EVALUACIÓN DE LA PATOGENICIDAD DE Cryptococcus …
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EVALUACIÓN DE LA PATOGENICIDAD DE Cryptococcus neoformans EN Gallería mellonella BAJO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE HIERRO. CARMEN ROSA ACOSTA MORA PONTIFICIA UNIVESIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BACTERIOLOGÍA BOGOTÁ 2015 1
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EVALUACIÓN DE LA PATOGENICIDAD DE Cryptococcus neoformans ENGallería mellonella BAJO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE HIERRO.
CARMEN ROSA ACOSTA MORA
PONTIFICIA UNIVESIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA
BOGOTÁ
2015
1
EVALUACIÓN DE LA PATOGENICIDAD DE Cryptococcus neoformans ENGallería mellonella BAJO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE HIERRO.
CARMEN ROSA ACOSTA MORA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para obtener el título de:
BACTERIÓLOGA
PONTIFICIA UNIVESIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA
BOGOTÁ
2015
2
EVALUACIÓN DE LA PATOGENICIDAD DE Cryptococcus neoformans ENGallería mellonella BAJO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE HIERRO.
CARMEN ROSA ACOSTA MORA
ZILPA A. SÁNCHEZ QUITIAN PhD
Codirectora
PONTIFICIA UNIVESIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA
Bogotá
2015
NOTA DE ADVERTENCIA
ARTÍCULO 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946
"La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por susalumnos en su trabajo de grado”
4
A mis padres, Luis Antonio Acosta que desde el cielo guía mis pasos y Sixta Tulia Mora que siempre me ha apoyado incondicionalmente, a ellos que con cariño y esfuerzo me han brindado más de lo necesario.
A Jilber Andres Acero, quien ha estado a mi lado apoyándome durante todo este proceso.
5
AGRADECIMIENTOS
A Dios primeramente por darme cada día de vida para realizar este logro que hoy se cumple.
Agradezco también a mi directora Melva Yomary Linares Linares, igualmente a la Dra. Claudia Marcela Parra Giraldo por brindarme la oportunidad de trabajar en el laboratorio de proteómica y micosis humanas ya que fue una experiencia enriquecedora para mi carrera y como experiencia personal.
Doy un agradecimiento especial a mi codirectora Zilpa Adriana Sánchez Quitian, quien estuvo permanentemente guiándome en todo el proceso y de quien aprendí enormemente.
6
TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE IMÁGENES........................................................................................................ 9
TABLA DE TABLAS............................................................................................................ 10
RESUMEN...........................................................................................................................11
INTRODUCCIÓN................................................................................................................12
JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA................................................. 16
MARCO TEORICO............................................................................................................. 18
Cryptococcus spp............................................................................................................ 18
Criptococosis................................................................................................................... 19
Respuesta inmunológica................................................................................................. 21
Infección e inmunidad innata....................................................................................... 21
Infección e inmunidad adaptativa................................................................................ 23
Factores de virulencia y evasión del sistema inmune.....................................................23
1. Cápsula.................................................................................................................23
2. Síntesis de melanina............................................................................................28
3. Crecimiento a 37°C.............................................................................................. 29
Metabolismo del hierro....................................................................................................29
Figura tomada: Acta bioquím. clín. latinoam. v.39 n.3 La Plata jun./sept. 2005......... 31
Mecanismos de captación de hierro............................................................................ 32
Captación de hierro en C. neoformans........................................................................33
Hierro asociado a patogenicidad en C. neoformans....................................................34
Modelos in-vivo en el estudio de infecciones................................................................. 34
Gallería mellonella como modelo in-vivo para el estudio de infección por C. neoformans................................................................................................................. 36
OBJETIVO GENERAL........................................................................................................ 37
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................................. 38
7
METODOLOGÍA................................................................................................................. 39
-Larvas de Gallería mellonella:........................................................................................ 39
Objetivo 1: “Determinar la concentración basal de hierro en Gallería mellonella.” ........ 39
Objetivo 2: “Evaluar el crecimiento de C. neoformans en presencia de hierro.”............42
Objetivo 3: “Evaluar la concentración de hierro consumido por C. neoformans a partir del medio de cultivo.” ...................................................................................................... 43
Objetivo 4: “Evaluar la supervivencia de G. mellonella inoculada con C. neoformans bajo la influencia de diferentes concentraciones de hierro”............................................ 45
Objetivo 5: “Evaluar la influencia del hierro en el tamaño capsular de C. neoformans”. 48
RESULTADOS Y DISCUSIÓN...........................................................................................52
Objetivo 1: “Determinar la concentración basal de hierro en Gallería mellonella.” ........ 52
Objetivo 2: “Evaluar el crecimiento de C. neoformans en presencia de hierro.”............53
Objetivo 3: “Evaluar la concentración de hierro consumido por C. neoformans a partir del medio de cultivo.” .......................................................................................................55
Objetivo 4: “Evaluar la supervivencia de G. mellonella inoculada con C. neoformans bajo la influencia de diferentes concentraciones de hierro”............................................ 57
Objetivo 5: “Evaluar la influencia del hierro en el tamaño capsular de C. neoformans”. 65
CONCLUSIONES................................................................................................................70
RECOMENDACIONES.......................................................................................................71
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................... 72
8
TABLA DE IMÁGENES
Figura 1. Agentes etiológicos de la Criptococosis......................................................18Figura 2. Respuesta inmune en Criptococosis.......................................................... 22Figura 3. Composición del Glucoronoxilomanano (GXM )...................................... 23Figura 4. Composición del Glucoronoxilomananogalactano (GXMGal)................ 24Figura 5. Vía de señalización: en respuesta a la privación de hierro....................27Figura 6. Metabolismo de h ierro.................................................................................. 30Figura 7. Extracción de hemolinfa de Gallería mellonella.........................................40Figura 8. Curva de crecimiento de C. neoformans (JEC21 y H99) bajoconcentración de 500 pM de FeCl3.............................................................................. 43Figura 9. Medición de hierro consumido por C. neoformans en medios de cultivocon FeCl3 (0, 5, 50, 500 pM)..........................................................................................45Figura 10. Inoculación en larvas de G. mellonella: se inoculó con 10pL desuspensión con C. neoformans.................................................................................... 46Figura 11. Desinfección de larvas de G. mellonella..................................................... 47Figura 12. Medición de capsula en cepas (JEC21 y H99) sin contacto con FeCl3.49 Figura 13. Medición de capsula en cepas (JEC21 y H99) incubadas con FeCl3 ..50 Figura 14. Medición de capsula en cepas (JEC21 y H99) obtenidas de larvas postinfección............................................................................................................................ 51Figura 15. Curva de crecimiento C. neoformans.......................................................... 55Figura 16. Curva de supervivencia de G. mellonella inoculada con cepas JEC21 yH99 de C. neoformans...................................................................................................58Figura 17. Curva de supervivencia G. mellonella inoculada con cepa JEC21...........60Figura 18. Curva de supervivencia G. mellonella inoculada con cepa H 99 .63Figura 19. Curva de supervivencia G. mellonella.......................................................64Figura 20. Tamaño capsular de C. neoformans........................................................ 65Figura 21. Tamaño capsular de C. neoformans extraído de macerado de larvasmuertas post-infección (H99).........................................................................................68Figura 22. Tamaño capsular de C. neoformans extraído de macerado de larvas muertas post-infección (JEC21).................................................................................... 69
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TABLA DE TABLAS
Tabla 1. Cepas de C. neoformans utilizadas en el estudio...................................... 39Tabla 2. Preparación de muestras y blancos.............................................................. 41Tabla 3. Controles empleados en la inoculación de C. neoformans.......................47Tabla 4. Concentración de hierro medida en hemolinfa de G. mellonella...............52Tabla 5. Concentraciones de hierro medidas con STAT FAX 3300.........................57Tabla 6. Prueba de igualdad de distribución de supervivencia.................................58Tabla 7. Supervivencia G. mellonella inoculada con cepa JEC21........................... 59Tabla 8. Supervivencia G. mellonella inoculada con cepa H 99.............................. 61
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RESUMEN
Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii son hongos patógenos
estrechamente ligados que causan afecciones pulmonares y del sistema nervioso
central en huéspedes inmunocomprometidos e inmunocompetentes. Ambas
especies se encuentran en el medio ambiente y la infección se adquiere a través de
la inhalación de propágulos infectantes.
La criptococosis es considerada una micosis oportunista en la cual se ven afectados
principalmente pacientes inmunocomprometidos, su presentación clínica está dada
por dos formas, dentro de las cuales se encuentran la pulmonar y extrapulmonar o
diseminada. El desarrollo de la infección se ha asociado a factores de virulencia
descritos en Cryptococcus spp. siendo destacados la producción de polisacáridos
capsulares, disposición de melanina en la pared celular y crecimiento a 37°C.
Adicional a los factores de virulencia descritos normalmente, se ha señalado la
presencia de hierro como un factor desencadenante en el desarrollo de la infección.
El hierro es un elemento esencial en procesos fisiológicos tanto del hospedero como
del hongo, el cual por ser eucariota comparte con los animales incluido el hombre,
procesos celulares como la cadena respiratoria, metabolismo de aminoácidos,
síntesis de ácidos nucleicos, los cuales están mediados por el hierro gracias a su
capacidad de cesión y captación de electrones.
La disposición de hierro en el hospedero suscita la captación del elemento por parte
del hongo, en el cual media procesos metabólicos que dan lugar al desarrollo de los
factores de virulencia ya mencionados y en los que se ha visto una mayor expresión
principalmente en el tamaño capsular, dando origen a células gigantes, a las que se
les ha atribuido la capacidad de inhibir la fagocitosis. Esto se ha convertido en un
problema en pacientes inmunocomprometidos, principalmente los seropositivos
para VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana) en los cuales la suplementación de
11
hierro hace parte del manejo terapéutico en respuesta a la anemia microcítica dada
por una alteración en el metabolismo de dicho elemento.
Con el fin de evaluar el efecto de la biodisponibilidad de hierro en el aumento de la
patogenicidad de C. neoformans, se planteó la utilización de dos cepas de dicha
especie (H99 y JEC21), que corresponden a la variedad grubii y variedad
neoformans respectivamente, las cuales fueron incubadas en medio mínimo
suplementado con concentraciones de 0, 5, 50 y 500pM de ClFe3 y posteriormente
inoculadas en el modelo invertebrado Gallería mellonella.
La modulación de la patogenicidad de C. neoformans medida por hierro se evaluó
mediante curvas de supervivencia de G. mellonella por el método estadístico Kaplan
meier, donde se observó disminución en los días de muerte para la cepa H99 con
500pM de ClFe3 y en la cepa JEC21 se observó un aumento de la patogenicidad
con la concentración de 500pM de FeCl3,lo cual se evidenció por la reducción en la
supervivencia de G. mellonella, comparado con el resto de concentraciones
evaluadas (5, 50 de ClFe3).
Adicionalmente se valoró el tamaño capsular de C. neoformans, debido a que la
capsula es el principal factor de virulencia descrito para el género Cryptococcus spp.
La medición capsular se realizó mediante preparación en fresco con tinta china,
evaluando diferentes condiciones (sin hierro, con hierro, post-infección), en las
cuales la cepa JEC21 no reflejo cambios en su tamaño capsular, contrario a la cepa
H99, en la cual se observó aumento del tamaño con la concentración de 50 y 500pM
de ClFe3 y post-infección.
