EVALUACIÓN DEL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS POR TRES ...
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8 EVALUACIÓN DEL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS POR TRES TÉCNICAS DE CONGELACIÓN A MEDIANO PLAZO MARTHA C. LOZANO T. LUISA F. CLAVIJO. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA SANTAFÉ DE BOGOTÁ JULIO 2001 AGRADECIMIENTOS
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EVALUACIÓN DEL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS POR TRES TÉCNICAS DE CONGELACIÓN A MEDIANO PLAZO
MARTHA C. LOZANO T. LUISA F. CLAVIJO.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA
SANTAFÉ DE BOGOTÁ JULIO 2001
AGRADECIMIENTOS
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A Dios por guiarnos siempre y brindarnos su fortaleza y su paciencia que nos permitieron culminar
otra meta.
A nuestros padres que nos apoyaron y nos llenaron de ánimo para no rendirnos en el camino.
A nuestras familias que creyeron en nosotras.
A Marcela Gómez por su entrega y su enseñanza a lo largo de nuestro estudio.
A nuestros profesores por guiarnos e ilustrarnos en nuestra formación profesional.
A nuestros compañeros y amigos que compartieron con nosotras y nos brindaron su alegría en
cada momento.
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TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción 9
2. Marco teórico 10
2.1 Preservación 11
2.1.1 Mantenimiento de viabililidad: 12
2.1.2 Cambio en las características: 12
2.1.3 Cambio de la población a través de la selección: 12
2.1.4 Evaluación del cultivo: 13
2.1.5 Costos: 13
2.1.6 Tamaño de la colección: 13
2.1.7 Pureza: 14
2.2 Métodos de preservación de corta duración 15
2.2.1 Método de subcultivo 15 2.2.3 Mantenimiento de las cepas bacterianas en aceite de inmersión 15
2.2.4 Métodos de congelación 16
2.2.4.1 Congelación ordinaria (0ºc –20ºc) 17
2.2.4.2 Congelación a –20ºc con discos de gelatina y desecación con silica gel. 18
2.2.4.3 Congelación a –20ºc con el uso de leche descremada y glicerol. 19
2.2.4.4 Congelación baja (-70ºc) 19
2.2.4.5 Almacenaje por congelación en perlas de vidrio a –70ºc: 20
2.2.4.6 Almacenaje a –196°c 20
2.3 Métodos de congelación y preservación a largo plazo 21
2.3.1 Método de liofilización 21
2.4 Papel protector de los crioprotectores 22
11
2.5 Generalidades de las cepas bacterianas en estudio 23
2.5.1 Bacterias gram positivas 23
2.5.1.1 staphylococcus aureus 24
2.5.1.2 staphylococcus epidermidis 24
2.5.1.3 streptococcus mutans 25
2.5.1.4 enterococcus faecium 25
2.5.1.5 bacillus subtillis 25
2.5.1.6 listeria monocytogenes 25
2.5.2 Cepas gram negativas 25
2.5.2.1 pseudomonas aeruginosas: 26
2.5.2.2 escherichia coli: 26
2.5.2.3 shigella sp 26
2.5.2.4 salmonella sp: 26
2.5.2.5 klebsiella sp: 26
2.5.2.6 pasteurella multocida 26
3. Justificación 27
4. Objetivos 29
4.1. General 29
4.2. Específicos 29
5. Materiales y métodos 30
5.1 Tipo de estudio 30
5.2 Hipótesis 30
5.3 Manejo de datos 30
5.4 Cepas bacterianas 31
5.5 Métodos a estudiar 31
5.6 Tiempo de evaluación 31
12
5.6.1 Congelación a –20ºc en leche descremada al 10% (skim milk) 32
5.6.2 Congelación a –20ºc en caldo tripticasa soya con adición de glicerol al 3% 33
5.6.3 Congelación a –20ºc en discos de gelatina 10% sobre silica-gel 33
5.7 Descongelación de cepas 34
5.8 Determinación de viabilidad 35
5.9 Determinación de recuperación 36
5.10 Determinación de pureza 36
5.10.1 cepas gram positivas 36
5.10.1.1 cocos 36
5.10.1.2 bacilos 37
5.10.2 cepas gram negativas 37
5.10.2.1 bacilos 37
6. Resultados 38
6.1 Viabilidad bacteriana posterior a la conservación en cada técnica 38
6.2 Evaluación de cada técnica de mantenimiento en los grupos de bacterias evaluados 45
6.3 Determinación de viabilidad posterior a cada técnica 47
6.3.1 Determinación de viabilidad posterior a la aplicación de leche descremada al 10%: 47
6.3.2 Determinación de viabilidad posterior a la aplicación de caldo triptona soya con adición de
glicerol al 3%: 48
6.3.3 Determinación de viabilidad posterior a la aplicación de discos de gelatina al 10% desecados
sobre silica gel 49
6.4 Determinación de identidad y pureza bacteriana 50
7. Discusión 53
7.1 Evaluación de la viabilidad bacteriana posterior a la conservación en cada técnica. 54
7.2 Evaluación del porcentaje de muerte bacteriana 55
13
7.3 Evaluación de cada técnica de mantenimiento en los grupos bacterianos (Gram positivos y Gram
negativos) 57
7.4 Determinación de viabilidad posterior a una incubación de 24 horas a 37ºCna.
8.Conclusiones
14
RESUMEN
En este estudio se buscó comparar tres métodos de congelación a –20· c para el
mantenimiento y preservación de cepas bacterianas Gram positivas y Gram
negativas a mediano plazo.
Se realizó este estudio con el fin de encontrar el método más eficaz para dicho propósito y de esta
manera implementarlo en el laboratorio de Microbiología especial de la pontificia Universidad
Javeriana ya que en este no se realiza nada diferente a los repiques.
El estudio se realizó durante tres meses consecutivos en donde la evaluación de recuperación,
viabilidad y pureza de las cepas bacterianas, se hizo mensualmente.
Por medio de la estadística _______________ se determinó que existe relación entre los métodos
empleados, el tiempo de preservación y la concentración de cepas recuperadas.
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1. INTRODUCCIÓN
Durante muchos años, en el área de la
microbiología se han desarrollado varios estudios
sobre los microorganismos, los cuales no sólo se
limitan al conocimiento de sus características físicas,
químicas o biológicas sino también al diseño de
métodos de mantenimiento y conservación con fines
de investigación.
La información sobre el mantenimiento y conservación de cepas bacterianas es muy
amplia y también es distinta en su fondo para los diferentes grupos de
microorganismos; una gran variedad de técnicas están disponibles para estos fines y
no es fácil escoger el método más adecuado ya que estos se eligen teniendo en cuenta
las ventajas y desventajas que estos proporcionan a los microorganismos en estudio y
al investigador, las necesidades del microorganismo para su desarrollo y los fines de
la investigación (Kirsop y Snell, 1983).
