Evaluación de la estabilidad de emulsiones O/W generadas a partir de proteína

OmpN de Escherichia coli como biosurfactante con aceite de palma “Milpesos”.

María Camila Henao Botía

Proyecto de grado para optar por el título de Ingeniero Químico

Asesor,

Andrés González Barrios

Ingeniero Químico, M. Sc, Ph. D

Co-Asesor,

Juliana Erika Cristina Cardona

Ingeniera Química, M. Sc, Ph D (c)

Universidad de Los Andes

Facultad de ingeniería

Departamento de ingeniería química

Bogotá D.C., Colombia

Junio, 2018

Objetivo general

Evaluar la estabilidad de emulsiones directas formuladas a partir de aceite de milpesos y

agua usando como biosurfactante OmpN de Escherichia coli.

Objetivos específicos

Establecer el efecto de la estrategia de agitación sobre la estabilidad de la emulsión

mediante la determinación de la distribución de tamaño de gota.

Determinar visualmente el comportamiento de la mezcla a diferentes tiempos de

almacenamiento.

Analizar los probables fenómenos de desestabilización de las emulsiones formuladas

utilizando métodos de medición de la transmisión y retrodispersión de la luz a través de

la muestra.

Evaluación de la estabilidad de emulsiones O/W generadas a partir de proteína

OmpN de Escherichia coli como biosurfactante con aceite de palma “Milpesos”.

María Camila Henao Botía1, Juliana Erika Cardona Jaramillo2, Andrés González Barrios3.

Departamento de ingeniería química, Universidad de Los Andes, Colombia

Resumen

Actualmente en el mercado se encuentra una gran variedad de surfactantes

disponibles; sin embargo, en la industria cosmética se tiene la creciente preocupación acerca

de los efectos secundarios que se pueden obtener por el uso de estos. En consecuencia, se

abre la oportunidad al uso de biosurfactantes obtenidos a partir de hongos filamentosos,

levaduras y más, reduciendo la probabilidad de alergias e irritaciones y mejorando su

compatibilidad ambiental; dentro de los cuales ha crecido el interés por las proteínas

transmembranales como OmpN, producida por Escherichia coli. El presente trabajo tuvo

como objetivo evaluar la estabilidad de emulsiones O/W usando OmpN como surfactante.

Su desempeño fue comparado con Tween 20 como control positivo. Adicionalmente fueron

evaluadas diferentes velocidades de agitación en el proceso de emulsificación usando el

dispersor DispermatTM. Los resultados mostraron que emulsiones con una concentración de

0.02% de OmpN y elaboradas con una velocidad de agitación de 5000 rpm presentan la mejor

estabilidad entre las condiciones analizadas. Además, se observó una similitud marcada en

cuanto a la cinética de desestabilización con el surfactante convencional.

1. Introducción

Los aceites vegetales son lípidos extraídos de diferentes recursos vegetales como

semillas, granos y frutos, los cuales pueden ser obtenidos mediante prensado, extracción por

solvente o una mezcla entre ambas técnicas [1]. Químicamente, se encuentran constituidos

por triglicéridos de ácidos grasos saturados e insaturados y, dependiendo de los porcentajes

de cada uno de estos, pueden presentar diferentes propiedades [2]. Dada su alta versatilidad

y los múltiples beneficios que conllevan, estos han sido ampliamente usados en la industria

alimenticia y farmacéutica y cada vez es más común encontrarlos en formulaciones

cosméticas y productos para el cuidado de la piel, gracias a que pueden suavizar la capa

cornea, además de exhibir efectos antioxidantes, desinflamatorios e hidratantes [2], [3].

Colombia se encuentra catalogada como el segundo país con mayor biodiversidad en

el mundo, ya que gracias a su privilegiada ubicación cuenta con el 10% de la variedad

biológica mundial de la cual se tiene registro en la actualidad [4]. Es por esto que la

biotecnología se perfila como una gran oportunidad para lograr un mayor desarrollo regional.

Sectores como el del aseo, alimenticio y cosmético pueden ser explotados mediante el uso

sostenible de los recursos del país [5]. El mercado global de los ingredientes para el cuidado

personal alcanzo los 9.62 billones de dólares en el 2015 [6]. Sólo en el 2007 una tercera parte

de los ingredientes usados correspondían a ingredientes naturales, cifra que se encuentra en

aumento gracias a la creciente preocupación del consumidor acerca de la toxicidad de los

productos sintéticos usados convencionalmente; generando de ese modo, un mercado

potencial dentro del cual, la biodiversidad del país nos otorga una ventaja considerable frente

a otras naciones. [6], [7].

Teniendo en cuenta que la mayoría de los productos usados en la industria cosmética

y de cuidado personal tienen altos contenidos de agua y aceite, se hace necesario generar

emulsiones con el fin de obtener mezclas estables y uniformes a lo largo del tiempo, función

que cumplen los surfactantes en este tipo de productos. Actualmente, en el mercado se

encuentran diferentes tensoactivos los cuales pueden ser clasificados como aniónicos,

catiónicos y no iónico; sin embargo, existe la creciente preocupación acerca del impacto que

estos causan sobre la piel y el ambiente. Por una parte, el contacto directo y prolongado en

la piel puede causar efectos indeseados como alergias, irritación dérmica y ocular. Por el

otro, los tensoactivos convencionales exhiben una escasa compatibilidad ambiental debido a

su toxicidad para la flora y la fauna acuática, así como su resistencia a la degradación

biológica [8], [9].

Este aspecto permite el avance en diversos estudios que presentan una alternativa ante

los surfactantes convencionales, la cual se basa en el uso de biosurfactantes producidos por

diferentes microorganismos como hongos, levaduras y bacterias, dentro de los cuales se ha

generado cierto interés en las proteínas transmembranales bacterianas. El uso de surfactantes

naturales proporciona diversos beneficios como baja toxicidad y alta biodegradabilidad,

además de disminuir la probabilidad de que el consumidor pueda sufrir reacciones alérgicas

al producto [9], [10].