Con estos datos se concluyó la modulación del hierro en la patogenicidad de C.
neoformans, dado por la reducción en la supervivencia de G. mellonella inoculada
con la cepa JEC21 con 500pM de ClFe3 y la reducción en el inicio de mortalidad
para la cepa H99 con la misma concentración de ClFe3.
INTRODUCCIÓN
12
El género Cryptococcus spp. perteneciente al filum Basidiomycota comprende
alrededor de 100 especies, dentro de las cuales C. neoformans y C. gattii se han
descrito como patógenos humanos, dichas especies se han clasificado en varios
serotipos, los cuales fueron determinados por variables antigénicas en su capsula
polisacárida: C. neoformans variedad grubii (serotipo A), C. neoformans variedad
neoformans (serotipo D), C. gattii (serotipo B y C) y los híbridos AD, AB y BD [1].
C. neoformans var. grubii (serotipo A) el principal agente etiológico de la infección
denominada criptococosis (95%) y abarca un 99% de las infecciones en pacientes
con SIDA [2,3] contrario a esto C. neoformans var. neoformans (serotipo D) está
asociado a un 5% de las infecciones en todo el mundo [2, 3].
El desarrollo de la infección por Cryptococcus spp. se ha vinculado a la presencia
de hierro, un elemento esencial en procesos fisiológicos del hospedero, dentro de
los cuales se incluye la cadena respiratoria, la cual en organismos eucariotas es
producida a nivel mitocondrial, metabolismo de aminoácidos y síntesis de ácidos
nucleicos, entre otras [4 - 7]. Estas reacciones intracelulares están mediadas por la
capacidad de cesión y captación de electrones de dicho elemento [6, 7].
Los distintos procesos fisiológicos en el hospedero están mediados por un equilibrio
en el depósito y utilización del hierro, sin embargo, cuando esta homeostasis es
alterada se favorece la disponibilidad de dicho elemento libre en el organismo, lo
cual fomenta el crecimiento y proliferación de numerosos microorganismos, entre
estos las especies fúngicas [4, 5, 8].
En pacientes VIH seropositivos se emplea adicional al tratamiento antirretroviral,
suplementación con hierro, debido a que en estos individuos hay una alteración en
el metabolismo de este elemento [5], razón por la cual se hace importante establecer
concentraciones adecuadas de hierro que amortigüen la ferropenia, sin generar una
sobrecarga que favorezca la captación de hierro por parte de microorganismos
oportunistas como C. neoformans.
13
En C. neoformans se han encontrado varios sistemas de transporte que le permiten
captar el hierro del medio ambiente, dentro de los que se destaca la presencia de
reductasas en la superficie celular con una captación de alta y baja afinidad por el
hierro [9]. Otro mecanismo descrito es la reducción no enzimática de hierro férrico
por un reductor secretado, el ácido 3-hidroxiantranílico y la presencia de melanina
en la pared celular, que puede contribuir a la captación del hierro adicional a la
mediación en la resistencia al estrés oxidativo producido en las células fagocíticas
del hospedero [9]. También se ha descrito la captación de hierro unido a sideróforos
secretados por otros microorganismos, ya que el género Cryptococcus no produce
sideróforos [4, 9, 10].
Basados en los mecanismos de captación de hierro expuestos anteriormente y su
relación con la patogenicidad de C. neoformans se identifica la contribución de dicho
elemento al desarrollo del tamaño capsular en asociación con CO2, adicionalmente
la presencia de hierro media la regulación de la enzima fenoloxidasa, intermediaria
en la síntesis de melanina a partir de compuestos difenólicos como las
catecolaminas, grupo que incluye la epinefrina, norepinefrina y dopamina, lo que
explica el tropismo de este microrganismo por el sistema nervioso central (SNC) [4,
9].
Apoyados en información reportada de estudios previos realizados con C.
neoformans, se establece la metodología para evaluar la patogenicidad del
microorganismo a diferentes concentraciones de hierro, este es un diseño
experimental, en el cual se emplearon dos cepas de C. neoformans: H99 var. grubii
(serotipo A) y JEC21 var. neoformans (serotipoD), las cuales fueron incubadas en
medio mínimo suplementado con diferentes concentraciones de FeCl3 (0, 5, 50 y
500 pM), posterior a la incubación, las células fueron lavadas con solución salina
normal al 0,9% mediante centrifugación y se ajustó a partir del pellet una
concentración de 1,5x 108 cel/ mL (Concentración establecida en el proyecto al que
pertenece este estudio) que posteriormente fue inoculada en el modelo invertebrado
Gallería mellonella (1,5x 106 cel/ Larva). Durante 15 días se observó la sobrevivencia
14
del invertebrado frente a la infección, este proceso fue evaluado por el método
estadístico Kaplan-Meier, por el cual se determinó un aumento de la patogenicidad
en la cepa menos virulenta (JEC21) con la concentración de 500pM, contrario a la
cepa más virulenta (H99) en la cual no se observó una diferencia significativa en la
patogenicidad con las diferentes concentraciones de hierro, sin embargo se observó
reducción en el día de inicio de mortalidad en esta cepa a concentración de 500pM.
A partir del macerado de larvas infectadas se evaluó el tamaño capsular del
microorganismo, encontrando un aumento en la cepa H99 con las diferentes
concentraciones (0, 5, 50 y 500pM de ClFe3) posterior a la infección, lo cual tendría
un efecto en la inhibición de la fagocitosis por parte de los hemocitos de las larvas
de G. mellonella que finalmente resultó en la muerte larval, contrario a esto en la
cepa JEC21 no se observó cambios en el tamaño capsular, lo cual puede estar
asociado al mayor porcentaje de sobrevivencia de G. mellonella, en las
concentraciones de (0, 5, 50pM de ClFe3) ya que en la concentración de 500pM
hubo una reducción significativa de la sobrevivencia de la larva, lo que estaría
relacionado a otros factores de virulencia diferentes a la capsula.
Con este estudio se identificó el papel del hierro en la mediación de la patogenicidad
de C. neoformans, var neoformans (JEC21) determinado por un aumento en la
mortalidad de G. mellonella con la concentración de 500pM y para C. neoformans,
var grubii (H99) con 500pM, dado por la reducción en el día de inicio de la
mortalidad.
15
JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La criptococosis es una micosis oportunista que afecta pacientes
inmunocomprometidos, aunque también se han reportado casos en pacientes
inmunocompetentes [1]. En Colombia, la vigilancia de pacientes seropositivos ha
sido importante en el estudio de infecciones oportunistas como la criptococosis, que
en nuestro país no es de obligatorio reporte [11]. Según el boletín epidemiológico
de la situación del VIH/Sida en Colombia 2013, en el periodo 1985-2012 se ha
reportado un total de 95.187 casos de infección por VIH/SIDA. Para el año 2012
ingresaron al SIVIGILA 8.196 casos, de los cuales 5.914 fueron hombres y 2.282
mujeres, con un porcentaje de 72,2% y 27,8% respectivamente, asociando la
infección al mecanismo de transmisión sexual en un 98.5% [12].
En cuanto a la epidemiología nacional de la criptococosis, se reportó un estudio
retrospectivo en un periodo de 5 años, dado entre el 2006 y 2010, en el cual se
determinó una incidencia general en la población de 2,4 casos por un millón de
habitantes y en pacientes SIDA una incidencia de 3,3 casos por cada mil pacientes.
Este análisis se realizó en un total de 526 encuestas, de las cuales el 76,6 % eran
hombres y el 74,9 % estaban entre los 21 y los 50 años. Adicionalmente, en el
estudio se identificó un predominio de infección por VIH del 83,5%, y una progresión
a SIDA en pacientes con criptococosis del 23% de los casos [11].
A partir de aislamientos recuperados en el estudio (413) se atribuyó un 95,6% de la
infección a C. neoformans var. grubii, 1% a C. neoformans var. neoformans y 3,4%
a C. gattii [11].
Un factor importante en el desarrollo de la criptococosis, adicional a la
inmunosupresión, es la suplementación con hierro, la cual se considera parte del
tratamiento en pacientes seropositivos, debido a la alteración en el metabolismo de
dicho elemento, que genera de manera secundaria anemia microcítica [5]. En
estado fisiológico las concentraciones de hierro en los fluidos se mantienen en
16
niveles bajos (1Ü-18), lo cual está dado por la fijación del hierro a proteínas como la
transferrina y lactoferrina [6, 7].
La sobrecarga de hierro asociada a diferentes factores como la predisposición
genética, estado nutricional e intervención terapéutica, que en este caso está
relacionada con la suplementación de hierro, aumentan el riesgo de infecciones por
diferentes microorganismos dentro de los cuales se encuentra Plasmodium
falciparum, Mycobacterium tuberculosis y Cryptococcus neoformans,
microorganismo objetivo del estudio [4, 8, 10, 13].
Aún no se ha descrito una relación directa entre el desarrollo de la criptococosis y
el tratamiento con suplementos en estos pacientes, sin embargo, se ha descrito la
relación de la patogenicidad del agente etiológico con el aumento de hierro en
estado férrico [10], el cual es captado por microorganismos oportunistas.
Por las razones anteriormente descritas, este estudio pretende evaluar la relación
de la biodisponibilidad de hierro con el desarrollo de factores de virulencia en C.
neoformans, siendo el principal objetivo la evaluación del tamaño capsular, el cual
puede asociarse a la patogenicidad e invasión en el hospedero, lo cual está
principalmente relacionado con pacientes inmunosuprimidos que han recibido
suplementos de hierro asociados a la terapia antiretroviral.
Los resultados de este estudio orientarían el manejo terapéutico de pacientes
vulnerables a la infección, al implementar concentraciones de hierro adecuadas que
amortigüen la ferropenia, sin generar una sobrecarga que pueda favorecer una
infección por microorganismos oportunistas como C. neoformans.
17
MARCO TEORICO
Cryptococcus spp.
El género Cryptococcus perteneciente al filum Basidiomycota, es caracterizado por
formas levaduriformes, ovales y encapsuladas. A este género pertenecen las
especies C. neoformans y C. gattii, definidas como patógenos humanos, las cuales
fueron caracterizadas por fenotipos fisiológicos y morfológicos [14]. Diferencias
antigénicas de polisacáridos capsulares, permitieron la clasificación filogenética de
C. neoformans en dos serotipos: variedad neoformans (serotipo D) y variedad grubii
(serotipo A). En contraste con la especie C. gattii caracterizada por su capsula
serotipo B y C, adicionalmente se describieron tres híbridos: AD, AB, BD [2, 14,
15].
Figura 1. Agentes etiológicos de la Criptococosis
18
Las dos especies exhiben diferentes distribuciones geográficas [17]:
- C. neoformans: la variedad grubii ha presentado una distribución mundial a
diferencia de la variedad neoformans que ha estado restringida en países
europeos, sin embargo las dos variedades comparten su asociación a
excremento de aves, principalmente palomas (Columba livia).
- C. gattii: parecía estar restringido en regiones tropicales y subtropicales, sin
embargo en 1999 se reportó un brote en la isla de Vancouver, Canada, lo
cual hizo pensar la capacidad de esta especie para establecerse en climas
templados. El serotipo B se ha asociado con varias especies de eucalipto
dentro de las que se encuentran, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus
tereticornis, Eucalyptus Rudis, y Eucalyptus gomphocephala, por el contrario
el serotipo C ha sido aislado a partir de dendritos de almendros (Terminalia
cattapa).