Algunos de estos métodos son, subcultivos, congelación, liofilización, desecación etc., y como se mencionó anteriormente cada método se emplea según las conveniencias de una necesidad en particular, no obstante, a veces se hace necesaria la conjugación de varios métodos para lograr los fines deseados (Alexander, 1980).
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2. MARCO TEÓRICO
Se han descrito varios métodos eficaces para la preservación y mantenimiento de
cepas bacterianas, sin embargo no ha sido posible establecer un protocolo universal
para este propósito ya que los microorganismos difieren en su estructura y por
consiguiente en su tolerancia a los diferentes métodos.
La preservación de cultivos es extremadamente importante y debe dársele la misma atención que a la
estandarización de equipos, ya que numerosos estudios han fracasado por la pérdida y la variación en
las cepas como resultado de una preservación inadecuada (Gerhadt, 1994).
Algunos métodos de preservación han sido aplicados solo a un grupo estricto de microorganismos con
excelentes resultados, pero esto no quiere decir que no se pueda ampliar la posibilidad de aplicarlos a
otros grupos (Gherma, 1981); algunos de estos métodos son: Subcultivos en medios apropiados
dependiendo del microorganismo, desecación y liofilización, congelación, congelación a –20ºC con
discos de gelatina y silica gel, como crioprotector congelación –20ºC con el uso de leche descremada y
glicerol (Stamp , 1947; Gherna, 1981; Kirsop et al, 1984; Gao et al, 1995).
Es importante tener en cuenta para asegurar el éxito en la preservación y mantenimiento de las cepas
la edad del cultivo, la correcta identificación de estas y por supuesto trabajar bajo condiciones de
esterilidad para evitar contratiempos de contaminación que perjudiquen el estudio (Gherna, 1991).
2.1 PRESERVACIÓN
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La preservación de las cepas bacterianas tiene como objetivo mantener al
microorganismo viable, no contaminado, sin cambios en sus características genéticas,
conservando sus propiedades morfológicas, taxonómicas y bioquímicas, logrando así
condiciones óptimas para que el microorganismo aislado sea igual a la cepa original
(Snell, J.J.S, 1984).
No todas las especies responden igual a los métodos de conservación y preservación, por esta razón diferentes laboratorios e instituciones, incluido el Laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana también varían los requerimientos necesarios para la conservación de las diferentes cepas bacterianas, empleando técnicas diferentes que pueda conservar el microorganismo de la mejor manera posible.
Todos los métodos ofrecen ventajas y desventajas, la elección del método para un uso particular debe
ser compatible a las necesidades del usuario. Los rasgos a considerar se describen a continuación:
22.1.1 MANTENNIMIENTO DE VIABILILIDAD :
En la conservación de un cultivo de microorganismos, están implicados tanto el mantenimiento como
la preservación de una cepa bacteriana. El mantenimiento de una cepa bacteriana significa que el
cultivo debe permanecer vivo y puro en el procedimiento, mientras que la preservación significa
mantener la cepa bacteriana con un potencial biológico constante por un periodo de tiempo
prolongado. Para que esto pueda llevarse a cabo, las instalaciones, el material empleado en el
laboratorio y su manipulación durante este proceso deben cumplir las normas de esterilidad;
especialmente cuando se trabaja con un amplio stock de microorganismo s (Weiss, F.A, 1957).
2.1.2 CAMBIO EN LAS CARACTERÍSTICAS :
Durante el almacenamiento, los cambios genéticos pueden ocurrir como resultado de mutaciones por
perdida de plásmidos. Por esta razón es importante que las cepas preservadas no pierdan sus
características que las hacen importantes. Así que las técnicas de preservación deben evitar la
ocurrencia de dichos eventos, se recomienda soluciones con bajas concentraciones de agentes
selectivos, para mantener la presión selectiva uniforme en estado preservado (Weiss, F.A, 1957).
18
2.1.3 CAMBIO DE LA POBLACIÓN A TRAVÉS DE LA SELECCIÓN :
Una proporción de las células en una población puede morir durante el proceso de preservación inicial
y esto puede ser de poca importancia para el investigador si se usan inicialmente concentraciones altas
en el número de células. Sin embargo, la reducción en el número de células viables puede producir la
selección de una población sobreviviente de células resistentes y puede introducir la posibilidad de
cambios en las características de la cepa en conservación. El método de preservación debe tener el
mayor número de células viables para que la población sobreviviente se asemeje lo mas
estrechamente posible a la población original (Kirsop et al, 1984).
2.1.4 EVALUACIÓN DEL CULTIVO:
La preservación por dos o más métodos de conservación y almacenamiento en diferentes lugares, es
aconsejable, ya que asegura la duración por muchos años y evita costos elevados, y las perdidas serán
mínimas con relación a las cepas bacterianas.
2.1.5 COSTOS :
Algunos métodos requieren inicialmente un gasto elevado generado por equipos, facilidades de
almacenamiento, materiales y gasto en personal. El elevado costo de capital en equipos para algunos
métodos como el liofilizador, pueden compensarse con los reducidos costos de personal, ya que la
estabilidad por largo plazo de los cultivos disminuye la necesidad de una intervención por parte del
personal de uso frecuente (Kirsop et al, 1984).
2.1.6 TAMAÑO DE LA COLECCIÓN:
El principal factor para ser considerado al escoger el método es el tiempo requerido en la
preservación inicial y por consiguiente la manipulación, si se requiere una o más copias; encontrar un
método apropiado para la preservación de cepas puede ser un proceso excesivo cuando el número de
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cepas es elevado. El método para un gran stock debe estar relacionado con la cantidad de espacio
disponible para su almacenamiento (Gerhardt, 1994).
2.1.7 PUREZA:
Los cultivos conservados para todas las aplicaciones deben permanecer puros, y el método de
preservación debe minimizar el riesgo de contaminación, este evento perjudica cualquier estudio y
aumenta el riesgo de perder la cepa inicial (Kirsop et al, 1984).
Los métodos de conservación más utilizados se clasifican en métodos de corta y larga duración:
CORTA DURACIÓN: Los métodos de corta duración son: Método de Subcultivo, Mantenimiento de
cepas bacterianas en Aceite de Inmersión, Métodos de Congelación (a -20°C por Congelación
ordinaria, -20°C con Discos de Gelatina y Desecación sobre Silica Gel, -20°C con el uso de Leche
Descremada y Glicerol, -70°C en Perlas de Vidrio, -70°C por Congelación, -196°C).
