

Mundo Editores. Bogotá.

García Kirkbride, M. C. 1987. Catálogo ilustrado de plantas de Cundinamarca.

Volumen 4. Rubiaceae. Universidad Nacional. Instituto de Ciencias Naturales.

Bogotá.

Heitzman, M., Neto, C., Winiarz, A., Vaisberg, J. & Hammond, G. 2005.

Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of Uncaria (rubiaceae).

Phytochemistry 66: 5-29.

La Rotta, C. 1988. Estudio etnobotánico sobre especies utilizadas por la

comunidad Miraña (Amazonas-Colombia). FEN. WWF. Bogotá.

Mahecha, G. 1997. Fundamentos y metodología para la identificación de plantas.

Proyecto BIOPACÍFICO Ministerio del Medio Ambiente, Instituto Humboldt.

Bogotá.

Mendoza, H., Ramírez, B. & Jiménez, L. C. 2004. Rubiaceae de Colombia.

Guía ilustrada de géneros. Instituto de Investigación de Recursos Biológicos

Alexander von Humboldt. Bogotá.

Mendoza, H. 2000. Las Especies de Rubiaceae del flanco oriental de la

Cordillera Oriental, Norte de los Andes, Colombia. Biota colombiana. 1: 224-

229.

Missouri Botanical Garden´s VAST (VAScular Tropicos) Nomenclatural Data

Base. http://mobot.mobot.org/W3T/search/vast.htm

Monks, A., Scudiero, D., Skehan, P., Shoemaker, R., Paull, K., Vistica, D.,

Hose, C., Langley, J., Cronise, P., Vaigro-Wolff, A., Gray-Goodrich, M.,

Campbell, H., Mayo, J & Boyd, M. 1991. Feasibility of high-flux anticancer

drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines. Journal of

the National Cancer Institute. 83: 757-766.

Morgan, S. J & Darling, D. C. 1995. Cultivo de células animales. Editorial

Acribia, Zaragoza., España.

Mosmann, T. 1983. Rapid colorimetric assays for cellular growth and survival:

application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological

Methods. 65: 55-63.

Pardo, C., Murillo, R.., Piñeros, M & Castro, M. A.. 2003. Casos nuevos de

cáncer en el Instituto Nacional de Cancerología, Colombia, 2002. Revista

Colombiana de Cancerología 7: 1- 24.

Pedrozo, J. 2004. Productos naturales vegetales: Generalidades químicas, papel

biológico e importancia industrial. Bogotá.

Reppeto, G & Reppeto M. 1995. Métodos alternativos: estudios toxicológicos in

vitro. Pags. 37-59 en: M. Reppeto (ed). Toxicología Avanzada. Ediciones Díaz

de Santos. Madrid, España.

Rumbero-Sanchez, A & Vazquez, P. 1991. Quinic acid esters from Isertia

haenkeana. Phytochemistry. 30: 311-313.

Rumbero-Sanchez, A & Vazquez, P. 1991. A nor-triterpene glycoside from

Isertia haenkeana and a 13CNMR study of cincholic acid. Phytochemistry. 30:

623-626.

Samper, C. 2000. Explicación del fenómeno de la pérdida de diversidad,

específicamente de la extinción de plantas. Pérez-Arbelaezia. 5: 11-17.

Sharapin, N et al. 2000. Fundamentos de tecnología de productos

fitoterapéuticos. Convenio Andrés Bello, Programa iberoamericano de ciencia y

tecnología para el desarrollo, Bogotá.

Setzer, M., Moriarity, D., Lawton, R., Setzer, N., Gentry, G. & Haber, W.

2003. Phytomedicinal potencial of tropical cloudforest plants from Monteverde,

Costa Rica. Revista de Biología Tropical 51: 647-674.

Soto-Sobenis, A., Castillo, B., Delgado, A., González, A. & Montenegro R.

2001. Alkaloid screening of herbarium samples of Rubiaceae from Panama.

Pharmaceutical Biology. 39: 161-169.

Sparg, S.G., Light, J & Staden J.van. 2004. Biological activities and distribution

of plant saponins. Journal of Ethnopharmacology. 94: 219-243.

Studzinski, G.P. 1999. Cell grown, differentiation and senescente. The paractical

approach. Series editor: B. D. Hames.

Téllez, N., de Castro, C., Riveros, T. & Torrenegra, R. 2006. Efectos citotóxicos

in vitro de extractos y fracciones de Espeletia killipii Cuatr. Frente a líneas

celulares tumorales humanos. Brazilian Journal of Pharmacognosy. 16: 12-16.

Téllez, N., de Castro, C., Riveros, T., Alvarado, A., Mendoza, L., Pedroso, J.

& Torrenegra, R. 2004. Citotoxicidad de metabolitos secundarios de algunas

plantas colombianas. Actualidad Biológica. 26: 12–16.

Um, B. H., Polat, M., Lobstein, A., Weniger, B., Aragón, R. & Declercq, L.

2002. A new dicaffeoylquinic acid butyl ester from Isertia pittieri. Fitoterapia. 73:

550-552.

Um, B. H., Weniger, B., Lobstein, A., Pouplin, T., Polat, M & Aragon, R. 2001.

Triterpenoid saponins from Isertia pittieri. Journal of Natural Products. 12: 1588-

1589.

10. ANEXOS.

Tabla 13. Efecto citotóxico de extracto y fracciones de petrol sobre la línea

celular CSC 1595.

CSC-1595

Petrol

300ug/mL F. Petrol 100ug/ml F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH CONTROL

0,108 0,12 0,077 0,065 0,06 0,147 0,117 0,101 0,076 0,069 0,006 0,193 0,108 0,094 0,064 0,058 0,005 0,191 0,111 0,091 0,081 0,073 0,004 0,194 0,094 0,113 0,085 0,062 0,005 0,188 0,011 0,176 0,086 0,092 0,005 0,172Promedio 0,0915 0,115833333 0,078166667 0,069833333 0,014166667 0,180833333Desv Est 0,040153456 0,031492327 0,008035339 0,01205681 0,022462561 0,018432761Comp Control 5,7623E-04 0,00141388 1,97853E-07 2,23796E-07 6,5468E-08 Viabilidad 50,59907834 64,05529954 43,22580645 38,61751152 7,834101382

Tabla 14. Efecto citotóxico de extracto y fracciones 1-3 de EtOH sobre la línea

celular CSC 1595.

