ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE EMULSIONES DE ...
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ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE EMULSIONES DE PERFLUOROCARBONO UTILIZANDO LECITINA DE YEMA DE HUEVO COMO SURFACTANTE Y DESOXICOLATO DE SODIO COMO COSURFACTANTE. CÉSAR CAMILO ROJAS MORALES UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C. 2016
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ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE EMULSIONES DE PERFLUOROCARBONO
UTILIZANDO LECITINA DE YEMA DE HUEVO COMO SURFACTANTE Y
DESOXICOLATO DE SODIO COMO COSURFACTANTE.
CÉSAR CAMILO ROJAS MORALES
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2016
II
ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE EMULSIONES DE PERFLUOROCARBONO
UTILIZANDO LECITINA DE YEMA DE HUEVO COMO SURFACTANTE Y
DESOXICOLATO DE SODIO COMO COSURFACTANTE.
CÉSAR CAMILO ROJAS MORALES
Trabajo de grado para optar por el título de Ingeniero Químico
Asesor:
ÓSCAR ALBERTO ÁLVAREZ SOLANO, Ph.D
Departamento de Ingeniería Química
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2016
III
AGRADECIMIENTOS
A mi familia, especialmente a mis papás y a mi hermano por su apoyo incondicional
durante toda mi vida, por sus consejos, por estar presentes y brindarme todas las
herramientas para la realización de este trabajo y la culminación de mi carrera.
A mi asesor Óscar Álvarez y a Juan Carlos Briceño por permitirme realizar este
proyecto, por los conocimientos brindados y por estar presentes en cada paso del desarrollo
del mismo.
A Carolina Navarrete, por compartir su experiencia, por su ayuda, recomendaciones
y permitirme desarrollarme profesionalmente en la realización de este proyecto.
A los técnicos del laboratorio y a todas las personas que de una u otra forma
estuvieron involucradas en el desarrollo del proyecto.
IV
Tabla de contenido
RESUMEN ........................................................................................................................................ VII
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 3
2.1. General ................................................................................................................................ 3
2.2. Específicos .......................................................................................................................... 3
3. ESTADO DEL ARTE ................................................................................................................. 4
3.1. Emulsiones de PFC ............................................................................................................. 4
3.2. Generaciones de hemosustitutos de PFC ............................................................................. 4
3.3. Surfactante: LYH ................................................................................................................ 4
3.4. Cambio de concentración de LYH y adición de cosurfactante DS ................................. 5
3.4.1. Cantidad teórica de LYH ............................................................................................. 5
3.4.2. Composición de vacunas de administración intravascular .......................................... 6
3.4.3. Desoxicolato de sodio ................................................................................................. 7
3.4.4. Interacción entre DS y LYH ........................................................................................ 9
3.5. Importancia del potencial Z ................................................................................................. 9
4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 10
4.1. Reactivos ........................................................................................................................... 11
4.2. Preparación de la emulsión ............................................................................................... 11
4.2.1. Preparación de las soluciones buffer ......................................................................... 11
4.2.2. Premezcla y homogenización de la fase dispersa ...................................................... 12
4.2.3. Adición de agentes .................................................................................................... 12
4.2.4. Microfluidización y esterilización ............................................................................. 12
4.3. Caracterización fisicoquímica ........................................................................................... 12
4.3.1. Tamaño de partícula .................................................................................................. 12
4.3.2. Potencial Z................................................................................................................. 12
4.3.3. pH .............................................................................................................................. 13
4.3.4. Viscosidad. ................................................................................................................ 13
4.4. Prueba de efectividad de la esterilización ......................................................................... 13
4.5. Comparación entre las solución buffer y L-Histidina ....................................................... 13
5. RESULTADOS Y ANÁLISIS .................................................................................................. 14
5.1. Caracterización .................................................................................................................. 14
V
5.1.1. Tamaño de partícula .................................................................................................. 14
5.1.2. Potencial Z................................................................................................................. 17
5.1.3. pH .............................................................................................................................. 18
5.1.4. Viscosidad ................................................................................................................. 19
5.2. Prueba de esterilidad ......................................................................................................... 20
5.3. Comparación entre las solución buffer y L-Histidina ....................................................... 22
6. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 24
Bibliografía ....................................................................................................................................... 26
VI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura molecular del DS [17]. ....................................................................................... 8
Figura 2. Estructura esquematizada del desoxicolato de sodio [20] ................................................... 8
Figura 3. Formación de micelas al agregar lecitina y desoxicolato de sodio [20] .............................. 9
Figura 4. Tamaño de partícula de emulsiones de PFC hasta el día 84. ............................................ 15
Figura 5. Distribución de tamaño de partícula para emulsión con 4.5 % w/v de LYH y 0.4 % w/v de
DS ...................................................................................................................................................... 16
Figura 6. Distribución de tamaño de partícula para emulsión con 1.2 % w/v de LYH y 0.4 % w/v de
DS ...................................................................................................................................................... 16
Figura 7. Potencial Z de emulsiones de PFC hasta el día 84. ........................................................... 17
Figura 8. pH de emulsiones de PFC hasta el día 84 ......................................................................... 18
Figura 9. Viscosidad de emulsiones de PFC hasta el día 84 ............................................................ 20
Figura 10. Emulsión a la concentración de 4.5 % w/v de LYH y 0.4 % w/v DS observada en el
microscopio. ...................................................................................................................................... 21
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Vacunas encontradas en el mercado actualmente que utilizan DS o LYH ........................... 7
Tabla 2. Diseño experimental ............................................................................................................ 11
Tabla 3. Relación molar DS-LYH para emulsiones analizadas ........................................................ 21
Tabla 4. Prueba de efectividad de la esterilización ........................................................................... 23
VII
RESUMEN
El presente estudio se centra en las emulsiones de perfluorocarbono en agua y su
uso como hemosustituto. El objetivo es formular una emulsión que pueda reemplazar la
capacidad de transportar oxígeno de la sangre y para esto, se deben estudiar propiedades
macroscópicas, microscópicas y moleculares con el fin de garantizar la estabilidad y
biocompatibilidad de la misma. Se prepararon dos emulsiones con su respectiva réplica
usando diferentes concentraciones de lecitina de yema de huevo (LYH) a 1.2 % w/v y 4.5
% w/v como surfactante y una concentración fija de desoxicolato de sodio (DS) de 0.4 %
w/v como cosurfactante. Se estudió la estabilidad temporal hasta el día 84, caracterizando
tamaño de partícula, potencial Z, pH y viscosidad. Se compararon los resultados con
investigaciones anteriores que emplearon en su formulación sólo LYH a una alta y baja
concentración. Al añadir el DS en una concentración de 0.4 % w/v a la emulsión preparada
con 4.5 % w/v LYH, se obtuvieron propiedades más estables a través del tiempo lo cual
ocurre por los enlaces de hidrógeno formados entre la LYH y el DS que impiden los
procesos de autooxidación de los fosfolípidos de la LYH. Sin embargo, es importante tener
en cuenta que la relación molar DS-LYH posiblemente debe ser mucho menor a 1 debido a
que se pueden generar fenómenos de coalescencia y de Ostwald ripening que desestabilicen
la emulsión como ocurrió en la emulsión con 1.2 % w/v LYH y 0.4 % w/v DS. Los valores
de tamaño de gota y viscosidad son aceptables para que la emulsión sea administrada vía
intravenosa, pero el pH aunque es constante, no tiene un valor aceptable. En
experimentaciones futuras se recomienda realizar un ajuste del pH antes de realizar la
esterilización y analizar el comportamiento del pH con otras soluciones buffer como L-
Histidina.
