Evaluación de las cepas Bacillus subtilis EA-CB0015 y ...
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Evaluación de las cepas Bacillus subtilis EA-CB0015 y Bacillus amyloliquefaciens EA-CB0959 sobre cuatro hongos patógenos de arroz Luisa María Valencia Riascos Asesor: I.A. Msc Juan José Arroyave Toro Co-Asesora: Dr. Valeska Villegas Escobar Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Bióloga Departamento de Ciencias Universidad EAFIT Febrero 2019
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Evaluación de las cepas Bacillus subtilis EA-CB0015 y Bacillus
amyloliquefaciens EA-CB0959 sobre cuatro hongos patógenos de arroz
Luisa María Valencia Riascos
Asesor:
I.A. Msc Juan José Arroyave Toro
Co-Asesora:
Dr. Valeska Villegas Escobar
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Bióloga
Departamento de Ciencias
Universidad EAFIT
Febrero 2019
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Dedicatoria
A mi familia, en especial a mi madre, por ser el motor que me impulsa a seguir adelante
y la mayor alegría de mi vida.
iii
Agradecimientos
A Dios por acompañarme en todo momento y haberme dado todas las bendiciones que hay en mi
vida.
A mi asesor Juan José Arroyave y a mi co-asesora Valeska Villegas por toda su paciencia, ayuda
y asesoramiento que hicieron posible la culminación de este proyecto.
A mi familia y amigos por acompañarme y motivarme durante todo mi proceso de formación
universitaria.
A la Universidad EAFIT por el conocimiento y los espacios de aprendizaje brindados.
Este trabajo fue posible gracias a los contratos 166 y 139 suscritos con el Ministerio de Medio
Ambiente y Desarrollo Territorial en las categorías "Contrato de acceso a Recursos Genéticos y
Productos Derivados de la Investigación Científica" y "Contrato de Acceso a Recursos Géneticos
y Productos Derivados con fines Comerciales", respectivamente.
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Resumen
El arroz (Oryza sativa) es un cultivo de gran importancia a nivel mundial, puesto que
además de ser la principal fuente de alimento para la mitad de la población humana y tener un
alto valor nutricional, también representa la mayor fuente de ingresos en muchos países en
desarrollo. Sin embargo, este cultivo es susceptible a sufrir pérdidas en su producción debido a
condiciones climáticas adversas, plagas, enfermedades, entre otros.
En el presente trabajo se muestran los resultados de una investigación con cuatro hongos
fitopatógenos de arroz Pyricularia oryzae, Helmintosporium oryzae, Rhizoctonia solani, y
Gaeunmannomyces graminis y las cepas de Bacillus subtilis EA-CB0015 (Bs15) y Bacillus
amyloliquefaciens EA-CB0959 (Ba959) como alternativa para su control. Se utilizaron las
células a nivel in vitro de Bs15, Ba959 y su combinación (B15-959) para evaluar el efecto
antagónico, mostrando un mayor efecto inhibitorio la cepa Ba959 o la combinación de ambas en
H. oryzae, R. solani y G. graminis; mientras que el hongo P. oryzae mostró una inhibición igual
para todos los tratamientos. También se evaluó el Sobrenadante Libre de Células (SLC) de Bs15,
Ba959 y B15-959 creciendo sumergido en medio D, óptimo para la producción de lipopéptidos;
aquí los tratamientos Ba959 y B15-959 presentaron mayor porcentaje de inhibición para los
hongos H. oryzae, R. solani y G. graminis. Para el ensayo in vivo se evaluó el efecto de las
células y los SLCs en el peso seco de la raíz, brote y porcentaje del tamaño de la lesión de G.
graminis en plantas de arroz. El tratamiento de sobrenadante B15-959 mostró diferencias
significativas en el peso del brote, que fue similar al del control absoluto, con plantas sanas, y el
porcentaje de tamaño de la lesión, que fue el menor de todos los tratamientos.
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Tabla de Contenidos
Introducción .................................................................................................................................... 1 Marco Teórico ................................................................................................................................. 3
Generalidades del arroz (Oryza sativa)....................................................................................... 3
Hongos patógenos que afectan el cultivo de arroz...................................................................... 5 Tizón del Arroz – Pyricularia oryzae ..................................................................................... 5 Helmintosporosis o mancha parda - Helminthosporium oryzae ............................................. 7 Añublo de la vaina – Rhizoctonia solani ................................................................................ 9 Mancha naranja o mal del pie – Gaeumannomyces graminis............................................... 11
Control biológico de enfermedades en plantas ......................................................................... 13 Familia surfactina.................................................................................................................. 14 Familia iturina ....................................................................................................................... 15
Familia fengicina .................................................................................................................. 15
Justificación .................................................................................................................................. 17 Objetivos ....................................................................................................................................... 18
Objetivo General ....................................................................................................................... 18 Objetivos específicos ................................................................................................................ 18
Metodología .................................................................................................................................. 19
Microorganismos utilizados y activación ................................................................................. 19 Evaluación del antagonismo de Bs15, Ba959 y B15-959 ......................................................... 20
Evaluación del sobrenadante libre de células de Bs15, Ba959 y B15-959 ............................... 21
Purificación de lipopéptidos de Bs15, Ba959 y B15-959 ......................................................... 22
Evaluación de las células y sobrenadantes de Bs15, Ba959 y B15-959 sobre el hongo G. graminis (pruebas en invernadero) ........................................................................................... 23
Análisis estadístico.................................................................................................................... 24 Resultados ..................................................................................................................................... 26
¿Hay diferencia en la inhibición de los cuatro hongos tratados con las células de Bs15, Ba959 y B15-959? ................................................................................................................................ 26 ¿Hay diferencia en la inhibición de los cuatro hongos con los sobrenadantes de Bs15, Ba959 y B15-959? ................................................................................................................................... 28 ¿Hay diferencia en la producción de lipopéptidos de Bs15, Ba959 y B15-959 al crecer en medio D? ................................................................................................................................... 29 ¿Hay diferencia en el peso del brote y la raíz de plantas de arroz infectadas con G. graminis al ser tratadas con Bs15, Ba959 y B15-959? ................................................................................. 30 ¿Hay diferencia en el porcentaje de área enferma de plantas de arroz infectadas con G. graminis al ser tratadas con Bs15, Ba959 y B15-959?.............................................................. 36
Discusión....................................................................................................................................... 37 Conclusiones ................................................................................................................................. 41 Perspectivas a futuro ..................................................................................................................... 42 Lista de referencias ....................................................................................................................... 43
vi
Lista de tablas
Tabla 1. Microorganismos utilizados para las pruebas. ................................................................ 20 Tabla 2. Tratamientos utilizados en los ensayos de invernadero. ................................................. 23 Tabla 3. Cantidad de lipopéptidos producidos en cada cultivo. ................................................... 30
vii
Lista de figuras
Figura 1. Ciclo de vida de Pyricularia oryzae y lesiones en hojas de arroz provocadas por Pyricularia oryzae .................................................................................................................. 6 Figura 2. Ciclo de infección de Helminthosporium oryzae y lesiones en hojas provocadas por el hongo ............................................................................................................................ 8 Figura 3. Lesiones en arroz provocadas por Rhizoctonia solani y ciclo de vida del hongo . 10 Figura 4. Ciclo de vida de Gaeumannomyces graminis y lesiones provocadas por el hongo en los tallos ........................................................................................................................... 12 Figura 5. Estructura de los compuestos pertenecientes a las familias surfactina, iturina y fengicina ................................................................................................................................ 15