El presente trabajo tiene como objetivo evaluar la estabilidad de emulsiones O/W

generadas a partir de aceite de palma milpesos (Seje) en agua con proteína OmpN como

surfactante. Estudios previos determinaron que la proteína tiene la capacidad de emulsificar,

sin embargo el proceso de emulsificación mediante el sonicador de punta generaba grandes

tamaños de gota, causando la rápida desestabilización de la mezcla por coalescencia[11]. Por

tal motivo, se realizó la evaluación del uso de un dispersor (Dispermat) en la elaboración de

las emulsiones, el cual además de permitir la variación en el tamaño de gota generado, abre

la posibilidad de escalar la emulsificación para obtener volúmenes de producción mayores y

lograr la viabilidad a nivel industrial de este tipo de productos.

2. Marco teórico

2.1. Palma de milpesos

Oenocarpus bataua, comúnmente conocida como palma de seje, milpesos o patawa,

es una especie de palma monoica, la cual presenta una altura entre los 10 y 30 metros

aproximadamente. Se caracteriza por tener hojas erectas que conforman una corona en forma

de V. La inflorescencia puede alcanzar hasta los 2 metros de largo y sus frutos presentan una

forma ovoide cuyo color alcanza un color violeta a café durante la madurez. Del fruto se

extrae un aceite el cual presenta diferentes usos, entre los cuales se distingue el tratamiento

para la bronquitis, inflamaciones, dolor de articulaciones y caída del cabello [12]. Su

composición química se asemeja a la del aceite de oliva, presentando en promedio 78% de

ácido oleico y 13% de ácido palmítico, sin embargo, su composición presenta variaciones

relacionadas con la ubicación geográfica de la plantación. La palma de seje se encuentra

presente en países como Venezuela, Bolivia, Brasil y Colombia, en donde está distribuida

alrededor de la Amazonía y el Chocó [12].

2.2. Emulsiones y tensoactivos

Se considera como emulsión a un sistema heterogéneo compuesto por dos líquidos

inmiscibles dispersados uno en otro en forma de gotas cuyos diámetros se encuentran entre

0.1- 5 μm; estas emulsiones pueden ser sencillas, ya sea aceite en agua (O/W) o agua en

aceite (W/O) pero también pueden ser múltiples como W/O/W y O/W/O. Sin embargo, éstas

no poseen gran estabilidad, por lo que se hace necesario el uso de diferentes aditivos como

surfactantes, los cuales alteran las propiedades interfaciales de la solución [8], [13], [14].

Los surfactantes tienen la capacidad de reducir la tensión interfacial debido a su

estructura molecular, la cual presenta una cabeza hidrofílica y una cola hidrofóbica,

permitiéndole adsorberse en la interfase de los dos componentes; esta adsorción puede ocurrir

a causa de la interacción electrostática, enlaces de hidrogeno o por medio de la interacción

de Van der Waals [8]. Los tensoactivos, como también pueden ser llamados, se clasifican de

acuerdo con sus propiedades fisicoquímicas en 3 grupos diferentes, aniónicos, catiónicos y

no iónicos. Estos pueden ser usados como dispersantes, detergentes, emulsificantes,

estabilizantes y humectantes [15].

2.3. Mecanismo de emulsificación

Un factor importante en cuanto a la realización de emulsiones es la agitación, ya que

si bien el surfactante es quien reduce la tensión interfacial, es mediante la adición de energía

que se logra crear una fase dispersa aumentando la interfaz [16]. Existen diferentes

mecanismos de emulsificación dependiendo de la energía que requiera el sistema y el tamaño

de gota que se desee obtener; existen métodos de baja y mediana energía como los

mezcladores estáticos o agitadores y los de alta energía que incluyen mezcladores de alta

velocidad como el Ultra TurraxTM (IKA), DispermatTM (VMA-Getzmann),

homogeneizadores a presión y ultrasonido [17].

Algunos aspectos que considerar para la selección del equipo a usar son la versatilidad

y escalabilidad de estos. Dispersores como el Ultra TurraxTM (IKA) o DispermatTM (VMA-

Getzmann) son considerados mezcladores de escala piloto y mediante los resultados

obtenidos en laboratorio es posible replicar los resultados a nivel industrial; para lo cual debe

mantenerse la velocidad de punta y la geometría del agitador; no obstante un aumento en la

temperatura y tiempo de agitación debe ser considerado gracias a la disminución en la

relación superficie/volumen así como la potencia por unidad de volumen [18].

2.4. Escherichia coli y procesos biológicos

La E. coli es un bacilo gram negativo, sin esporas, anaerobio facultativo perteneciente

a la familia Enterobacteriaceae [19]. Este grupo de bacterias puede crecer en temperaturas

entre los 7 y 45 °C y aunque prefieren pHs neutros pueden sobrevivir entre un pH de 4.3 a

10 [20]; a pesar de que estas bacterias son generalmente encontradas en el tracto intestinal,

se han encontrado diferentes cepas catalogadas como patógenas en humanos [20].

La E. coli es considerablemente usada a nivel industrial para la producción de

proteínas recombinantes (PR), actualmente alrededor del 30% de las PR son producidas a

partir de esta bacteria dadas las diversas ventajas que este organismo presenta, como lo son

el rápido crecimiento en medios simples y económicos, la variedad de vectores para la

producción de la proteína, además del basto conocimiento acerca del genoma, de su fisiología

y metabolismo [21].

Las bacterias gram negativas como E. coli presentan proteínas transmembranales

como lo son OmpA, OmpC, OmpF y OmpN. Específicamente, la proteína OmpN cumple la

función de crear poros que permitan la difusión pasiva de moléculas de tamaño pequeño a

través de la membrana externa. Esta se encuentra como una porina la cual forma un barril β

antiparalelo de 16 cadenas, compuesta por un total de 356 aminoácidos y una masa molecular

estimada en 39.152 Da [22], [23]. Su estructura al poseer grupos hidrofílicos y lipofílicos

le concede a la proteína un carácter anfipático, haciendo posible su uso como biosurfactante.