ETOH total F.1 F.2 F.3 CONTROL 0,042 0,234 0,049 0,036 0,147 0,087 0,195 0,051 0,038 0,193 0,084 0,187 0,043 0,033 0,191 0,097 0,173 0,051 0,057 0,194 0,118 0,235 0,068 0,033 0,188 0,123 0,387 0,165 0,056 0,172Promedio 0,091833333 0,235166667 0,071166667 0,042166667 0,180833333Desv Est 0,029157618 0,078552955 0,046717948 0,011267949 0,018432761Comp Control 8,6832E-05 0,130069354 0,000324199 2,22335E-08 Viabilidad 50,78341014 130,0460829 39,35483871 23,31797235

Tabla 15. Efecto citotóxico de fracciones 4-6de EtOH sobre la línea celular CSC

1595.

F.4 F.5 F.6 CONTROL 0,08 0,086 0,086 0,175 0,072 0,094 0,102 0,19 0,08 0,092 0,101 0,146 0,09 0,093 0,097 0,188 0,076 0,104 0,099 0,159 0,081 0,106 0,088 0,133Promedio 0,079833333 0,095833333 0,0955 0,165166667Desv Est 0,006013873 0,007652886 0,00683374 0,023129346Comp Control 5,34706E-06 3,84804E-05 3,39292E-05 Viabilidad 48,33501514 58,0221998 57,82038345

Tabla 16. Efecto citotóxico de fracciones 7-10 de EtOH sobre la línea celular CSC 1595.

F.7 F.8 F.9 F.10 CONTROL 0,061 0,066 0,067 0,15 0,175 0,062 0,075 0,074 0,167 0,19 0,056 0,058 0,068 0,168 0,146 0,055 0,072 0,081 0,185 0,188 0,051 0,068 0,072 0,183 0,159 0,066 0,044 0,061 0,178 0,133Promedio 0,0585 0,063833333 0,0705 0,171833333 0,165166667Desv Est 0,005468089 0,011321072 0,00683374 0,013044795 0,023129346Comp Control 6,6293E-07 2,22443E-06 2,27595E-06 0,552315225 Viabilidad 35,41876892 38,64783047 42,68415742 104,0363269

Tabla 17. Efecto citotóxico de extracto y fracciones petrol sobre la línea Colo

205.

Colo 205

Petrol


0,252 0,19 0,227 0,246 0,224 0,246 0,389 0,26 0,243 0,302 0,266 0,281 0,33 0,195 0,223 0,267 0,152 0,318 0,234 0,175 0,256 0,242 0,134 0,284 0,242 0,175 0,163 0,272 0,149 0,228 0,234 0,255 0,216 0,25 0,19 0,256Promedio 0,280166667 0,208333333 0,221333333 0,263166667 0,185833333 0,268833333Desv Est 0,06456134 0,038944405 0,032054121 0,022435834 0,051164115 0,032089978Comp Control 7,0826E-01 0,014868353 0,02811947 0,730327646 0,007165794 Viabilidad 104,2157471 77,49535028 82,33106014 97,89212647 69,12585245


celular colo 205.

ETOH total F.1 F.2 F.3 CONTROL 0,325 0,203 0,221 0,462 0,246 0,255 0,262 0,197 0,39 0,281 0,202 0,289 0,321 0,353 0,318 0,208 0,374 0,33 0,55 0,284 0,345 0,383 0,37 0,602 0,228 0,299 0,235 0,223 0,267 0,256Promedio 0,272333333 0,291 0,277 0,437333333 0,268833333Desv Est 0,060251694 0,07359076 0,071897149 0,125525562 0,032089978Comp Control 9,0255E-01 0,51417516 0,804586015 0,009725912 Viabilidad 101,3019219 108,2455053 103,0378177 162,6782393

Tabla 19. Efecto citotóxico de fracciones 4-6 de EtOH sobre la línea celular Colo

205.

F.4 F.5 F.6 CONTROL 0,258 0,241 0,553 0,401 0,197 0,208 0,548 0,455 0,212 0,198 0,535 0,406 0,179 0,147 0,46 0,429 0,155 0,172 0,481 0,579 0,142 0,186 0,599 0,482Promedio 0,1905 0,192 0,529333333 0,458666667Desv Est 0,041965462 0,032106074 0,050867147 0,066358622Comp Control 7,93916E-06 4,75947E-06 0,065256485 Viabilidad 41,53343023 41,86046512 115,4069767

Tabla 20. Efecto citotóxico de fracciones 7-10 de EtOH sobre la línea celular

Colo 205.

F.7 F.8 F.9 F.10 CONTROL 0,575 0,665 0,667 0,74 0,401 0,655 0,718 0,784 0,685 0,455 0,564 0,799 0,886 0,395 0,406 0,55 0,704 0,491 0,698 0,429 0,466 0,621 0,776 0,711 0,579 0,701 0,835 0,606 0,863 0,482Promedio 0,585166667 0,723666667 0,701666667 0,682 0,458666667Desv Est 0,082804388 0,080587013 0,142138899 0,154660919 0,066358622Comp Control 1,5298E-02 9,90923E-05 0,003517424 0,008712474 Viabilidad 127,5799419 157,7761628 152,9796512 148,6918605

Tabla 21. Efecto citotóxico de extracto y fracciones Petrol sobre la línea celular

MCF-7.

MCF-7

Petrol


0,388 0,255 0,421 0,42 0,152 0,458 0,348 0,379 0,421 0,492 0,155 0,403 0,49 0,352 0,372 0,535 0,182 0,502 0,654 0,548 0,411Promedio 0,408666667 0,328666667 0,404666667 0,482333333 0,163 0,496Desv Est 0,073221126 0,065209917 0,028290163 0,058106225 0,016522712 0,094891517Comp Control 2,0887E-01 0,030365027 0,157508506 0,828605817 0,000639086 Viabilidad 82,39247312 66,26344086 81,58602151 97,24462366 32,86290323


celular MCF-7.