LARGO PLAZO: Método de Liofilización.
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2.2 MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE
CORTA DURACIÓN
2.2.1 MÉTODO DE SUBCULTIVO
Consiste en la inoculación de cepas puras en medios de cultivo específicos seguido de una incubación
a una temperatura conveniente, generalmente a 37ºC, para obtener el crecimiento del microorganismo,
y posteriormente almacenarlo en condiciones adecuadas como la refrigeración, pero si hay
inconveniente, el almacenamiento puede hacerse a temperatura ambiente (18ºC –20ºC); el proceso se
repite a intervalos cortos de tiempo que aseguren la preservación de un cultivo fresco antes de que el
viejo muera. El tiempo que puede permitirse pasar entre los subcultivos sin riesgo de perder las cepas
depende del microorganismo en particular, los aislamientos deben realizarse por duplicado para evitar
la perdida de las cepas y por supuesto verificar la pureza de las cepas antes de realizar el aislamiento
(Kirsop et al, 1984).
2.2.3 MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS BACTERIANAS EN ACEITE DE INMERSIÓN
Mediante este método se ha logrado preservar gran variedad de cepas bacterianas a mediano plazo
(Perkins, 1962). El microorganismo se siembra en un medio adecuado, ya sea en caldo, agar inclinado
o medio semisólido, y una vez el microorganismo se halle en fase de crecimiento (18-20 horas), se
adiciona 2ml del aceite mineral estéril, se sella o se almacena en refrigeración ó al medio ambiente
(Perkins, 1962). El aceite se esteriliza por calor seco (horno) a 180ºC por dos horas, en tubos tapa
rosca colocando 5ml por tubo; generalmente la contaminación de los cultivos se debe a la mala
esterilización del aceite por esta razón es necesario hacer un control de esterilidad al aceite, sembrando
en agar nutritivo (Perkins, 1962). Este método es económico y se emplea con frecuencia, sin
embargo, presenta desventajas como la contaminación y la perdida de viabilidad (Bank, 1995).
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2.2.4 MÉTODOS DE CONGELACIÓN
En la preservación por congelación, se forman cristales de agua, que por esta razón perjudican la integridad de los microorganismos. Los microorganismos deben ser deshidratados para ser almacenados a bajas temperaturas. El daño puede causarse durante la fase refrescante y el deshelar subsecuente, esto puede ser causado por la concentración de electrolitos a través del levantamiento de agua como hielo o por la formación de los cristales de hielo que pueden dañar la integridad y la morfología del microorganismo (Snell, J.J.S, 1984).
Los esfuerzos por limitar este daño pueden lograrse por el ajuste del proceso de descongelar y la
adición de crioprotectores como el glicerol o leche descremada a la suspención celular (Gao et al,
1995).
Los métodos descritos anteriormente presentan algunas ventajas y desventajas, sin embargo, siempre
debe buscarse y emplearse el método que se ajuste a las necesidades del microorganismo o
microorganismos en estudio, por estas razones no se descarta la posibilidad de conjugar dos o más
métodos para lograr los fines deseados (Alexander, 1980).
Los métodos de conservación por congelación pueden ser extensos y son clasificados de acuerdo a la
temperatura de almacenaje, estos son: -20ºC, -30ºC, -40ºC, -70ºC, -140ºC, y –196ºC; en general la
temperatura sobre los –30ºC genera mejores resultados, la conversión a –70ºC ha sido empleada para
una variedad de microorganismos incluyendo bacterias, hongos, Mycoplasma y virus; la conservación
a –140ºC (Vapor de nitrógeno) y –196ºC (nitrógeno líquido) son empleados para microorganismos que
no pueden ser preservados en otras condiciones (Snell, J.J.S, 1984).
2.2.4.1 CONGELACIÓN ORDINARIA (0ºC –20ºC)
Este proceso no es muy recomendado para la preservación de cepas debido a que la congelación daña
las células. Cuando la temperatura de cualquier suspensión celular se halla bajo 0ºC, el agua del
líquido extracelular comienza a congelarse y se forman cristales de hielo que aumentan la
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concentración del soluto y el agua intracelular migra al exterior por diferencia en la presión osmótica,
al removerse el agua del interior se produce daños celulares y por consiguiente la perdida de las
mismas (Kirsop et al, 1984).
2.2.4.2 CONGELACIÓN A –20ºC EN DISCOS DE GELATINA Y DESECACIÓN SOBRE
SILICA GEL.
En este método originalmente descrito por Stamp (1974), los microorganismos son suspendidos en una
gelatina nutritiva, esta se sirve en cajas de Petri hasta que se solidifiquen, luego de esto se sacan los
discos los cuales son puestos a desecación almacenados sobre silica-gel y congelados a –20ºC.
El propósito de este, es lograr que pare el metabolismo celular lo cual se logra con la congelación,
requisito para la preservación y almacenamiento a largo plazo de las cepas bacterianas en un estado
esencialmente natural sin variantes morfológicas ni fisiológicas (Reusser, 1963). La función que
ejerce la silica-gel en el proceso de congelación es atrapar la mayor cantidad de moléculas de agua
para que los cristales junto con la acumulación de electrolitos no causen daños celulares irremediables
(Kirsop et al, 1984).
La contaminación por este método es menor en comparación con el uso de subcultivos en serie; la
viabilidad a largo plazo parece ligeramente buena, por otra parte es un método donde se puede
preservar las cepas bacterianas sin que sufran cambios genéticos aparentes que modifiquen la cepa
inicial (Reinhard, 1966).
La desecación en silica gel es un procedimiento fácil, rápido y económico, los tubos con silica son
esterilizados a 180ºC por 2 horas ; se agrega la suspención bacteriana en leche descremada al 10% o
los discos de gelatina con una concentración bacteriana conocida. Se cubre y se llevan a refrigeración.
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La silica es un absorbente que tiene la capacidad de resistir altas y bajas temperaturas y controlar la
humedad sin alterar su estructura (Jackson, 1969; Kirsop y Snell, 1984).
2.2.4.3 CONGELACIÓN A –20ºC CON EL USO DE LECHE DESCREMADA Y GLICEROL.
El glicerol y la leche descremada son agentes crioprotectores eficaces, empleados ampliamente en
criopreservación de microorganismos, y su función es prevenir el daño celular. El glicerol como
crioprotector tiene la capacidad de actuar como un radical hidroxilo, lo cual le permite estabilizar la
estructura de la membrana celular, penetrar a la célula y también actúa como nutriente, tiene una baja
toxicidad biológica para la célula y la capacidad de atrapar los fragmentos de agua descongelada a
cualquier temperatura baja (Miura, 1994). La leche descremada funciona disminuyendo la tensión
termal causada principalmente por la expansión del volumen del agua durante la formación del hielo
(Gao et al, 1995).