Palabras claves: Lecitina de yema de huevo, Desoxicolato de sodio, pH, Potencial Z,
Tamaño de partícula, Viscosidad.
1
1. INTRODUCCIÓN
Los hemosustitutos se han venido desarrollando con el objetivo de evitar las
transfusiones de sangre debido a que estos procedimientos presentan distintas dificultades
tales como un elevado costo, una disponibilidad limitada, reacciones alérgicas, transfusión
accidental de sangre incompatible, transmisión de infecciones virales o bacterianas y la
posible TRALI o lesión pulmonar aguda relacionada con la transfusión [1]. Ésta última
consiste en una insuficiencia respiratoria aguda y edema pulmonar que puede llevar a la
muerte del paciente, y es la causa más frecuente de muertes relacionadas con transfusiones
de sangre en EE.UU. [2]. Un hemosustituto ideal debe tener las siguientes características:
una alta disponibilidad para poder suplir la demanda, debe ser económico, no debe ser
tóxico, compatible con todos los tipos de sangre, de fácil almacenamiento y no debe
contener virus ni bacterias [3]. Buscando las características nombradas anteriormente se
han desarrollado investigaciones alrededor del mundo para crear una emulsión capaz de
transportar oxígeno como lo hace la sangre. Los tres principales tipos de hemosustitutos
transportadores de oxígeno son: Perfluorocarbonos (PFC) procesados sintéticamente,
compuestos basados en hemoglobina y liposomas que contienen hemoglobina imitando el
medio de eritrocitos como “glóbulos rojos artificiales” [4]. La presente investigación se
centra en las emulsiones de PFC. Estas emulsiones tienen la ventaja de no producir toxinas,
no se metabolizan, no tienen efecto antigénico y la forma en la que el cuerpo la elimina es
inicialmente por circulación por fagocitosis, luego por el sistema retículo endotelial y
finalmente es expulsado a través de los pulmones [4]. Sin embargo, al ser una sustancia
oleosa, no se puede administrar directamente vía intravenosa. Por esto, se debe crear una
emulsión de PFC en agua. Adicionalmente, entre las sustancias que debe contener, se
encuentra un buffer con el fin de mantener un pH constante y un surfactante, el cual influye
directamente con la estabilidad de la emulsión. Además es importante garantizar que
propiedades como viscosidad, potencial Z, pH y tamaño de gota sean constantes en el
tiempo y apropiadas para que al ser administrada vía intravenosa, exista una
biocompatibilidad de la emulsión.
Actualmente, en los departamentos de Ingeniería Química e Ingeniería Biomédica de la
Universidad de los Andes se han desarrollado emulsiones de PFC mediante un proceso de
2
emulsificación en el que se crea una emulsión con gotas de perfluorooctilbromuro (PFOB)
dispersas en una fase continua acuosa. Este proceso tiene como nombre homogenización a
presiones elevadas el cual hace pasar el fluido a través de una abertura en la válvula de
homogenización. Esta condición de alta turbulencia, esfuerzo, compresión y aceleración de
las partículas causa menor tamaño de gota y por tanto, mayor estabilidad del producto [5].
En el grupo de investigación de la Universidad de los Andes se ha encontrado que las
propiedades de la emulsión no son estables en el tiempo pues se genera un aumento en el
tamaño de gota y una disminución del pH debido a una acidificación de la emulsión,
posiblemente generada por reacciones de oxidación y/o hidrólisis [6]. Con el objetivo de
aumentar la estabilidad temporal de la emulsión se ha decidido realizar un cambio de
concentración de lecitina de yema de huevo (LYH) y adicionar desoxicolato de sodio (DS)
como cosurfactante. Este cambio se debe a que se ha encontrado mediante cálculos
teóricos, que la concentración de LYH para estabilizar la emulsión debe ser menor [6].
Adicionalmente, en vacunas administradas vía intravenosa que se encuentran en la
industria, la concentración que utilizan de LYH es menor, lo cual coincide con los cálculos
teóricos de esta concentración [7] [8] [9] [10] [11]. Por último, se encontró que la
interacción del DS con LYH puede producir ventajas en la estabilidad de la emulsión de
PFC [12].
3
2. OBJETIVOS
2.1. General
Evaluar la estabilidad temporal de las emulsiones de PFC al añadir en la
formulación un agente cosurfactante a través de sus propiedades macroscópicas,
microscópicas y moleculares
2.2. Específicos
Identificar las diferencias de las propiedades entre las emulsiones a altas y bajas
concentraciones de surfactante
Analizar el efecto del desoxicolato de sodio en la emulsión para garantizar la
estabilidad en el tiempo
4
3. ESTADO DEL ARTE
3.1. Emulsiones de PFC
Las moléculas de PFC son derivadas de cadenas cíclicas o lineales de hidrocarburos
con átomos de hidrógeno reemplazados por halógenos. Estos compuestos son química y
biológicamente inertes, e insolubles en agua por lo que deben ser emulsificados antes de ser
administrados vía intravascular. La farmacocinética que siguen estos compuestos consiste
en dos etapas: la primera se lleva acabo a las pocas horas de ser administrado y es
expulsado por el sistema reticuloendotelial. En el momento de la administración, las gotas
de PFC son distribuidas en el plasma, elevando la solubilidad del oxígeno. Además, se
piensa que el PFC también facilita la liberación de hemoglobina mediante la disminución
de la barrera difusiva entre los eritrocitos y el plasma. La segunda etapa se lleva acabo a los
20 días en donde la emulsión es redistribuida por la sangre, transportada a los pulmones y
luego exhalada debido a su alta presión de vapor [4].