ETOH total F.1 F.2 F.3 CONTROL 0,04 0,537 0,197 0,14 0,458 0,407 0,408 0,221 0,12 0,403 0,692 0,442 0,222 0,142 0,502 0,654 0,548 0,411Promedio 0,379666667 0,462333333 0,213333333 0,134 0,496Desv Est 0,326858277 0,066860551 0,014153916 0,012165525 0,094891517Comp Control 4,2043E-01 0,604456533 0,001632932 0,000380601 Viabilidad 76,54569892 93,21236559 43,01075269 27,01612903

Tabla 23. Efecto citotóxico de fracciones 4-6 de EtOH sobre la línea celular

MCF-7.

F.4 F.5 F.6 CONTROL 0,224 0,462 0,182 0,458 0,192 0,326 0,211 0,403 0,251 0,292 0,265 0,502 0,654 0,548 0,411Promedio 0,222333333 0,36 0,219333333 0,496Desv Est 0,02953529 0,089955545 0,042122836 0,094891517Comp Control 0,002120235 0,078728504 0,002215909 Viabilidad 44,82526882 72,58064516 44,22043011

Tabla 24. Efecto citotóxico de fracciones 7-10 de EtOH sobre la línea MCF-7.

F.7 F.8 F.9 F.10 CONTROL 0,14 0,214 0,108 0,281 0,458 0,143 0,297 0,1 0,356 0,403 0,162 0,237 0,102 0,182 0,502 0,654 0,548 0,411Promedio 0,148333333 0,249333333 0,103333333 0,273 0,496Desv Est 0,011930353 0,04285246 0,004163332 0,087275426 0,094891517Comp Control 4,8556E-04 0,004124494 0,000226881 0,011455932 Viabilidad 29,90591398 50,2688172 20,83333333 55,04032258

Tabla 25. Efecto citotóxico del sólido alcaloide sobre la línea celular CSC 1595.

Alcaloide CONTROL

0,3390

0,4150

0,3930

0,4460

0,3280

0,4840

0,4650

0,3910

0,3710

0,4110

0,3010

0,4950

Promedio

0,3662

0,4403

Desv Est

0,0582

0,0421 Comp Control

0,0300

Viabilidad

83,1567

Tabla 26. Efecto citotóxico de fracción MeOH en la línea CSC 1595.

CSC-1595 fr. MeOH(50) CONTROL 0,166 0,244 0,183 0,249 0,156 0,237 0,152 0,272Promedio 0,16425 0,2505Desv Est 0,01381726 0,01515476Comp Control 0,0001539 Viabilidad 65,5688623

Tabla 27. Efecto citotóxico de las subfracciones MeOH del extracto petrol sobre

1595.

CSC-1595 A+B+C A+B(50) B+C(50) A+C CONTROL 0,215 0,229 0,289 0,165 0,282 0,15 0,171 0,177 0,164 0,249 0,163 0,148 0,174 0,187 0,237 0,166 0,161 0,162 0,181 0,272 0,178 0,169 0,25 0,223 0,244 Promedio 0,1744 0,1756 0,2104 0,184 0,2568 Desv Est 0,02478508 0,03118974 0,05596695 0,02397916 0,01925357 Comp Control 0,00037389 0,00111581 0,11769359 0,00073416 Viabilidad 67,9127726 68,3800623 81,9314642 71,6510903

Tabla 28. Efecto citotóxico de las subfracciones de la fracción 3 del extracto

EtOH sobre la línea celular CSC 1595.

Subfr.1 Subfr. 2 CONTROL 0,238 0,196 0,415 0,261 0,244 0,446 0,261 0,292 0,484 0,294 0,327 0,391 0,284 0,286 0,411 0,261 0,274 0,495Promedio 0,2665 0,269833333 0,440333333Desv Est 0,01982675 0,045070685 0,042103048Comp Control 3,5671E-06 4,91071E-05 Viabilidad 60,52233157 61,27933384

Tabla 29. Efecto citotóxico de las subfracciones de la fracción 3 del extracto

EtOH sobre la línea celular CSC 1595.

CSC-1595 F-3 1+2 CONTROL 0,381 0,282 0,243 0,249 0,225 0,237 0,224 0,272 0,335 0,244Promedio 0,2816 0,2568Desv Est 0,0720125 0,01925357Comp Control 0,47819333 Viabilidad 109,657321

Tabla 30. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones Petrol

sobre la línea celular CSC 1595. (300 µg/ml), (100 µg/ml).

VAR. 1 VARIABLE 1 VARIABLE 1 VARIABLE 1 VARIABLE1 VARIABLE2 Ext. Petrol F. Petrol F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH Media 0,043597704 0,110308296 0,07741116 0,0683247 0,00580645 0,17906486Varianza 0,0016123 0,000991767 6,4567E-05 0,00014537 0,00050457 0,00033977Observaciones 6 6 6 6 6 6Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 0 Grados de libertad 10 10 10 10 10 P(T< =t) una cola 0,000288113 0,00070694 9,8927E-08 1,119E-07 3,2734E-08 P(T< =t) dos colas 0,000576226 0,00141388 1,9785E-07 2,238E-07 6,5468E-08

Tabla 31. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones 1-3

EtOH sobre la línea celular CSC 1595. (300 µg/ml), (100 µg/ml).

VARIABLE 1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2 Ext. EtOH F.1 F.2 F.3 Media 0,080947109 0,21922655 0,05788927 0,039973183 0,179064859Varianza 0,000850167 0,00617057 0,00218257 0,000126967 0,000339767Observaciones 6 6 6 6 6Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 Grados de libertad 10 10 10 10 P(T< =t) una cola 4,3416E-05 0,06503468 0,0001621 1,11168E-08 P(T< =t) dos colas 8,68319E-05 0,13006935 0,0003242 2,22335E-08

Tabla 32. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH sobre la

línea celular CSC 1595. (100 µg/ml).

VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2 F.4 F.5 F.6 Media 0,079466437 0,095332209 0,095077002 0,162363964 Varianza 3,61667E-05 5,85667E-05 4,67E-05 0,000534967 Observaciones 6 6 6 6 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 Grados de libertad 10 10 10 10 P(T< =t) una cola 2,67353E-06 1,92402E-05 1,69646E-05 0 P(T <=t) dos colas 5,34706E-06 3,84804E-05 3,39292E-05 0

Tabla 33. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH sobre la

línea celular CSC 1595. (100 µg/ml). VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2 F.7 F.8 F.9 F.10 Media 0,058071563 0,061824903 0,069952263 0,17096484 0,162363964Varianza 2,99E-05 0,000128167 4,67E-05 0,000170167 0,000534967Observaciones 6 6 6 6 6Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 0Grados de libertad 10 10 10 10 10P(T< =t) una cola 3,31465E-07 1,11222E-06 1,13797E-06 0,276157613 0P(T< =t) dos colas 6,6293E-07 2,22443E-06 2,27595E-06 0,552315225 0

Tabla 34. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones

Petrol sobre la línea celular colo 205. (300 µg/ml), (100 µg/ml).

VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 2 Ext. Petrol F. Petrol F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH Media 0,26968121 0,20278726 0,216796946 0,2616623 0,175234231 0,26570122 Varianza 0,00416817 0,00151667 0,001027467 0,00050337 0,002617767 0,00102977 Observaciones 6 6 6 6 6 6 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 0 0 Grados de libertad 10 10 10 10 10 10 P(T< =t) una cola 0,35413138 0,00743418 0,014059735 0,36516382 0,003582897 P(T <=t) dos colas 0,70826276 0,01486835 0,02811947 0,73032765 0,007165794


EtOH sobre la línea celular colo 205. (300 µg/ml), (100 µg/ml).

VAR. 1 VAR.2 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 Ext. EtOH F.1 F.2 F.3 Media 0,26087284 0,26570122 0,27594845 0,261624814 0,40578663 Varianza 0,00363027 0,00102977 0,0054156 0,0051692 0,01575667 Observaciones 6 6 6 6 6 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 0 Grados de libertad 10 10 10 10 10 P(T< =t) una cola 0,45127341 0,25708758 0,402293007 0,00486296 P(T <=t) dos colas 0,90254683 0,51417516 0,804586015 0,00972591

Tabla 36. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones 4-6 EtOH sobre

la línea celular colo 205. (100 µg/ml). VAR.1 VAR.1 VAR.1 VAR. 2 F.4 F.5 F.6 Media 0,183208619 0,187496522 0,52517979 0,45155463 Varianza 0,0017611 0,0010308 0,00258747 0,00440347 Observaciones 6 6 6 6 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 Grados de libertad 10 10 10 10 P(T< =t) una cola 3,96958E-06 2,37973E-06 0,03262824 P(T< =t) dos colas 7,93916E-06 4,75947E-06 0,06525649

Tabla 37. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH 7-10

sobre la línea celular colo 205. (100 µg/ml).

VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2 F.7 F.8 F.9 F.10 Media 0,575289271 0,716294168 0,67575836 0,64234781 0,45155463 Varianza 0,006856567 0,006494267 0,02020347 0,02392 0,00440347 Observaciones 6 6 6 6 6 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 0 Grados de libertad 10 10 10 10 10 P(T< =t) una cola 0,007649051 4,95462E-05 0,00175871 0,00435624 P(T< =t) dos colas 0,015298102 9,90923E-05 0,00351742 0,00871247

Tabla 38. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones Petrol

sobre la línea celular MCF-7. (300 µg/ml), (100 µg/ml).

VAR.1 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 VAR.1 VARIABLE2 Ext. Petrol F. Petrol F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH Media 0,4004432 0,31911498 0,4032927 0,477506911 0,16194274 0,482168327 Varianza 0,00536133 0,00425233 0,00080033 0,003376333 0,000273 0,0090044 Observaciones 6 6 6 6 6 6 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 0 0 Grados de libertad 10 10 10 10 10 10 P(T<=t) una cola 0,10443536 0,01518251 0,07875425 0,414302908 0,00031954 P(T< =t) dos colas 0,20887071 0,03036503 0,15750851 0,828605817 0,00063909


EtOH sobre la línea celular MCF-7. . (300 µg/ml), (100 µg/ml).

VARIABLE 1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2 Ext. EtOH F.1 F.2 F.3 Media 0,10379872 0,45623066 0,21268249 0,133224125 0,48216833 Varianza 0,10683633 0,00447033 0,00020033 0,000148 0,0090044 Observaciones 6 6 6 6 6 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 0 Grados de libertad 10 10 10 10 10 P(T< =t) una cola 0,21021593 0,30222827 0,00081647 0,000190301 P(T <=t) dos colas 0,42043187 0,60445653 0,00163293 0,000380601

Tabla 40. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH 4-6 sobre

la línea celular MCF-7. (100 µg/ml).

VAR.1 VAR.1 VAR.1 VAR. 2 F.4 F.5 F.6 Media 0,219672672 0,346554609 0,214172098 0,4821683 Varianza 0,000872333 0,008092 0,001774333 0,0090044 Observaciones 3 3 3 3 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 Grados de libertad 7 7 7 7 P(T <=t) una cola 0,001060117 0,039364252 0,001107954 P(T <=t) dos colas 0,002120235 0,078728504 0,002215909

Tabla 41. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH 7-10

sobre la línea celular MCF-7. (100 µg/ml). VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2 F.7 F.8 F.9 F.10 Media 0,14771992 0,244711981 0,103223388 0,252903903 0,48216833 Varianza 0,00014233 0,001836333 1,73333E-05 0,007617 0,0090044 Observaciones 3 3 3 3 3 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 0 Grados de libertad 7 7 7 7 7 P(T< =t) una cola 0,00024278 0,002062247 0,000113441 0,005727966 P(T <=t) dos colas 0,00048556 0,004124494 0,000226881 0,011455932

Tabla 42. Análisis estadístico del efecto citotóxico de sólido alcaloide sobre la

línea celular CSC 1595. (25 µg/ml). VAR.1 VAR 2 Alcaloide Media 0,35903684 0,437039267Varianza 0,00339057 0,001772667Observaciones 6 6 Diferencia hipotética de las medias 0 0 Grados de libertad 10 10 P(T< =t) una cola 0,0149798 P(T< =t) dos colas 0,0299596

Tabla 43. Análisis estadístico del efecto citotóxico de la fracción MeOH sobre la

línea celular CSC 1595. (50 µg/ml).