3. Metodología

3.1. Extracción de aceite

Para obtener el aceite de Seje, se tomó el fruto y se dispuso en un secador de bandejas

a 70°C por 24 horas. Posteriormente, se procedió a moler el material vegetal en un molino

de cuchilla y mezclarlo con éter de petróleo 40/60, el cual fue usado como solvente. La

mezcla fue dejada en reposo por 3 días. Finalmente, se extrajo el solvente y se llevó a cabo

la extracción del aceite mediante el método de evaporación a presión reducida, proceso que

se llevó a cabo por lotes en un evaporador rotativo.

3.2. Producción de la proteína

3.2.1. Curva de crecimiento

La curva de crecimiento permite observar las diferentes etapas del crecimiento

bacteriano, lo que permite identificar el momento indicado para adicionar el agente inductor

y lograr una mayor cantidad de bacterias con el gen ompN sobre expresado. Para esto, se

realizó una siembra por agotamiento de la bacteria E. coli K-12 W3110/pCA24N ompN+ en

un medio LB sólido usando cloranfenicol como antibiótico, la cual se dejó incubando a 37°C

durante la noche. Luego se seleccionó una colonia aislada de la caja de Petri sembrada, la

cual fue inoculada a un medio LB líquido de 40 mL y se dispuso en un shaker a 250 rpm y

una temperatura de 37°C durante 16 horas. Finalmente, el inóculo fue llevado a un medio LB

líquido de 400 mL el cual se dejó a 250 rpm y 37°C. A partir de este momento, se tomaron

alícuotas de 1mL cada media hora y se midió la densidad óptica en el espectrofotómetro a

una longitud de onda de 600 nm por un tiempo de 7 horas.

3.2.2. Sobreexpresión del gen

Siguiendo el procedimiento descrito en el inciso 3.2.1, se realizó un medio LB líquido

de 3600 mL el cual se esterilizó previamente en un biorreactor con capacidad de 4 L,

acondicionado para permitir fermentación de la bacteria (temperatura de 37 °C, 250 rpm y

un flujo de aire de 0.2 L/min). Una vez se alcanzó estas condiciones, se introdujo el inóculo

de 400 mL y al llegar a una densidad óptica de 0.7 se indujeron 20 g de lactosa. Ya adicionado

el agente de inducción, se esperó un tiempo aproximado de 4 horas hasta alcanzar la fase

estacionaria de la bacteria. Finalmente se almacenó el cultivo a temperatura de refrigeración

(4°C).

3.2.3. Concentración de la proteína OmpN

El cultivo fue filtrado en primera instancia por el filtro de capsula OpticapTM

(Millipore), el cual fue previamente esterilizado, con el fin de eliminar de la solución todas

las partículas con tamaños mayores a 0.5 μm. Después, el permeado fue filtrado en el filtro

tangencial, el cual se encontraba equipado con el cassette Pellicon 2 mini GVPP 0.22 μmTM

(Millipore), logrando un volumen retenido de 500 mL; este protocolo se encuentra disponible

en el Anexo 1. Posteriormente, se procedió a disponer la muestra en tubos falcon de 50 mL

y centrifugar por una hora a 2500 rpm y 4°C con el fin de separar por densidades el cultivo,

se descartó el sobrenadante. Los pellets obtenidos, fueron lisados resuspendiéndolos en una

relación 1:6 (p/v) con solución buffer (300 mM cloruro de sodio, 50 Mm fosfato sódico,

0.01% Tween®-20, 1% Triton X-100, pH 8) y sonicándolos a una amplitud de 37% y 40

ciclos de 20s x 40s en un baño de hielo. El resultante fue centrifugado nuevamente a 2500

rpm y 4°C por una hora del cual se conservó el sobrenadante.

3.3. Purificación de proteína OmpN mediante cromatografía por afinidad

La proteína fue purificada por lotes en una columna de flujo gravitacional haciendo

uso de una resina ProfinityTM IMAC de Bio-Rad con tecnología UNOsphereTM. Una técnica

basada en la afinidad de una molécula por ciertos metales inmovilizados en una superficie

quelante. El ligando quelante se carga con un metal de transición, en este caso Níquel, dando

como resultado una alta selectividad de las proteínas con histidina, causando que se retengan

fuertemente en el soporte cromatográfico poroso. La tecnología UNOsphere permite a la

resina tener excelentes propiedades de flujo sin comprometer la unión, la recuperación o la

pureza de las proteínas. [24]

Figura 1. Etapas purificación de OmpN

Para la etapa de la purificación (Figura 1) se usaron tres soluciones buffer, iniciando

con un buffer vinculante (50 mM fosfato sódico, 300 mM cloruro de sodio, 5 mM imidazol,

pH 8 ), el cual cumple con la función de establecer las condiciones óptimas que favorecen la

unión con el ligando de afinidad, seguido por la incorporación de la muestra. Con el objetivo

de eliminar todas las sustancias indeseadas que no se unieron al ligando, se añade el

equivalente a 5 volúmenes de la resina de un buffer de lavado (50 mM fosfato sódico, 300

mM cloruro de sodio, pH 8). Finalmente se usa el buffer de elución (50 mM fosfato sódico,

300 mM cloruro de sodio, 500 mM imidazol, pH 8) en la misma proporción, para así poder

liberar las moléculas unidas haciendo uso de un ligando competitivo, en este caso imidazol.

Se recolectaron fracciones de un volumen aproximado de 10 mL que fueron almacenadas a

una temperatura de refrigeración para su posterior verificación [25].