Figura 6. Montajes para las pruebas de antagonismo con la circunferencia de Bs15 (A) y el sobrenadante de Ba959 (B) sobre P. oryzae. ........................................................................ 21 Figura 7. Plantas de arroz en el invernadero ......................................................................... 25
Figura 8. Ensayo de antagonismo para P. oryzae. Control (A), células de Ba959 (B) y células de Bs15 (C). .............................................................................................................. 27 Figura 9. Porcentaje de inhibición de Bs15, B15-959 y Ba959 sobre P. oryzae, H. oryzae, R. solnai y G. graminis a nivel in vitro ..................................................................................... 27 Figura 10. Ensayo de antagonismo con SLC de Bs15, Ba959 y B15-959 para G. graminis comparando el control (A), el tratamiento Bs15 (B), el tratamiento Ba959 (C) y el tratamiento B15-959 (D) ....................................................................................................... 28 Figura 11. Porcentaje de inhibición de los SLCs de Bs15, B15-959 y Ba959 sobre P. oryzae, H. oryzae, R. solani y G. graminis a nivel in vitro ............................................................... 29
Figura 12. Plantas de arroz A) Control absoluto durante la última semana del ensayo. B) Control con hongo durante la segunda semana del ensayo. C) Control con hongo durante la última semana del ensayo ..................................................................................................... 31
Figura 13. Planta del tratamiento de células de Bs15; planta del tratamiento de células de B15-959 ................................................................................................................................. 32
Figura 14. Comparación entre las plantas del control absoluto (A), el tratamiento de sobrenadante de B15-959 (B) y el control negativo (C) ....................................................... 33 Figura 15. Peso seco de la raíz de plantas de arroz infectadas artificialmente con G. graminis. Ensayo 1 en invernadero. ...................................................................................... 34
Figura 16. Peso seco del brote de plantas de arroz infectadas artificialmente con G. graminis. Ensayo 1 en invernadero. ...................................................................................... 34 Figura 17. Peso seco de la raíz de plantas de arroz infectadas artificialmente con G. graminis. Ensayo 2 en invernadero. ...................................................................................... 35 Figura 18. Peso seco del brote de plantas de arroz infectadas artificialmente con G. graminis. Ensayo 2 en invernadero. ...................................................................................... 35 Figura 19. Área enferma de las plantas de arroz infectadas con G. graminis. Ensayo 2 en invernadero. .......................................................................................................................... 36
1
Introducción
La importancia del arroz como cultivo comprende desde lo económico hasta lo
social y cultural, puesto que este alimento es consumido por más de la mitad de la población
mundial y a su alrededor se han desarrollado culturas, dietas y la economía de muchos países en
desarrollo (Gnanamanickam, 2009c), como China, India e Indonesia, que son los principales
productores de este alimento (FAO, 2018b). Al igual que muchos otros cultivos, el arroz se
encuentra a la merced de variadas condiciones ambientales y fisiológicas que lo afectan y lo
vuelven susceptible a cerca de 50 enfermedades causadas por hongos, bacterias, parásitos
(nematodos) y virus (Mew & Gonzales, 2002). Entre estos, algunos de los que generan mayor
preocupación tanto en Colombia como en el resto de países productores son Pyricularia oryzae,
Helminthosporium oryzae, Rhizoctonia solani y Gaeumannomyces graminis, causantes de las
enfermedades conocidas como tizón del arroz, mancha parda o helmintosporosis, añublo de la
vaina de arroz y mancha naranja o mal del pie, respectivamente; puesto que en condiciones
propicias para el desarrollo de sus respectivas enfermedades pueden llegar a acabar con el 50%
del cultivo (Gnanamanickam, 2009b; Jatoi et al., 2016; Lee & Rush, 1983).
Estos microorganismos producen diferentes tipos de lesiones en diferentes partes de la
planta y en cualquiera de sus estadios de desarrollo, además de presentar una amplia distribución
que hace más difícil su control. Generalmente las estrategias para el manejo de estas
enfermedades se basan en fungicidas químicos como triciclazol, propiconazol o validamicina
que, aunque resultan efectivos, su uso excesivo termina por crear resistencia en los organismos
patógenos, además de generar residuos indeseados que afectan la salud y el medio ambiente
2
(Khalili et al., 2012), motivo por el cual muchos de ellos ya han sido prohibidos en varios países
(The Commission of the European Communities, 2002).
Como alternativas para el manejo de estas enfermedades, algunas investigaciones se han
centrado en microorganismos que produzcan metabolitos secundarios con actividad contra
hongos fitopatógenos. Los metabolitos secundarios son compuestos que no son esenciales para el
crecimiento normal de un organismo pero cuentan con funciones adaptativas sirviendo como
compuestos de defensa o señalización en interacciones ecológicas (Osbourn, 2010). Aunque se
ha encontrado evidencia de la formación de estas moléculas en los genomas de ciertas especies
de arqueas, la producción de metabolitos secundarios se ha estudiado de forma más detallada en
plantas y bacterias (S. Wang & Lu, 2017), y su alta variabilidad les permite ser utilizados como
armas competitivas contra bacterias, hongos, plantas e insectos, como agentes de simbiosis,
hormonas sexuales o incluso efectores de diferenciación (Demain & Fang, 2000).
Entre los organismos que producen metabolitos secundarios, las especies del género
Bacillus, principalmente Bacillus subtilis, y Pseudomonas han demostrado un gran potencial
antifúngico y se han convertido en el centro de interés para desarrollar una nueva forma de
control de enfermedades en cultivos (Raaijmakers et al., 2010).
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Marco Teórico
Generalidades del arroz (Oryza sativa)
El arroz (Oryza sativa) se considera una planta anual semiacuática en climas templados y
subtropicales, aunque en climas tropicales puede sobrevivir como perenne; su ciclo de vida se
puede dividir en dos etapas: la fase vegetativa, que incluye los estadios de germinación, plántula
y macollamiento; y la fase reproductiva, con el inicio del primordio floral y la panícula
(Olmos, 2007). Cuando están maduras, las plantas poseen un tallo principal con cierta cantidad
de macollos, los cuales pueden desarrollar su propio sistema de raíces y ser independientes del
brote original, la altura de las plantas puede variar de 0.4 m a 1 m y el número de macollos puede
variar de 3 a 15 aunque no todos son fértiles (Olmos, 2007). El periodo de maduración de los
granos de arroz varía entre 15-40 días dependiendo de la temperatura y es el momento en el que
el grano incrementa su tamaño y peso acumulando almidón y azúcares, aunque pueden
presentarse diferencias en cuanto a los ciclos de crecimiento y desarrollo dependiendo de la
variedad que se siembre, sobretodo en la duración de la fase vegetativa (Olmos, 2007).
El arroz es un cultivo con una gran relevancia a nivel mundial, debido a que cerca del
50% de las calorías consumidas por la población humana provienen del trigo, el maíz y el arroz,
y es este último el que proporciona el 21% de energía y el 15% de proteína para los seres
humanos (Gnanamanickam, 2009c); sin embargo no todo el arroz producido se utiliza para
alimentar a la población humana, puesto que según datos de la FAO (Food and Agriculture
Organization of the United Nations), entre 2016 y 2017 de las 501.2 millones de toneladas de
arroz producidas, 400.6 se utilizaron para alimentación humana y 17.8 para alimentación de
animales (FAO, 2018b). La importancia nutricional del arroz es otro factor importante a la hora
4
de considerarlo como un alimento necesario para garantizar la seguridad alimentaria, puesto que
este es rico en carbohidratos y es una buena fuente de vitaminas del complejo B; una porción de
300 g de arroz diario suple del 2-5% de la ingesta recomendada de calcio, folato y hierro; del 9-
17% de tiamina (Vitamina B1), riboflavina (Vitamina B2) y niacina (Vitamina B3); y el 21% de
zinc (Kennedy, Burlingame, & Nguyen, n.d.).
Históricamente el arroz empezó a cultivarse hace aproximadamente 6.500 años en los
valles del sur y sureste de Asia (Gnanamanickam, 2009c), donde actualmente se cultiva cerca del
90% de arroz consumido en el mundo, con China, India e Indonesia como los mayores
productores de la región (FAO, 2018b); en América se produce el 5%, el 4% en África, y el 1%
en el resto del mundo (Federación Nacional de Arroceros (FEDEARROZ), 2018a). A excepción
de Canadá, el arroz es un cultivo que está presente en todos los países del continente americano,
donde Brasil, Estados Unidos, Colombia, Perú, Argentina, Ecuador y Uruguay son los mayores
productores de grano por área, mientras que los mayores consumidores de este alimento son
Cuba (72 kg), Costa Rica (53 kg), Panamá (60 kg), República Dominicana (50 kg), Ecuador (47
kg), Haití (47 kg), Perú (45 kg) y Brasil (43 kg). En Colombia, el arroz es el tercer producto
agrícola en extensión cultivado después del café y el maíz, con 595.375 hectáreas sembradas
durante el año 2017 (Federación Nacional de Arroceros (FEDEARROZ), 2018b), y de acuerdo
con el último Censo Nacional Arrocero, realizado en 2016, es posible distinguir cinco zonas
arroceras en el territorio: Centro, Llanos orientales, Bajo Cauca, Costa norte y Santanderes,
dentro de las cuales los departamentos de Casanare, Tolima y Meta fueron los que tuvieron una
mayor participación en la producción de ese año con 28.6%, 23.5% y 13.8%, respectivamente
(Federación Nacional de Arroceros (FEDEARROZ), 2017).