2.2.4.4 CONGELACIÓN BAJA (-70ºC)
En este proceso se hace el mantenimiento de las cepas a –70ºC, este involucra la congelación
bacteriana en presencia de sustancias crioprotectoras. Estos crioprotectores pasan a través de la
membrana celular y producen una protección intra y extra celular contra la congelación (Gao et al,
1995).
Una vez las bacterias han crecido en un medio apropiado, se hace una suspensión de estas en un caldo
con el crioprotector y se dispensan en los viales para llevarlos a congelación, para la recuperación se
debe realizar una recuperación rápida colocando las suspensiones a 37ºC (Gherna, 1991).
2.2.4.5 ALMACENAJE POR CONGELACIÓN EN PERLAS DE VIDRIO A –70ºC
24
Este método de almacenamiento en pequeñas perlas de vidrio en glicerol ha sido empleado exitosamente para gran variedad de bacterias, el método es muy fácil y rápido y no requiere de una subsecuente manipulación durante el almacenaje. La desventaja que presenta este método de conservación es el elevado costo del congelador a –70ºC (Jones et al, 1978).
2.2.4.6 ALMACENAJE A –196°C (Nitrógeno líquido)
El almacenaje en líquido o vapor de nitrógeno es el método universal más aplicable de todos los
métodos de conservación. Es utilizado para hongos, bacterias, virus, algas, protozoos y cultivos
celulares que son preservados exitosamente mediante este método. El método tiene como principal
desventaja que el nitrógeno líquido se evapora y requiere ser reemplazado regularmente, por
consiguiente, los costos de equipos y materiales son elevados (Straws; Kirsop; James, 1984).
2.3 MÉTODOS DE CONGELACIÓN Y PRESERVACIÓN A LARGO PLAZO
2.3.1 MÉTODO DE LIOFILIZACIÓN.
Se suspenden organismos en un medio especifico, helado y expuesto al vacío. El vapor de agua se
entrapa en un condensador refrigerado o con pentóxido de fósforo, después del secado los
microorganismos son almacenados al vacío o en gas inerte en viales individuales o ampollas (kirsop et
al, 1984).
Para este proceso los microorganismos se suspenden en un medio apropiado que le sirva de soporte,
almacenados en viales, congelados y expuestos a un sistema de vacío, donde el agua es removida y
convertida en vapor, sin pasar por el estado líquido. El resultado es un producto soluble en agua que
puede ser fácilmente rehidratado (Kirsop et al, 1984).
Este sistema se ha empleado por muchos años para preservar una gran variedad de materiales
biológicos que son sensibles al calor. La naturaleza no destructiva de este proceso se ha demostrado
por la viabilidad observada en estudios realizados en virus y otros microorganismos (Bank, 1995).
25
Generalmente todas las cepas bacterianas se pueden someter a este proceso utilizando como medio de
soporte leche descremada al 20%. Para este proceso las cepas deben ser puras de un cultivo de 18-24
horas, y debe hacerse control de viabilidad y esterilidad para poder determinar la efectividad del
proceso, para ello se toman más o menos del 10% de los viales, y se reconstituyen en caldo nutritivo
estéril y se siembra en un medio adecuado de acuerdo a la cepa e incuban por 18 horas, transcurrido
ese tiempo se espera observar crecimiento de las cepas con las mis mas características de las que se
aislaron inicialmente (Gao et al, 1995).
Las desventajas que se pueden presentar en este tipo de conservación bacteriana son los altos costos
por la adquisición de equipos comerciales y los cambios que pueden sufrir algunas cepas bacterianas
durante el proceso de recuperación, como cambios en la morfología, características físicas, perdida de
plásmidos y algunas veces cambios en la población (Snell, J.J.S, 1984).
2.4 PAPEL PROTECTOR DE LOS CRIOPROTECTORES
La función principal de los crioprotectores es prevenir el daño ocasionado a las células por la
criopreservación, tienen la capacidad de actuar como radical hidroxilo y estabilizar la estructura de las
membranas de las células, presentan habilidades de penetrar las memb ranas de las células y producen
una protección intra y extra celular contra la congelación (Miura, 1994).
Los agentes crioprotectores funcionan disminuyendo la “Tensión termal” fuerza que causa el
rompimiento de células y fractura de órganos helados, causada principalmente por la expansión del
volumen de agua durante la formación de hielo (Gao et al, 1995).
Algunos agentes crioprotectores empleados en procesos de congelación y liofilización son el glicerol,
y la leche descremada respectivamente. Sin emb argo, se emplean para estos procesos otras sustancias
26
como el dextran, la gelatina, la glucosa, lactosa, el manitol, el sorbitol y la sacarosa que también
protegen la membrana extracelular (Miura, 1994).
2.5 GENERALIDADES DE LAS CEPAS BACTERIANAS EN ESTUDIO
2.5.1 BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Las bacterias Gram positivas poseen varias características que ayudan a diferenciarlas de los
microorganismos Gram negativos, estas son el elevado contenido de glucopéptidos y bajo contenido
lipídico de sus paredes celulares, lo cual les permite retener el colorante de cristal violeta de la tinción
de Gram (Desarrollada por el médico Danés Hans, Cristian Gram; de aquí su nombre) debido a que los
alcoholes y otros solventes orgánicos no penetran en las paredes celulares, deficientes en lípidos. Son
en general más resistentes a los efectos de la desecación, el calor y la luz solar, así como la acción de
sustancias químicas (Mattar y Melo, 1998). Las paredes celulares son las capas más externas de estos
microorganismos (Incluyendo las cápsulas), esencialmente gruesas(20-80nm) y consisten en un 50-
60% de péptido glicano, extensivamente entrecruzado en tres dimensiones, para formar una red
polimérica gruesa; el restante esta compuesto de ácidos teicóicos, ácidos teicurónicos y
lipopolisacáridos en bajas proporciones. Todas las células Gram positivas poseen un polímero lineal
de ácido N- acetilmurámico que cruza hacia el polímero adyacente. Los ácidos teicóicos, están unidos
al ácido murámico de la cepa de peptidoglicano y se presentan en dos formas principales: ácido ribitol
teicóico y ácido glicerol teicóico. En general hay polímeros largos ya sea de ribitol (Un alcohol azúcar
de cinco carbonos) o un glicerol (alcohol azúcar de tres carbonos) unidos entre sí a través de puentes
fosfodiester. Sin embargo, los grupos hidroxil de ribitol o subunidades de glicerol están unidos a
diferentes azucares o aminoácidos. Debido a que estos ácidos teicóicos son altamente antigénicos
(Inducen en el huésped la producción de anticuerpos que reaccionan contra estos) parece que se
extienden a través de la capa de peptidoglicano, y por lo tanto brindan determinantes antigénicos
utilizados en la identificación serológica de muchos grupos y especies de bacterias Gram positivas
27
(Howard, 1983; Wesley, 1993). Para la mayor parte de las proteínas no se encuentran como
constituyentes de la pared celular de este grupo, una excepción es la proteína M del Streptococcus del
grupo A .