3.4. Corroboración presencia de la proteína mediante SDS- PAGE

Con el fin de determinar la presencia de la proteína, se realizó una electroforesis en

gel de poliacrilamida. En un principio, se utiliza un gel de corrido (3350 μL de agua

desionizada, 2500 μL Tris HCl pH 8, 100 μL SDS 10%, 4000 μL solución acrilamida y 60

μL de solucion de peroxidisulfato con 20 μL de Temed los cuales fueron adicionados en

última instancia) se esperó 20 minutos mientras el gel polimerizaba. Seguido, se preparó el

gel de almacenamiento (300 μL de agua desionizada, 1250 μL Tris HCl pH 6.8, 100 μL SDS

10%, 700 μL solución acrilamida, 50 μL solución de peroxidisulfato, 10 μL Temed), el cual

se virtió sobre gel de corrido, ubicando el peine con el fin de marcar los carriles.

Simultáneamente, se tomaron alícuotas de 10 μL de las muestras obtenidas y se

diluyeron en una relación 3:1 (v/v) en buffer de muestra. Se desnaturalizaron en baño seco a

90°C por 10 minutos. Se introdujo una alícuota de 10 μL en carril demarcado, añadiendo el

marcador de peso molecular Bio-Rad #1060318 y se corrió a 100 V durante hora y media.

Se extrajo el gel y se llevó a cabo la coloración usando solución de azul de Comassie.

Finalmente, se realizó la distinción mediante una solución de lavado (metanol 20%, ácido

acético 10% en agua desionizada).

3.5. Cuantificación de la proteína

Una vez se haya detectado la presencia de la proteína, se procede a cuantificarla

mediante espectrofotometría. Esto se logró, con la ayuda del equipo NanodropTM

(Thermofisher), el cual se adaptó para absorber una longitud de onda de 280 nm, longitud

correspondiente al máximo de absorción en el espectro de ultravioleta de las proteínas [20].

3.6. Liofilización de la proteína

La liofilización es un proceso de deshidratación mediante el cual se pueden solidificar

formulaciones permitiendo su almacenamiento en su forma seca. Esto permite disminuir

tanto la tasa como el alcance de las transformaciones físicas no deseadas, así como las

degradaciones químicas de las proteínas para evitar alteraciones en la calidad y estabilidad

de los productos generados a partir de estas [26]. Esto se logró liofilizando la muestra en

cajas de Petri de máximo un centímetro de espesor a -40°C por un tiempo de 24 horas en un

liofilizador.

3.7. Medición de tensión interfacial

3.7.1. Determinación de la dinámica de adsorción del surfactante

La dinámica de adsorción del surfactante permite determinar cuánto tiempo requieren

las moléculas del surfactante para adsorberse completamente en la interface aceite-agua y

que tanto puede disminuir la tensión interfacial a cierta concentración de surfactante. [27]

Ésta fue determinada midiendo la tensión interfacial del sistema a lo largo del tiempo

haciendo uso de un tensiómetro óptico, mediante el método de la gota colgante (pendant

drop), el cual, a partir de la obtención de imágenes a lo largo del tiempo, permite determinar

la variación en la forma de una gota de aceite que cuelga de una jeringa dentro de una celda

con la fase continua. Este perfil es obtenido mediante un ajuste iterativo de la ecuación de

Young-Laplace propuesto por Bashforth y Adams, la cual equilibra la deformación

gravitacional de la gota con la tensión interfacial. [28]

Para determinar la cinética de adsorción, se llevaron a cabo dos experimentos. El

primero correspondiente al control negativo, el cual consistió en realizar la medición con

agua únicamente y el segundo con OmpN como surfactante a 0.07 mg/mL. Se tomaron

medidas a lo largo de 7 minutos hasta lograr la estabilización de la tensión interfacial en el

sistema y se registraron los datos.

3.7.2. Curva de tensión interfacial vs concentración de surfactante

Se procedió a realizar experimentos en el tensiómetro óptico, realizando variaciones

en la concentración de la proteína con el fin de obtener una curva de concentración vs tensión

interfacial, bajo el cual se realizó la medición una vez la tensión alcanzara un valor constante

a lo largo del tiempo, permitiendo determinar qué tanto puede disminuir la tensión el

surfactante a una concentración determinada; para lo cual se llevó a cabo un control negativo

con agua, 4 experimentos con OmpN a concentraciones de 0.04, 0.07, 0.15 y 0.32 mg/mL y

3 experimentos con Tween 20 a 0.4, 0.2 y 0.1 mg/mL el cual es usado como un surfactante

homólogo convencional debido a que al igual que la proteína, éste presenta una alta afinidad

por el agua.

3.8. Preparación de las emulsiones

Se prepararon seis emulsiones mediante el uso del dispersor Dispermat, haciendo uso

de 3 velocidades de agitación diferentes (1000, 5000 y 8000 rpm). Con base en los resultados

del tensiómetro, se realizaron emulsiones de 60 g, compuestas por 15% y 0.02% (p/p) de

aceite y surfactante, 3 de estas se hicieron con Tween 20, usado como control positivo y las

otras 3 con el biosurfactante proveniente de la proteína OmpN. Inicialmente, se homogenizó

el agua con el surfactante a una velocidad de 2500 rpm por un tiempo de 5 minutos,

posteriormente se ajustó la velocidad a la propuesta para la emulsión y se procedió a agregar

el aceite de seje por goteo mediante el uso de una bomba peristáltica; una vez adicionado

todo el aceite, se agitó por 5 minutos.

3.9. Evaluación de la estabilidad de las emulsiones

En primer lugar, una muestra fue analizada en el Turbiscan, el cual través de un

análisis de transmisión y retro dispersión, permite determinar la variación en la estabilidad

de la emulsión durante 1 hora así como los fenómenos de desestabilización encontrados. Su

principio se centra en enviar fotones a la muestra a través de un cabezal de detección y

mediante dos detectores síncronos, determinar la cantidad de luz que fue transmitida y la que

fue retrodispersada al emerger de esta [29].