5
Por todo lo mencionado anteriormente el arroz es uno de los cereales de mayor
importancia para mantener la seguridad alimentaria. La FAO estima que a nivel mundial 40
países, de los cuales 31 están en África, necesitan ayuda externa para suplir sus necesidades de
alimentación y cita como responsables de esta situación factores como: 1) un déficit en la
producción o suministro de alimentos por la pérdida de cosechas o desastres naturales; 2) falta de
acceso por parte de la población debido a ingresos muy bajos o precios de alimentos
excesivamente altos; y 3) conflictos internos que provocan la afluencia de desplazados o
refugiados a zonas que no pueden suplir sus necesidades alimentarias (FAO, 2018a). A estas
pérdidas de cultivos debido a condiciones sociales o de carácter abiótico se suman aquellas
provocadas por animales, malas hierbas y patógenos que, se estima, son responsables de entre el
20% y 40% de pérdidas en la producción agrícola global (Ficke et al., 2012). El arroz no es la
excepción, ya que este puede ser susceptible al ataque de varias plagas y hongos patógenos entre
los cuales se encuentran Pyricularia oryzae, Helminthosporium oryzae, Rhizoctonia solani y
Gaeumannomyces graminis.
Hongos patógenos que afectan el cultivo de arroz
Tizón del Arroz – Pyricularia oryzae
El hongo Pyricularia oryzae (forma sexual Magnaporthe oryzae) provoca la enfermedad
más común del arroz y una de las que genera más pérdidas de este cultivo, conocida como “tizón
del arroz” (Talbot, 2003); la enfermedad se encuentra reportada en cerca de 85 países y pueden
presentarse pérdidas de hasta 50% de los cultivos (Gnanamanickam, 2009b). Este hongo
ascomiceto es considerado hemibiotrófico puesto que, durante la etapa inicial de infección
necesita de tejido vivo para posteriormente necrosar el tejido vegetal en el que se encuentra, pero
6
continúa alimentándose de él para sobrevivir y reproducirse (Talbot, 2003). La actividad
patógena producida por el hongo provoca en la planta unas lesiones características en forma
elipsoidal y de colores que van desde el verde claro hasta el verde oscuro con bordes café, dichas
manchas se observan después de los 5 o 7 días de la inoculación y se pueden encontrar a lo largo
de las hojas y el tallo, e incluso en las raíces (Ribot et al., 2008).
Figura 1. Ciclo de vida de Pyricularia oryzae (Dean et al., 2005); lesiones en hojas de arroz provocadas por Pyricularia oryzae (Agrios, 2005).
El ciclo de infección de Pyricularia oryzae empieza cuando una de sus esporas se adhiere
a la superficie de la hoja de arroz y seguidamente forma una célula especializada para la
infección llamada apresorio, la cual facilita su acceso al tejido vegetal provocando una gran
presión de turgencia en la célula infectada (Dean et al., 2005). Una vez ha penetrado el tejido del
hospedero, el hongo desarrolla hifas que se esparcen por el interior de la célula y posteriormente
alcanzan las células vecinas (Ribot et al., 2008), este proceso de infección dura tan solo 24 horas
(Gupta & Chattoo, 2007) y durante este tiempo la planta activa mecanismos de defensa
regulados por genes aún no identificados; sin embargo, se desconoce las causas precisas de por
qué dichos mecanismos terminan fallando (Ribot et al., 2008)
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Actualmente, el tratamiento principal para la enfermedad del tizón de arroz es el control
químico, que implica el uso de fungicidas, como triciclazol, fenoxanil, probenazole; o
antibióticos como blasticidina o kasugamicina; sin embargo este método químico de control no
siempre es ideal, puesto que puede traer consecuencias negativas para el ambiente y la salud
humana, además de promover el surgimiento de cepas resistentes debido a su uso constante
(Gnanamanickam, 2009b). También se ha evaluado la posibilidad de usar otros organismos como
control biológico, entre los cuales destacan especies de Pseudomonas y Bacillus
(Gnanamanickam, 2009a).
Helmintosporosis o mancha parda - Helminthosporium oryzae
Un hongo ascomiceto que genera gran preocupación es Helminthosporium oryzae (syn.
Bipolaris oryzae, forma sexual Cochliobolus miyabeanus) (Mycobank, 2016a), que provoca la
enfermedad conocida como Helmintosporosis o mancha parda, considerada como la enfermedad
más devastadora para el arroz en el mundo, debido a que éste microorganismo fue el responsable
de la pérdida de producción durante los años 1942-1943 en la región de Bengala, India en un
episodio conocido como la “Gran hambruna de Bengala”; cerca de 2 millones de personas
murieron debido a la escasez de alimento (Padmanabhan, 1973). H. oryzae puede provocar entre
el 7- 45% de pérdidas en los cultivos de arroz (Jatoi et al., 2016), puesto que causa infección en
cualquiera de las etapas de crecimiento de la planta y está presente en todas las áreas donde se
cultiva este cereal en el mundo (Khalili et al., 2012), aunque ocurre principalmente en ambientes
donde el suministro de agua es escaso y hay desequilibrio en los nutrientes del suelo,
especialmente nitrógeno (Barnwal et al., 2013); estas condiciones ambientales también favorecen
otras enfermedades, como la del añublo de la vaina de arroz provocada por Rhizoctonia solani
8
(Ou, 1985) y el tizón del arroz, provocada por Pyricularia oryzae (Savary et al., 1997).
Figura 2. Ciclo de infección de Helminthosporium oryzae y lesiones en hojas provocadas por el hongo (Development of e-courses for B. Sc Agriculture, n.d.)
La helmintosporosis puede aparecer en diferentes partes de la planta como el coleóptilo,
las hojas y las vainas foliares; en las hojas la enfermedad se reconoce por la presencia de
manchas café con centro gris o blanco de forma cilíndrica u ovalada y usualmente con halo
amarillo, aunque las manchas más jóvenes son pequeñas, circulares y de color café oscuro o con
tonalidades púrpura (Sunder et al., 2014). El hongo produce micelio inter e intracelular de color
café grisáceo o café oscuro en los tejidos afectados, aunque cuando se cultiva en laboratorio su
color puede ser gris o negro y se ha reportado que puede producir fitotoxinas como ergosterol y
cochliobolin (Sunder et al., 2014), estas fitotoxinas pueden ser específicas para cada huésped y
se encargan de suprimir el mecanismo de defensa en la planta al interferir en la producción de
fenoles (Vidhyasekaran et al., 1986).
9
Para el tratamiento de la helmintosporosis se ha comprobado que existen muchos fungicidas que
funcionan bien contra la enfermedad como el hexaconazol y el propiconazol, los cuales
demuestran ser más efectivos rociándose en las hojas y no como tratamiento para las semillas o
las raíces (Sunder et al., 2014). En cuanto al control biológico como tratamiento alternativo,
especies de Pseudomonas y Trichoderma han demostrado ser eficaces para suprimir la
enfermedad a través de micoparasitismo o compitiendo por nutrientes con el hongo, además
mejoran la inmunidad de la planta (Khalili et al., 2012; Singh et al., 2005); las especies de
Bacillus también han demostrado inhibición para el crecimiento de H. oryzae además de ser
promotoras del crecimiento en plantas (Saechow et al., 2018).
Añublo de la vaina – Rhizoctonia solani
El hongo basidiomiceto Rhizoctonnia solani (Mycobank, 2016c) es el causante de la
enfermedad conocida como “añublo de la vaina de arroz”, considerada también como una de las
enfermedades más importantes de este cultivo (Ou, 1985), puesto que las pérdidas atribuidas a
esta enfermedad están entre el 4% y el 50% (Lee & Rush, 1983).
Este patógeno habita en el suelo y se presenta como un conjunto de cepas que varían en
su morfología y virulencia, lo que le permite tener un amplio rango de hospederos entre los que
se encuentran plantas pertenecientes a 32 familias y 188 géneros (Gangopadhyay & Chakrabarti,
1982) muchas de ellas con importancia comercial como la cebada, lechuga, tomate, sorgo, maíz,
entre otros (Chen et al., 2012). En el caso del arroz, cuando hay condiciones favorables para la
enfermedad, el micelio se esparce por el suelo y continúa creciendo dentro del tejido vegetal
desde la base de la planta (propagación vertical) y puede llegar al resto del cultivo a través de las
hojas cuando hay contacto de follaje enfermo con follaje sano (propagación horizontal) (Kozaka,
10
1961; Rabindran & Vidhyasekaran, 1996); los síntomas de la enfermedad empiezan como
lesiones en las hojas más bajas con forma ovalada o elíptica de color gris verdoso con un ancho
de 0.5 cm y largo de 1-2.5 cm, en estados avanzados de la infección las lesiones se decoloran y
tienen un borde café irregular (Persaud et al., 2019).