2.5.1.1 Staphylococcus aureus: Aerobio facultativo, que convierte el peróxido de hidrógeno en agua
por poseer la enzima catalasa, fermenta azucares, a las pruebas de manitol y coagulasa positivo (Brock,
1982).
2.5.1.2 Staphylococcus epidermidis: Aeorbio facultativo, catalasa positivo, coagulasa negativo,
sensible a novobiocina (Brock, 1982).
2.5.1.3 Streptococcus mutans: Coco que se adhiere a los dientes, catalasa negativa, hemólisis alfa,
pertenece al Streptococcus del grupo viridans (Brock 1982).
2.5.1.4 Enterococcus faecium: Cocos en cadena que se caracterizan por la producción de ácido
láctico, no forman gas a partir de glucosa, catalasa negativa (Brock, 1982).
2.5.1.5 Bacillus subtilis: Bacilos con endosporas que principalmente ocupan posición central,
aerobios facultativos, catalasa positivos (Brock, 1982).
2.5.1.6 Listeria monocytogenes: Catalasa positivo, motilidad positiva de 20-25ºC por 48-72 horas,
Beta-hemolítico (Brock, 1982).
2.5.2 CEPAS GRAM NEGATIVAS
La pared celular de las bacterias Gram negativas es más compleja desde el punto de vista químico,
estructuralmente poseen una membrana citoplasmática fosfolipídica, rodeada por una capa de
peptidoglicano que delimitan el espacio periplasmático, así como una pared externa que contiene
elementos intercalados como lipopolisacáridos (LPS), moléculas construidas sobre la región core y una
cadena lateral. El LPS es un complejo lipídico en el que intervienen, un lípido A (Disacárido de
glucosamina) un polisacárido, de extrema importancia por su toxicidad para los animales, recibiendo el
nombre de endotoxina; aunque esta se encuentra asociada principalmente con el lípido A, mientras que
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el polisacárido constituye el antígeno O somático. Otros elementos de la membrana son lipoproteínas,
porinas y otras proteínas las cuales son bastante complejas e irradian los flagelos, las fimbrias o pilis.
Al microscopio con la tinción de Gram estos microorganismos se observan rosados por tomar el
colorante de fucsina de la técnica debido a que el colorante en estas bacterias actúa como un solvente
de los lípidos presentes, los poros de la pared se aumentan de tamaño y el complejo cristal violeta
menos yodo se libera (Howard, 1983; Wesley 1993).
2.5.2.1 Pseudomonas aeruginosa: Bacilos con flagelos polares, no forman gas a partir de glucosa,
oxidasa positivos, no fermentadores, poseen cápsula (Brock, 1982).
2.5.2.2 Escherichia coli: Habitante de vía intestinal, sintetiza vitamina K en el intestino, aerobio
facultativo, produce ácido a partir de glucosa, catalasa positivo, oxidasa negativa (Brock, 1982).
2.5.2.3 Shigella sp: Bacilo, oxidasa negativa, catalasa positiva, muy relacionado con E. coli (Brock,
1982).
2.5.2.4 Salmonella sp: Son mótiles, forman gas a partir de glucosa, son bacilos Gram negativos
(Brock, 1982).
2.5.2.5 Klebsiella sp: Bacilos con cápsula, forma gas a partir de glucosa, oxidasa negativo (Brock,
1982).
2.5.2.6 Pasteurella multocida: Son bacilos pleomórficos presentan gránulos bipolares, oxidasa
positiva (Brock, 1982).
29
3. JUSTIFICACIÓN
En todos los laboratorios de microbiología se hace necesaria la preservación de
microorganismos ya sea para fines docentes, de información, o de investigación,
características que hacen que se estudie diversas técnicas y mecanismos para la
preservación de estas.
Para el estudio hay que tener en cuenta que las bacterias poseen diversas
composiciones estructurales y bioquímicas, propiedades que indican que no se podrá
establecer un protocolo universal.
En los ensayos de los diversos métodos de preservación ocurren varios eventos como
la muerte de una proporción de células de una población y aunque este fenómeno no
sea muy significativo cuando se emplean altas concentraciones celulares, la reducción
de estas puede producir la selección de una población resistente de células
supervivientes y se puede introducir la posibilidad de cambio en las características de
la cepa en conservación (Kirsop et al, 1984). El método de preservación debe retener
el mayor número de células viables para que la población superviviente se asemeje lo
más estrechamente posible a la población original.
30
La muerte de las células durante estos procesos en el futuro produce inaceptables
niveles de viabilidad, para evitar pérdidas, la cepa debe ser sometida a un proceso que
minimice estas, por ejemplo, el empleo de sustancias crioprotectoras que eviten el
daño celular causado por la formación de cristales y aumento de electrolitos durante
la congelación y la temperatura final de almacenamiento (Feltham et al, 1978), para
que una vez las cepas en conservación sobrevivan largos periodos.
En este estudio se evaluara el uso de algunos métodos de conservación para cepas
bacterianas como Silica-Gel + Gelatina al 10%, Glicerol al 3% y Leche Descremada
al 10%, y teniendo en cuenta el estudio realizado en el laboratorio de Microbiología
especial de la Pontificia Universidad Javeriana “ COMPARACIÓN DE TRES TÉCNICAS DE
PRESERVACIÓN POR CONGELACIÓN A –20 ºC PARA EL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS
GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS”, se evaluarán durante un tiempo mayor a 4
semanas, en este caso 3 meses para determinar el tiempo máximo de conservación de
cada técnica y la concentración celular será mayor.
31
4. OBJETIVOS
4.1. GENERAL
Establecer un método eficaz para el mantenimiento y conservación de cepas
bacterianas a mediano plazo.
4.2. ESPECÍFICOS
Comparar la viabilidad de bacterias Gram positivas y Gram negativas sometidas a
Congelación en Glicerol al 3%, Leche Descremada al 10% y Silica Gel + Gelatina al
10% durante tres meses.
Determinar cual de los tres métodos es más apropiado para el mantenimiento y
conservación de cepas bacterianas.
Implementar estos métodos en el laboratorio de Microbiología especial de la
Pontificia Universidad Javeriana debido a que en este no se practica nada diferente a
los repiques.