Simultáneamente, una muestra más es enviada al MasterSizer, el cual realiza un

análisis de difracción laser que mide la intensidad de la luz dispersada a diferentes ángulos,

y mediante el modelo matemático de Fraunhoffer, determina la distribución de los tamaños

de gota así como el diámetro de volumen medio [30]. Se añadió la muestra hasta obtener una

oscuración de entre 11% y 12% y se tomó la medida. Posteriormente, haciendo uso de un

microscopio óptico con un objetivo de 100x se tomaron imágenes que permitieran corroborar

los resultados obtenidos por el MasterSizer. Finalmente, la emulsión clasificada como la más

estable se almacenó por un tiempo de 7 días y se determinó visualmente su comportamiento

a lo largo de este tiempo.

4. Resultados y discusión

4.1. Curva de crecimiento

De acuerdo con la Figura 2, es posible diferenciar tres de las fases del crecimiento

microbiano. Iniciando con la etapa de latencia entre las 0 y 1.5 horas, la bacteria se adapta al

medio y sintetiza las enzimas necesarias presentando un escaso crecimiento. A partir de este

momento hasta la cuarta hora, la bacteria entra en la fase exponencial, donde muestra una

velocidad de crecimiento máxima. Finalmente, a partir de la 4 hora se comienza a ver una

disminución en el crecimiento bacteriano, llegando a una estabilidad en la cantidad de

microorganismos encontrados en consecuencia al posible agotamiento de algún nutriente en

el medio [31].

Figura 2. Curva de crecimiento E. coli K-12 W3110/pCA24N ompN+ a 600 nm

La pendiente máxima fue encontrada entre la tercera y la cuarta hora, tiempo en el

cual se alcanzó una densidad óptica de 0.7 aproximadamente, lo que implica que es en este

instante en el que el crecimiento bacteriano es mayor, y por tanto se define como el mejor

momento para realizar la inducción del gen en la mayor cantidad de microorganismos.

4.2. Corroboración presencia de la proteína

El gel de electroforesis SDS-PAGE (Figura 3), permitió determinar que a partir del

noveno carril se encuentra una tinción marcada en una banda correspondiente a un peso

molecular cercano a los 39 kDa, lo cual se entiende como un indicador de la sobreexpresión

y correcta purificación de la proteína OmpN. Adicionalmente, se encontró la presencia de

una banda tenue correspondiente a una proteína de mayor peso molecular en una de estas

muestras; sin embargo, teniendo en cuenta su baja intensidad se presume una baja

concentración y que la presencia de esta no precede de un error en el proceso de purificación.

-1,4

-1,2

-1

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0

0,2

0,4

0 1 2 3 4 5 6 7 8

log

(Ab

sorb

anci

a)

Tiempo [h]

Figura 3. SDS-PAGE OmpN biorreactor. MW marcador de peso molecular. Carril 1:3 muestra sonicada;

carril 4:8 lavado; carril 9: elusión.

4.3. Dinámica de adsorción del surfactante

De las mediciones obtenidas por el tensiómetro, se encontró que la dinámica que

presenta el sistema sin el surfactante es estable a lo largo del tiempo ya que no se presenta

una variación significativa en la tensión interfacial como se observa en la Figura 4, caso

contrario a los resultados obtenidos con OmpN a una concentración de 0.07 mg/mL en el

cual se observa como disminuye la tensión interfacial en el tiempo. Se encuentra que la

adsorción total del surfactante a la interface requiere de alrededor de 7 minutos y puede

disminuir la tensión interfacial hasta 3.4 mN/m.

Figura 4. Hidrodinámica del sistema aceite de Seje con OmpN y Blanco

2

3

4

5

6

7

8

9

0 100 200 300 400 500

Ten

sió

n in

terf

acia

l [m

N/m

]

Tiempo [s]OmpN Blanco

4.4. Curva de tensión interfacial vs concentración de surfactante

De la Figura 5 se observa que el sistema con OmpN alcanza una tensión interfacial

más baja a menor concentración que el Tween 20 a una concentración similar; alcanzando

una tensión de 1.8 mN/m a 0.15 mg/mL comparado a los aproximados 3.2 mN/m con Tween

20. Adicionalmente, fue posible observar que el sistema con OmpN después de una

concentración determinada comienza a aumentar la tensión interfacial.

Se encontró adicionalmente, que los comportamientos de ambos surfactantes no

coinciden con el reportado en la literatura como se observa en el Anexo 6. En el cual la

isoterma de adsorción se presenta en dos fases, la primera, en donde la tensión interfacial

disminuye con la concentración hasta llegar a un valor mínimo (concentración micelar crítica

para surfactantes convencionales) y una segunda fase en la cual la tensión interfacial se

mantiene constante, dentro de la cual, se encuentra que sin importar la concentración, la

naturaleza del surfactante no permite una mayor disminución de la tensión [32].

Figura 5. Curva concentración vs tensión interfacial

Respecto a Tween 20, se concluye que este comportamiento se debe a que el

surfactante no logra llegar a la concentración micelar crítica a lo largo de las concentraciones

evaluadas y es por esto que solo es posible observar la primera fase de la curva. Esto implica,

que aunque la proteína disminuya más la tensión a bajas concentraciones, el Tween 20 puede

lograr una tensión más baja, permitiendo interpretar que este surfactante es menos eficiente

pero más efectivo que OmpN.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5Ten

sió

n In

terf

acia

l [m

N/m

]

Concentración [mg/mL]

OmpN Tween 20

En cuanto a OmpN, se encontró que aunque esta tiene la capacidad de disminuir la

tensión interfacial, después de determinada concentración, la tensión vuelve a aumentar; esto

e se debe posiblemente a que la estructura de la proteína es compleja y que si bien esta

presenta grupos hidrofílicos y lipofílicos en su estructura primaria, estos únicamente

equivalen a pequeñas fracciones de la proteína las cuales se encuentran distribuidas

aleatoriamente a lo largo de ésta, por lo que en su estructura secundaria pueden ser

encontrados como zonas segregadas en la superficie, causando que mientras que una pequeña

fracción de la proteína se adsorba a la interface, el resto quede suspendida en la fase acuosa,

pudiendo generar diferentes interacciones proteína-proteína que generen que la tensión

interfacial vuelva a aumentar [33].