Figura 3. Lesiones en arroz provocadas por Rhizoctonia solani (Lee & Rush, 1983) y ciclo de vida del hongo (The American Phytopathological Society, 2006)
El control de esta enfermedad es difícil debido a su alta variabilidad genética (Guleria et
al., 2007; Yugander et al., 2014) y a la capacidad que tiene R. solani de sobrevivir en forma de
esclerocios en el suelo por largos periodos de tiempo entre una temporada de cosecha y otra
(Taheri & Tarighi, 2010). Hasta la fecha se ha encontrado que la mayoría de cultivos de arroz
plantados en el mundo son susceptibles a este patógeno y el control químico con fungicidas es
una medida importante para su manejo (Prasad & Eizenga, 2008). En China, por ejemplo, el
fungicida más utilizado es Jinggangmycin que tiene como ingrediente activo la validamicina
producida por Streptomyces hygroscopicus (Chen et al., 2012), sin embargo, en algunas
11
provincias de este país se ha reportado resistencia de R. solani a este compuesto (C. Zhang et al.,
2009), y la Unión Europea ha prohibido el uso de validamicina debido a su posible efecto dañino
para la salud y el medio ambiente (The Commission of the European Communities, 2002).
Alternativas para el control químico de R. solani incluyen fungicidas SDHI (Inhibidores de
succinato deshidrogenasa) como thifluzamide, carboxin, benodanil, flutolanil, entre otros (Chen
et al., 2012); y en cuanto al control biológico se han realizado ensayos utilizando extractos de
plantas, fungicidas de nueva generación como Antracol, Nativo, Cyclpos, y especies de Bacillus
(Persaud et al., 2019) u hongos micoparásitos como los pertenecientes al género Trichoderma
(Agrios, 2005).
Mancha naranja o mal del pie – Gaeumannomyces graminis
La enfermedad conocida como mancha naranja o “mal del pie” es causada por el hongo
ascomiceto Gaeumannomyces graminis (Mycobank, 2016b) y fue reportada por primera vez en
algunos estados de Brasil durante la temporada de crecimiento de 1997-1998 (Prabhu & Filippi,
2002). Existen cuatro variedades de esta especie de hongo que atacan diferentes hospederos:
Gaeumannomyces graminis var. tritici, el cual provoca enfermedades en trigo y cebada,
Gaeumannomyces graminis var. avenae que ataca la avena, Gaeumannomyces graminis var.
maydis, cuyo hospedero es el maíz y Gaeumannomyces graminis var. graminis que afecta al
arroz (Freeman & Ward, 2004; Peixoto et al., 2013), las cuatro variedades se pueden diferenciar
morfológicamente por el tamaño de sus ascosporas e hifopodios (Mathre, 1992). Aunque las tres
variedades generan pérdidas en los cultivos mencionados, curiosamente, la mayoría de la
información disponible sobre la biología del género Gaeumannomyces, las características de las
enfermedades que produce y su control se han reportado mayoritariamente para la variedad tritici
12
(Prabhu & Filippi, 2002), y en el caso de la variedad graminis, su importancia como agente
causal de pérdidas del cultivo de arroz normalmente se pasa por alto, y estas se atribuyen a
Rhizoctonia solani (añublo de la vaina) y Sarocladium oryzae (pudrición de la vaina del arroz)
(Peixoto et al., 2013).
Figura 4. Ciclo de vida de Gaeumannomyces graminis (Vukson - Van Beek, 2010). Lesiones provocadas por el hongo en los tallos (Vivas & Intriago Mendoza, 2012)
Los síntomas del mal del pie se reconocen al principio como lesiones de café oscuro o
negras en la base de la vaina, y las raíces se tornan de color oscuro debido a la intensa necrosis
en el tejido causada por la infección del hongo (Prabhu & Filippi, 2002). G. graminis coloniza
las raíces del arroz produciendo dos tipos de hifas conocidas como hifas corredoras e hifas
infecciosas; las hifas corredoras son cafés, septadas, de paredes gruesas y a menudo crecen en la
superficie de las raíces, mientras que las hifas infecciosas tienen paredes celulares delgadas y
crecen al interior del tejido del hospedero (Peixoto et al., 2013). Se ha encontrado que la
13
virulencia de G. graminis está asociada a la producción de melanina-DHN en las paredes
celulares de sus hifas (Frederick et al., 1999), este tipo de pigmentos ofrece protección contra el
estrés ambiental como la radiación UV y los mecanismos de defensa de la planta, además la
melanina es requerida para mantener la presión de turgencia necesaria para penetrar las células
del hospedero (Kubo & Furusawa, 1991).
Para controlar la enfermedad de “mal del pie” normalmente se recurre a fungicidas a base
de Cyproconazole y Propiconazole (Corporación Arrocera Nacional, 2013), y como alternativa
de control biológico se han utilizado especies de Pseudomonas (M. Yang et al., 2011), y
Trichoderma (Tirado Ospina & Higuera Acosta, 2018).
Control biológico de enfermedades en plantas
El exceso de fungicidas y otros compuestos químicos puede traer consecuencias
negativas para la salud y el ambiente, por lo que el uso de bio-pesticidas con microorganismos
benéficos se considera uno de los métodos más prometedores para el manejo de enfermedades en
cultivos (Ongena & Jacques, 2007). Las especies de Bacillus son reconocidas por producir
metabolitos secundarios que son objeto de estudios químicos debido a su gran variabilidad y las
oportunidades que ofrecen para inhibir microorganismos patógenos, entre estos compuestos
destacan los lipopéptidos, que confieren ventaja a las bacterias en diferentes nichos ecológicos,
al permitir a las bacterias una mejor utilización de sustratos hidrofóbicos específicos como el
almidón, o hidrocarburos como hexadecano, octano, antraceno, pireno, entre otros (Mukherjee &
Das, 2005).
Los lipopéptidos cuentan con variadas funciones biológicas debido a su capacidad de
irrumpir en la estructura de la membrana celular; entre estas funciones se encuentra
14
principalmente la actividad anti-fungica propiciada por las altas concentraciones de estos
compuestos; la actividad antiviral que se ha demostrado contra virus como el virus del bosque
Semliki, el virus del Herpes simple, el virus de la estomatitis vesicular, entre otros; e incluso
aplicaciones médicas gracias a su actividad anti-inflamatoria y anti-tumoral (Zhao et al.,
2017)(Zhao et al., 2017).
De manera particular la especie Bacillus subtilis, que se encuentra relacionada muy
cercanamente con la especie Bacillus amyloliquefaciens, es una de las especies más estudiadas
debido a sus lipopéptidos (Sansinenea & Ortiz, 2011). Estos compuestos están formados por una
cadena lipídica que puede estar unida a un oligopéptido cíclico o de cadena corta (Raaijmakers et
al., 2010) pueden clasificarse en tres familias teniendo en cuenta su tipo y secuencia de residuos
de aminoácidos, el tipo de ciclación y la longitud y ramificación de la cadena de ácidos grasos
(Ongena & Jacques, 2007).
Familia surfactina
Los compuestos miembros de esta familia son heptapéptidos interconectados que forman
la estructura cíclica de un anillo de lactona (Peypoux et al., 1999), que pueden clasificarse a su
vez en Surfactinas A, B y C de acuerdo a las diferencias en sus secuencias de aminoácidos
(Rodrigues et al., 2006). Debido a su naturaleza anfifílica pueden anclarse a las paredes de la
membrana celular e intervenir en su integridad al crear poros cuando se encuentra en altas
concentraciones, lo que les confiere actividad hemolítica, antibacterial y antiviral (Ongena &
Jacques, 2007). Algunos estudios han demostrado que las surfactinas son necesarias para la
colonización de las bacterias en las raíces de las plantas (Bais, 2004).
15
Figura 5. Estructura de los compuestos pertenecientes a las familias surfactina, iturina y fengicina (Ongena & Jacques, 2007)
Familia iturina
Los compuestos de esta familia son heptapéptidos con cadenas de 14 a 17 carbonos; y las
seis variantes principales dentro de esta familia son Iturina A y C, bacillomycin D, F y L y
mycosubtilin (Raaijmakers et al., 2010). Aunque tienen fuerte actividad hemolítica, se
diferencian de las surfactinas al demostrar una fuerte actividad antifúngica in vitro contra un
amplio rango de patógenos, poca actividad antibacterial y nada de actividad antiviral (Moyne et
al., 2011). El mecanismo para la actividad antifúngica está en la perturbación osmótica debido a
la formación de poros conductores de iones (Aranda et al., 2005). La iturina A ha demostrado ser
eficaz para controlar patógenos del suelo como R. solani (Asaka & Shoda, 1996), además de ser
el único tipo de lipopéptido producido por todas las cepas de Bacillus (Ahimou et al., 2000).