3.2. Generaciones de hemosustitutos de PFC
Existen varias generaciones de emulsiones de PFC que han sido creadas y
administradas a individuos para estudiar sus efectos. La primera generación utilizó Pluronic
F-68 como agente emulsificante, sin embargo presentaba distintos efectos sobre los
pacientes que según varios autores estaban relacionadas al agente emulsificante por la
existencia de reacciones anafilácticas e interferencia con la quimiotaxis de neutrófilos, e
interferencia del surfactante causando hiperinflación pulmonar [5]. Posteriormente se
desarrolló la segunda generación, la cual utiliza como surfactante lecitina de yema de huevo
(LYH). Estas no presentaron activación del sistema complemento, ni alteraciones de la
función circulatoria. Al administrarla en concentraciones relativamente bajas, no se
presentaron efectos relacionados a hematología, coagulación o funciones de la sangre. Sin
embargo, si se presentaron efectos secundarios moderados tales como síntomas de gripe,
leve fiebre, escalofríos, dolor de cabeza y náuseas. Por esto, la experimentación con esta
emulsión fue detenida [5].
3.3. Surfactante: LYH
La LYH es una mezcla natural de fosfolípidos polares y neutrales entre los que se
encuentran la fosfatidilcolina (60-73 %), fosfatidiletanolamina (15-26 %), liso-
5
fosfatidilcolina y fosfatidilinositol en una menor concentración. Los dos primeros
fosfolípidos son zwiteriónicos y por la alta concentración que representan de la lecitina,
ésta es considerada como un surfactante zwiteriónico. Este tipo de surfactante consiste en
una misma molécula con dos partes principales: una aniónica que generalmente es un grupo
carboxilo y otra catiónica que generalmente es un grupo amonio. La primera se disocia en
un anión anfífilo y un catión mientras que la catiónica lo hace en solución acuosa en un
catión orgánico anfífilo y un anión [7]. Esta clase de surfactantes son sensibles al pH. La
LYH presenta este comportamiento, por lo cual a medida que aumenta el pH, cambiará
desde catiónica a zwiteriónica y posteriormente a aniónica [8], [9]. Estos fosfolípidos son
ricos en di- y poli- ácidos grasos insaturados, por lo cual son propensos a su autooxidación
[10].
3.4. Cambio de concentración de LYH y adición de cosurfactante DS
Dada la importancia que tiene la naturaleza del surfactante en la estabilidad de la
emulsión, se desea realizar un cambio en la concentración del surfactante basado en 3
principales motivos: Cálculos teóricos indican que la concentración de LYH para
estabilizar la emulsión debe ser menor [11] , concentración de surfactante en vacunas
administradas vía intravenosa encontradas en la industria es menor a 2 % w/v [12] [13] [14]
[15] [16] y adicionalmente, se encontraron ventajas en la interacción entre DS y LYH y se
espera que la adición de DS favorezca la estabilidad de la emulsión.
3.4.1. Cantidad teórica de LYH
En primer lugar, en investigaciones previas se han preparados las emulsiones con
una concentración de LYH de 4.5 w/v y como resultados, se obtuvo que los procesos de
degradación de la LYH tales como hidrólisis y oxidación comienzan a partir del día 42 y
son los responsables de los cambios observados en las propiedades. Por esto, en
investigaciones previas, se realizaron cálculos teóricos para hallar la cantidad de surfactante
requerido para la preparación de las emulsiones, con base en la composición de fase
dispersa utilizada actualmente. Lo anterior debido a que se cree que existe un exceso de
concentración de LYH, lo cual genera un incremento acelerado de ácidos grasos y por lo
tanto cambios en el pH de la emulsión. Como resultado teórico se obtuvo que una
concentración de 1.12 % w/v es suficiente para recubrir las gotas de la fase dispersa [11].
6
Cabe resaltar que estos cálculos son teóricos y existen distintas desviaciones de la realidad,
pero es un valor aproximado que debe tener la emulsión para mantener su estabilidad.
3.4.2. Composición de vacunas de administración intravascular
El segundo motivo del cambio de concentración de surfactante y cosurfactante se
debe a una revisión bibliográfica realizada sobre la concentración de los surfactantes usados
en vacunas que se encuentran actualmente en la industria. Se encontró que muchas de ellas
no utilizan únicamente un surfactante sino que según las propiedades químicas de las
moléculas, se adiciona a la formulación un cosurfactante que mejora la estabilidad de las
gotas para evitar la separación de las fases [12].
Dentro de los cosurfactantes encontrados en el mercado se analizaron Tween 80,
PEG 400, Pluronic F68, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y desoxicolato de sodio
(DS). Sin embargo, se encontró que el primero no se utilizaba en una vacuna de forma
intravascular sino intramuscular y los 3 siguientes presentaban inestabilidad temporal de
propiedades [12]. Con base en lo anterior, se decidió profundizar en el estudio del efecto
del desoxicolato de sodio en la emulsión. En la Tabla 1 se presenta un resumen de las
vacunas y emulsiones investigadas.
Se puede observar las 3 primeras vacunas (Influenza A, Fluarix y Flulaval) tienen
como surfactante Tween 80 y como cosurfactante DS, son administradas vía intramuscular
y la concentración de ambos compuestos son bajas a comparación de la concentración
actual de la emulsión de PFC de 4.5 % w/v.
Dado que el Tween 80 no fue encontrado en vacunas administradas vía
intravascular sino intramuscular, fue descartado por los requerimientos de la emulsión de
PFC. Las siguientes vacunas, Intralipid y Lyposin solo utilizan LYH como surfactante y
son administradas vía intravenosa. Estas se encuentran a una concentración de 1.2 % w/v, y
cabe resaltar que este resultado concuerda con los resultados teóricos comentados
anteriormente.