Mantener cepas bacterianas viables en el laboratorio de microbiología de la Pontificia
Universidad Javeriana para que se puedan establecer como un recurso de
información y de apoyo para la investigación.
32
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 TIPO DE ESTUDIO
Este estudio fue realizado en el laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana, como modelo experimental de tipo comparativo, en el que se evaluó el uso de Caldo Tripticasa Soya con adición de glicerol al 3%, leche descremada al 10% y Discos de Gelatina al 10% sobre Silica-Gel como métodos de mantenimiento a mediano plazo y de preservación de cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas.
5.2 HIPÓTESIS
Ø Hipótesis nula (Hn): No existe relación entre las variables concentración bacteriana recuperada, el
tipo de sistema de preservación empleado y el tiempo de preservación según la cepa bacteriana, es
decir, el resultado se debe al azar.
Ø Hipótesis alterna (Ha): Plantea que existe una relación entre la concentración de cada cepa
bacteriana recuperada, la técnica empleada y el tiempo de preservación.
5.3 MANEJO DE DATOS
El manejo de datos se realizo por medio del programa Start View 4.0. En el que se evaluaron las
variables: Tiempo vs. Concentración de bacterias, Evaluación de recuperación de cepas bacterianas en
cada técnica vs. Tiempo, Viabilidad vs Tiempo, y evaluación de recuperación de cepas bacterianas en
cada técnica vs. Pureza.
5.4 CEPAS BACTERIANAS
Las cepas usadas en este estudio proceden del Cepario de Microbiología Especializada de la Pontificia
Universidad Javeriana mantenidas normalmente por repiques consecutivos.
Ø Cocos Gram positivos: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium,
Streptococcus mutans.
Ø Bacilos Gram positivos: Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis.
33
Ø Bacilos Gram negativos: Escherichia coli, Shigella sp, Salmonella sp, Klebsiella sp, Pseudomonas
aeruginosa, Pasteurella multocida.
5.5 MÉTODOS A ESTUDIAR
Ø Congelación a –20ºC en Leche Descremada al 10% (Skim Milk)
Ø Congelación a –20ºC en Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3%
Ø Congelación a –20ºC en Discos de Gelatina al 10% sobre Silica-Gel
5.6 TIEMPO DE EVALUACIÓN
Las cepas se preservaron por un periodo de tres meses y las evaluaciones de viabilidad y
recuperaciones respectivas se realizaron mensualmente y por duplicado.
Para el ensayo se tomó una colonia de cada una de las cepas bacterianas a partir de cultivos jóvenes
previamente incubados a 37ºC durante 24 horas, y se suspendieron en Caldo Eugebion, estas fueron
llevadas a escala 2 de turbidez de Mc. Farland correspondiente a 6x10^8 UFC/ml.
Posteriormente se procedió a montar cada uno de los métodos de preservación para evaluar viabilidad
bacteriana:
5.6.1 CONGELACIÓN A –20ºC EN LECHE DESCREMADA AL 10% (SKIM
MILK)
El polvo de leche desnatada se emplea como aditivo que mejora las condiciones de crecimiento de los
microorganismos presentes, y el uso de esta ofrece un soporte sólido para la congelación (Gibson y
Khoury, 1986), por la presencia de sustancias conocidas como osmoprotectoras, osmolitos o solutos
compatibles. Los osmolitos son acumulados usualmente en las células durante periodos de estrés
34
osmótica y pueden estabilizar funciones fisiológicas inestables de proteínas citoplasmáticas u otras
estructuras bajo estas condiciones (Ryser y Marth, 1999). El medio fue basado en la fórmula descrita
por Gibson y Khoury (1986) y Gherna (1994) con las siguientes modificaciones.
Ø El ensayo se montó por duplicado para cada cepa, dispensando 9ml de Leche Descremada al 10%
(Anexo No 1) en tubos tapa rosca (16x150 mm) y 1ml de cada una de las suspensiones
bacterianas, llevando a diluciones de 1/10, a continuación de estas diluciones se tomaron alicuotas
de 1ml y se dispensaron en viales plásticos.
Ø Los viales fueron llevados a congelación a –20ºC.
5.6.2 CONGELACIÓN A –20ºC EN CALDO TRIPTICASA SOYA CON ADICIÓN DE
GICEROL AL 3%
El caldo Tripticasa Soya es un medio altamente nutritivo que se emplea para cultivar gran variedad de
cepas bacterianas; el glicerol se adiciona como crioprotector que pasa a través de la membrana celular
y produce una protección intra y extracelular contra la congelación (Gao et al, 1995).
Ø Al igual que con la Leche Descremada, cada cepa bacteriana se montó por duplicado dispensando
9ml de Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3% (Anexo No 2) en tubos tapa rosca
(16x150mm) y 1ml de las suspensiones para llevar a diluciones de 1/10 y se alicuotó de 1ml en
viales plásticos y se congelaron a –20ºC.
5.6.3 CONGELACIÓN A –20ºC EN DISCOS DE GELATINA 10% SOBRE
SILICA-GEL
El método originalmente descrito por Stamp (1947), se basa en que los microorganismos son
suspendidos en una Gelatina nutritiva, esta se pone en cajas de Petri hasta que solidifique, luego de
esto se sacan los discos los cuales son puestos a des ecación almacenados sobre Silica-Gel, cuya
35
función es atrapar la mayor cantidad de moléculas de agua para evitar la formación de cristales de
hielo que afecten la integridad celular.
Ø El ensayo se montó por duplicado para cada cepa dispensando 9ml de gelatina líquida (Anexo
No 3) en tubos tapa rosca (16x150mm) y 1ml de cada suspensión bacteriana llevando a diluciones
de 1/10 cuya concentración corresponde a 6x10^7 UFC/ml.
Ø Luego estas suspensiones, se dispensaron en cajas de Petri pequeñas y se llevaron a refrigerar
(4ºC) para su solidificación.
Ø Posteriormente se perforaron los medios con una pipeta Paster estéril para extraer discos de 6mm
de diámetro, para una concentración final de 7,408x10^6 UFC por disco, que se colocaron sobre el
algodón en los tubos con Silica-Gel previamente activados a 180º C durante dos horas en calor
seco; por último los tubos fueron sellados con parafilm y se llevaron a congelación a –20ºC.
5.7 DESCONGELACIÓN DE CEPAS
Cuando las cepas bacterianas van a ser recuperaradas, debe realizarse una descongelación rápida,
colocando las suspensiones a 37ºC en baño María o incubadora durante media hora (Gerhardt,
1994); en nustro ensayo, después de transcurrido cada mes de preservación para cada cepa
bacteriana en las técnicas de Leche Descremada al 10% y Caldo Tripticasa Soya con adición de
Glicerol al 3%, se retiraron dos viales de cada cepa y se sometieron a descongelación rápida en
incubadora en el tiempo y la temperatura ya mencionadas; en el caso de los tubos con los Discos de
gelatina sobre Silica –Gel, primero se retiraron los discos y se suspendieron en 9ml de Caldo
Eugebion y posteriormente se incubaron a 37ºC durante 30 minutos.