Familia fengicina
Estas moléculas son lipodecapéptidos con un anillo de lactona y cadenas de 14 a 18
carbonos que pueden ser saturadas o insaturadas; las dos variantes de fengicinas son Fengicina A
16
y B, también llamadas “Plipastatins” (Raaijmakers et al., 2010), aunque recientemente se
descubrió otra variante nombrada como Fengicina C (Villegas-Escobar et al., 2013). Las
fengicinas tienen menos actividad hemolítica que las iturinas y surfactinas, pero mantienen una
fuerte actividad antifúngica, especialmente contra hongos filamentosos (Koumoutsi et al., 2004);
su mecanismo de acción no es tan bien conocido, pero se sabe que también pueden intervenir en
la membrana celular alterando su estructura y permeabilidad (Deleu et al., 2005). Estos
compuestos han demostrado ser efectivos contra hongos patógenos como Fusarium
graminearum (J. Wang et al., 2007), Botrytis cinérea (Toure, Ongena, Jacques, Guiro, &
Thonart, 2004) y Podosphaera fusca (Romero et al., 2007). Las fengicinas, al igual que las
surfactinas pueden interactuar con las células vegetales promoviendo una respuesta inmune
(Ongena & Jacques, 2007) que se ha comprobado en muchos cultivos como tomate y frijol
(Ongena et al., 2007).
A pesar de su inmenso potencial para aplicaciones comerciales, ambientales y
terapéuticas el uso de estos compuestos es limitado debido a su alto costo de producción (Das et
al., 2008), por lo que varias estrategias como el diseño de biorreactores, optimización de medios
de cultivo, y el uso de desechos agroindustriales como materia prima para la fermentación se han
utilizado para tratar de mejorar la producción de este tipo de compuestos (Sansinenea & Ortiz,
2011).
17
Justificación
Las plantas en general contribuyen al 80% de la dieta de los seres humanos (FAO, 2017),
por lo que son necesarias para la seguridad alimentaria; esta puede entenderse como el acceso
continuo a comida nutritiva, segura, accesible y suficiente para todas las personas que permita
llevar una vida activa y saludable; sin embargo, las pestes y enfermedades representan una
amenaza para este objetivo, puesto que pueden dañar los cultivos y, en consecuencia reducir la
disponibilidad y el acceso a la comida, incrementando también su costo (FAO, 2017).
Aunque se siguen diversas estrategias para el manejo de enfermedades en plantas, el uso
continuo e indiscriminado de químicos provoca consecuencias indeseadas como la acumulación
de residuos tóxicos, el desarrollo de la resistencia en los patógenos a los fungicidas utilizados,
contaminación ambiental, amenazas a la salud de humanos y animales y un aumento en la
inversión para la protección del ambiente (Khalili et al., 2012). Es por este motivo que el control
biológico se ha convertido en una alternativa amigable con el ambiente, de larga duración y
efectiva para el manejo de enfermedades de plantas (Saechow et al., 2018), siendo las especies
del género Bacillus las que se consideran entre las más adecuadas para usarse como agentes de
control biológico por su capacidad de sintetizar compuestos como iturinas, surfactinas y
fengicinas, las cuales demuestran actividad antifúngica y antibacteriana contra diversos
fitopatógenos (Alvarez et al., 2011).
Investigar acerca del potencial de microorganismos como Bacillus subtilis y Bacillus
amyloliquefaciens para reducir el crecimiento de los hongos patógenos más dañinos para el
cultivo de arroz es un acercamiento para lograr el objetivo de la seguridad alimentaria sin
perjudicar el ambiente con exceso de químicos dañinos.
18
Objetivos
Objetivo General
Evaluar la actividad inhibitoria de las cepas Bacillus subtilis EA-CB0015 y Bacillus
amyloliquefaciens EA-CB0959 contra los patógenos de arroz Pyricularia oryzae,
Helminthosporium oryzae, Rhizoctonia solani y Gaeumannomyces graminis, mediante ensayos
de antagonismo in vitro e in vivo.
Objetivos específicos
Evaluar la acción individual de las cepas Bacillus subtilis EA-CB0015 y Bacillus
amyloliquefaciens EA-CB0959 a nivel in vitro sobre el crecimiento de los hongos
patógenos de arroz, mediante ensayos de antagonismo con el fin de determinar su
potencial inhibitorio.
Evaluar la acción individual de las cepas Bacillus subtilis EA-CB0015 y Bacillus
amyloliquefaciens EA-CB0959 en tejido vegetal sobre uno de los patógenos de arroz
aislados que hayan mostrado susceptibilidad a la bacteria.
Evaluar la acción conjunta de las cepas Bacillus subtilis EA-CB0015 y Bacillus
amyloliquefaciens EA-CB0959 a nivel in vitro e in vivo.
19
Metodología
Microorganismos utilizados y activación
Las cepas bacterianas utilizadas para la evaluación se mantuvieron conservadas en TSB +
20% glicerol a una temperatura de -80°C. Las cepas Bacillus subtilis EACB-0015 (Bs15) y
Bacillus amyloliquefaciens EACB-0959 (Ba959), se activaron en medio TSA (Agar tríptico de
soya, Thermo Scientific™, U.S.A) 50% y posteriormente se dejaron creciendo por 48 horas a
una temperatura de 30°C, previo a cualquier prueba.
Los hongos patógenos de arroz utilizados en este estudio P. oryzae, H. oryzae y G.
graminis fueron facilitados por el laboratorio de sanidad vegetal de la empresa Ecoflora Agro
S.A.S. El hongo R. solani EAHP-002 hace parte de la colección de la universidad EAFIT. Los
hongos fueron conservados en papel filtro a una temperatura de 4°C y activados en medio PDA
(Papa dextrosa agar, Thermo Scientific™, U.S.A).
La identificación molecular de los hongos se realizó por medio de la secuenciación de la
región 5.8S-ITS según la metodología reportada por Tapia-Tussell et al. (2008). Brevemente la
extracción del ADN se realizó con el Kit comercial Ultraclean® (Mo-Bio), siguiendo las
instrucciones del fabricante y la PCR se realizó con los primers universales ITS1 e ITS4 con un
volumen de la reacción total de 50 µL, los cuales contenían 25 ng del ADN genómico, 1x del
buffer de PCR, 0.2 mM de cada dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 µM de cada primer y 1U de la Taq
polimerasa. La amplificación del ADN se hizo en un termociclador T100 (BioRad, U.S.A) y el
programa consistió en una desnaturalización inicial a 94°C por un minuto, seguido de 30 ciclos
en las siguientes condiciones: 60s a 94°C, 2min a 58°C, 60s a 72°C y por último una fase final de
extensión de 5 min a 72°C. Los productos de la PCR (4 µL) fueron separados por medio de una
20
electroforesis en un gel de agarosa al 1%. La secuenciación de ADN se hizo con los dos primers
utilizados (ITS1 e ITS4) y los productos de la PCR fueron purificados y secuenciados por
Macrogen Inc. Corea.
Tabla 1. Microorganismos utilizados para las pruebas.
Microorganismo Cepa Planta donde fue aislado
Bacillus subtilis
Bacillus amyloliquefaciens
Pyricularia oryzae
Helminthosporium oryzae
Gaeumannomyces graminis
Rhizoctonia solani
EACB-0015
EACB-0959
ECO-001
ECO-002
ECO-003
EAHP-002
Banano
Banano
Arroz
Arroz
Arroz
Papa
Evaluación del antagonismo de Bs15, Ba959 y B15-959
Bs15 y Ba959 fueron inoculadas en PDA formando una circunferencia (∅: 6 cm) en cajas
Petri (∅: 9 cm). Luego discos de los diferentes hongos (∅: 5 mm) se pusieron en el centro de la
circunferencia y fueron incubados a 22°C. Para la impresión de las circunferencias bacterianas se
utilizaron cajas Petri de (∅: 6 cm) impregnadas de Bs15, Ba959 o la combinación de ambas B15-
959 (Figura 6A). Cada tratamiento contó con 3 réplicas y el porcentaje de inhibición se calculó
cuando el control (cada uno de los hongos patógenos creciendo en ausencia de las bacterias)
alcanzó el diámetro (∅: 6 cm):
21
% 𝐼 =𝐷. 𝐶 − 𝐷. 𝑇
𝐷. 𝐶× 100
Donde:
% I= Porcentaje de inhibición
D. C = Diámetro de control
D. T = Diámetro de tratamiento
Figura 6. Montajes para las pruebas de antagonismo con la circunferencia de Bs15 (A) y el sobrenadante de Ba959 (B) sobre P. oryzae.