C. neoformans es causa principal de infecciones oportunistas en pacientes
inmunocomprometidos, como VIH seropositivos, con leucemia y otros tipos de
cáncer, o en aquellos que toman medicamentos corticosteroides [16,18]. C.
neoformans var. grubii (serotipo A) es responsable de la mayoría de los casos de
criptococosis en huéspedes inmunocomprometidos [18]. Contrario a esto, C. gattii
afecta principalmente a individuos inmunocompetentes [16].
C rip tococosis
Micosis oportunista producida por C. neoformans (var. neoformans y var. grubii) y
C. gattii, que afecta pacientes inmunocomprometidos, aunque también se han
reportado casos en pacientes inmunocompetentes [1]. En Colombia según estudios
recientes, se estimó una incidencia de 2,4 casos por un millón de habitantes y en
pacientes SIDA 3,3 casos por cada mil pacientes, atribuyendo un 95,6% de la
infección a Cryptococcus neoformans var. grubii [12].
19
Esta patología es adquirida por la inhalación de esporas o levaduras desecadas y
presenta dos formas clínicas, la pulmonar y la extrapulmonar o diseminada [3,
14,19, 20]:
• Pulmonar: generalmente asintomática o caracterizada por síntomas
inespecíficos como tos, esputo escaso, en ocasiones hemoptisis, febrículas,
pérdida de peso y malestar general. En las imágenes diagnosticas pueden
evidenciarse nódulos, infiltrados lobares, intersticiales, patrón miliar, masas
endobronquiales y cavitaciones.
• Extrapulmonar o invasiva: es característica de pacientes con SIDA y afecta
órganos diferentes al pulmón, donde se efectúa la infección primaria. Dentro
de los principales órganos afectados de encuentra [19, 20]:
- Sistema nervioso central (SNC): es la forma clínica más frecuente, en la
mayoría de los casos cursa como meningitis o meningoencefalitis que puede
presentarse de manera aguda, subaguda o crónica.
En pacientes inmunocomprometidos la respuesta inflamatoria es escasa, por
lo que se evidencia fiebre sin foco o manifestaciones clínicas, por el contrario
en personas inmunocompetentes, la presentación clínica es severa, esto
como resultado de la reacción inflamatoria producida, la cual es caracterizada
por la formación de lesiones granulomatosas denominadas criptococomas,
principalmente localizados en hemisferios cerebrales.
Dentro de las manifestaciones clínicas más comunes se encuentra cefalea,
nauseas, vomito, fiebre, alteración de la conciencia, signos meníngeos e
hipertensión intracraneana.
- Piel: puede ser primaria, siendo definida en la literatura como la identificación
de Cryptococcus spp. en biopsia o cultivo de piel en ausencia de enfermedad
diseminada; o secundaria en casos de diseminación hematógena.
20
La manifestación clínica característica de esta presentación está dada por
infiltraciones dérmicas con contornos definidos, ocasionalmente fluctuantes,
semejante al eritema nodoso.
- Ojos: más del 50% de pacientes con neurocriptococosis presentan
afectaciones oculares, siendo más frecuente el papiledema secundario a
meningitis, y menos frecuente la coroiditis en la cual un 5% de pacientes con
meningitis cursa con esta presentación clínica.
- Hueso: produce osteolisis.
- Vísceras: lesiones granulomatosas.
Respuesta inm unológica
Infección e inm unidad innata
Los mecanismos de la inmunidad innata restringen el establecimiento de la infección
por Cryptococcus spp. El primer medio de contención son las barreras físicas como
la piel y mucosas, sin embargo el sistema del complemento, las células fagocíticas
son los principales actores en la respuesta inespecífica frente a este
microorganismo [16].
El sistema del complemento es una cascada de reacciones de proteínas séricas
que pueden activarse por tres vías, la clásica (mediada por anticuerpos), lectinas, o
alternativa (mediada por la superficie microbiana). Las tres vías convergen en la
formación de C3 convertasa dando como resultado la escisión de C3 en C3a y C3b
[16,21]. El C3b tiene dos funciones, la primera es la opsonización del
microorganismo para posteriormente ser fagocitado y la segunda está dada por su
acción de escisión sobre el C5, convirtiéndolo de esta manera en C5a y C5b, siendo
21
C5b una opsonina al igual que C3b. C5b es el desencadenante en la formación del
complejo de ataque a la membrana (C5b, C6, C7, C8, C9) [21,22].
Figura 2. Respuesta inmune en Criptococosis: respuesta mediada principalmente por la cascada del complemento y la posterior opsonización dada por C3b, la cual favorece la fagocitosis.
Figura tomada: EUKARYOTIC CELL, June 2010, p. 835-846
La fagocitosis es iniciada por el reconocimiento directo de la levadura o mediada
por receptores que reconocen anticuerpos o complemento [16]. Los componentes
de la capsula criptocócica pueden ser directamente reconocidos por los receptores
de reconocimiento de patrones (PRR), donde el glucoronoxilomanano se une a
receptores Toll tipo 4 y el receptor de manosa de las células dendríticas se une a
manoproteínas expresadas en la superficie celular de la levadura [16, 23].
22
Infección e inm unidad adaptativa
Los anticuerpos anticriptocócicos promueven la fagocitosis mediante el
reconocimiento de la porción FC (fracción cristalizable) del anticuerpo por parte de
receptores en las células fagocíticas. Por otro lado media la activación del
complemento por la vía clásica [16].
Factores de viru lencia y evasión del sistem a inmune
1. Cápsula
La capsula está compuesta principalmente por Glucoronoxilomanano (GXM), el cual
a su vez se compone a-1,3-ligado a residuos de manosa con grupos laterales de
xilosil y glucuronil, pesa entre 1,700 y 7,000 kDa y abarca aproximadamente el 90%
de la capsula de C. neoformans [2, 24, 25].
Figura 3. Composición del Glucoronoxilomanano (GXM): el Glucoronoxilomanano
es un polisacárido compuesto por tres monosacáridos (Ácido glucuronico, xilosa y
manosa)
Figura tomada: Annu Rev Microbiol. 2009; 63: 223-247.
23
El Glucoronoxilomananogalactano (GXMGal) también hace parte en menor
cantidad de la estructura capsular y está compuesto por a-1,6-ligado a polímeros
de galactosa, manosa, xilosa y modificaciones de ácido glucurónico [24, 25].
Figura 4. Composición del Glucoronoxilomananogalactano (GXMGal): el
Glucoronoxilomananogalactano es un polisacárido compuesto por cuatro
monosacáridos (Ácido glucuronico, xilosa, manosa y galactosa)
Figura tomada: Annu Rev Microbiol. 2009; 63: 223-247.
Los polisacáridos capsulares son sintetizados a partir de la polimerización de
azúcares simples sobre una columna vertebral de hidratos de carbono, este proceso
depende principalmente del metabolismo de carbohidratos, al suministrar
eficientemente los azúcares necesarios para dicha síntesis [24,26].
Los azucares que componen los polisacáridos capsulares son sintetizados en el
citoplasma, la estructura característica de cada uno es ensamblada cerca de la
pared celular para posteriormente ser transportados a través de esta, concluyendo
así la formación de la capsula [24].
24
La cápsula está implicada en la evasión de la fagocitosis, afectando
secundariamente el procesamiento y presentación antigénica y por ende la
expansión clonal de linfocitos T [27]. Dicha evasión se ha asociado a la capacidad
del microorganismo de cambiar su estructura capsular impidiendo de esta manera
el reconocimiento por parte del sistema inmune y a la capacidad protectora de la
capsula frente al estrés oxidativo mediado por especies reactivas de oxigeno (ROS)
y nitrógeno dentro de los fagolisosomas de macrófagos, células dendríticas y
neutrófilos, convirtiéndolo de esta manera en un parasito intracelular facultativo [16,
27, 28].
La capacidad de C. neoformans de modificar el tamaño y estructura de su cápsula
está ligada principalmente a factores fisiológicos en el huésped, dentro de los cuales
se describen la exposición a dióxido de carbono y bajos niveles de hierro, elemento
esencial en el metabolismo del microorganismo. Se cree que el aumento del tamaño
capsular en C. neoformans frente a concentraciones disminuidas de hierro,
contribuye a una mayor obtención del elemento por parte de la levadura y este
cambio se produce durante las primeras horas de infección [16, 27].
Modificación de la cápsula a concentraciones bajas de hierro
Condiciones mínimas de hierro inducen el aumento del tamaño capsular en C.
neoformans. Actualmente se han descrito vías de señalización que regulan la
adaptación del microorganismo al medio [24]. Uno de los principales reguladores de
la adaptación a la privación de hierro es el factor de transcripción tipo GATA Cir1, el
cual responde también a altas concentraciones de hierro, aumentando la captación
de este por la célula. En estudios realizados por Jung y colaboradores, utilizando
mutantes Cir1 sometidas a bajas y altas concentraciones de hierro, se demostró el
papel de este factor de transcripción en la regulación de diversos procesos que
mantienen la integridad de la pared celular en medios con privación de hierro y
25
adicionalmente la regulación en la expresión de enzimas mediadoras en la síntesis
de la capsula [24, 13].
Modificación de la cápsula a diferentes niveles de CO2
C. neoformans en respuesta a diferentes niveles de dióxido de carbono utiliza la
proteína Can2 (Anhidrasa carbónica) para convertir CO2 a HC03 (Bicarbonato), con
el fin de contrarrestar los elevados niveles de CO2 en el medio pulmonar,
permitiéndole de esta manera el crecimiento en el entorno. La producción de HCO3
a pH fisiológico estimula la producción de cAMP activa la vía de señalización cAMP-
PKA responsable de la producción de levaduras encapsuladas en el hospedero
[24,29].
La respuesta celular a factores como el hierro y el CO2, los cuales son de interés
para este estudio son expuestos en la imagen a continuación:
26
Figura 5. Vía de señalización: la respuesta a la privación de hierro está dada por
el factor de transcripción tipo GATA Cir1 que promueve la encapsulación,
adicionalmente el Cir1 responde también a altas concentraciones de hierro,
aumentando la captación de este por la célula.
ESCRTIcomplex?
Transport
ESCRTIIcomplexVps2S
ESCRTI1Icomplex?
I: "y - U i: | ~nni
Uetn mineuni
G IK O «N itro g e n
Rim9? PH sensor?Gpf4GPCR:
Iron uptake
•Cü,
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cAMP----- ► Pdel
Rimí ■ScaffoW assembtyi mu Mioramon5er»se low iron
Rim13
irelT x ,
■ Mvataa
Figura tomada: American Society for Microbiology, July 2012 , p. 387-408
Modificación de la cápsula en respuesta a estrés
Es un factor represor en la inducción de la cápsula, lo cual está estrechamente
relacionado con alteraciones en la integridad de la pared celular, impidiendo una
27
adecuada secreción capsular. La principal condición asociada es una elevada
osmolaridad del entorno donde se encuentre el microorganismo [2, 24].
En cuanto al aumento del tamaño capsular en C. neoformans, estudios recientes
han asociado este estado a la adición de polisacáridos diferentes a los
preexistentes, produciendo de esta manera un aumento significativo de la densidad
de la cápsula. Este hallazgo es de vital importancia en el entendimiento de la
interacción del microorganismo con el sistema inmune del hospedero, ya que la
acumulación de nuevas moléculas de polisacáridos que tienen diferentes
propiedades físicas y antigénicas a las preexistentes podrían afectar el
reconocimiento por parte de anticuerpos, complemento y por ende no se realizaría
una fagocitosis efectiva de la levadura [2, 30, 31, 32].