7
Tabla 1. Vacunas encontradas en el mercado actualmente que utilizan DS o LYH
Vacuna Surfactante Concentración
(% w/v) Cosurfactante
Concentración
(% w/v) Administración
Influenza A
(H5N1)
Virus
monovalent
[13]
Tween 80 0.972 DS 0.00075 Intramuscular
Fluarix [14] Tween 80 0.083 DS 0.001 Intramuscular
o subcutánea
FluLaval
[14] Tween 80 0.11 DS 0.013 Intramuscular
Intralipid
[15] LYH 1.2 - - Intravenoso
Lyposin [16] LYH 1.2 - - Intravenoso
Patente [12] LYH 1.2 DS 0.4 Intravenoso
Por último, se encontró una patente de gran interés en el proyecto debido a que la
emulsión desarrollada posee propiedades similares a las que se están buscando actualmente.
La emulsión debe ser administrada vía intravenosa en un procedimiento llamado
aterectomía. En este estudio se analizaron diferentes surfactantes y cosurfactantes a
distintas concentraciones, concluyendo que los componentes que presentaban mejores
propiedades temporales eran LYH como surfactante y DS como cosurfactante. El pH
obtenido fue de 8.3 a 8.8, el tamaño de gota obtenido fue menor a 1 µm, cuyo valor es
menor al máximo permitido de 5 µm para garantizar que no exista una obstrucción de los
vasos sanguíneos. Por último, el tiempo de almacenamiento es de 24 meses [12].
3.4.3. Desoxicolato de sodio
Por las propiedades encontradas del DS se decidió incluirlo en la formulación. El
DS es una sal biliar con una naturaleza anfifílica y corresponde a un surfactante de tipo
aniónico. Las sales biliares son importantes biosurfactantes que se encuentran en los
organismos vivos. Su estructura se muestra en la Figura 1 Figura 2 , en la cual se observa
que tienen una estructura rígida con grupos α-orientados hidroxilo y β-orientados grupos
8
metilo conjugados en una cadena aniónica. Esto hace que los grupos hidroxilo se
encuentren en la parte cóncava de la estructura y los grupos metilo en el lado convexo. Esta
conformación los hace diferentes de los surfactantes convencionales con una cabeza
hidrofílica y una larga cola hidrofóbica. Adicionalmente, esta conformación también altera
la formación de agregados, es decir, forman agregados primarios debido a las interacciones
hidrofóbicas, y a una mayor concentración forman agregados secundarios debido a los
enlaces de hidrógeno entre los grupos hidroxilo [17]. Este modelo es conocido como
micelas faciales debido a que por esta conformación tiene una cara polar y otra apolar [18].
Estas propiedades le dan una gran importancia en las funciones fisiológicas debido a que
estas sales actúan como emulsificantes o solubilizantes de grasas en el intestino [19].
Figura 1. Estructura molecular del DS [17].
Figura 2. Estructura esquematizada del desoxicolato de sodio [20]
En cuanto a la forma en la que el DS es eliminado por del cuerpo, se encontró que
en vacunas con una alta concentración de esta sustancia, tras la administración intravenosa,
más del 90 % del fármaco ha desaparecido 12 horas después a través de la orina y las heces.
La eliminación total del fármaco ocurre de forma lenta varias semanas después de su
administración [21] [22].
9
3.4.4. Interacción entre DS y LYH
El tercer motivo del cambio de concentración de LYH y DS corresponde a las
investigaciones en la formación de micelas que se ven favorecidas por la interacción entre
ambos compuestos. Se han realizado estudios del DS con LYH, debido a que este último es
insoluble en agua, y al añadir esta sal biliar, se solubiliza [23]. Esta interacción fue
analizada debido que al conocer la formación de enlaces entre los surfactantes, también se
comprende la interacción en la emulsión de PFC.
La LYH sola forma una estructura de cono y al añadirse con otras moléculas, forma
micelas esféricas inversas. Al añadir la sal biliar es posible que se formen enlaces de
hidrógeno entre la LYH y el DS. Estos enlaces protegen las repulsiones iónicas entre las
cabezas del surfactante y promueve el crecimiento de las micelas. Además, se ha
encontrado que la razón molar sal contra LYH debe ser mucho menor a 1 para generar este
efecto [20]. La Figura 4 muestra lo descrito anteriormente.
Figura 3. Formación de micelas al agregar lecitina y desoxicolato de sodio [20]
Aunque en el proyecto no se están generando micelas, este comportamiento se
puede extrapolar al comportamiento de las gotas de aceite en agua con los surfactantes. Por
esto, se espera que los enlaces de hidrógeno entre los surfactantes favorezcan la estabilidad
de la emulsión y reduciendo o eliminando la oxidación de la LYH.
3.5. Importancia del potencial Z
Una de las propiedades más importantes para observar la estabilidad de la emulsión
es el potencial Z. Por esto, a continuación se describe una revisión de su definición. Su
10
fundamento se basa en que el potencial eléctrico decrece a medida que se aleja de la
superficie de la partícula. Las moléculas polares son influenciadas por este potencial y por
una región con carga no balanceada alrededor de las partículas llamada la doble capa
eléctrica. Esta capa actúa para contrarrestar el potencial eléctrico de la partícula y
controlando la tasa a la cual el potencial eléctrico disminuye con la distancia. El potencial Z
para cada gota en la emulsión se describe como una medida del potencial eléctrico en el
plano entre la partícula y el bulk de la solución. Este plano se encuentra fuera de la
superficie debido a una capa de moléculas que están tan eléctricamente unidas a la
superficie de las partículas que se mueven con la gota. Por esta razón, el potencial Z es el
factor determinante para conocer acerca de la estabilidad de la emulsión y en qué grado se
generara la producción de agregados. Un valor alto significa en mayores fuerzas de
repulsión electrostáticas y por lo tanto una mayor distancia entre las partículas. Esto reduce
la floculación causada a las interacciones de Van der Waals. El rango usualmente utilizado
para identificar la estabilidad de la emulsión se da en valores mayores a 30mV y menores a
-30mV. Es decir, las que se encuentren en estos valores son estables mientras que los
valores restantes revelan una tendencia a formar agregados [24].
4. MATERIALES Y MÉTODOS
Con el objetivo de analizar el efecto de un cosurfactante en la estabilidad de la
emulsión, y al mismo tiempo evaluar el uso de una menor cantidad de surfactante, se
decidió realizar los experimentos mostrados en la Tabla 2.