4.5. Tamaño de gota

De acuerdo a los resultados obtenidos por el MasterSizer, se encuentra que a una

velocidad de 1000 rpm el diámetro de volumen medio, así como la polidispersidad, son altos

tanto para el caso de Tween 20, como para OmpN (Tabla 1). Esto provoca que la emulsión

tienda a la desestabilización por fenómenos como la coalescencia, la cual genera que las gotas

choquen y formen gotas de mayor tamaño. Al realizar las emulsiones a 5000 rpm se observó

que el diámetro de gota disminuyó razonablemente y de manera comparable entre los

surfactantes además de encontrarse monodispersidad en los tamaños obtenidos; esto indica

que las emulsiones presentan una mayor estabilidad. Finalmente, a 8000 rpm se encontró que

el diámetro de gota aumentó en ambas emulsiones, siendo mayor la diferencia con Tween.

Velocidad

[rpm]

Tween 20 OmpN

D[4,3] Registro fotográfico D[4,3] Registro fotográfico

1000 35.9

39.7

5000 2.05

1.5

8000 22.5

1.85

Tabla 1. Diámetro volumétrico medio

4.6. Estabilidad de las emulsiones

El TSI (Turbiscan Stability Index) es un cálculo basado en los datos brutos de

transmisión y retro dispersión arroja un número que permite clasificar la estabilidad de la

muestra, dentro del cual entre menor sea el número obtenido, mayor es la estabilidad de la

emulsión [34]. Es decir que al cabo de una hora, las emulsiones realizadas al nivel bajo de

agitación, presentan una escasa estabilidad. Esta condición se supera al aumentar la velocidad

de agitación, sin embargo no se encuentra una diferencia destacada entre las muestras

realizadas a 5000 y 8000 rpm.

Figura 6. Resumen TSI OmpN/Tween 20

De las emulsiones, fue posible determinar que a una velocidad de 1000 rpm los

diámetros volumétricos medios de las gotas tanto en Tween 20 como con OmpN son muy

altos, siendo estos mayores a 30 μm y presentando una alta polidispersidad. Resultado

complementario al obtenido por el Turbiscan, el cual indica que en ambas emulsiones se

genera una rápida coalescencia de las gotas, causando posteriormente el fenómeno de

flotación, mediante el cual las aglomeraciones de gotas de aceite por diferencia de densidades

se elevan y causan el rompimiento de la emulsión al poco tiempo. Esto implica, que la energía

adicionada al sistema es insuficiente para generar diámetros de gota lo suficientemente

pequeños como para que no choquen con otras gotas tan rápidamente.

Al llevar a cabo la experimentación a 5000 rpm, se obtiene que la estabilidad de

ambas emulsiones mejora significativamente y de forma comparable; el diámetro de volumen

medio de estas alcanza valores de 1.8 um para el sistema con OmpN y 1.2 μm para Tween

0

2

4

6

8

10

12

14

0 2000 4000 6000 8000 10000

TSI

Velocidad [rpm]OmpN Tween 20

20, se obtuvo monodispersidad en los tamaños de gota y valores similares de TSI con 1.5

para el biosurfactante y 1.1 con el surfactante convencional y finalmente, cinéticas de

desestabilización semejantes, dentro de las cuales se encuentra una clarificación en la zona

superior e inferior del recipiente, con la diferencia de que en el sistema con OmpN la

clarificación es más marcada pero a una menor proporción volumétrica (Anexo 3). Teniendo

como resultado que la emulsión con Tween 20 es ligeramente más estable que la formulada

con OmpN y que tanto el tamaño de gota como la polidispersidad son función de la agitación

incorporada [35].

Finalmente, a 8000 rpm se encuentró que el sistema con Tween 20 se ve afectado

negativamente por el incremento en la agitación, en el cual se encontró un mayor tamaño de

gota y polidispersidad en la muestra; fenómeno que pudo ser causado por el exceso de

agitación el cual pudo romper la emulsión. Esto no ocurrió con OmpN, el cual solo sufrió un

leve descenso en la estabilidad en comparación con la emulsión propuesta a 5000 rpm. En

resumen, un aumento excesivo en la velocidad de agitación no necesariamente genera mayor

estabilidad; resultados comparables con los reportados por Bendjaballah en donde se

concluye que el sistema evaluado entre 4000 y 8000 rpm genera emulsiones estables y que

aumentar más la velocidad resulta en la desestabilización de la emulsión [14]. Por lo tanto,

se determina que la mejor velocidad de agitación para el sistema OmpN Seje es alrededor de

5000 rpm.

En las emulsiones desarrolladas, se encontraron fenómenos como la coalescencia y la

flotación (Anexo 3), el cual es un fenómeno muy común en emulsiones O/W causado por la

diferencia de densidades entre el aceite y el agua bajo la influencia de la gravedad. Esto

genera una variación en las características sensoriales del producto, puesto que una emulsión

O/W presenta una textura fresca y poco grasosa a pesar de su contenido en aceite dado que

la fase acuosa es la fase externa y por lo tanto es la que primero entra en contacto con la piel

[36]. Sin embargo, al emerger esta capa oleosa, se genera una sensación más pesada;

causando una variación en la percepción y aceptación del consumidor [37].