2. Síntesis de melanina
La melanina es un pigmento que se encuentra en la pared celular de muchos
hongos patógenos dentro de los cuales se encuentra C. neoformans. Hay varios
tipos de melaninas: eumelaninas, feomelaninas, alomelaninas y piomelaninas, las
cuales comparten características físicas como el color oscuro, insolubilidad y
resistencia a hidrolisis acida [33].
La melanización en C. neoformans está catalizada por la lacasa, una difenoloxidasa
asociada a la pared celular que acciona la oxidación de compuestos difenólicos
como las catecolaminas, grupo que incluye la epinefrina, norepinefrina y dopamina,
esto explica el tropismo de este microorganismo por el sistema nervioso central
(SNC). Los genes LAC 1 y LAC2 han sido identificados en C. neoformans, siendo
LAC 1 el principal en la producción de melanina [33]. Este compuesto ha sido
fuertemente asociado a resistencia al estrés oxidativo dentro de los fagolisosomas
de las células fagocíticas del hospedero, esto adicional a la evasión del
reconocimiento por parte de la respuesta inmune del mismo [33, 34].
28
3. Crecim iento a 37°C
C. neoformans es un microorganismo termotolerante en comparación con otros
hongos, y puede por lo tanto, crecer a temperaturas corporales de los mamíferos
[35].
4. Enzimas extracelulares
En C. neoformans se han descrito tres mecanismos de actividad enzimática que
favorecen la patogenicidad y diseminación del microorganismo, dentro de estos se
encuentra[36 - 38, 73]:
• Producción de proteasas: juegan un papel importante en la degradación
tisular del hospedero, favoreciendo la invasión del parénquima pulmonar a
partir del espacio alveolar.
• Fosfolipasa B: está localizada en la pared celular, manteniendo la integridad
de está y adicionalmente contribuye a la invasión fúngica del tejido
pulmonar y a la diseminación del microorganismo.
• Ureasa: cataliza la hidrolisis de urea a amoniaco y carbamato, esta
actividad mejora la habilidad se C. neoformans para invadir el SNC
(sistema nervioso central)
Metabolismo del hierro
El hierro es empleado por las células como cofactor de variadas actividades
bioquímicas como el transporte de oxígeno, metabolismo energético y síntesis de
DNA, esto debido a su capacidad de óxido-reducción que le permite asociarse a
proteínas, transferir electrones y mediar reacciones catalíticas [6, 39].
29
Una gran cantidad de hierro (al menos 2,1 g) es empleado en la eritropoyesis,
formación de hemoglobina en los eritrocitos y por ende el transporte de oxígeno,
también una cantidad significativa está depositada en los macrófagos (~600 mg),
adicionalmente se encuentra presente en la mioglobina (~ 300 mg), y el exceso de
hierro en el organismo (~ 1 g) se almacena en el hígado [6].
La obtención nutricional del hierro está dada por tres vías dependiendo del estado
químico del metal [6, 40]:
• Estado férrico Fe3+: es reducido a ferroso Fe2+ por medio de reductasas
DcytB (Citocromo B duodenal) ubicadas en el lumen intestinal.
• Estado ferroso Fe2+: es transportado directamente a través de la
membrana apical de los enterocitos por el DMT1 (Transportador divalente
de metal 1).
• Grupo hem: es degradado por la hemooxigenasa, obteniendo de esta
manera el hierro que compone la estructura tetrapirrólica.
Los iones ferrosos obtenidos de estas vías pueden ser almacenados por la ferritina
o ser exportados a través de la membrana basolateral por medio de la ferroportina
Fpn y posteriormente oxidados por la proteína de membrana hefaestina. La
transferrina Tf se une al hierro en estado férrico Fe3+ para de esta manera ser
transportado a donde se requiera [6, 40].
Figura 6. Metabolismo de hierro: el hierro es obtenido a partir de la dieta, este
proceso se da mediante la DcytB que reduce el Fe3+ a Fe2+ y este es posteriormente
internalizado por el DMT1, ya en el interior este elemento es distribuido para ser
30
almacenado en forma de ferritina o entregado a la transferrina para su transporte a
los órganos que lo requieren.
Figura tomada: Acta bioquím. clín. latinoam. v.39 n.3 La Plata jun./sept. 2005
La entrega de hierro a la transferrina es regulado por la hepcidina, péptido
sintetizado por el hígado en respuesta al índice de saturación de la transferrina y el
nivel de receptores dispuestos para esta proteína en el hígado, sin embargo la
hepcidina también es sintetizada en procesos infecciosos e inflamatorios
produciendo de esta manera una regulación negativa al impedir la entrega de hierro
a la transferrina afectando directamente el metabolismo normal de este elemento,
generando secundariamente procesos anémicos por deficiencia de hierro [5, 6, 7,
40].
Los mamíferos secuestran y retienen el hierro como un mecanismo de defensa,
manteniendo así un entorno nutricional hostil para los patógenos invasores como
es el caso de C. neoformans. Una gran cantidad de hierro está asociado a proteínas
como transferrina, lactoferrina, ferritina y como hem en la hemoglobina.
La transferrina representa aproximadamente 1% del hierro total en el cuerpo
humano, se mantiene a ~ 33% de saturación en suero y neutraliza eficazmente el
31
hierro libre. La lactoferrina es similar a la transferrina en estructura y función, pero
esta proteína retiene el hierro en condiciones ácidas, mientras que la transferrina se
une al hierro a pH neutro [41].
Teniendo en cuenta lo anterior, los patógenos compiten con el hospedero por la
obtención de este elemento por medio de diversos mecanismos de captación, lo
cual es importante para la virulencia [41,42].
Mecanismos de captación de hierro
Los mecanismos de captación de hierro han sido más descritos en patógenos
bacterianos, de los cuales muchos producen sideróforos que se unen con gran
afinidad al hierro férrico y otros son capaces de utilizar proteínas como la ferritina,
lactoferrina, grupo hemo y proteínas que contienen hemo [43]; por ejemplo
Staphylococcus aureus durante la infección usa hierro del grupo hemo en lugar de
la transferrina, por esta razón su capacidad Beta-hemolítica con lisis total de los
glóbulos rojos [44].
Contrario a lo expuesto anteriormente, los mecanismos fúngicos en la captación de
hierro han sido menos descritos [9], sin embargo se han detallado cuatro estrategias
de captación y almacenamiento, lo cual les ha permitido competir eficazmente por
este elemento en el medio [4]:
1. Reducción extracelular del hierro en estado férrico (Fe3+) a ferroso (Fe2+)
mediado por reductasas localizadas en la pared fúngica, dichas reductasas
están asociadas a permeasas que permiten la internalización del hierro en el
citoplasma.
2. Síntesis y secreción de sideróforos, que una vez unidos al hierro lo introducen
en la célula fúngica mediante diversos mecanismos enzimáticos y no
enzimáticos.
32
3. Desarrollo de sistemas enzimáticos con actividad homologa a la
hemooxigenasa humana, haciendo posible la liberación del hierro de la
hemoglobina tras la lisis eritrocitaria.
4. Acidificación del medio en condiciones anaerobias, secundario a la formación
de hidrogeniones libres, lo cual permite la liberación del hierro unido a la
transferrina sérica, facilitando la captación de este elemento.
El modelo fúngico mejor caracterizado es Saccharomyces cerevisiae, al cual se le
han identificado dos sistemas de captación de alta afinidad [45, 46]:
1. Reducción de hierro férrico a ferroso por actividad de una reductasa de la
superficie celular con posterior transporte a través de la membrana
plasmática por una permeasa de alta afinidad por el hierro (complejo
ferroxidasa multicobre).
2. Utilización de sideróforos de otros organismos.
Se han descrito mecanismos en el transporte de hierro similares al de S. cerevisiae
en patógenos humanos. Los sistemas de reducción del hierro y utilización de
sideróforos, también se han encontrado en Candida albicans y Aspergillus
fumigatus [47,48].
En Candida albicans se ha descrito un mecanismo adicional de captación similar a
S. aureus, el cual está asociado a la actividad hemolítica, otorgándole la capacidad
de utilizar el hierro del grupo hemo presente en la hemoglobina [49, 50].
Captación de hierro en C. neoformans
33
En C. neoformans se han encontrado varios sistemas de transporte que le permiten
captar el hierro del medio ambiente, dentro de los que se destaca la presencia de
reductasas en la superficie celular, el sistema de captación de alta afinidad
compuesto por la permeasa CFT1 y la ferroxidasa Cfo1, la reducción extracelular
no enzimática de hierro férrico por un reductor secretado, el ácido 3-
hidroxiantranílico, la presencia de melanina en la pared celular, que puede contribuir
a la reducción de hierro férrico [9, 51, 52]. Y por último también se ha descrito la
captación de hierro unido a sideróforos secretados por otros microorganismos, ya
que éste no produce sideróforos [9,51].
Hierro asociado a patoqenicidad en C. neoformans
El hierro en toda célula eucariota es empleado como cofactor de variadas
actividades bioquímicas como el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, la respiración
mitocondrial, la biosíntesis de aminoácidos, lípidos y esteroles, esto debido a su
capacidad de óxido-reducción que le permite asociarse a proteínas, transferir
electrones y mediar reacciones catalíticas. Dicho elemento se vincula en C.
neoformans al desarrollo del tamaño capsular en asociación con CO2,
adicionalmente la presencia de hierro media la regulación de la enzima
fenoloxidasa, intermediaria en la síntesis de melanina a partir de compuestos
difenólicos como las catecolaminas, favoreciendo la virulencia y patogenicidad de
este microorganismo [6, 39].
Modelos in-vivo en el estudio de infecciones
La infección por C. neoformans ha sido previamente evaluada en modelos animales,
dentro de los cuales se encuentran murinos e invertebrados, siendo los primeros
relegados por aspectos bioéticos [53,54], según el Consejo Internacional de
Organizaciones Médicas (CIOM) para investigación con animales señalan los
criterios éticos que deben seguirse en el manejo y cuidado de animales para
experimentación [54]:
34
1. Reemplazo de animales conscientes por animales inconscientes o materiales
no sensibles. Son alternativas de reemplazo:
- Uso de técnicas físicas y químicas y predicciones basadas en las
propiedades físicas de las moléculas.
- Uso de modelos matemáticos y de computación, uso de organismos
inferiores como invertebrados o microorganismos.
- Uso de organismos muertos.
-Uso de estados primarios de desarrollo, uso de métodos in vitro (fracciones
subcelulares, fracciones de tejidos, suspensiones celulares, órganos, cultivos
celulares, incluyendo células humanas).
2. Reducción del número de animales sin disminución de la precisión. Esto se
logra con colonias genéticamente homogéneas, sin influencias ambientales,
seleccionando el modelo animal adecuado, usando una metodología
bioestadística avanzada y un banco de datos adecuado en que se publica
tanto los resultados positivos como los negativos para no repetir
experimentos
3. Refinamiento de las técnicas para reducir el dolor y las molestias. Se debe
considerar los siguientes aspectos:
- Cuidado y bienestar animal para evitar molestias innecesarias.
- Destrezas y capacitación del personal para dar el tratamiento adecuado a
los animales de experimentación.