Evaluación del sobrenadante libre de células de Bs15, Ba959 y B15-959
En segunda instancia se evaluó la actividad de los metabolitos producidos por las
bacterias; para esto se prepararon tres tratamientos en medio líquido: el primero con la cepa de
Bs15, el segundo con la cepa de Ba959 y el tercero con la combinación B15-959 de ambas
bacterias. Para la inoculación en medio líquido a la cepa Bs15 se le hizo un choque térmico a
80°C por 20 minutos, con el fin de reducir la probabilidad de que aparezca una morfología que
no corresponde a la de esta cepa.
Las bacterias fueron inoculadas en medio D, compuesto de 0.042 g/L MnSO4*4H2O,
0.031 g/L CaCl2, 0.5 g/L KH2PO4, 1.0 g/L (NH4)2SO4, 33 g/L extracto de levadura, 32 g/L
A B
22
glucosa, 4 g/L MgSO4*7H2O, 0.5 g/L K2HPO4 (Mosquera et al., 2014) durante cinco días a 150
RPM en una temperatura de 30°C; para verificar el estado de los cultivos se hacía una prueba de
contaminación con un rayado en TSA 50%, corroborando que sólo estuvieran presentes las
morfologías de las bacterias Bs15 y Ba959.
Para determinar la densidad celular en los cultivos se utilizó la metodología de diluciones
seriadas, y para la obtención del SLC, los cultivos se centrifugaron en tubos eppendorf de 2 ml a
14000 RPM durante 10 minutos. Posteriormente los sobrenadantes fueron filtrados a través de
una membrana de poro 0.2 μm,
Los SLCs de Bs15, Ba959 y B15-959 fueron dispuestos en 8 pozos de (∅: 5 mm), cada
uno con 80 µl. Los pozos se ubicaron formando una circunferencia de (∅: 6 cm) (Figura 6B) y en
el centro un disco (∅: 5 mm) de cada hongo. Cada tratamiento contó con 3 réplicas y el
porcentaje de inhibición se calculó cuando el control (cada uno de los hongos patógenos
creciendo en pozos sin el tratamiento) alcanzó el diámetro (∅: 6 cm). Para el cálculo de %
inhibición se utilizó la misma ecuación que en la metodología anterior.
Purificación de lipopéptidos de Bs15, Ba959 y B15-959
Para la purificación de los lipopéptidos de Bs15, Ba959 y su combinación se siguió la
metodología de (Villegas-Escobar et al., 2013). Al medio D descrito anteriormente se le adicionó
4% de amberlita (p/v) 24 horas después de inoculado con Bs15, Ba959 o B15-959; los
metabolitos absorbidos fueron recuperados en 200 mL de metanol. Después de la elución fueron
evaporados (50 psig, 50°C) y ajustados en agua a una concentración de 37mg/mL. La suspensión
fue pasada por una fase solida de C18 cartridge (Agilent®, 10 g) y sucesivamente se hicieron
eluciones en un gradiente de 80 mL de metanol/agua. Los gradientes consistieron en 0%, 50% y
23
100%. La fracción correspondiente al 100% fue evaporada (50 psig, 50°C), y se pesó la cantidad
de compuestos totales producidos por cada uno de los tratamientos.
Evaluación de las células y sobrenadantes de Bs15, Ba959 y B15-959 sobre el hongo G.
graminis (pruebas en invernadero)
Para cumplir con el segundo objetivo se prepararon los siguientes tratamientos:
Tabla 2. Tratamientos utilizados en los ensayos de invernadero.
Tratamientos Detalle Inoculación de hongo
Control Absoluto
Control Negativo
Células Bs15
Células Ba959
Células B15-959
Sobrenadante Bs15
Sobrenadante Ba959
Sobrenadante B15-959
Agua
Agua
Densidad celular de 2,8x108 UFC/ml
Densidad celular de 3,8x108 UFC/ml
Densidad celular de 2,5x108 UFC/ml
(Ba959=84% - Bs15=16%)
Proveniente de un cultivo con densidad celular de
2,8x108 UFC/ml
Proveniente de un cultivo con densidad celular de
3,8x108 UFC/ml
Proveniente de un cultivo con densidad celular de
2,5x108 UFC/ml (Ba959=84% - Bs15=16%)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
Las semillas de arroz fueron desinfectadas en una solución de hipoclorito al 1% y lavadas
con agua estéril, luego se sumergieron en un volumen de 4 ml de cada tratamiento por 2 horas
24
(Tabla 2). Los tratamientos con los sobrenadantes de las células no fueron filtrados como en el
caso de los sobrenadantes usados en los ensayos in vitro.
Paralelamente se prepararon macetas con 500 gramos de suelo previamente esterilizado y
en cada una se depositaron entre 15-20 semillas de arroz, cada una acompañada de un disco (∅: 5
mm) del hongo Gaeumannomyces graminis, excepto en el caso del control absoluto. Se hicieron
dos ensayos en invernadero y para el segundo ensayo se realizó un paso adicional de acuerdo a la
metodología de L. Yang et al. (2015) que consistió en regar el suelo de las macetas con un
volumen de 50 ml del respectivo tratamiento una semana después de haber sembrado las
semillas, esto con la finalidad de saber si una aplicación adicional de los tratamientos provocaba
diferencias en el desarrollo de la enfermedad en las plantas. Cada tratamiento contó con tres
réplicas, y las macetas se ubicaron sobre una estera en el invernadero de la Universidad EAFIT
donde contaban con alta humedad y riego periódico (Figura 7), y se les hizo un seguimiento cada
semana para corroborar el avance de la enfermedad.
Pasado un mes se sacaron las plantas de sus macetas, se lavaron las raíces con ayuda de
un ultrasonido y se midieron las siguientes variables: longitud de la lesión, peso seco del brote y
peso seco de la raíz; para medir estas últimas dos variables las plantas se secaron durante dos
días en un horno a 60°C.
Análisis estadístico
Los ensayos se hicieron mediante un diseño completamente al azar y se analizaron por
medio de un análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de confianza del 95% verificando que
se cumplieran los supuestos de normalidad por medio de las pruebas de Shapiro Wilk y
homogeneidad de varianzas de Levene. Para determinar las diferencias entre medias se utilizó la
25
prueba de la mínima diferencia significativa (MDS) con un nivel de confianza del 95%. Para el
procesamiento de los datos se usó el programa estadístico R studio versión 3.0.1. con los
paquetes “car”, “lattice” y “Agricolae” (R Core Team, 2016).
Figura 7. Plantas de arroz en el invernadero. Cada maceta corresponde a una de las réplicas de todos los tratamientos y controles
26
Resultados
¿Hay diferencia en la inhibición de los cuatro hongos tratados con las células de Bs15,
Ba959 y B15-959?
Para los ensayos realizados con la biomasa bacteriana se observó que hubo inhibición
para todos los hongos, como se ejemplifica en la Figura 8 donde a simple vista el tratamiento con
células de Ba959 (Figura 8B) muestra una mayor reducción en el diámetro del hongo P. oryzae
comparado con el control (Figura 8A) y el tratamiento de Bs15 (Figura 8C).
En la Figura 9 se representan gráficamente los resultados del análisis estadístico de los
datos de las mediciones del diámetro de cada hongo, donde las letras en cada una de las barras
hacen referencia a los grupos definidos en base a la diferencia estadística. Los resultados
obtenidos con los tratamientos de células de Bs15, Ba959 y la combinación B15-959 mostraron
altos porcentajes de inhibición para los cuatro hongos evaluados, pero en mayor medida para los
hongos H. oryzae y P. oryzae en los cuales se presentó una inhibición de entre el 70% y el 80%,
que varió de acuerdo a los tratamientos utilizados, en el caso de H. oryzae el tratamiento que
mostró mayor inhibición fue la combinación B15-959, seguida por el tratamiento de las células
de Ba959 solas; en cuanto a P. oryzae, todos los tratamientos mostraron un porcentaje de
inhibición similar. Para los hongos G. graminis y R. solani hubo una inhibición menor, del 60%
y 50% respectivamente, siendo el tratamiento de la combinación B15-959 el que demostró una
mayor inhibición para R. solani, y el tratamiento de Ba959 el mejor contra G. graminis.