Media 0,163413505 0,24983909 Varianza 0,000190917 0,00022967 Observaciones 4 4 Diferencia hipotética de las medias 0 0 Grados de libertad 6 6 P(T< =t) una cola 7,69487E-05 P(T <=t) dos colas 0,000153897

Tabla 44. Análisis estadístico del efecto citotóxico de subfracciones de la fracción

MeOH del extracto petrol sobre la línea celular CSC 1595. (50 µg/ml).

Media 0,17185159 0,17182212 0,18171954 0,25567072 Varianza 0,0009728 0,0031323 0,000575 0,0003707 Observaciones 5 5 5 5 Diferencia hipotética de las medias 0 0 0 0 Grados de libertad 8 8 8 8 P(T <=t) una cola 0,0005579 0,0588468 0,00036708 P(T< =t) dos colas 0,00111581 0,11769359 0,00073416

Tabla 45. Análisis estadístico del efecto citotóxico de subfracciones de la fracción

3 del extracto EtOH sobre la línea celular CSC 1595. (50 µg/ml).

Media 0,268330991 0,25567072 Varianza 0,0051858 0,0003707 Observaciones 5 5 Diferencia hipotética de las medias 0 0 Grados de libertad 8 8 P(T< =t) una cola 0,239096666 P(T< =t) dos colas 0,478193332

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICO DE EXTRACTOS Y


DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS

SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ., ALBA .N. TÉLLEZ ALFONSO.

[email protected], [email protected]

RESUMEN

Las fracciones y subfracciones de Isertia laevis del extracto Petrol y EtOH,

mostraron actividad citotóxica frente a líneas celulares tumorales humana de

cáncer de seno (MCF-7 y CSC 1595) y de cólon (colo 205). Las fracciones

fueron probadas a una concentración de 100 µg/ml, la fracción MeOH del

extracto Petrol presentó un porcentaje de viabilidad de 7% sobre la línea celular

1595 y fue la fracción más activa, del extracto EtOH la fracción 3 con 27%

para la línea MCF-7 y 23 % de viabilidad en la línea 1595 fue la fracción que

mostró mejor resultado. Para la línea celular colo 205 las fracciones más activas

fueron la 4 y 5 del extracto EtOH con un porcentaje de viabilidad de 41%. Las

pruebas fitoquímicas cualitativas mostraron que las fracciones de petrol y las de

EtOH contienen esteroles y/o triterpenos

Palabras claves: Actividad Citotóxica, Isertia laevis, Extractos hojas.

ABSTRACT

The fractions of Isertia laevis showed citotoxic activity in front of human tumor

cell lines of breast cancer (MCF-7 and CSC 1595) and of colon (colo 205). The

fractions were proven to a concentration of 100 µg/ml, the fraction MeOH of the

extract Petrol presented a percentage of viability of 7% on the cell line 1595 and it

was the most active fraction, of the extract EtOH the fraction 3 with 27% for the

line MCF-7 and 23% of viability in the line 1595 the fraction that showed better

result were. For the cell line colo 205 the most active fractions it was the 4 and 5

of the extract EtOH with a percentage of viability of 41%. The tests qualitative

showed that the fractions contain esterols and/or triterpenes.

Key words: cytotoxic activity, Isertia laevis, leaves extracts.

INTRODUCCIÓN.

Colombia presenta una gran diversidad de plantas vasculares, la mayoría de ellas

no han sido estudiadas o son poco conocidas.

No se conocen trabajos fitoquímicos de Isertia laevis, se tienen reportes de los

metabolitos secundarios de I.pittieri, I.haenkeana e I.hypoleuca, en las que se han

encontrado alcaloides indólicos Bohrmann et al (1969); García Barriga (1992);

Bruix et al (1993) y Soto et al (2001), triterpenos Arriaga et al (1990) y Rumbero

et al (1990) y saponinas triterpénicas Um et al (2001); estas últimas según

varios estudios en otras familias botánicas tienen propiedades citotóxicas y

anticancerígenas y han presentado buenos resultados en ensayos con líneas

celulares tumorales. Sparg et al (2004). En etnobotánica I. laevis se utiliza como

anticancerígena García Barriga (1992).

En este trabajo se evaluó la actividad citotóxica de extractos y fracciones de hojas

de la especie I. laevis sobre las líneas celulares de cáncer de seno MCF-7, CSC-

1595 y de cólon Colo 205 mediante el método in vitro MTT, un ensayo

colorimétrico rápido, versátil y cuantitativo. Mosmann (1983).

MATERIALES Y MÉTODOS.

Material vegetal: Se colectó en el municipio de Medina departamento de

Cundinamarca. Un ejemplar se depositó en el Herbario Nacional Colombiano con

No. COL: 506495.

Obtención de extractos: Se realizó extracción en Soxhlet con Petrol para el

desengrase del material durante 72 horas, se concentró en rotavapor a presión

reducida. Al extracto floculado se le hizo una cromatografía en columna flash en

sílica gel eluída con Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH de la cual se obtuvieron 4

fracciones. A cada fracción se le realizó cromatografías en placas de sílica gel

corridas en Petrol:AcOEt (7:3), reveladas con ácido perclórico.

El material desengrasado fue extraído por maceración en frío con EtOH, el

extracto se concentró a presión reducida en rotavapor. Se realizó cromatografía en

columna flash con RP-18 eluída con mezclas de MeOH:H2O (10:2), MeOH,

MeOH:CH2Cl2 (8:2) y CH2Cl2, se obtuvieron 10 fracciones.