- Perfeccionamiento de métodos para detectar dolor.
- Uso de anestésicos, analgésicos y tranquilizantes para disminuir el dolor.
- Uso de técnicas no invasivas o telemétricas para evitar dolor y molestias.
- Aplicar eutanasia anticipada o finalización del procedimiento doloroso
(llamado punto final) para evitar la prolongación de sufrimiento
Recientes estudios han tomado ventaja de la fácil utilización de invertebrados como
modelos de infección; amebas como Acanthamoeba castellanii y Dictyostelium
discoideum, el nematodo Caenorhabditis elegans y el insecto Drosophila
melanogaster, han sido principalmente utilizados en el estudio de procesos
35
celulares, moleculares e infecciosos [55]. En D. melanogaster de tipo salvaje, hay
una limitación especial dada por la resistencia a infección sistémica producida por
diversos hongos, incluyendo C. neoformans [55, 56].
Gallería mellonella como modelo in-vivo para el estudio de infección por C. neoformans
En respuesta a la necesidad de un modelo que se ajuste a las condiciones de
infección para C. neoformans, se implementó el uso de larvas de G. mellonella,
polilla perteneciente al orden lepidóptero, suborden Glossata y clado Ditrysia. Esta
permite el desarrollo de la patogenicidad del agente etiológico, dando un alto índice
de mortalidad en estos insectos. El hongo dentro de la larva está sometido a
fagocitosis por parte de los hemocitos, lo cual hace una representación de la
respuesta inmune frente a estos patógenos [57].
G. mellonella ha sido utilizada también en el estudio de la patogénesis bacteriana
de Pseudomona aeruginosa, Proteus mirabilis, Escherichia coli y patogénesis
fúngica de C. albicans y Aspergillus spp., principalmente A. fumigatus y A. flavus
obteniendo de igual manera que con C. neoformans la muerte de la larva [53, 58
66].
La respuesta inmune producida por G. mellonella durante la infección por C.
neoformans es diferente en comparación con células de mamíferos, dado que los
invertebrados carecen de respuesta inmune adaptativa y no hay producción de
inmunoglobulinas, sin embargo, los insectos poseen mecanismos de respuesta
inmune innata efectivos, los cuales están dados por la presencia de hemocitos que
tienen capacidad fagocítica similar a la actividad de macrófagos y neutrófilos;
células presentes en la respuesta innata de mamíferos, adicionalmente se ha
reportado la producción de péptidos antimicrobianos en estos insectos que median
la inmunidad frente a la infección [53].
36
En cuanto a los factores de virulencia de C. neoformans que este modelo permite
evaluar, se encuentra el tamaño capsular, el cual se ve sometido a cambios
morfológicos, caracterizados por aumento del tamaño capsular, dando lugar a
células gigantes que logran inhibir la fagocitosis [11, 53]. El modelo G. mellonella
también ha sido caracterizado en la especie C. gattii obteniendo igual utilidad y
correlación que con C. neoformans [74].
A pesar de la gran utilidad que brinda este modelo en el estudio de diversas
infecciones, dentro de estas la criptococosis, se han identificado ciertas desventajas
principalmente dadas en la producción de este modelo, ya que muchas veces se ve
afectado por factores fisiológicos y patológicos de los insectos si no se llevan las
medidas adecuadas para su producción en masa. Otro aspecto importante es la
caracterización genética de este modelo, siendo pobre en comparación con D.
melanogaster. Sin embargo, dichas desventajas no han opacado el potencial de
este organismo como modelo experimental, dado que sus ventajas sopesan sus
desventajas.
Dentro de las ventajas adicionales a la evaluación de respuesta inmune y factores
de virulencia, se une la gran correlación con resultados obtenidos en modelos
murinos, su fácil manipulación y su tolerancia a 37°C, lo cual no es compatible con
otros modelos como C. elegans o D. melanogaster, en los cuales la temperatura
máxima a emplear es 25 °C [57].
OBJETIVO GENERAL
37
Evaluar la patogenicidad de Cryptococcus neoformans expuesto a diferentes
concentraciones de hierro en el modelo invertebrado de Gallería mellonella.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar la concentración basal de hierro en Gallería mellonella.
2. Evaluar el crecimiento de C. neoformans en presencia de hierro.
3. Evaluar la concentración de hierro consumido por C. neoformans a partir del
medio de cultivo.
4. Evaluar la supervivencia de G. mellonella inoculada con C. neoformans bajo
la influencia de diferentes concentraciones de hierro.
5. Evaluar la influencia del hierro en el tamaño capsular de C. neoformans.
38
METODOLOGÍA
-Cepas de trabajo: En el estudio se emplearon las cepas descritas en la tabla 1.
Tabla 1. Cepas de C. neoformans utilizadas en el estudio
Código
INSCódigo Especie Variedad
Serotipo/
Pareja
sexual
V iru lencia Referencia
H0058-I-
1129H99
C. neoformans grubííA / a Alta [15,75]
H0058-I-
1128JEC21
C. neoformans neoformansD / a Baja [15,75]
Las cepas se emplearon en fase logarítmica de crecimiento, las cuales fueron
sembradas en agar Sabouraud e incubadas por 24 horas a 37°C.
-Larvas de Gallería mellonella:
Las larvas fueron adquiridas con la empresa SCIENTIA COLOMBIA S.A.S Cali-
Colombia, en último estadio larval (15 días antes de convertirse a pupa).
Objetivo 1: "Determinar la concentración basal de hierro en Gallería mellonella
Se realizó medición de la concentración basal de hierro en G. mellonella con el fin
de determinar la concentración de hierro en el organismo.
Para esto se seleccionaron cuatro larvas al azar, las cuales fueron introducidas
individualmente en tubos eppendorf y posteriormente puestas en contacto con hielo,
logrando de esta manera una sedación y disminución en la movilidad de estos
39
invertebrados. La exposición al frio se realizó aproximadamente por 10-15 minutos.
A las larvas sedadas se les realizó una incisión en la última pata falsa, garantizando
de esta manera una extracción de la hemolinfa sin agregados intestinales [67].
La hemolinfa extraída (aproximadamente 15-50pl por cada larva) se depositó en
tubos eppendorf los cuales contenían 200pl de anticoagulante con propiedad
antimelanizante: Buffer Insect physiological saline (IPS), para posteriormente
realizar la medición de hierro en la hemolinfa, la cual fue medida dentro de un
periodo de 10 minutos posteriores a la extracción, garantizando la calidad de la
hemolinfa para el respectivo procedimiento [53, 67]. (Figura 7).
Figura 7. Extracción de hemolinfa de Gallería mellonella
La concentración basal de hierro de G. mellonella en último estadío larval fue
medida por el método colorimétrico descrito a continuación.
P rincip io del método: el hierro se disocia del complejo sérico hierro-transferrina en
medio ácido débil. El hierro libre se reduce a ión ferroso mediante el ácido ascórbico.
40
Los iones ferrosos en presencia de FerroZine forman un complejo coloreado, como
se describe en la siguiente reacción:
Transferrina (Fe3+)z + e Acidoascártaico > ¿ ^ T rans fe rr¡na
Fe2+ FerroZine Complejo coloreado
Procedim iento: se siguieron las indicaciones de la casa comercial (ESPINREACT)
para el kit IRON-FZ dispuesto para la cuantificación de dicho elemento:
para determinar la concentración de hierro se puso en contacto 200 pL de la muestra
(hemolinfa) con ácido ascórbico (reactivo de trabajo RT) y los iones ferrosos
resultantes de esta reducción fueron coloreados con ferroZine (R3) (Tabla 2.) Luego
se mezclaron e incubaron 10 minutos a temperatura ambiente. Se leyó la
absorbancia (580 nm) del patrón y la muestra, frente al blanco del reactivo.
Tabla 2. Preparación de muestras y blancos: inserto de la casa comercial
SPINREACT para el kit IRON-FZ.
Reactivos1 1
Blanco
RT
Patrón Blanco
Muestra
Muestra
RT (Tampón+ reductor) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0
R3 (Color-FerroZine) (gotas) 1
Agua destilada (pL) 200
Patrón (pL) 200
Muestra (pL) 200 200
Control (50 pM FeCl3) 200 200
En el procedimiento se utilizó un control con concentración conocida (50pM) FeCl3.
41
La medición se realizó con el Stat Fax 3300, instrumento ampliamente utilizado en
inmunoensayos de bioquímica a nivel clínico. Para este procedimiento se siguieron
los lineamientos de la casa comercial.
Objetivo 2: "Evaluar el crecimiento de C. neoformans en presencia de hierro.”
La concentración de FeCl3 a emplear en este objetivo fue determinada con base
en revisión bibliográfica, la cual reportaba concentraciones de 10, 100 y 1000 pM,
sin embargo al realizar la incubación empleando la mayor concentración (1000 pM)
no se obtuvo crecimiento de ninguna de las cepas (JEC21 y H99), por lo cual se
replanteo la concentración máxima de FeCl3 a evaluar:
se determinó reducir a la mitad las concentraciones reportadas en la literatura (5,
50 y 500 pM de FeCb), de las cuales se empleó la máxima concentración (500 pM)
con el fin de evaluar el crecimiento de las cepas de C. neoformans (JEC21 y H99)
a mayor biodisponibilidad de hierro [9, 68].
Teniendo en cuenta lo anterior se inició con la incubaron de las cepas (H99 y JEC21)
en 20mL de medio mínimo (compuesto por 5 g de glucosa, 5 g de asparagina, 0,4
g de K2 HPO4 , 80 mg de MgSO4 • 7H2O, 0,25 g de CaCl2 • 2H2O, 0,4 mg de Tiamina,
0,057 g de ácido bórico, 0,005 g de CuSO4 • 5H2O, 0,01 mg de MnCl2 • 4H2O, 2
mg de ZnSO4 • 7H2O y 0,46 mg de molibdato de sodio por litro), toda la noche (16
horas). Las cepas utilizadas se emplearon a partir de cultivo fresco (< 24 horas) en
agar Sabouraud dextrosa [69].
Posterior a la incubación en medio mínimo toda la noche, se midió el número de
células/mL de cada cepa (H99 y JEC21) en cámara de Neubauer. El inoculo de
cada cepa (H99 y JEC21) se ajustó a una concentración final de 1 x 107 células/mL
para un volumen final de 40mL de medio mínimo. Esta preparación fue incubada a
37°C en agitación continua de 180 rpm por 21 horas, tiempo durante el cual se midió
42
la densidad óptica de cada medio de cultivo con la respectiva cepa. Dicha medición
se realizó cada hora (Figura 8).
Figura 8. Curva de crecimiento de C. neoformans (JEC21 y H99) bajo
concentración de 500 pM de FeCl3.
Objetivo 3: "Evaluar la concentración de hierro consumido por C. neoformans a partir del medio de cultivo.”
Para cumplir con este objetivo se evaluaron tres concentraciones de hierro, según
revisión bibliográfica, lo cual permite determinar el consumo de dicho elemento por
parte de C. neoformans en distintas condiciones de biodisponibilidad [9, 68]:
• FeCl3: 0, 5, 50, 500 pM.
43
Se empleó medio mínimo con y sin suplementación:
1. Hierro (FeCb): se evaluó la utilización de hierro, con el fin de observar
una reducción del elemento a estado ferroso, importante para la
internalización a nivel intracelular.