27
Figura 8. Ensayo de antagonismo para P. oryzae. Control (A), células de Ba959 (B) y células de Bs15 (C).
Figura 9. Porcentaje de inhibición de Bs15, B15-959 y Ba959 sobre P. oryzae, H. oryzae, R. solnai y G. graminis a nivel in vitro. ANOVA p = 5.928657e-18. Medias de las barras sin diferencias estadísticas se denotan con las mismas letras de acuerdo a la prueba de la mínima diferencia significativa. MDS p < 0.05.
a a a ba
b
ba ab
b b a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Bs1
5
B1
5-9
59
Ba9
59
Bs1
5
B1
5-9
59
Ba9
59
Bs1
5
B1
5-9
59
Ba9
59
Bs1
5
B1
5-9
59
Ba9
59
P. oryzae H. oryzae R. solani G. graminis
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
Tratamientos
Porcentaje de inhibición de Bs15, B15-959 y Ba959
A B C
28
¿Hay diferencia en la inhibición de los cuatro hongos con los sobrenadantes de Bs15, Ba959
y B15-959?
Para los ensayos con sobrenadante se encontró que todos los hongos fueron inhibidos por
el SLC de los tres tratamientos (Bs15, Ba959 y B15-959), como se ejemplifica en la Figura 10
donde se muestra la acción de los tratamientos sobre G. graminis. Para el caso de estos
tratamientos el porcentaje de inhibición más alto se presentó en los hongos G. graminis y H.
oryzae con un 60% y un 40% de inhibición respectivamente, siendo el sobrenadante de la
combinación y el sobrenadante de Ba959 los que demostraron una mayor inhibición en ambos
casos. Para P. oryzae y R. solani los porcentajes de inhibición fueron los más bajos, con el
tratamiento de Ba959 siendo el más alto de estos, mostrando una inhibición de entre el 20% y el
30% (Figura 11).
Figura 10. Ensayo de antagonismo con SLC de Bs15, Ba959 y B15-959. Ensayo para G. graminis comparando el control (A), el tratamiento Bs15 (B), el tratamiento Ba959 (C) y el tratamiento B15-959 (D).
A B C D
29
Figura 11. Porcentaje de inhibición de los SLCs de Bs15, B15-959 y Ba959 sobre P. oryzae, H. oryzae, R. solani y G. graminis a nivel in vitro. ANOVA p = 5.601711e-13. Medias de las barras sin diferencias estadísticas se denotan con las mismas letras de acuerdo a la prueba de la mínima diferencia significativa. MDS p < 0.05.
¿Hay diferencia en la producción de lipopéptidos de Bs15, Ba959 y B15-959 al crecer en
medio D?
Al pesar los lipopéptidos producidos en cada cultivo (Bs15, Ba959 y B15-959) se
encontró que el que producía una mayor cantidad era B15-959 con 92.7 mg, seguido del cultivo
de Ba959 que produjo 79.7 mg; la menor cantidad de lipopéptidos se registró para el cultivo
Bs15 con 29.1 mg (Tabla 3).
b
b ab
aa
a
b
ab
a
b
a a
-10
0
10
20
30
40
50
60
70B
s15
B1
5-9
59
Ba9
59
Bs1
5
B1
5-9
59
Ba9
59
Bs1
5
B1
5-9
59
Ba9
59
Bs1
5
B1
5-9
59
Ba9
59
P. oryzae H. oryzae R. solani G. graminis
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
Tratamientos
Porcentaje de inhibición de los SLCs
30
Tabla 3. Cantidad de lipopéptidos producidos en cada cultivo.
Cultivo Peso (mg)
Bs15
Ba959
B15-959
29.1
79.7
92.7
¿Hay diferencia en el peso del brote y la raíz de plantas de arroz infectadas con G. graminis
al ser tratadas con Bs15, Ba959 y B15-959?
Como se mencionó anteriormente, los ensayos fueron monitoreados cada semana para
visualizar el avance de la enfermedad, la cual se pudo observar a partir de la segunda semana y
se manifestó con manchas de color negro en los tallos de las plantas, que fueron expandiéndose
por las hojas y hacia el final del ensayo pasaron a tener una coloración naranja, lo que concuerda
con los signos de la enfermedad de “mal del pie” causada por Gaeumannomyces graminis. En la
Figura 12 se puede observar un contraste entre las plantas del control absoluto (Figura 12A) que
no presentan lesiones y las plantas del control negativo con las manchas descritas (Figura 12B,
12C).
31
Figura 12. Plantas de arroz A) Control absoluto durante la última semana del ensayo, ninguna presenta lesiones. B) Control con hongo durante la segunda semana del ensayo, donde se observa al menos cuatro plantas con manchas negras en la base del tallo. C) Control con hongo durante la última semana del ensayo, donde todas las plantas presentan lesiones de color negro o naranja a lo largo del tallo.
Tanto en el ensayo 1, donde sólo las semillas se sometieron a los tratamientos, como en el
ensayo 2 donde se realizó el riego de 50 ml de cada tratamiento una semana después de haber
sembrado las semillas, hubo una incidencia del 100%, es decir, todas las plantas en presencia del
A
B
C
32
hongo sufrieron la enfermedad; la longitud de las lesiones en cada planta era variable llegando en
algunos casos a extenderse rápidamente por el tejido, limitando el crecimiento de las plantas
(Figura 13). Sin embargo, en el caso del tratamiento con sobrenadante de B15-959 es posible
observar que las plantas sometidas a este tratamiento presentan similitudes con el control
absoluto que contrastan con las plantas del control negativo (Figura 14).
Figura 13. Planta del tratamiento de células de Bs15; planta del tratamiento de células de B15-959.
33
Figura 14. Comparación entre las plantas del control absoluto (A), el tratamiento de sobrenadante de B15-959 (B) y el control negativo (C)
Los datos de peso seco tanto de las raíces como de los brotes fueron analizados en R. Los
resultados para el primer ensayo de invernadero se muestran gráficamente en las Figuras 15 y 16,
donde es posible observar que no hubo diferencia significativa entre los tratamientos y el control
negativo, lo que motivó a realizar el segundo ensayo con el paso adicional de aplicación de los
tratamientos en las macetas; los resultados de este ensayo se muestran en las Figuras 17 y 18,
donde es posible observar que en el caso del peso seco del brote (Figura 18) el único tratamiento
que presentó un peso de brote similar al del control absoluto, que no estaba infectado con el
hongo, fue el tratamiento de sobrenadante de B15-959.
A B C
34
Figura 15. Peso seco de la raíz de plantas de arroz infectadas artificialmente con G. graminis. ANOVA p = 0.03604983 Medias de las barras sin diferencias estadísticas se denotan con las mismas letras de acuerdo a la prueba de la mínima diferencia significativa. MDS p < 0.05. Ensayo 1 en invernadero.
Figura 16. Peso seco del brote de plantas de arroz infectadas artificialmente con G. graminis. ANOVA p = 0.0647902. Ensayo 1 en invernadero.
a
b bb b b b
b
0
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024gr
amo
s
Tratamientos
Peso seco de raíz (Ensayo 1)
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
gram
os
Tratamientos
Peso seco de brote (Ensayo 1)
35
Figura 17. Peso seco de la raíz de plantas de arroz infectadas artificialmente con G. graminis. ANOVA p = 0.0007161314. Medias de las barras sin diferencias estadísticas se denotan con las mismas letras de acuerdo a la prueba de la mínima diferencia significativa. MDS p < 0.05. Ensayo 2 en invernadero.
Figura 18. Peso seco del brote de plantas de arroz infectadas artificialmente con G. graminis. ANOVA p = 0.02178343. Medias de las barras sin diferencias estadísticas se denotan con las mismas letras de acuerdo a la prueba de la mínima diferencia significativa. MDS p < 0.05. Ensayo 2 en invernadero.
a
bc
cbc
bc
c
bc
b
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025gr
amo
s
Tratamientos
Peso seco de raíz (Ensayo 2)
a
bb
b
ab
b
ab
a
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
gram
os
Tratamientos
Peso seco de brote (Ensayo 2)
36
¿Hay diferencia en el porcentaje de área enferma de plantas de arroz infectadas con G.
graminis al ser tratadas con Bs15, Ba959 y B15-959?
Se midió la longitud de las lesiones en las plantas para ambos ensayos, pero solo en el
segundo se encontró diferencia significativa, siendo el tratamiento de sobrenadante B15-959 el
que presentó el menor porcentaje de área enferma (Figura 19).