El primer experimento corresponde a la concentración de LYH que se ha venido
trabajando actualmente, y la concentración del DS a la cual la patente presenta las mejores
propiedades. El segundo experimento corresponde a exactamente las mismas
concentraciones encontradas en la patente [12]. Además se realizó una réplica de cada una
de las emulsiones.
11
Tabla 2. Diseño experimental
Concentración LYH
como surfactante
(% w/v)
Concentración DS
como cosurfactante
(% w/v)
4.5 0.4
1.2 0.4
Cabe resaltar que se comprobó que la concentración del DS, fuera menor al LD50
(150 mg/kg) para asegurar que no vaya a representar un compuesto tóxico al administrarlo
vía intravenosa.
4.1. Reactivos
Para la preparación de la emulsión se utilizó Lecitina de yema de huevo (Ovothin
160 CargillCompany®) como agente surfactante, desoxicolato de sodio (Sigma Aldrich®)
como cosurfactante, 30 % w/v de PFOB (ExfluorResearchCorporation®) como
transportador de oxígeno, solución buffer de fosfatos y 50 % w/v, dextrosa (Sigma
Aldrich®). Para comprobar el proceso de esterilización de las emulsiones se utilizó como
medio de cultivo soya tripticaseína (TSB) (Panreac®) y agar papa dextrosa (PDA)
(Oxoid®) y para realizar el análisis del pH se utilizó L-histidina (Pharmpur®) para
compararlo con la solución Buffer utilizada actualmente.
4.2. Preparación de la emulsión
A continuación se describe la preparación de la emulsión. En cada una de las
emulsiones se utilizó agua ultra pura tipo 1, suministrada por el equipo Direct-Q3 UV R®
(Millipore, Billerica, USA). Ésta preparación consiste en 4 etapas.
4.2.1. Preparación de las soluciones buffer
La fase dispersa de la emulsión está conformada por una solución buffer de
monofosfato básico y difosfato básico de sodio diluidos en agua. Se preparan 2 soluciones
diluidas, la primera a una concentración de 1 % w/v y la segunda a una concentración de
20 % w/v. Luego se llevan a una plancha para su agitación.
12
4.2.2. Premezcla y homogenización de la fase dispersa
Se calienta la solución buffer diluida, al igual que el PFC. Se adiciona el glicerol a
la solución buffer, el surfactante y el cosurfactante a las concentraciones especificadas en la
Tabla 2. Se agita la mezcla en el homogeneizador (HeidolphSilentCrusher M®). Por
último, se adiciona el volumen total de PFC hasta la completa formación de la emulsión.
4.2.3. Adición de agentes
A la solución de la etapa anterior se le adiciona la solución de alginato, dextrosa y la
solución buffer diluida. Finalmente se agita la emulsión en el agitador Heildoph a 700 rpm
por 5 minutos más para garantizar una mezcla homogénea.
4.2.4. Microfluidización y esterilización
En el equipo microfluidizador M-110Y (MicrofluidicsCorp®), se añade la muestra
obtenida anteriormente y mediante presiones elevadas, se genera una disminución y
uniformidad del tamaño de partícula. Finalmente, se esteriliza y la emulsión es almacenada
a 4°C en viales color ámbar con tapón ágrafe.
4.3. Caracterización fisicoquímica
Tras la preparación de la emulsión, se procede a realizar la caracterización en los
días 0, 7, 14, 28, 42, 56, 63, 84. Esto, con el objetivo de analizar la estabilidad temporal de
las emulsiones y evaluar por qué ocurren los cambio en sus propiedades. A continuación se
describe cada una de las caracterizaciones.
4.3.1. Tamaño de partícula
El equipo utilizado es Master Sizer 3000 de Malvern Instruments Ltd. La variable a
analizar es el Dv.90, es decir el diámetro en el cual el 90 % de las gotas se encuentran
debajo de este valor [25]. La técnica que utiliza este equipo es la difracción láser que
consiste en medir la intensidad de luz dispersada cuando un láser pasa a través de una
muestra de partículas dispersa [26].
4.3.2. Potencial Z
Se determina con el equipo Z-Sizer Nano ZS de Malvern Instruments a 37°C para
simular las condiciones del cuerpo humano. Este equipo utiliza la técnica de
microelectroforésis por dispersión de luz láser y efecto Doppler. Ésta consiste en aplicar un
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campo eléctrico a la solución de moléculas, las cuales se moverán con una velocidad
relacionada con el potencial Z. Esta velocidad es medida usando una técnica de
interferometría láser llamada M3-PALS (Phase Analysis Light Scattering), la cual permite
calcular la movilidad electroforética y a partir de esta la distribución del potencial Z y su
valor [27].
4.3.3. pH
Se mide mediante el pHmetro Mettler Toledo para determinar la acidez o basicidad
de la emulsión.
4.3.4. Viscosidad.
El equipo utilizado es el reómetro AR-G2 de TA Instrument®. Asemejando la
temperatura del corporal, se realiza una prueba de flujo en estado estacionario a 37°C
utilizando una geometría de cilindros concéntricos, midiendo la viscosidad desde 0.1 s-1
hasta 300 s-1
, pero se reporta la viscosidad arrojada a 100 s-1
.
4.4. Prueba de efectividad de la esterilización
Para comprobar la esterilización realizada al preparar las emulsiones, se realizó un
cultivo de las emulsiones en PDA y TSB. Estos medios de cultivo están aprobados por la
Pharmacopeia para usarlo en pruebas de esterilidad [28]. Para la realización de esta prueba,
se prepara el medio y junto con las cajas de Petri, se esteriliza por 20 minutos a 121°C.
Luego se sirve en las cajas de Petri la muestra y se deja enfriar hasta que se solidifique. Se
adicionan 100 μL sobre cada caja de Petri y se almacena a 37°C para bacterias en el caso
del TSB y 25°C para hongos en el caso del PDA. Además se realizó un control para
verificar que la presencia de microorganismos se deba a la emulsión y no a
microorganismos del ambiente. El estudio se realizó por 48 horas para las bacterias y 7 días
para el caso de los hongos. Para analizar la emulsión en el microscopio, se utilizó un
microscopio BA-300 Motic®.