2. Ausencia de hierro: en esta condición se evaluó el metabolismo del
microorganismo en ausencia de hierro.
Las cepas de C. neoformans (H99 y JEC21) a una concentración de 1.5x108
células/mL (concentración establecida en ensayos previos del proyecto al que
pertenece este estudio), fueron incubadas en 20mL de medio mínimo suplementado
con las diferentes concentraciones de FeCl3 descritas anteriormente, dicha
incubación se realizó por un periodo de 12 horas a una temperatura de 37°C y
agitación constante de 180 rpm [69]. Posterior a la incubación se tomó 10mL de
cada medio de cultivo y se centrifugo 5 minutos a 10000 rpm. La medición del hierro
se realizó a partir del sobrenadante, con el mismo principio descrito en el objetivo 1
(Figura 9).
44
Figura 9. Medición de hierro consumido por C. neoformans en medios de cultivo con FeCl3 (0, 5, 50, 500 pM).
1,5 x 10®cel /m i
Lavado celular
1,5 x 10®cel/mlICm 20ml
5 uM SO pM S00 pM
Incubación 37 C - 180 rpm - 1 2 horas
MM MM + Fe MM + Fe MM + Fe5pM 50pM 500 uM
_____ N RON-t Z(SPINREACT)
i'C brenadante STAT FAX 3300(Solución salina)
En el procedimiento se utilizó un control con concentración conocida (50pM) FeCl3.
Objetivo 4: "Evaluar la supervivencia de G. mellonella inoculada con C. neoformans
bajo la influencia de diferentes concentraciones de hierro”.
Se incubaron dos cepas de C. neoformans (JEC21 y H99) a una concentración
inicial de 1.5x108 cel/mL, con las diferentes concentraciones de hierro, las cuales
fueron descritas en el objetivo 3.
Posterior a la incubación se tomó 10mL de los diferentes medios y se centrifugaron
5 minutos a 10000 rpm para obtener el pellet, el cual fue resuspendido con solución
salina 0,85 % con el fin de lavar las células, este proceso se realizó dos veces para
45
finalmente resuspender el pellet en 1mL de solución salina, a partir del cual se
determinó el número de células/mL en cámara de Neubauer.
La concentración de cel/mL determinada para cada medio, se ajustó para obtener
una concentración de 1.5x108 cel/mL, la cual posteriormente se inoculó a las
respectivas larvas, generando de esta manera un modelo de infección.
Para la inoculación se clasificaron grupos de 20 larvas, a las cuales se inyectaron
10 pL de una suspensión de C. neoformans preincubado con y sin FeCl3 con jeringa
de insulina (concentración equivalente a 1.5x106 cel/ larva). Esta inoculación se
realizó en la última pata falsa de la larva (Figura 10).
Figura 10. Inoculación en larvas de G. mellonella: se inoculó con 10pL de
suspensión con C. neoformans (pre-incubado con concentraciones de 0, 5, 50 y 500
pM de FeCl3), lo cual equivale a concentración de 1.5x106 cel/ Larva.
En este modelo de infección se emplearon tres controles descritos en la tabla 3.
46
Tabla 3. Controles empleados en la inoculación de C. neoformans (pre-incubado
con concentraciones de 0, 5, 50 y 500 pM de FeCl3) en el modelo invertebrado de
Gallería mellonella.
Control absoluto 20 larvas Larvas sin ningún tipo de manipulación en
el laboratorio.
Control inoculación 20 larvas Larvas inoculadas con solución salina
0.85%.
Control desinfección 20 larvas Larvas que han sido desinfectadas con
una solución de hipoclorito de sodio 0,1 %.
Todas las larvas, excepto el control absoluto, fueron previamente desinfectadas
utilizando hipoclorito de sodio al 0,1% seguido por dos lavados con agua destilada
(Figura 11).
Figura 11. Desinfección de larvas de G. mellonella: procedimiento realizado previo
a la infección, utilizando hipoclorito de sodio al 0,1%.
7 -Á
JHipoclorito 0,1% Agua destilada Agua destilada
30 segundos 30 segundos 30 segundos
47
Posterior a la inoculación se registró diariamente el número de larvas muertas
identificando características como flacidez, ausencia de movilidad y coloración
negra. Adicionalmente, se realizó el análisis de sobrevivencia de las larvas mediante
el método de Kaplan-Meier (KM).
KM utiliza una función de supervivencia no paramétrica para un grupo analizado, es
decir su probabilidad de supervivencia después del momento de inoculación. La
comparación de esta supervivencia entre grupos se realizó con la aplicación las
pruebas de Breslow y log-rank, estas pruebas permiten identificar diferencias
estadísticamente significativas entre los grupos analizados, evidenciando si estas
diferencias se presentan al inicio o al final del periodo de observación (Breslow y
log-rank respectivamente). Este análisis se realizó utilizando el programa SPSS -
IBM [53, 57].
Se realizaron tres réplicas de cada experimento.
Objetivo 5: "Evaluar la influencia del hierro en el tamaño capsular de C. neoformans".
Medición de cápsula de cepas sin tratamiento
Las cepas de C. neoformans (H99 y JEC21) fueron extraídas de cultivo fresco en
agar Sabouraud dextrosa y resuspendidas en 5mL de caldo Sabouraud, las cuales
fueron incubadas por 48 horas con una agitación constante de 150 rpm y
temperatura de 37°C. Posterior a la incubación se realizó una preparación en fresco
con tinta china (1 gota de medio y 1 gota de tinta) entre lámina y laminilla, la
medición se efectuó en microscopio óptico con objetivo de 100x y la utilización de
micrómetro ocular con resolución de 1 gm. Se observaron 20 células, a las cuales
se les midió el tamaño capsular (de la pared celular al borde de la capsula) y
posteriormente se realizó promedio de los datos [70] (Figura 12).
48
Figura 12. Medición de capsula en cepas (JEC21 y H99) sin contacto con FeCl3:
se realizó mediante la incubación de las cepas en caldo sabouraud, a partir de un
cultivo fresco (<24 horas) en agar sabouraud, posterior a esto se hizo preparación
en fresco entre lamina y laminilla con tinta china, lo cual fue observado en
microscopio óptico a 100X.
5mL Caldo Sabouraud
ir Sabouraud
Tinta china
H99 JEC21
Aga
Rotación: 150 rpmIncubación: 37°C
48 horas
20 cé lu la s / prom ed io
Medición de cápsula de cepas incubadas con FeCl3.
El pellet obtenido a partir del cultivo de C. neoformans con FeCl3 fue resuspendido
en 1mL de solución salina 0,85 %, y posteriormente se realizó la medición del
tamaño capsular. Para esto se hizo una preparación en fresco con tinta china (figura
13).
49
Figura 13. Medición de capsula en cepas (JEC21 y H99) incubadas con FeCb: para
esto se obtuvo el pellet de células preincubadas con concentración de 0, 5, 50 y 500
pM de FeCl3 a las cuales se les realizó preparación en fresco entre lamina y laminilla
con tinta china, y posteriormente observado en microscopio óptico a 100X.
Medición de cápsula en cepas obtenidas a partir del macerado de larvas de G.
mellonella infectadas con C. neoformans (preincubado con y sin FeCb)
Durante los 15 días del experimento post-infección, se realizó recolección diaria de
larvas muertas correspondientes a las dos cepas de C. neoformans (H99 y JEC21),
las cuales fueron maceradas individualmente en tubos eppendorf con 1mL de
solución salina 0,85 %.
El macerado fue centrifugado por 5 minutos a 10000 rpm para eliminar lípidos que
puedan interferir con la observación. La medición de tamaño capsular y celular fue
realizada mediante preparación en fresco con tinta china, utilizando el sobrenadante
del macerado, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente (Figura 14).
50
Figura 14. Medición de capsula en cepas (JEC21 y H99) obtenidas de larvas post
infección: obtención a partir de macerados de larvas muertas en 1 mL de solución
salina 0,85 %, del cual se empleó el sobrenadante obtenido por centrifugación y
posteriormente preparado entre lamina y laminilla con tinta china y observado en
microscopio óptico a 100X.
Se realizó medición del 50% de larvas muertas, las cuales fueron escogidas al
azar.
51
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Objetivo 1: "Determinar la concentración basal de hierro en Gallería mellonella.”
En el desarrollo de este objetivo se empleó el STAT FAX 3300, equipo empleado
en análisis bioquímicos a nivel clínico, el cual se fundamenta en un sistema
hidráulico asociado a espectrofotometría y se empleó el kit IRON- FZ de la casa
comercial SPIREACT con un rango de medida de 1,85 pg/dL hasta el límite de
linealidad de 1000 pg/dL.
La concentración basal de hierro en la hemolinfa de G. mellonella no fue
determinada, ya que en la medición de dicho elemento en el control de
concentración conocida (50 pM) se obtuvo gran variabilidad en los resultados, lo
cual no permite la validación de la prueba y por ende los resultados obtenidos en
esta (Tabla 4).
Tabla 4. Concentración de hierro medida en hemolinfa de G. mellonella: se realizó
con la utilización del kit IRON- FZ de la casa comercial SPINREACT. El resultado
se obtuvo por lectura de densidades ópticas (OD) A 580 nm en el equipo STAT
FAX 3300.
MUESTRA CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓNjiM jiM jiM
P r im e r a m e d ic ió n S e g u n d a m e d ic ió n T e r c e r a m e d ic ió n
C o n tro l 50 |nM 232 66,9 77,2
H e m o lin fa 10,8 0,8 0,4
Si se tuviera en cuenta la concentración determinada en la segunda medición:
0,8 pM = 4,6pg/dl (7,4 X 10-8 ppm), en la que el control estuvo cerca de la
concentración esperada, se encuentra que los niveles de hierro son muy bajos en
52
comparación con mediciones hechas en estudio previo realizado por Malik y
colaboradores 2009, en el cual se determinó una concentración de 11 ppm para los
insectos pertenecientes al orden lepidóptero, como es el caso de G. mellonella.
Cabe aclarar que la concentración descrita (11 ppm) puede variar según las
condiciones alimenticias y el estadio de la larva [71].
Por otro lado Malik y colaboradores midieron la concentración de diferentes metales
de Bombix mory en diferentes estadíos, utilizando la técnica de espectrometría de
absorción atómica, lo cual presenta una alta sensibilidad para la detección a nivel
de ppm de diferentes metales [91].Teniendo en cuenta lo anterior, se puede inferir
que el método utilizado en este estudio para la medición de hierro, no fue el más
apropiado, ya que el kit IRON-FZ es empleado en la práctica clínica para la medición
en suero humano, adicionalmente para esta prueba se ha reportado interferencias
en la lectura dada por lípidos presentes en la muestra, razón por la cual se podría
disminuir la efectividad del método fotométrico para el análisis de hierro en la
hemolinfa, la cual está compuesta aproximadamente por un 90% de agua y el
porcentaje restante corresponde a iones (Hierro, manganeso, cobre, zinc, sodio,
potasio, magnesio, cloro), lípidos, azucares, factores humorales y células siendo
más destacados los hemocitos [71].
Dadas las posibles interferencias descritas anteriormente, se hace necesaria la
utilización de un método más sensible en la medición de hierro, es por esto que la
espectrometría de absorción atómica es la técnica más indicada, ya que permite
evaluar concentraciones específicas de un analito en una mezcla determinada.
Objetivo 2: "Evaluar el crecimiento de C. neoformans en presencia de hierro.”