Figura 19. Área enferma de las plantas de arroz infectadas con G. graminis. ANOVA p = 0.0164. Medias de las barras sin diferencias estadísticas se denotan con las mismas letras de acuerdo a la prueba de la mínima diferencia significativa. MDS p < 0.05. Ensayo 2 en invernadero.
abc
a
ab
bcd
bcd
cd d
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
% Á
rea
enfe
rma
Tratamientos
% de área enferma en los tratamientos
37
Discusión
Al analizar los resultados obtenidos con los tratamientos de células de Bs15, Ba959 y
B15-959 a nivel in vitro, es posible observar que hay diferencias en los porcentajes de inhibición
entre tratamientos para cada hongo evaluado. Este contraste entre los porcentajes de inhibición
de cada tratamiento pudo deberse a varios factores como una diferencia en la cantidad de
compuestos producidos por cada bacteria o el hecho de que cada uno de los hongos presentara
una susceptibilidad diferente a los metabolitos producidos por cada cepa, ya que en estudios
anteriores se ha encontrado que hongos patógenos como Colletotrichum acutatum y Botrytis
cinerea son susceptibles a diferentes concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) de fengicina C
e iturina A producidas por Bs15 (Arroyave-Toro et al., 2017).
Las especies del género Bacillus son conocidas por producir una amplia gama de
metabolitos secundarios con actividad antifúngica y antibacterial, y se esperaría que los
metabolitos responsables de la inhibición observada en los ensayos con células sean
lipopéptidos, los cuales han sido evaluados previamente en H. oryzae, con iturinas producidas
por B. amyloliquefaciens (Saechow et al., 2018); en P. oryzae con iturinas, surfactinas y
fengicinas producidas por B. amyloliquefaciens (Liao et al., 2016), en R. solani con iturinas,
surfactinas y fengicinas producidas por B. subtilis (Mnif et al., 2015) e iturinas producidas por B.
amyloliquefaciens (Yu et al., 2002); y G. graminis var. tritici con iturinas de B. subtilis (D.
Zhang et al., 2017). Es por esto que, para los ensayos con sobrenadante, se optó por cultivar las
bacterias en medio D que permite la producción de lipopéptidos de las tres familias (Mosquera et
al., 2014).
38
Los resultados con el sobrenadante libre de células a nivel in vitro, muestran diferencias
significativas con respecto a los obtenidos con el tratamiento de células. La razón de la diferencia
en el porcentaje de inhibición para cada uno de los hongos puede estar en la cantidad de
metabolitos producidos por cada bacteria, pero en especial de lipopéptidos, que para Ba959 fue
de 79.7 mg, para Bs15 de 29.1 mg y para B15-959 fue de 92,7 mg. A pesar de que la cantidad de
lipopéptidos en Ba959 y Bs15-Ba959 no fue similar, con una diferencia de 13 mg, los
porcentajes de inhibición con ambos tratamientos a nivel in vitro no presentaron diferencias
significativas (Figura 11), por lo que se podría inferir que en la combinación B15-959 los
lipopéptidos que se producen, probablemente iturinas y fengicinas por ser las familias de
lipopéptidos que poseen mayor actividad antifúngica, están en concentraciones similares a las de
Ba959 sola, cosa que no ocurriría con Bs15, que además de producir una cantidad mucho menor
de lipopéptidos, crece con una densidad celular menor a la de Ba959 (Tabla 2), lo que indicaría
que la cantidad de lipopéptidos obtenidos es directamente proporcional al número de células en
los cultivos.
Los bajos porcentajes de inhibición para los ensayos con sobrenadante comparados con
los ensayos de células a nivel in vitro, puede deberse a que en los ensayos de células las bacterias
están creciendo en PDA y estarían produciendo continuamente metabolitos en concentraciones
mucho mayores a las que se estarían adicionando con los sobrenadantes libres de células; además
como las bacterias están creciendo en conjunto con los hongos puede estar presentándose una
competencia por los nutrientes del medio que provoca un crecimiento menor de los patógenos.
En cuanto a los datos de los ensayos en invernadero, sólo en el segundo ensayo se
observaron diferencias significativas entre los tratamientos y los controles; éste fue el ensayo con
39
el paso adicional en donde las macetas se regaron con los respectivos tratamientos una semana
después de haber sembrado las semillas, esto indica que no bastaría con aplicar los tratamientos
sólo a la semilla, sino que es necesario hacer aplicaciones continuas para controlar la enfermedad
provocada por G. graminis. El “mal del pie” tiene consecuencias bastante negativas para las
plantas de arroz puesto que provoca una reducción en el macollamiento, una maduración
prematura de las plantas, vaneamiento, pérdidas de peso de grano y hasta la muerte de la plántula
o su volcamiento cuando la enfermedad está muy avanzada (Smith et al., 1992); de estas
consecuencias, la reducción del macollamiento y la aparición del vaneamiento tienen
repercusiones directas en la productividad del cultivo y por consiguiente en su valor económico,
puesto que la primera evita que se formen los macollos, que son estructuras originadas de la
misma planta, y que en estadios avanzados de crecimiento pueden convertirse en plantas
independientes al desarrollar sus propias raíces (Olmos, 2007), esto implicaría una reducción en
el número de plantas que podrían crecer dentro del cultivo. En el caso del vaneamiento, este
fenómeno impide que las espigas se llenen completamente de granos (Oñate Mendoza, 2015), lo
que provoca una producción menor del cultivo.
De los resultados obtenidos a partir de los ensayos de invernadero sólo el tratamiento del
sobrenadante B15-959 traería beneficios a las plantas de arroz cuando estas se encuentran
infectadas por G. graminis, puesto que fue el tratamiento donde se presentó un menor porcentaje
de área infectada (20%) seguida del tratamiento con el sobrenadante de Ba959 (25%), y que se
diferencia del porcentaje de área infectada del control de hongo (35%), lo que muestra una
reducción en el avance de la enfermedad; además el tratamiento de sobrenadante B15-959 fue el
único en donde el peso seco del brote fue similar al del control absoluto (0.1g), esto podría
40
indicar activación de esos mecanismo de defensa (Saechow et al., 2018), lo que se relaciona con
la propiedad que tienen las bacterias del género Bacillus para potenciar el crecimiento en plantas,
este fenómeno no ocurrió con los demás tratamientos, por lo que un método de control con
ambas bacterias puede disminuir los síntomas de la enfermedad del “mal del pie” y evitar
pérdidas económicas graves para los productores.
41
Conclusiones
Las cepas de Bacillus subtilis EA-CB0015 y Bacillus amyloliquefaciens EA-CB0959
son capaces de inhibir el crecimiento in vitro de los cuatro hongos estudiados:
Rhizoctonia solani, Pyricularia oryzae, Helminthosporium oryzae y
Gaeumannomyces graminis.
Para los hongos Helminthosporium oryzae y Pyricularia oryzae se presentaron los
porcentajes de inhibición más altos con los tratamientos de células de Bacillus subtilis
EA-CB0015 y Bacillus amyloliquefaciens EA-CB0959 en los ensayos in vitro, con un
80% y 75%, respectivamente.
Los tratamientos con los sobrenadantes de las bacterias mostraron un porcentaje de
inhibición menor en comparación a los tratamientos con las células, siendo el hongo
Gaeumannomyces graminis el único en el que se presentó el mismo porcentaje de
inhibición para los dos tipos de tratamiento a nivel in vitro (60%).
La cepa Bacillus amyloliquefaciens EA-CB0959 inhibió en mayor medida a los
hongos patógenos en comparación con la cepa Bacillus subtilis EA-CB0015.
Entre los tratamientos usados para los ensayos de invernadero sólo el sobrenadante de
la combinación mostró un área enferma menor a la de los demás y un crecimiento del
brote similar al del control absoluto, cuando se infectó con Gaeumannomyces
graminis.
42
Perspectivas a futuro
Para futuros ensayos sería útil hacer un reconocimiento más preciso de los hongos
patógenos evaluados, especialmente de la susceptibilidad que cada uno pueda tener a los
metabolitos producidos por las cepas de Bacillus subtilis EA-CB0015 y Bacillus
amyloliquefaciens EA-CB0959, haciendo ensayos de concentración mínima inhibitoria.
Para pruebas en invernadero sería adecuado hacer ensayos con más de una aplicación de
los tratamientos en las macetas para ejercer un control periódico contra la enfermedad.
También probar metodologías de infección con el hongo no directamente en la semilla
sino en el suelo, en condiciones en las que la infección no sea tan propicia para el hongo.
43
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