4.5. Comparación entre las solución buffer y L-Histidina
Para efectuar un análisis de la influencia de la solución buffer y la L-Histidina se
prepararon 3 soluciones acuosas: una con la solución buffer utilizada actualmente, y otras
14
dos con L-Histidina. Se midió el pH antes y después de la esterilización para evaluar el
efecto de cada solución en el pH.
5. RESULTADOS Y ANÁLISIS
A continuación se presentan los datos medidos a través la caracterización de cada
una de las emulsiones. El análisis mostrado se realizó hasta el día 84 de las dos emulsiones
y las propiedades se compararon con un experimento realizado a las mismas condiciones
pero a una concentración de LYH de 4.5 % w/v y sin adicionar DS [11]. También se
comparó con una experimentación a una concentración de LYH de 1.2 % w/v solamente
[29]. Lo anterior tiene como fin comparar el efecto de las propiedades al añadir el
surfactante.
5.1. Caracterización
A continuación se presentan los valores medidos para el tamaño de partícula,
potencial Z, pH, viscosidad con su respectivo análisis.
5.1.1. Tamaño de partícula
Esta propiedad es de vital importancia en la estabilidad de la emulsión debido a que
no puede sobrepasar diámetros de 5 µm, y así evitar embolismo graso y oclusión capilar
[30]. La Figura 4 muestra las mediciones de estas propiedades.
Comparando las emulsiones de investigaciones previas con solamente LYH, los
resultados indican que la concentración elevada de lecitina favorece los procesos de
degradación fisicoquímica o envejecimiento de los fosfolípidos, por lo cual, los derivados
de la fosfatildicolina generan un aumento en la permeabilidad de la capa de surfactante y
finalmente generan inestabilidad de la gota reflejada en su tamaño [31]. Por esto, se observa
que la emulsión con 4.5 % w/v de LYH tiene un aumento significativo del tamaño de gota
mientras que la emulsión con 1.2 % w/v de LYH tiene un comportamiento menos variable.
Observando los resultados al añadir como cosurfactante DS, la emulsión con
concentración 4.5 % w/v de LYH y 0.4 % w/v de DS tuvo hasta el día 84 un tamaño de
partícula estable y menor a 5 µm, es decir, aceptable para ser administrado de forma
15
intravascular. En cambio, la emulsión con 1.2 % w/v de LYH y 0.4 % w/v de DS tuvo un
crecimiento constante del Dv-90, hasta llegar a 43 µm en el día 63 y 44.5 µm en el día 84.
Figura 4. Tamaño de partícula de emulsiones de PFC hasta el día 84.
Para la emulsión con concentración 4.5 % w/v de LYH y 0.4 % w/v de DS, no
presenta fenómenos de inestabilidad posiblemente explicados por los enlaces de hidrógeno
que forman estos dos compuestos [20]. Debido a estos enlaces, las repulsiones iónicas entre
las cabezas de LYH disminuyen y los efectos de la oxidación tampoco se ven reflejados.
Es importante resaltar que esta concentración obtuvo el menor tamaño de gota de las
emulsiones preparadas.
En cuanto a los resultados de la emulsión con 1.2 % w/v de LYH y 0.4 % w/v de
DS, se analizó la distribución del tamaño de partícula comparando una muestra de cada
emulsión en el día 0 y en el día 84. Analizando la Figura 5 se observa que efectivamente la
distribución es muy parecida en el día 0 y en el día 84, lo cual concuerda con el Dv-90
reportado anteriormente. El segundo pico que presenta desde los 5 µm es un
comportamiento normal y obtenido en emulsiones preparadas anteriormente con LYH al
4.5 % w/v. Este pequeño pico con tamaños de gota grandes puede ser eliminado mediante
un proceso de filtración. Por otro lado, en la Figura 6 se observa que el segundo pico de la
distribución en el día 0 es muy pequeño al igual que en la anterior emulsión, sin embargo
este pico crece con el tiempo. Con el fin de explicar este fenómeno, es necesario comprobar
16
que no existió contaminación de la muestra, y este segundo pico no sea el resultado de
microorganismos presentes en la emulsión. Para comprobar esta hipótesis, se realizó un
cultivo en los medios de cultivo PDA y TSB para comprobar la existencia de hongos o
bacterias, el cual es analizado en la sección 5.2.
Figura 5. Distribución de tamaño de partícula para emulsión con 4.5 % w/v de LYH y
0.4 % w/v de DS
Figura 6. Distribución de tamaño de partícula para emulsión con 1.2 % w/v de LYH y
0.4 % w/v de DS
17
5.1.2. Potencial Z
La Figura 7 muestra las mediciones del potencial Z. Al comparar las emulsiones con
solo LYH a una concentración alta y baja, se observa que una menor cantidad de
surfactante genera una emulsión más estable, es decir con un potencial Z menor. Además,
la concentración baja no presenta una tendencia a acercarse al punto isoeléctrico, lo cual si
ocurre con la concentración alta.
Al analizar el efecto de añadir DS, se observa que la emulsión con 4.5 % w/v de
LYH y 0.4 % w/v de DS su valor permanece constante mientras que sin este compuesto, se
observa la tendencia a acercarse al punto isoeléctrico a medida que pasa el tiempo. En este
pH, la LYH se comporta como un surfactante aniónico, y al generar enlaces de hidrógeno
con el DS que también es aniónico, el potencial eléctrico alrededor de las gotas aumenta,
alejándose del punto isoeléctrico [20]. Por otro lado, la emulsión con 1.2 % w/v de LYH y
0.4 % w/v de DS tiene valores más lejanos del punto isoeléctrico, sin embargo, los
resultados de tamaño de partícula obtenidos, se observa que esta concentración no es
estable debido a que el Dv-90 aumenta a través del tiempo.
Figura 7. Potencial Z de emulsiones de PFC hasta el día 84.
Un importante aspecto a considerar es que se logró modificar el potencial Z de la
emulsión sin modificar la solución de electrolitos generada por los restantes componentes
que se incluyen en la formulación de la emulsión. Es decir, estos electrolitos tienen una
18
importante influencia en la medición del potencial Z de la emulsión. Sin embargo, dejando
esta concentración constante y agregando a la formulación un surfactante aniónico se logró
modificar el potencial Z manteniéndolo constante y por lo tanto, más estable.