Se evaluó la capacidad de crecimiento de las dos cepas de C. neoformans (JEC21
y H99) en medio mínimo con la concentración máxima (500pM de FeCl3) a evaluar
53
en el estudio, esto con el fin de observar el comportamiento de las cepas en un
medio con abundante biodisponibilidad de hierro.
Como resultado se observó un comportamiento de adaptación o fase logarítmica
durante las primeras cinco horas, seguido de una fase exponencial hasta las 13
horas de cultivo y finalmente una fase estacionaria (Figura 15). Con los resultados
obtenidos se observó que tanto C. neoformans H99 como JEC21 crecen en medio
mínimo y en medio suplementado con 500pM de hierro, sin observarse diferencias
significativas entre las dos cepas (p=0.02).
El metabolismo del hierro es de gran importancia en las células eucariotas, ya que
este elemento interviene en procesos intracelulares, dentro de los que se destaca
la cadena respiratoria, el metabolismo de aminoácidos y la síntesis de ácidos
nucleicos [4-7]. Este proceso fisiológico del microorganismo se puede asociar a su
crecimiento en el medio dispuesto para el estudio, con el cual se evidenció todas
las fases consistentes con una curva de crecimiento determinada para
microorganismos.
Con estos resultados se confirmó el crecimiento de las dos cepas en medio mínimo
y suplementado con hierro, lo que permitió establecer esta concentración como la
máxima a utilizar en un rango de 5 a 500 pM. A pesar de que la literatura reporta
concentraciones de hierro en un rango de 10 a 1000 pM, con buen crecimiento, en
este estudio no se observó crecimiento en la concentración de 1000pM (datos no
mostrados). Este comportamiento posiblemente se deba a la inhibición del
crecimiento dado por una alta concentración de este elemento [9, 24, 68].
54
Figura 15. Curva de crecimiento C. neoformans: se emplearon dos condiciones a
evaluar (medio mínimo y medio mínimo suplementado con 500 pM de FeCl3). En
las dos cepas (JEC21 y H99) se observaron las diferentes fases de crecimiento
(latencia, exponencial y estacionaria), determinando así el adecuado desarrollo de
las cepas en el medio de cultivo dispuesto para el estudio.
Objetivo 3: "Evaluar la concentración de hierro consumido por C. neoformans a partir del medio de cultivo.”
Al evaluar la concentración de hierro consumida por C. neoformans se encontró que
mediante el uso del kit IRON- FZ no fue posible su determinación, ya que los valores
obtenidos presentaron concentraciones muy variables que no corresponden a los
valores de hierro esperados. Durante el proceso se empleó un control con una
concentración conocida de hierro (50pM), para el cual tampoco fue posible una
medición concordante (Tabla 5). El medio mínimo tiene una concentración de hierro
reportada de 5 pM lo cual no fue posible corroborar con el kit utilizado [72].
55
El kit IRON-FZ de la casa comercial SPINREACT utilizado en el ensayo tiene
instaurado un rango de lectura de 1,85 pg/dL hasta el límite de linealidad de 1000
pg/dL, el cual abarca todos los datos recolectados. Sin embargo, estos resultados
no son validados, debido a la incoherencia de la medición obtenida del control con
concentración conocida (50pM).
Estos resultados posiblemente se pueden deber a la disposición de este kit, el cual
está determinado para la medición de hierro en suero. Adicionalmente, el FeCl3 es
estable por 7 días en refrigeración y las condiciones de crecimiento de las cepas
(H99 y JEC21) en los medios dispuestos para la medición (Medio mínimo sin y con
5, 50, 500 pM de FeCb) fueron incubados a 37°C por 16h, lo cual pudo haber
interferido con la correcta cuantificación de este elemento. Otro factor que puede
estar relacionado es la composición del medio mínimo (Glucosa, asparagina,
K2HPO4, MgSO4 • 7H2O, CaCl2 • 2H2O, Tiamina, ácido bórico, CuSO4 • 5H2O,
MnCl2 • 4H2O, ZnSO4 • 7H2O y molibdato de sodio) en la cual uno o varios de sus
componentes pueden estar interfiriendo en la reacción mediada por los reactivos
del kit y por ende en la lectura y cuantificación del hierro, obteniéndose de esta
maneragran variabilidad en los resultados.
Teniendo en cuenta las inconsistencias en los resultados obtenidos mediante la
utilización del STAT FAX 3300, se decidió utilizar los resultados de las absorbancias
para realizar el cálculo empleando la ecuación descrita en el inserto del kit IRON-
FZ, obteniendo igualmente resultados inconsistentes (datos no mostrados).
Ecuación
(A)Muestra - (A) blanco de muestra x 100 pg/dL (Concentración del patrón)
(A) Patrón
56
Tabla 5. Concentraciones de hierro medidas con STAT FAX 3300 en los medios
de cultivo dispuestos para las cepas de C. neoformans (JEC21 y H99). Se observó
variabilidad en los resultados del control de concentración conocida (50 j M) y en
las muestras analizadas para cada cepa: medio mínimo sin y con suplementación
de hierro (5, 50 y 500 j M).
MUESTRA CONCENTRACIÓN
mm
Primera medición
CONCENTRACIÓN
mm
Segunda medición
CONCENTRACIÓN
mm
Tercera medición
Medio mínimo 10,1 10,3 38,0
Control 50 j M 232 66,9 77,2
Medio JEC21 27 15,9 8,5
Medio JEC21 +5 |jM 8,3 68,8 10,5
Medio JEC21 +50 j M 148,4 138,3 13,8
Medio JEC21 +500j M 36,6 26,5 7,2
Medio H99 3,1 78,5 68,4
Medio H99 +5 j M 2,5 36,9 25,7
Medio H99 +50 j M 7,8 165,9 155,8
Medio H99 +500 j M 159,2 11,5 149,1
Objetivo 4: "Evaluar la supervivencia de G. mellonella inoculada con C. neoformans bajo la influencia de diferentes concentraciones de hierro” .
Los resultados presentados corresponden al análisis de las tres replicas, en las
cuales se observó una supervivencia del 100% para el control absoluto, control de
inoculación y control de desinfección, lo que permite validar los ensayos realizados,
además se observó diferencias significativas en la supervivencia de G. mellonella
entre la cepa JEC21 y H99 (Figura 16, tabla 6).
57
Figura 16. Curva de supervivencia de G. mellonella inoculada con cepas JEC21 y
H99 de C. neoformans (preincubadas con 0, 5, 50 y 500 pM de FeCl3): se obtuvo
100% de supervivencia para los controles (absoluto, inoculación y desinfección) lo
cual permite validar el ensayo.
Funciones de supervivenciaCepa
. .AbsolutoC D e s in fe c c ió n
h " il;j i-1H V :
H99 + 5uMH99 + 50uMH99 + 500|jMJE1. _ IJE1. 2 5pMJE1. U1 S IJp M
JE1.21 5Ü0pM
■“ 0 .4
4.00 6.00 10.00 12.00 1 4 ,0 0
Tiempo
Tabla 6. Prueba de igualdad de distribución de supervivencia (cepa JEC21 y H99
sin y con concentraciones de FeCl3 5, 50, 500 pM)
Comparaciones tjlohales
Log Rank (Mantel-Cox)Breslüw (Generalized WilEDKOn)
Sig.,000
.000
Análisis en cepa JEC21
Para la cepa JEC21 sin FeCl3, el porcentaje de supervivencia fue del 93% hasta el
día 8 y al finalizar el experimento se observó un 75% de supervivencia. Contrario a
58
esto, en la cepa JEC21 con las diferentes concentraciones de FeCl3 (5, 50 y 500
pM) se encontró a los 8 días un porcentaje de supervivencia del 92%, 80%, 46% y
al final del experimento se observó un porcentaje de supervivencia de 78%, 61%,
35% respectivamente. Las larvas que sobrevivieron pasaron a pupa, por lo que se
estableció el día 15 como el último día del experimento (Tabla 7).
Tabla 7. Supervivencia G. mellonella inoculada con cepa JEC21 (preincubada con
0, 5, 50, 500 pM de FeCls)
Tiem po
en días
ENSAYOS
JEC21 SIN
FeCl3
ENSAYOS
J E C 2 1 5 pM
FeCl3
ENSAYOS
JEC21 50 pM
FeCl3
ENSAYOS
JEC21 500 pM
FeCl31 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 201 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 18 202 19 20 20 20 20 20 20 20 20 20 18 163 19 20 20 20 20 20 20 20 17 20 18 94 19 20 20 20 20 20 20 20 16 17 17 75 19 20 20 20 20 19 20 20 14 17 17 56 19 19 20 20 20 18 20 20 13 16 17 57 19 19 20 20 19 17 20 20 10 15 17 58 19 17 20 20 19 16 20 20 8 11 14 39 19 15 20 20 17 16 20 19 6 10 13 210 18 15 19 18 17 16 20 18 4 10 12 211 18 15 18 18 15 16 20 16 4 10 11 212 17 15 16 17 15 16 19 16 4 10 10 113 15 15 15 16 15 16 18 16 4 10 10 114 15 15 15 16 15 16 17 16 4 10 10 115 15 15 15 16 15 16 17 16 4 10 10 1
La prueba de Breslow (Wilcoxon) evalúa los eventos producidos al inicio del
seguimiento y la prueba log-rank, evidencia las diferencias de supervivencia tardía,
teniendo en cuenta esto al analizar la curva de supervivencia de G. mellonella (cepa
JEC21 sin y con concentraciones de FeCl3 5, 50, 500 pM), se encontró una
diferencia significativa, principalmente dada por la cepa JEC21 con 500 pM, que a
59
diferencia de las otras condiciones evaluadas tuvo un pequeño pico de mortalidad
en el día 3 y 4 , y al finalizar el ensayo presento una supervivencia de 35% , la cual
está muy disminuida en comparación con las demás condiciones evaluadas (Figura
17).
Figura 17. Curva de supervivencia G. mellonella inoculada con cepa JEC21
(preincubada con 0, 5, 50, 500 pM de FeCb)
La disminución significativa de la sobrevida de G. mellonella inoculada con la cepa
JEC21 con 500 pM de FeCl3 da indicio de la modulación de la patogenicidad
mediada por el hierro, lo cual está determinado por la mortalidad de las larvas.
Con base en estos resultados se puede inferir la captación del hierro, por parte C.
neoformans var. neoformans dada la gran biodisponibilidad de este elemento en el
medio de cultivo, lo que posiblemente favoreció una mayor actividad celular y por
ende el aumento de la patogenicidad en la cepa expuesta a 500 pM de FeCl3.
60
Análisis en cepa H99
Para la cepa H99 sin FeCl3, el porcentaje de supervivencia fue de un 3% hasta el
día 8 y al finalizar el experimento se observó un 2% de supervivencia. Contrario a
esto, en la cepa H99 con las diferentes concentraciones de FeCl3 (5, 50 y 500 pM)
se encontró a los 8 días un porcentaje de supervivencia del 12%, 3%, 7% y al final
del experimento se observó un porcentaje de supervivencia de 12%, 3%, 5%
respectivamente. Las larvas que sobrevivieron pasaron a pupa, por lo que se
estableció el día 15 como el último día del experimento (Tabla 8).