5.8 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD
Después de la descongelación, las cepas dispuestas en los viales con Leche Descremada al 10% y
Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3% se resuspendieron en 9ml de Caldo Eugebion y se
obtuvo nuevas diluciones de 1/100 para cada cepa en los distintos métodos; de estas suspensiones se
36
tomaron 100λ y se montaron en microplacas con pozos de fondo redondo y se leyeron en un
MultiSkan (Ref 340 Labsystem) a 540nm, con el fin de comparar la viabilidad de cada cepa bacteriana
en los métodos ya mencionados en intervalos mensuales durante tres meses; se continuo la incubación
durante 24 horas y se realizó una segunda lectura de la manera descrita anteriormente, para establecer
la viabilidad posterior a la aplicación de cada técnica y de igual forma se realizaron lecturas mensuales
durante tres meses.
Con los datos arrojados de las lecturas se realizaron una serie de promedios con el propósito de
comparar el comportamiento de las cepas bacterianas en estudio, separadas por grupos con respecto a
su pared en Cocos Gram Positivos, Bacilos Gram Positivos y Bacilos Gram negativos en los métodos
estudiados en intervalos mensuales durante tres meses.
5.9 DETERMINACIÓN DE RECUPERACIÓN
En este proceso, después de montar las últimas diluciones de 1/100 para cada una de las cepas en los
distintos métodos y antes de montar las placas donde se evalúo la viabilidad, se tomaron 10λ de cada
suspensión y se sembraron en Agar Columbia las cepas Gram positivas y en Agar MacConkey las
cepas Gram negativas excepto la cepa de Pasteurella multocida que se sembró en Agar Columbia
porque en MacConkey no crece. Se incubaron a 37ºC durante 24 horas con el fin de obtener el
crecimiento típico para cada cepa bacteriana, en donde se estableció la integridad celular, la capacidad
metabólica, y la viabilidad posterior a la aplicación de cada técnica.
5.10 DETERMINACIÓN DE PUREZA
En esta etapa, la pureza se verificó sobre las cajas mediante la realización de pruebas
bioquímicas a las cepas bacterianas utilizando las guías de identificación de Koneman
(1999), así:
37
5.10.1 CEPAS GRAM POSITIVAS
5.10.1.1 COCOS: Coloración de Gram, Catalasa, Coagulasa, Sensibilidad a la
novobiocina, DNasa, Hemólisis en Agar Sangre de Cordero, Sensibilidad a la
optoquina, Solubilidad en bilis, Bilis esculina, Crecimiento en NaCl 6.5%.
5.10.1.2 BACILOS: Coloración de Gram, Catalasa, Hemólisis en Agar Sangre de
Cordero, Crecimiento en NaCl 6.5%, Movilidad a 25ºC y a 37ºC, Bilis esculina.
5.10.2 CEPAS GRAM NEGATIVAS
5.10.2.1 BACILOS: Aislamiento en Agar EMB, Lactosa, Coloración de Gram,
Oxidasa, TSI, H2S/Gas, LIA, Citrato, Urea, Indol, Motilidad, RM, VP.
Nota: Cualquier contaminación con otros microorganismos en estos ensayos arrojaría
lecturas falsas y no se podría determinar la efectividad de los métodos empleados
(Kirsop et al, 1984).
38
6. RESULTADOS
6.1 VIABILDAD BACTERIANA POSTERIOR A LA CONSERVACIÓN EN CADA TECNICA: Se evaluó la recuperación de las bacterias en intervalos mensuales durante 3 meses, después de aplicados los métodos de conservación por congelación a –20º C, en cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas (fig.1,2,3,4,5,6,7,8,9,19,11 y 12) FIGURA 1.
C O N S E R V A C I Ó N D E S t . a u r e u s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L
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Leche 10%Gl icero l 3%Gela t ina 10%
39
FIGURA 2.
FIGURA 3.
C O N S E R V A C I Ó N D E S t . e p i d e r m i d i s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L
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Leche 10%Gl icero l 3%Ge la t i na 10%
40
FIGURA 4.
FIGURA 5.
C O N S E R V A C I Ó N D E S t . m u t a n s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L
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C O N S E R V A C I Ó N D E L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L
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Leche 10%Gl icero l 3%Ge la t i na 10%
41
FIGURA 6.
FIGURA 7.
C O N S E R V A C I Ó N D E B . s u b t i l i s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L
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Leche 10%Gl icero l 3%Ge la t i na 10%
CONSERVACIÓN DE E .coli EN LECHE DESCREMADA AL 10 %, CALDO TRIPTONA SOYA CON GLICEROL AL 3 % Y DISCOS DE GELATINA AL 10 % SOBRE SILICA GEL
0
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Leche 10%
Glicerol 3%Gelatina 10%
42
FIGURA 8.
FIGURA 9.
CONSERVACIÓN DE Shigella sp EN LECHE DESCREMADA AL 10 %, CALDO TRIPTONA SOYA CON GLICEROL AL 3 % Y DISCOS DE GELATINA AL 10 % SOBRE SILICA GEL
0
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Leche 10%Gl icero l 3%
Ge la t i na 10%
CONSERVACIÓN DE Salmonella sp EN LECHE DESCREMADA AL 10 %, CALDO TRIPTONA SOYA CON GLICEROL AL 3 % Y DISCOS DE GELATINA AL 10 % SOBRE SILICA GEL
0
100000000
200000000
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Leche 10%
Gl icero l 3%Ge la t i na 10%
43
FIGURA 10.
FIGURA 11.
C O N S E R V A C I Ó N D E K l e b s i e l l a s p E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L
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Leche 10%Gl icero l 3%Gela t ina 10%
C O N S E R V A C I Ó N D E P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L
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UFC
/cc)
Leche 10%Gl icero l 3%Ge la t i na 10%
44
FIGURA 12.
CONSERVACIÓN DE Pasteurella multocida EN LECHE DESCREMADA AL 10 %, CALDO TRIPTONA SOYA CON GLICEROL AL 3 % Y DISCOS DE GELATINA AL 10 % SOBRE SILICA GEL
0
100000000
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500000000
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Mes 01 Mes 02 Mes 03
TIEMPO EN MESES
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c)
Leche 10%Glicerol 3%Gelatina 10%
45
6.2 EVALUACIÓN DE CADA TÉCNICA DE MANTENIMIENTO EN LOS GRUPOS DE
BACTERIAS EVALUADOS : Se realizó comparación en los grupos de Bacilos Gram+, Bacilos Gram- y Cocos Gram+ para cada una de las técnicas utilizadas (fig. 13,14 y 15).