5.1.3. pH
Esta propiedad es de vital importancia para la biocompatibilidad de la emulsión. El
pH de la sangre oscila entre 7.35 y 7.45, pero el cuerpo humano puede tolerar entre 6.9 y
7.5 por unos pocos minutos. Si la concentración de protones está por encima, este
fenómeno se denomina acidosis mientras que si está por debajo se denomina alcalosis, las
cuales son condiciones no deseables en los pacientes [32]. La Figura 8 muestra los
resultados obtenidos.
Analizando las emulsiones con solo LYH se observa el mismo fenómeno presentado
en el potencial Z y en el tamaño de partícula. Al aumentar la concentración de LYH, los
fenómenos de degradación y envejecimiento de los fosfolípidos presentes en la LYH
generan una disminución significativa del pH. Al reducir esta concentración, no se generan
procesos de inestabilidad y el pH permanece constante. Es importante resaltar que en el día
0, esta emulsión con sólo LYH tiene un pH alto debido a que se realizó un ajuste con
hidróxido de sodio hasta llegar a un valor biocompatible con la sangre, mientras que en los
experimentos restantes no se realizó este ajuste.
Figura 8. pH de emulsiones de PFC hasta el día 84
19
Al observar la influencia en el pH del cosurfactante DS, esta propiedad permaneció
constante y con valores semejantes a una alta y baja concentración de LYH. Por lo anterior,
se puede afirmar que al añadir el cosurfactante, el pH no se ve afectado en gran medida por
la concentración de LYH. Comparando las emulsiones con DS y la emulsión con 1.2 % w/v
de LYH se observa que el DS genera un aumento del pH en todos los periodos. Lo anterior
sugiere que tanto los enlaces de hidrógeno formados entre el DS y LYH, y una menor
concentración de LYH generan una disminución de la oxidación de este compuesto.
Igualmente, la adición del DS genera un ligero aumento del pH.
Aunque se obtuvo un pH constante en las emulsiones, este valor no se encuentra
dentro del rango de aceptación del cuerpo humano. Por lo tanto, se espera que en futuros
experimentos se realice un procedimiento para ajustarlo. Una primera opción es ajustar este
valor con hidróxido de sodio a un pH mayor que 7.45 que corresponde al pH de la sangre.
Esto debido a que en el momento de realizar la esterilización, el pH baja y se espera que
alcance el pH de la sangre. Una segunda opción a considerar es preparar diferentes mezclas
de soluciones buffer y de otros compuestos que puedan estabilizar esta propiedad, ajustar el
pH a diferentes valores y estudiar su valor en el tiempo con el fin de identificar que
compuesto presenta una menor variación del pH en el tiempo.
Con el fin de examinar estas dos opciones se realizó un estudio que se explica en la
sección 5.2, el cual compara el pH de soluciones acuosas de la solución buffer utilizada
actualmente y otra solución con L-histidina antes y después de la esterilización.
5.1.4. Viscosidad
Esta propiedad es medida para verificar que la emulsión presente una viscosidad
cercana a la de la sangre, y por lo tanto, capaz de generar el cizallamiento necesario para
mantener capilares y venas abiertas evitando complicaciones por vasoconstricción [11]. La
Figura 9 muestra las mediciones de la viscosidad.
Se observa que en las emulsiones con DS y con solo LYH al 4.5 % w/v, la viscosidad
presenta un comportamiento constante a través del tiempo y cercanos a la viscosidad de la
sangre entre 3 y 4 cP [33]. Esto muestra que agregar la sal biliar a la formulación no tiene
un comportamiento significativo sobre esta propiedad. Sin embargo, la emulsión con LYH
20
al 1.2 % w/v aunque tuvo un comportamiento constante, tuvo un valor ligeramente menor
al de la sangre.
Figura 9. Viscosidad de emulsiones de PFC hasta el día 84
5.2. Prueba de esterilidad
Esta prueba se realizó debido al incremento de tamaño de gota encontrado en la
emulsión. Para descartar que fuera resultado de una contaminación de la muestra se quiso
comprobar que no existieran bacterias ni hongos en las muestras. Al finalizar el tiempo del
estudio, en ninguno de los casos se encontró el crecimiento de los microorganismos. Por lo
tanto, se puede descartar que la medición del tamaño de partícula se deba a contaminación.
También se descartan fenómenos de inestabilidad reversible como sedimentación y
floculación debido a que antes de la caracterización fisicoquímica, la emulsión es agitada a
2000 rpm por 60 segundos en un vortex. Por lo anterior se piensa que la inestabilidad
encontrada en la emulsión con LYH a 1.2 % w/v y DS a 0.4 % w/v se debe a la
coalescencia y el fenómeno de Ostwald ripening.
Coalescencia se refiere a la fusión de gotas para crear gotas más grandes. Este
efecto está relacionado con la curvatura y la rigidez del surfactantes. El fenómeno de
Ostwald ripening se debe al crecimiento de gotas grandes a partir de las más pequeñas hasta
21
que estas últimas desaparezcan [34]. Esto ocurre probablemente debido a los efectos de
curvatura y por la relación LYH-DS debido a que se ha encontrado que la razón molar sal
contra LYH debe ser mucho menor a 1 [20]. En la Tabla 3 se muestra las relaciones
molares DS-LYH.
Tabla 3. Relación molar DS-LYH para emulsiones analizadas
4.5 % w/v LYH,
0.4 % w/v DS
1.2 % w/v LYH,
0.4 % w/v DS
Relación molar
DS - LYH 0.16 0.60
Se observa que la emulsión con alta concentración de LYH tiene un
comportamiento mucho menor a 1 como se encuentra en la literatura y por esto es estable
en el tiempo, mientras que la relación de la emulsión a baja concentración de LYH, tiene un
valor alto. Posiblemente esta es la razón por la cual la emulsión con LYH a 4.5 % w/v y DS
a 0.4 % w/v es estable en el tiempo mientras que con LYH a 1.2 % w/v y DS a 0.4 % w/v,
las gotas aumentaron su tamaño significativamente. Para mantener la relación de 0.16 con
una concentración de LYH al 1.2 % w/v, se necesita una concentración de 0.11% w/v.
Como trabajo futuro, se puede preparar una emulsión con esta concentración y de esta
manera, posiblemente se pueda obtener un pH más alto y constante, además de un tamaño
de partícula menor a 5µm y constante en el tiempo.
Figura 10. Emulsión a la concentración de 4.5 % w/v de LYH y 0.4 % w/v DS
observada en el microscopio.