Tabla 8. Supervivencia G. mellonella inoculada con cepa H99 (preincubada con 0,
5, 50, 500 pM de FeCb)
Tiem po
en días
ENSAYOS
H99 SIN FeCl3
ENSAYOS
H99 5 pM
FeCl3
ENSAYOS
H99 50 pM
FeCl3
ENSAYOS
H99 500 pM
FeCl31 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 201 19 20 20 20 20 20 20 20 20 20 19 202 19 20 16 20 20 18 16 16 9 17 6 23 18 5 0 19 7 3 4 4 1 13 0 14 14 1 0 8 2 3 0 2 0 8 0 15 8 1 0 5 0 3 0 2 0 3 0 16 2 1 0 5 0 3 0 2 0 3 0 17 2 1 0 4 0 3 0 2 0 3 0 18 1 1 0 4 0 3 0 2 0 3 0 19 1 1 0 4 0 3 0 2 0 3 0 110 0 1 0 4 0 3 0 2 0 2 0 111 0 1 0 4 0 3 0 2 0 2 0 112 0 1 0 4 0 3 0 2 0 2 0 113 0 1 0 4 0 3 0 2 0 2 0 114 0 1 0 4 0 3 0 2 0 2 0 115 0 1 0 4 0 3 0 2 0 2 0 1
61
Al evaluar la curva de supervivencia de G. mellonella (cepa H99 sin y con
concentraciones de FeCl3 5, 50, 500 pM) mediante la prueba de Breslow (Wilcoxon)
y log-rank no se encontró diferencias significativas entre la cepa sin y con las
diferentes concentraciones de FeCl3 (Figura 18). Sin embargo la cepa H99 con 500
pM presentó un pico de mortalidad en el día 2, reduciendo la supervivencia de las
larvas a cerca de un 40%, esto contrario a las demás condiciones (0, 5 y 50 pM)
que presentaron el pico en el día 3.
Estos resultados pueden sugerir la modulación de la patogenicidad de H99 con 500
pM, basados en la reducción del tiempo en el pico de mortalidad, que para esta
cepa sin hierro en ensayo previo del proyecto al que pertenece este estudio, se
estimó al 3 día con la concentración inoculada (1.5x106 cel/ Larva).
62
Figura 18. Curva de supervivencia G. mellonella inoculada con cepa H99
(preincubada con 0, 5, 50, 500 pM de FeCl3)
Adicionalmente se evaluó de manera individual las cepas sin y con exposición a las
distintas concentraciones de FeCl3 5, 50, 500 pM.
Análisis de las cepas H99 y JEC21
Se observa una diferencia significativa al comparar las cepas (H99 y JEC21) en
cada condición (sin y con diferentes concentraciones de FeCl3 5, 50, 500 pM).
Evidentemente la cepa H99 es más patógena que la JEC21, lo cual esta reportado
en la literatura [86], aunque la cepa JEC21 aumentó su patogenicidad como
resultado de la biodisponibilidad del hierro otorgada por la concentración de 500 pM,
no llega a ser tan patógena como la H99, en la cual se observó un porcentaje de
supervivencia de G. mellonella cercano al cero y picos de mortalidad en el comienzo
de la infección (día 2 y 3) (Figura 19), lo cual puede estar relacionado con la
63
incapacidad de G. mellonella de mediar una respuesta inmune efectiva frente a la
infección por C. neoformens var. grubii.
Figura 19. Curva de supervivencia G. mellonella. A) Cepa H99 y JEC21 sin FeCl3.
B) Cepa H99 y JEC21 con 5pM FeCl3. C) Cepa H99 y JEC21 con 50pM FeCl3. D)
Cepa H99 y JEC21 con 500pM FeCl3
Fun c ioné t de supe i v iv irte a■ ; j Fu rtG lM ití d i tu p ir v iv in d a
r tm p d Tumpo
F u rtc id ñe i de aupe iv iverid ie Funcionee de tupHviverttii_r 1 :>r>
Tlimp« • «Tipo
64
Objetivo 5: "Evaluar la influencia del hierro en el tamaño capsular de C. neoformans".
Para determinar las diferencia en el tamaño capsular de Cryptococcus se realizó la
medición de las cepas H99 y JEC21 sin ninguna preincubación o crecimiento en
medio mínimo, con el fin de tomar esta medida como control frente a las mediciones
de cápsula en las diferentes condiciones evaluadas (Figura 20a). El tamaño
capsular para las cepas sin ningún tratamiento fue de 1 gm, que al compararlo con
el tamaño de la cepa JEC21 después de someterla a las diferentes concentraciones
de FeCl3 no mostro cambios en su tamaño capsular. Por el contrario, en la cepa
H99 se observó un aumento en el tamaño capsular en las concentraciones de 50,
500 gM de FeCl3 (Figura 20 b, c).
Figura 20. Tamaño capsular de C. neoformans. A) Cepas H99 y JEC21 (C.
neoformans var. grubii y var. neoformans respectivamente) incubadas sin FeCl3. B)
Cepa JEC21 incubada con FeCl3 (5, 50, 500 gM). C) Cepa H99 incubada con FeCl3
(5, 50, 500 gM)
65
Al realizar el análisis del tamaño capsular en la cepa H99 post-infección se observó
que sin hierro hubo un aumento en este parámetro respecto al medido pre-infección,
lo cual ha sido descrito en estudios previos por Zaragoza y colaboradores 2004,
donde se relaciona dicho incremento con los factores a los que se expone el
microorganismo dentro del hospedero, como lo son los niveles bajos de hierro y
altos niveles de CO2 que inducen el aumento del tamaño capsular [24, 31, 53].
Al evaluar H99 con las distintas concentraciones de hierro, se evidencio aumento
del tamaño capsular post- infección respecto al medido pre-infección en la cepa con
5 pM lo cual puede estar relacionado al igual que la cepa sin hierro a la exposición
dentro del hospedero debido a que el aporte de hierro in-vitro no es significativo,
66
esto no se ve reflejado en las cepas con 50 y 500 pM, las cuales mantuvieron un
valor de tamaño capsular post- infección cercano al medido pre-infección, lo cual se
puede asociar al mayor aporte de hierro realizado in- vitro que favoreció la
adaptación de esta cepa en el hospedero.
Posiblemente la alta virulencia de C. neoformans var. grubii esté relacionada con la
expresión de una cápsula de gran tamaño que le permita evadir la respuesta inmune
del hospedero, en este caso los hemocitos de G. mellonella, generando así mayor
patogenicidad al producir mortalidad en los primeros días de infección (Figura 21).
Estos resultados al ser relacionados con la supervivencia de G. mellonella, evaluada
en el objetivo 4 , corroboran lo mencionado anteriormente ya que la cepa H99 sin
hierro en el día 3 presento un pico de muerte según las curvas de supervivencia,
día en el que se determinó un promedio capsular de 2 .1 pm.
La misma situación se presentó con la cepa H99 con 5 pM y 500 pM de hierro, las
cuales mostraron un pico de mortalidad el día 3 y 2 respectivamente, donde se
determinó un promedio de tamaño capsular de 1,5 pm para ambas.
Por último la cepa H99 con 50 pM de hierro, que mostro un pico de mortalidad el
día 3, pero contrario a las demás condiciones evaluadas, este día presento el
promedio capsular más bajo, que fue de 1,3 pM, siendo mayor en el día 4 (1,6 pM)
pero con un bajo pico de mortalidad, por lo cual se tendría que tener en cuenta otros
factores de virulencia diferentes al evaluado, que puedan estar interviniendo en la
patogenicidad y por ende en la muerte de las larvas.
67
Figura 21. Tamaño capsular de C. neoformans extraído de macerado de larvas
muertas post-infección. A) Cepa H99 (sin contacto con FeCl3). B) Cepa H99 (5 pM
FeCla). C) Cepa H99 (50 pM FeCla). D) Cepa H99 (500 pM FeCl3)
En la cepa JEC21 no se observaron cambios en el tamaño capsular pre y post
infección, ni con las diferentes concentraciones de FeCla, esto sugiere la ausencia
de modulación de este elemento en el tamaño capsular (Figura 21), sin embargo al
relacionar los datos obtenidos en este objetivo con la supervivencia de G. mellonella
evaluada en el objetivo 4, en el cual hubo una marcada reducción de la sobrevida
del modelo de infección con la concentración de 500 pM, se puede inferir la
modulación del hierro en otros factores de virulencia diferentes al evaluado en este
estudio, lo cual conllevo al aumento de mortalidad larval con esta concentración.
La ausencia de cambios en el tamaño capsular, podría facilitar la fagocitosis de las
levaduras por parte de los hemocitos de G. mellonella retrasando así el inicio de
mortalidad y por tanto aumentando la sobrevivencia de las larvas.
68
Para evaluar la reducción de la supervivencia de las larvas con la concentración de
500 pM en C. neoformans var. neoformans (JEC21) es necesario contemplar otros
factores de virulencia diferentes a la cápsula que es el objetivo de este ensayo.
Figura 22. Tamaño capsular de C. neoformans extraído de macerado de larvas
muertas post-infección. A) Cepa JEC21 (sin contacto con FeCb). B) Cepa JEC21 (5
pM FeCl3). C) Cepa JEC21 (50 pM FeCb). D) Cepa JEC21 (500 pM FeCb).
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CONCLUSIONES
• La concentración basal del hierro a partir de muestras de hemolinfa no fue
posible determinarla con el método Iron-FZ.
• El medio mínimo permitió el crecimiento normal de las dos cepas empleadas
en este estudio y la determinación de la concentración de hierro máxima a
utilizar.
• La variabilidad en la cuantificación de hierro a partir del medio mínimo no
permitió establecer la cantidad de hierro consumido por el microorganismo.
• Con la cepa H99 considerada de alta virulencia, se observó un bajo
porcentaje de supervivencia en G. mellonella, lo que confirma su alta
patogenicidad. Además al pre incubar esta cepa con 500uM de hierro el pico
de mortalidad disminuyo del día 3 (sin hierro) al día 2.
• En la cepa H99 sin suplemento de hierro, se encontró relación entre los picos
de muerte en la curva de supervivencia de G. mellonella y el aumento del
tamaño capsular medido en dichos días, lo cual asocia la expresión de este
factor de virulencia en la evasión del sistema inmune del hospedero.
• Para la cepa JEC21 no se observó aumento del tamaño capsular bajo
ninguna condición evaluada.
• En la cepa JEC21 se logró modular la patogenicidad con la mayor
concentración de FeCl3 empleada en el estudio (500 pM), dando como
resultado un porcentaje de sobrevivencia en G. mellonella del 35%.
• Teniendo en cuenta que C. neoformans es el principal agente etiológico de
criptococosis en personas inmunocomprometidas (95,6% C. neoformans var.
grubii, y 1% a C. neoformans var. neoformans) es importante que basados
en los resultados de este estudio, en el cual se presentó un marcado aumento
de virulencia en la cepa JEC21 con 500 pM y para H99 con 500 pM en
menor proporción, se implementen concentraciones adecuadas de
suplementos de hierro, con el fin de prevenir en gran parte estas infecciones
oportunistas.
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RECOMENDACIONES
• Es importante contemplar nuevos métodos en la medición de hierro en la
hemolinfa de G. mellonella que brinden resultados óptimos, dados por la
reducción significativa las posibles interferencias.
■ Espectrometría de absorción atómica.
• Dada las interferencias que pueden presentar los lípidos en la cuantificación
del hierro se recomienda utilizar acetato de etilo para la remoción de lípidos
de la hemolinfa.
71
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