A la fracción MeOH se le hizo cromatografía en columna con Sephadex eluída

con MeOH, se obtuvieron tres subfracciones, se les hizo cromatografía en placas

de RP-18 corridas en MeOH:H2O (10:2), revelada en ácido perclórico. A la

fracción 3 del extracto EtOH también se le hizo subfraccionamiento y se

obtuvieron dos subfracciones, se realizó cromatografía en placas de RP-18

corridas en MeOH:H2O (10:2), revelada con ácido perclórico.

A los extractos totales de EtOH y Petrol y a las fracciones se les realizaron

pruebas fitoquímicas cualitativas de terpenos: liebermann burchard, salkwoski;

saponinas: molish, antrona, prueba de espuma; flavonoides: shinoda, cloruro

férrico; alcaloides: dragendorff.

Fraccionamiento guiado por bioensayo: consiste en la aplicación de técnicas de

separación y aislamiento sobre un determinado extracto, con el objeto de hacer un

seguimiento de la actividad biológica de las fracciones obtenidas, para finalizar

con la identificación de los principios activos responsables de la actividad

citotóxica demostrada por el extracto original, determinar el posible efecto

sinérgico o antagónico entre las sustancias que están presentes en la fracción que

contiene el posible principio activo.

Bioensayos: La viabilidad celular fue determinada por la técnica del MTT, ensayo

que se encuentra ampliamente referenciado en la literatura Studzinski (|1999). Se

tomó como control negativo del solvente empleado DMSO 0.2%.

Solubilización y preparación de muestras: Los extractos se solubilizan en

Dimetil Sulfoxido (Merck) al 0.2% concentración inocua para las células.

Líneas celulares: Se utilizaron las líneas celulares neoplásicas suministradas por

el Instituto Nacional de Cáncer de EEUU: MCF -7 (seno) y Colo 205 (cólon) y

la línea de cáncer de seno obtenida y caracterizada en el Instituto Nacional de

Cáncer de Colombia CSS-1595 con las siguientes características:

MCF-7. Tumor de una paciente de 69 años con adenocarcinoma de glándula

mamaria, hipotetraploide, células epiteliales.

CSC 1595. Tumor de una paciente de 77 años con cáncer de seno ductal

infiltrante avanzado, características: aneuploide, 70 cromosomas,

hormonodependiente, sensible a antraciclinas y 5-fluoracilo. Téllez et al (2006).

Colo 205. Tumor de un paciente de 70 años, caucásico, con carcinoma de cólon

(adenocarcinoma), hipertriploide.

Cultivo celular: Se utilizaron cajas de 96 pozos para el cultivo de las células con

medio L-15 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 µl/10ml,

penicilina estreptomicina y neomicina (5000U, 5mg estreptomicina y 10 mg

neomicina/ml). Las líneas celulares fueron resuspendidas en medio de cultivo L-

15 (±40 000 células por pozo) en 100 µl por pozo. Las cajas se incubaron a 37º C

y 5% de CO2 por 24 horas, tiempo para la formación de la monocapa de células.

Después de la formación de la monocapa, se colocaron 20 µl de cada una de las

soluciones de extractos y fracciones a las concentraciones definidas (300 µg/ml de

extractos y 100 µg/ml de fracciones), en los pozos de la caja, se incubaron por 24

horas, tiempo para que las células puedan incorporar las sustancias. Pasado este

periodo las soluciones de extractos y sus respectivas fracciones son retiradas y a

cada pozo se le adicionaron 100 µl de medio L-15, por 24 horas para establecer si

las células se recuperan.

Posteriormente el medio es retirado y a cada pozo se le agregaron 100 µl de

medio Dulbecco modificado y 50 µl de MTT, las cajas se incubaron por 4 horas a

37º C. Pasadas las 4 horas se retiraron los 150 µl de medio Dulbecco y MTT y se

adicionaron en los pozos 100 µl de isopropanol para disolver los cristales de

formazan producidos, a continuación se leyó la absorbancia en espectrofotómetro

a una longitud de onda de 540 nm.

RESULTADOS.

Para las fracciones Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH del extracto en Petrol, las

pruebas fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos.

Tabla 1. Pruebas fitoquímicas de las fracciones del extracto Petrol.

Fracción Cloruro

Férrico

Shinoda Liebermann

Burchard


Petrol - - - - - -

CH2Cl2 - - + + - +

AcOEt - - + + - +

MeOH - - + + + -

Las fracciones obtenidas del extracto EtOH mostraron en las pruebas

fitoquímicas cualitativas la presencia de flavonoides, esteroides y/o triterpenos y

saponinas ver tabla 2.

Tabla 2. Pruebas fitoquímicas de las fracciones del extracto EtOH.

Fracción Cloruro

Férrico

Shinoda Liebermann

Burchard


1 + + + + + +

2 + - + + + +

3 - - + + + +

4-10 - - + - - -

A los extractos de Petrol y EtOH se hojas de I.laevis se les evaluó el efecto

citotóxico a una concentración de 300 µg/ml y a las fracciones a una

concentración de 100 µg/ml, frente a las líneas celulares. Las fracciones que se

consideraron activas fueron las que presentaron un porcentaje de viabilidad menor

a un 50%. La fracción MeOH del extracto Petrol presentó la mayor actividad

como se muestra en la Tabla 3 con un porcentaje de viabilidad de 7% en la línea

celular 1595.

Tabla 3. Porcentaje de viabilidad de las células para las fracciones Petrol, CH2Cl2,

AcOEt, MeOH del extracto petrol. Concentración a 100 µg/ml.

F. Petrol F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH

MCF-7 66 81 97 32

Colo 206 77 82 97 69

CSC 1595 64 43 38 7

En el estudio se encontró que las fracciones actuaron mejor sobre las líneas

celulares de cáncer de seno 1595 y MCF-7 en las que se encontraron porcentajes

de viabilidad de 20 a 48%. Según tabla 4.

Tabla 4. Porcentaje de viabilidad de las células para las fracciones 1 – 10 del

extracto EtOH. Concentraciones a 100 µg/ml.