22
La emulsión con LYH a 1.2 % w/v y DS a 0.4 % w/v se observó en el microscopio
y se muestra en la Error! Reference source not found.. Se observa que concuerda con los
resultados obtenidos en la gráfica de distribución de tamaño de partícula puesto que se
muestra unas gotas de tamaño aproximado de 10µm y también gotas muy pequeñas que se
distinguen difícilmente en el microscopio debido a su resolución.
5.3. Comparación entre las solución buffer y L-Histidina
La L-histidina es un aminoácido polar con un grupo funcional imidazo. Su pKa es
cercano a 6.5, es decir cercano al fisiológico. Por sus propiedades fue utilizado en la patente
nombrada anteriormente que formula una emulsión para ser administrada vía intravenosa
[12]. Se utilizaron diferentes aminoácidos como buffer y se encontró que el que mayor
estabilidad presentaba era la emulsión con L-histidina a una concentración de 0.16 % w/v
[12]. Con este buffer y con un ajuste del pH con hidróxido de sodio, se encontró que el
rango del pH que optimiza la estabilidad de la emulsión era entre 8.3 y 8.8. Adicionalmente
tiene propiedades antioxidantes, específicamente es depurador de radicales hidroxilo [12].
Por las propiedades que presenta la L-Histidina, se comparó este compuesto con la
solución buffer utilizada actualmente. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Se escogió
la concentración de 0.16 % w/v debido a que esta concentración es utilizada en la patente
con características similares a la emulsión preparada [12]. También se escogió la
concentración de 0.32 % w/v para evaluar el efecto de aumentar la concentración de la L-
histidina.
23
Tabla 4. Prueba de efectividad de la esterilización
pH
Muestra
Antes de
esterilización
Después de
esterilización Diferencia
Solución
acuosa
L-Histidina (0.16 % w/v) 6.42 ± 0.09 6.99 ± 0.04 0.57
L-Histidina (0.32 % w/v) 6.22 ± 0.07 6.79 ± 0.01 0.57
Solución buffer diluida
No. 1 7.44 ± 0.01 7.86 ± 0.01 0.42
Emulsión
LYH 4.5 % w/v, DS 0.4
% w/v 8.07 ± 0.06 6.68 ± 0,04 1.39
LYH 1.2 % w/v, DS 0.4
% w/v 8.48 ± 0.05 6.68 ± 0.07 1.80
Se observa que para todas las soluciones acuosas, la esterilización genera un
aumento del pH, contrario a lo obtenido en la preparación de las emulsiones. Además la
diferencia en el pH en las emulsiones es mayor que en las soluciones acuosas. Estos
resultados no son concluyentes debido a que los otros compuestos presentes en la
preparación de la emulsión tienen un efecto importante en el valor del pH. Por esto, no es
suficiente hacer esta prueba solo con la solución buffer sino que es necesario incluir los
compuestos restantes.
24
6. CONCLUSIONES
Se logró evaluar la estabilidad temporal de las emulsiones mediante sus propiedades
macroscópicas, microscópicas y moleculares, al añadir un cosurfactante en la formulación y
variar la concentración de LYH.
Se encontró que una disminución en la concentración de LYH de 4.5 % w/v a 1.2 %
w/v genera una disminución de los procesos de degradación fisicoquímica o envejecimiento
de los fosfolípidos, lo cual se ve reflejado en la estabilidad del tamaño de gota, pH y
potencial Z a través del tiempo.
La emulsión con LYH al 1.2 % w/v y DS al 0.4 % w/v resultó tener un aumento del
tamaño de gota a través del tiempo debido a los fenómenos de inestabilidad de coalescencia
y de Ostwald ripening. Se cree que este comportamiento se debe a que la relación molar
DS-LYH debe ser mucho menor a 1 [12].
Se logró obtener una emulsión con LYH al 4.5 % w/v y DS al 0.4 % w/v cuyos
valores de potencial Z, pH, tamaño de gota y viscosidad son constantes en el tiempo. Este
comportamiento se debe posiblemente a los enlaces de hidrógeno que forma el DS con la
LYH, lo cual impide la autooxidación de la LYH. Este proceso de degradación si ocurría
con solo LYH a una alta concentración y se veía reflejado en el pH, tamaño de gota y
potencial Z.
En resumen, las dos emulsiones que presentan valores constantes de sus
propiedades a través del tiempo son LYH al 1.2% w/v únicamente y la emulsión con LYH
al 4.5 % w/v y DS al 0.4 % w/v. Ambas detienen los procesos de degradación de los
fosfolípidos de LYH. Para la primera emulsión, una posible explicación es que un exceso
de LYH favorece los procesos de autooxidación de la misma, lo cual coincide con los
cálculos teóricos realizados anteriormente y la cantidad utilizada en vacunas administradas
vía intravenosa [13-16]. Al disminuir la cantidad de LYH para estabilizar las gotas de PFC,
se detienen estos procesos de degradación. Para la segunda emulsión se cree que se debe a
los enlaces de hidrógeno generados entre el DS y LYH [12]. Comparando estas dos
emulsiones, se observa que al añadir DS, el tamaño de gota obtenido resultó menor y el pH
mayor por lo que se sugiere realizar una emulsión con LYH al 1.2 % w/v y DS al 0.11%
25
w/v. De esta manera se mantiene una relación molar DS-LYH de 0.16 encontrada en la
emulsión con LYH al 4.5 % w/v y DS al 0.11% w/v. Adicionalmente, con esta
concentración se esperaría que al aumentar el tamaño de gota, la viscosidad de la emulsión
no presente una disminución como ocurrió con la emulsión al 1.2% w/v de LYH.
Para ambas emulsiones estables LYH al 1.2 % w/v únicamente y la emulsión con
LYH al 4.5 % w/v y DS al 0.4% w/v el tamaño de gota es aceptable para ser administrado
vía intravenosa, sin embargo el pH aunque es constante, no es aceptable. Para esto se
sugiere que en experimentaciones futuras se realice un ajuste del pH antes de la
esterilización para que después de este proceso, el pH disminuya a un valor cercano al de la
sangre y así, asegurar la biocompatibilidad de la emulsión. Adicionalmente se puede
cambiar la solución buffer utilizada actualmente por L-Histidina ya que aunque la
experimentación en solución acuosa no logró arrojar resultados concluyentes, sus
propiedades indican que puede presentar una baja disminución del pH de la emulsión
después de la esterilización.
26
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