4.7. Comportamiento de la emulsión a diferentes tiempos de almacenamiento

Teniendo en cuenta que la emulsión OmpN-Seje a 5000 rpm fue la más estable, se

determinó la variación en la estabilidad de ésta a lo largo de diferentes tiempos de

almacenamiento. Se observó una única fase por un tiempo de 4 horas, a partir del cual fue

posible observar una tenue línea de aceite en la zona alta de la emulsión (fenómeno

denominado flotación), a partir de la 6 hora el grosor de la capa aumento a 0.2 cm,

correspondiente al 1.5% del volumen total de la emulsión; a las 13 horas el tamaño de la capa

aumentó a 0.5 cm. A la hora 26 el aceite emergente alcanzó cerca del 7% del volumen de la

emulsión y a partir de este momento, no se presentaron variaciones visualmente significativas

en la apariencia de ésta.

Figura 7. Estabilidad visual sistema OmpN 5000 rpm a lo largo del tiempo.

Se determinó visualmente la completa desestabilización de ésta a las 26 horas,

momento a partir del cual no se presentaron variaciones significativas en su apariencia. Se

mantuvo un aspecto opaco a lo largo de los días, por lo que se supone que una pequeña

fracción de aceite se mantuvo en solución durante el tiempo evaluado. Sin embargo, esto

sugiere que no todo el aceite fue incorporado, resultado consecuente con lo encontrado en

los vasos de precipitado al finalizar la homogeneización (Anexo 7), en donde una capa de

una solución más oscura y viscosa fue encontrada, la cual se asume que contiene el aceite

que no se logró incorporar.

A pesar de que con ambos surfactantes ocurrió el mismo fenómeno, el aspecto de las

emulsiones fue diferente; las emulsiones realizadas con OmpN presentaban un color beige

turbio, característico de las macroemulsiones, mientras que el sistema con Tween 20 se veía

más traslucido. La apariencia de las emulsiones es producto de la luz que se refleja o se

dispersa y esto es consecuencia de las características de las gotas, ya sea por la concentración,

tamaño o índice de refracción de estas [38],[39]. De este modo, teniendo en cuenta que el

mismo aceite fue usado y que los tamaños de gota encontrados fueron similares entre los

surfactantes, es posible atribuirle este cambio en apariencia a la concentración de aceite que

se logró incorporar. Teniendo como resultado que el sistema con OmpN emulsificó una

cantidad mayor de aceite que el de Tween 20.

5. Conclusiones

Se observaron claramente las fases del crecimiento bacteriano, identificando el

momento óptimo para adicionar el agente inductor. Este procedimiento permitió

posteriormente sobre-expresar exitosamente el gen responsable de la producción de OmpN.

Adicionalmente, la cromatografía por afinidad permitió obtener una alta pureza de OmpN, la

cual logró corroborarse satisfactoriamente mediante el SDS PAGE y la liofilización facilitó

el almacenamiento de la proteína y su cuantificación para la elaboración de las emulsiones.

La proteína posee propiedades tenso-reductoras, por lo cual, es posible usarla como

surfactante. Al realizar la comparación con un surfactante homologo convencional (Tween

20), se obtiene que a concentraciones bajas OmpN disminuye más la tensión interfacial. Sin

embargo, a concentraciones altas, la proteína se segrega teniendo como consecuencia una

disminución en su desempeño.

El uso de una estrategia de emulsificación continua y de alta energía como lo es el

Dispermat, en reemplazo del sonicador de punta, logró disminuir significativamente el

diámetro medio volumétrico de gota. Se encontró que la velocidad de agitación afecta la

distribución y el tamaño de gota obtenido; se recomienda emulsificar a 5000 rpm de modo

que se adicione la energía suficiente para emulsificar pero no para romper la emulsión.

Los fenómenos de desestabilización mayormente encontrados corresponden a

coalescencia y flotación debido a que la diferencia de densidades entre el aceite de Seje y el

agua causan que el aceite emerja por la zona superior de la emulsión.

La no incorporación de todo el aceite a la emulsión, así como el corto tiempo de

estabilidad de las emulsiones con ambos surfactantes puede deberse a incompatibilidades

acerca del HLB del aceite con el de los surfactantes, así como la baja concentración del

biosurfactante.

6. Recomendaciones

Para trabajos posteriores, se propone aumentar la cantidad del biosurfactante usado

ya que no se logró incorporar todo el aceite y esto pudo ser consecuencia de la baja

concentración de OmpN. Sin embargo, mayores concentraciones no fueron usadas por las

interacciones proteína-proteína que generaban un aumento en la tensión interfacial, por lo

tanto, se sugiere adicionalmente, llevar a cabo la desnaturalización de la proteína, de modo

que ésta se despliegue y así determinar si es posible disminuir las interacciones indeseadas

entre las proteínas mediante la exposición de los grupos hidrofílicos y lipofílicos de éstas.

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8. Anexos Anexo 1. Concentración de la bacteria- Filtración Tangencial

1.1 Lavado del filtro.

Se realiza la instalación del montaje, incorporando el cassette Pellicon 2 mini GVPP de 0.22

μm y se procede a pasar agua desionizada por el filtro, abriendo la válvula de retenido

totalmente; se ajusta la presión a 5 PSI y se purga el retenido con aproximadamente 1.2 L de

agua desionizada. Posteriormente, se ajusta la presión a 25 PSI ajustando la válvula de

retenido y se lava con 7 L de agua desionizada en el permeado.

1.2 Sanitización del filtro.

Se prepara un agente sanitizante compuesto por 50 ppm de NaOCl en 7 L de agua

desionizada, se incorpora en el sistema y se procede a abrir la válvula del retenido

completamente, ajustando el flujo a 1.1 L/min. Luego, se ajusta la presión del retenido a 5

PSI y se recircula la solución por un tiempo de 30 minutos.

1.3 Limpieza del filtro

Haciendo uso de las mismas presiones y flujos que en 9.1.2, recircular una solución de

limpieza, compuesta por 250 ppm de NaOCl en 7 L de agua desionizada. Finalmente, se

procedió a drenar y lavar el filtro.

1.4 Test de integridad

Se toma agua desionizada y se pasa por el filtro, ajustando el flujo a 0.6 L/min. Se mide la

caída de presión; evaluándola en el rango correspondiente (4-12 PSI para el filtro de 0.22

um).