F.1 F.2 F.3 F.4 F.5 F.6 F.7 F.8 F.9 F.10

MCF-7 93 43 27 44 72 44 29 50 20 55

Colo 205 108 103 162 41 41 115 127 157 152 148

CSC 1595 130 39 23 48 58 57 35 38 42 104

Figuras 1, 2 y muestran las fracciones tanto del extracto petrol como del EtOH

que tuvieron un porcentaje de viabilidad menor al 50%. Las dos líneas celulares

de cáncer de seno presentaron un mayor número de fracciones con viabilidad

inferior al 50%. En la línea celular colo 205 las fracciones 4 y 5 presentaron

viabilidad de 41%.

01020304050

%

VIA

BIL

IDA

D

F. MeOH F.2 F.3 F.4 F,7 F.8 F.9

FRACCIONES

FRACCIONES CON EFECTO CITOTOXICO < A 50% EN LA LÍNEA CELULAR 1595

Figura 1. Fracciones petrol y EtOH con porcentaje de viabilidad menor al 50% en

la línea celular 1595

0

20

40

60

%

VIA

BIL

IDA

D

F. MeOH F.2 F.3 F.4 F.6 F,7 F.9

FRACCIONES

FRACCIONES CON EFECTO CITOTOXICO < AL 50% EN LA LÍNEA CELULAR MCF-7

Figura 2. Fracciones petrol y EtOH con porcentaje de viabilidad menor al 50%

sobre la línea celular MCF-7.

Para las subfracciones de la fracción MeOH del extracto en Petrol, las pruebas

fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos. Las

subfracciones Sf1, Sf2 y Sf3 obtenidas a partir de la fracción MeOH del extracto

Petrol se probaron a la concentración de 50 µg/ml. La subfracción Sf1 mostró

un porcentaje de viabilidad del 100%; La subfracción Sf2 presentó un porcentaje

de viabilidad de 72% y Sf3 83% de viabilidad para la línea celular de cáncer de

seno CSC 1595 como se muestra en la Tabla 5 y figura 3.


fracción MeOH del extracto Petrol concentraciones 50 µg/ml

% viabilidad

Sf1 Sf2 Sf3

CSC 1595 100 72 83

0

50

100

%

VIA

BIL

IDA

D

Alcaloide subfr.1 subfr. 2 Subfr.3

SUBFRACCIONES

EFECTO CITOTOXICO DE SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN MeOH DEL EXTRACTO PETROL EN LA LÍNEA

CELULAR 1595

Figura 3. Efecto citotóxico de subfracciones de la fracción MeOH del extracto

petrol sobre línea celular 1595.

Para probar si las subfracciones actuaban de forma sinérgica o antagónica se

hicieron mezclas de las subfracciones, se probaron a una concentración de 50

µg/ml, las subfracciones 1 y 2 fueron las que presentaron un porcentaje de

viabilidad más bajo 68% como se muestra en la tabla 6.

Tabla 6. Porcentaje de viabilidad de la mezcla de las subfracciones de la fracción

MeOH del extracto Petrol concentraciones 50 µg/ml.

% viabilidad

Sf1+ Sf2+Sf3

Concentración 16.6

µg/ml

Sf1+ Sf2

Concentración

16.6 µg/ml

Sf2+Sf3

Concentración 25

µg/ml

Sf1+Sf3

Concentración 25

µg/ml

CSC 1595 71 68 92 84

Las pruebas fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos

en las subfracciones de la fracción 3 del extracto EtOH. Las subfracciones S3.1

y S3.2 de la fracción 3 del extracto EtOH se probaron a la concentración de 50

µg/ml. La subfracción S3.1 tuvo un porcentaje de viabilidad del 60% y la

subfracción S3.2 mostró un porcentaje de viabilidad de 61% en la línea celular

CSC 1595


fracción 3 del extracto EtOH. Concentraciones 50 µg/ml.

Sf1 Sf2

CSC 1595 60 61

60

62

%

VIA

BIL

ID AD

subf r . 1 Subf r . 2

SUBFRACCIONES

EFECTO CITOTOXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO EtOH DEL EXTRACTO EN LA LÍNEA CELULAR 1595

Figura 4. Efecto citotóxico de subfracciones de EtOH en línea celular 1595

DISCUSIÓN

Los extractos se probaron a una concentración de 300 µg/ml mostrando los

siguientes efectos citotóxicos, la línea tumoral CSC 1595 fue la más sensible a los

extractos totales petrol y etanólico, con un efecto citotóxico del 50% (% de

viabilidad 50%).

En la evaluación de las fracciones petrol, CH2Cl2, AcOEt y MeOH valoradas a

100 µg/mL, se demostró que la más activa fue la fracción MeOH con porcentajes

de viabilidad de 32% y 7% en las líneas tumorales de seno MCF-7 y CSC 1595

respectivamente.

La línea celular obtenida de tumor de paciente colombiano CSC 1595 fue la más

sensible al efecto de las fracciones CH2Cl2, AcOEt y MeOH con porcentajes de

viabilidad del 43%, 38% y 7% respectivamente, este resultado es interesante si

se tiene en cuenta que esta línea se considera joven, conservando un buen grado

de similitud entre el tejido tumoral y la línea celular, opuesto a lo que sucede con

la líneas celulares comerciales como lo menciona Téllez et al (2004). Las

fracciones no fueron activas para la línea celular de colón Colo 205. Estos

resultados demuestran cierta selectividad de acción frente a las líneas tumorales de

diversa procedencia y origen.

El comportamiento de las fracciones del extracto de EtOH también fue similar

para las líneas 1595 y MCF-7. Las fracciones 2, 3, 4, 7, 8 y 9 del extracto EtOH

presentaron porcentajes de viabilidad entre 23 y 50% para las líneas celulares

CSC 1595 y MCF-7, la fracción 6 tuvo una viabilidad 44% solo para la línea

celular MCF-7, la línea celular Colo 205 tuvo un comportamiento diferente al de

las otras dos líneas, siendo las fracciones 4 y 5 las más activas con un porcentaje

de viabilidad de 41%, opuesto a lo que mostró la viabilidad para el resto de

fracciones y extractos de petrol y EtOH que tuvieron un efecto proliferativo con

porcentajes de viabilidad entre 79 y 162% en esta línea celular.

Las pruebas fitoquímicas cualitativas muestran que las fracciones del extracto

EtOH y del extracto petrol contienen esteroides y/o triterpenos y saponinas

triterpénicas Tablas 1 y 2, concuerda con la química reportada en la literatura

para las especies de Isertia, Arriaga et al (1990), Rumbero et al (1990), Bruix et

al (1993); Um et al (2001).

Los resultados del porcentaje de citotoxicidad para la fracción MeOH a unas

concentraciones de 100 y 50 µg/ml fue de (93% y 35% de efecto citotóxico)

respectivamente lo que indica que la CC50 se debe encontrar entre los 50 y 100

µg/ml; al subfraccionar la fracción MeOH que fue la que presentó el porcentaje

de viabilidad inferior al 7% se quiso determinar el posible efecto sinérgico o

antagónico entre las sustancias que presentaba esta fracción, se obtuvieron tres

fracciones y la fracción que presentó un mayor porcentaje de citotoxicidad fue la

Sf2 (28%), las subfracciones no actuaron de manera similar como la fracción

MeOH, por eso se hicieron mezclas de las subfracciones para observar cual

presentaba un efecto citotóxico moderado, se observó que las mezclas donde se

encontraba la subfracción 2 presentaron una mejor actividad citotóxica explicando

así que las subfracciones 2 y 1 se relacionan de forma sinérgica y la subfracción 3

presenta un efecto antagónico con respecto a las otras subfracciones.

Según las cromatografías y las pruebas fitoquímicas cualitativas, los metabolitos

secundarios esteroides y/o triterpenos posiblemente sean los que están actuando

favorablemente en la actividad citotóxica de las fracciones que presentaron un

porcentaje de viabilidad menor o igual al 50%. A los triterpenos y saponinas

triterpénicas se les ha comprobado propiedades farmacológicas importantes, entre

ellas una buena actividad citotóxica en varias líneas celulares derivadas de

tumores humanos, como lo referencia Sparg et al (2004) para varias familias

botánicas y Cheng et al (2002) y Setter et al (2003) para especies de la familia

rubiaceae.

Uno de los géneros más estudiado ha sido el género Uncaria, en la especie U.

rhynchophylla se encontraron varios esteres triterpenos tetracíclicos y ácidos

uncarínicos, los cuales inhibieron el crecimiento de las líneas celulares de cáncer

A-549, HCT-15, MCF-7 y HT-1197. Heitzman et al (2005).

En el trabajo de Cheng et al (2002) sobre Mitragyna inermes se reportó una 27-

nor-triterpenoide aglycona que había sido aislada solo de Isertia haenkeana y

Adina rubella. El extracto MeOH fue el que mostró ser citotóxico contra un

panel de líneas celulares de cáncer humanos, utilizaron como eluyentes de la

columna de sílica gel CH2Cl2, AcOEt y MeOH, obteniendo tres fracciones. La

fracción I presentó la inhibición del crecimiento de más del 50% en la línea

celular Bel-7402, esta fracción fue sometida a purificación sobre columna de

Sephadex LH-20 y se aisló el componente citotóxico (un ácido quinóvico).

Tanto el género Uncaria como el género Isertia pertenecen a la subfamilia

Cinchonoideae compartiendo caracteres morfológicos, pero sería preciso acudir a

caracteres quimiotaxonómicos que fortalecieran aún más los aspectos

filogenéticos dentro de la subfamilia.

El análisis estadístico entre los valores de controles y ensayos fueron

interpretados mediante la prueba t (Student), con un nivel de significancia de

(p<0.05). Los valores de t calculados mostraron ser inferiores a los valores de t

de la tabla, sí hay diferencias significativas entre los tratamientos y el control, el

efecto citotóxico de los extractos y fracciones fue producto de las concentraciones

que fueron probadas y no causado por otros agentes.

LITERATURA CITADA.

-Aquino, R., De Tomáis, N., De Simona, F & Pizza, C. 1997. Triterpenes and

quinovic acid glycosides from Uncaria tomentosa. Phytochemistry 45: 1035-

1040.

-Arriaga, F, J., Rumbero-Sanchez, A & Vazquez, P. 1990. Two triterpene

glycosides from Isertia haenkeana. Phytochemistry. 29: 209-213.

-Bohrmann, H., Lau-Cam, C., Tashiro, J & Youngken Jr. 1969. Constituens of

Isertia hypoleuca Benth. (Rubiaceae)-I. Isolation and characterization of

dihydroquinamine from the leaf material. Phytochemistry. 8: 649-652.

-Bruix, M., Rumbero, A & Vazquez, P. 1993. Apodihydrocinchonamine, an

indole alkaloid from Isertia haenkeana. Phytochemistry. 33: 1257-1261.

-Cheng, Z-H., Yu, B-Y. & Yang, X-W. 2002. 27-nor-triterpenoid glycosides from

Mitragyna inermis. Phytochemistry 61: 379-382.

-García Barriga, H. 1992. Flora Medicinal de Colombia. Tomos I, II y II. Tercer

Mundo Editores. Bogotá.

-Mosmann, T. 1983. Rapid colorimetric assays for cellular growth and survival:

application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological

Methods. 65: 55-63.

-Rumbero-Sánchez, A & Vazquez, P. 1991. A nor-triterpene glycoside from

Isertia haenkeana and a 13CNMR study of cincholic acid. Phytochemistry. 30:

623-626.

-Setzer, M., Moriarity, D., Lawton, R., Setzer, N., Gentry, G. & Haber, W.

2003. Phytomedicinal potencial of tropical cloudforest plants from Monteverde,

Costa Rica. Revista de Biología Tropical 51: 647-674.

-Sparg, S.G., Light, J & Staden J.van. 2004. Biological activities and distribution

of plant saponins. Journal of Ethnopharmacology. 94: 219-243.

-Um, B. H., Weniger, B., Lobstein, A., Pouplin, T., Polat, M & Aragon, R. 2001.

Triterpenoid saponins from Isertia pittieri. Journal of Natural Products. 12: 1588-

1589.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE EXTRACTOS …evaluaciÓn de la actividad citotÓxica de...

Documents

Transcript of EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE EXTRACTOS …evaluaciÓn de la actividad citotÓxica de...