1.5 Evaluación de la limpieza

Se adapta la bomba peristáltica a una velocidad y un flujo mayor al usado en 9.1.4 y se

mantiene la válvula de retenido abierta. Se recircula agua desionizada a una presión de 5 PSI

por 5 minutos y se mide el flujo de permeado, temperatura del agua y presiones de entrada y

salida y se calcula el NWP mediante la siguiente ecuación.

𝑁𝑊𝑃 =𝑅 ∙ 𝐹

𝐴 ∙ [(𝑃𝑖𝑛 + 𝑃𝑜𝑢𝑡

2 ) − 𝑃𝑝]

Ecuación 1. Cálculo NWP

1.6 Concentración de la proteína

Se toma el material obtenido del biorreactor y se filtró a una condición de 5 PSI de presión

en la alimentación y 15 PSI en el retenido. Finalmente, se procedió a determinar el factor de

concentración mediante la siguiente ecuación.

𝑋 =𝑉𝑓𝑒𝑒𝑑

𝑉𝑓𝑒𝑒𝑑 − 𝑉𝑟𝑒𝑚𝑜𝑣

Ecuación 2. Factor de concentración

1.7 Almacenamiento del filtro

Se repite el mismo procedimiento de los incisos 9.1.1- 9.1.3, posteriormente se recircula a un

flujo de 1.1 L/min la solución de almacenamiento (compuesta por 0.05% NaN3) y para

finalizar se desinstala la membrana, se inunda en solución de almacenamiento y se almacena

a temperatura de refrigeración.

Anexo 2. Purificación de la proteína- Cromatografía por afinidad

2.1 Embalaje de la columna

Se sitúan 10 mL de la resina Profinity IMAC en una columna 2.5 veces más larga que la

requerida del lecho, asegurándose de no dejar burbujas a lo largo de esta.

2.2 Inmovilización de iones metálicos

1. Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de solución de 50 mM de acetato de

sodio, 300 mM de NaCl, pH 4.

2. Se añadieron 4 volúmenes de solución de metal Ni 2+ (0.2 M de cloruro de níquel)

3. Se lavó la columna con una solución de 50 mM de acetato de sodio, 300 mM de NaCl,

pH4.

4. Se adicionaron 10 volúmenes de agua desionizada.

5. Se equilibró la columna con 5 volúmenes de solución 50 mM de acetato de sodio, 300 mM

de NaCl, pH 8.

2.3 Purificación de la proteína

1. Se equilibró la columna con 5 volúmenes de buffer binding (50 mM de acetato de sodio,

300 mM de NaCl, 5 mM imidazol, pH 8)

2. Se añadió la muestra obtenida (sobrenadante recuperado de la lisis) y se procedió a

recolectar fracciones de 10 mL en tubos falcon de 15 mL.

3. Se adicionaron 5 volúmenes de buffer de lavado (50 mM de fosfato de sodio, 300 mM de

NaCl, pH 8) y se recolectaron las fracciones.

4. Se añadieron 5 volúmenes de buffer de elusión (50 mM de acetato de sodio, 300 mM de

NaCl, 500 mM imidazol, pH 8). Se recolectaron las fracciones.

5. Se almacenaron las fracciones recolectadas a temperatura de refrigeración.

2.4 Regeneración, limpieza, sanitización y almacenamiento

1. Para retirar los iones metálicos, se procedió a lavar la resina con 10 volúmenes de buffer

EDTA (50 mM de fosfato de sodio, 300 mM de NaCl, 200 mM EDTA, pH 7.5)

2. Se lavó la columna con un buffer acido (1% ácido acético, 0.12 M ácido fosfórico, pH 1.5)

mediante la exposición de la columna con el buffer por un tiempo de 11 minutos.

3. Se enjuagó la columna con 10 mL de agua desionizada.

4. Se removieron las soluciones de limpieza mediante la adición de 10 volúmenes de buffer

binding.

5. Se enjuagó la columna con fosfato de sodio 50 Mm, 300 mM NaCl, pH 8.

6. Finalmente, se almacenó la resina en una solución compuesta por 20% etanol.

Anexo 3. Resultados Turbiscan

3.1 Retrodispersión

Figura 8. Retrodispersión OmpN 1000 rpm

Figura 9. Retrodispersion Tween 1000 rpm

.

Figura 10. Retrodispersion OmpN 5000 rpm

Figura 11. Retrodisperion Tween 5000 rpm

Figura 12. Retrodispersión OmpN 8000 rpm

Figura 13. Retrodispersion Tween 8000 rpm

3.2 TSI global

Figura 14. TSI global OmpN 1000 rpm

Figura 15. TSI global Tween 1000 rpm

Figura 16. TSI global OmpN 5000 rpm

Figura 17. TSI global Tween 5000 rpm

Figura 18. TSI global OmpN 8000 rpm

Figura 19. TSI global Tween 8000 rpm

Anexo 4. Resultados MasterSizer

Figura 20. Distribución tamaño de gota OmpN 1000 rpm

Figura 21. Distribución tamaño de gota Tween 1000 rpm

Figura 22. Distribución tamaño de gota OmpN 5000 rpm

Figura 23. Distribución tamaño de gota Tween 5000 rpm

Figura 24. Distribución tamaño de gota OmpN 8000 rpm

Figura 25. Distribución tamaño de gota Tween 8000 rpm

Anexo 5. Microscopía óptica

Figura 26. Imagen microscópica Tween 20/ OmpN – 1000 rpm

Figura 27. Imagen microscópica Tween 20/ OmpN 5000 rpm

Figura 28. Imagen microscópica Tween 20/ OmpN - 8000 rpm

Anexo 6. Isoterma de adsorción

Figura 29. Isoterma de adsorción reportada en literatura

Anexo 7. Aspecto de la emulsión en hora cero.

Figura 30. Apariencia emulsión hora cero.