FIGURA 13.
Concentración de Bacterias Recuperadas en los grupos de estudio mediante Congelación a -20ºC en Leche Descremada al 10%
0
100000000
200000000
300000000
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600000000
1 2 3
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Cocos G+Bacilos G+Bacilos G-
46
FIGURA 14.
FIGURA 15.
Concentración de Bacterias Recuperadas en los grupos de estudio mediante Congelación a -20ºC en Caldo Triptona Soya con adición de Glicerol al 3%
0
100000000
200000000
300000000
400000000
500000000
600000000
700000000
1 2 3
TIEMPO EN MESES
Pro
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once
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ción
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Bac
teri
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x10^
8 U
FC/c
c)
Cocos G+Bacilos G+Bacilos G-
C o n c e n t r a c i ó n d e B a c t e r i a s R e c u p e r a d a s e n l o s g r u p o s d e e s t u d i o m e d i a n t e C o n g e l a c i ó n a - 2 0 º C p o s t e r i o r a l a D e s e c a c i ó n s o b r e S i l i c a G e l e n D i s c o s d e G e l a t i n a A L 1 0 %
0
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1 5 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0 0
4 5 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0
1 2 3
T I E M P O E N M E S E S
Pro
med
io d
e C
once
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ción
de
Bac
teri
as R
ecup
erad
as
(7.4
08x1
0^8
UFC
/Dis
co)
C o c o s G +B a c i l o s G +B a c i l o s G -
47
. 6.3 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A CADA TÉCNICA 6.3.1 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A LA APLICACIÓN DE LECHE DESCREMADA AL 10%: Se evaluó la recuperación de las bacterias posterior a una incubación de 24 horas a 37º C en interva los mensuales durante 3 meses, después de aplicados los métodos de conservación por congelación a –20º C, en cepas bacterianas Gram+ y Gram- (fig. 16).
FIGURA 16.
Recuperación de Cepas Gram + y Gram - en Leche Descremada al 10 %
0
1000000000
2000000000
3000000000
4000000000
5000000000
6000000000
7000000000
8000000000
9000000000
St.aure
us
St.epid
ermidi
s
E .faec
ium
St.muta
ns
Lister
ia mon
ocyto
gene
s
B .sub
tilis
E .coli
Shigell
a sp
Salmon
ella sp
Klebsie
lla sp
Pseud
omon
as ae
rugino
sa
Pasteu
rella
multoc
ida
CEPAS BACTERIANAS
CO
NC
EN
TRA
CIÓ
N D
E B
AC
TER
IAS
(6 *
10^
8 U
FC/c
c)
Promedios 30min24 h mes 0124 h mes 0224 h mes 03
48
6.3.2 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A LA APLICACIÓN DE CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN DE GLICEROL AL 3%: Se evaluó la recuperación de las bacterias posterior a una incubación de 24 horas a 37º C en intervalos mensuales durante 3 meses, después de aplicados los métodos de conservación por congelación a –20º C, en cepas bacterianas Gram+ y Gram- (fig.17).
FIGURA 17.
6.3.3 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A LA APLICACIÓN DE DISCOS DE GELATINA AL 10% DESECADOS SOBRE SILICA GEL: Se evaluó la recuperación de las
Recuperación de Cepas Gram + y Gram - en Caldo Triptona Soya con Glicerol al 3%
0
1000000000
2000000000
3000000000
4000000000
5000000000
6000000000
7000000000
8000000000
St.aure
us
St.epid
ermidi
s
E .faec
ium
St.muta
ns
Lister
ia mon
ocyto
gene
s
B .sub
tilis
E .coli
Shigell
a sp
Salmon
ella sp
Klebsie
lla sp
Pseud
omon
as ae
rugino
sa
Pasteu
rella
multoc
ida
CEPAS BACTERIANAS
CO
NC
EN
TRA
CIO
N D
E B
AC
TER
IAS
RE
CU
PE
RA
DA
S (6
* 1
0^8
UFC
/cc)
Promedios 30min24 h mes 0124 h mes 0224 h mes 03
49
bacterias posterior a una incubación de 24 horas a 37º C en intervalos mensuales durante 3 meses, después de aplicados los métodos de conservación por congelación a –20º C, en cepas bacterianas Gram+ y Gram- (fig.18).
FIGURA 18.
Recuperación de Cepas Gram + y Gram - en Discos de Gelatina al 10% Desecados sobre Silica Gel
0
500000000
1000000000
1500000000
2000000000
2500000000
3000000000
3500000000
4000000000
4500000000
5000000000
St.aure
us
St.epid
ermidi
s
E .faec
ium
St.muta
ns
Lister
ia mon
ocyto
gene
s
B .sub
tilis
E .coli
Shigell
a sp
Salmon
ella sp
Klebsie
lla sp
Pseud
omon
as ae
rugino
sa
Pasteu
rella
multoc
ida
CEPAS BACTERIANAS
CO
NC
EN
TRA
CIO
N D
E B
AC
TER
IAS
RE
CU
PE
RA
DA
S (7
.408
* 1
0 ^6
UFC
/Dis
co)
Promedios 30min24 h mes 0124 h mes 0224 h mes 03
50
6.4 DETERMINACIÓN DE IDENTIDAD Y PUREZA BACTERIANA: para este
procedimiento se siguieron las guías de identificación de Koneman (1999); los
resultados obtenidos son presentados en las tablas No 1, 2 y 3 y fueron constantes a
lo largo del estudio, demostrando así la pureza de cada una de las cepas en los
diversos métodos de preservación y mantenimiento bacterianos aplicados.
TABLA No 1. RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS
St.aureus St. epidermidis St.mutans E. faecium
Colonias características
en Agar Columbia
Colonias elevadas redondas con
borde continuo, lisas brillantes con
pigmento beis.
Colonias redondas de
borde continuo, lisas, mucoides,
brillantes.
Colonias redondas de
borde continuo, lisas, mucoides con superficie
granulosa.
Colonias redondas,
lisas, cremosas de color blanco
Morfología en tinción de
Gram
Cocos Gram positivos
Cocos Gram positivos
Cocos Gram positivos
Cocos Gram
positivos
Catalasa Positiva Positiva Negativa Negativa
Coagulasa Positiva Negativa NR NR
Sensibilidad a la novobiocina
NR Sensible NR NR
Dnasa Positiva Negativa NR NR
Hemólisis en Agar Sangre de
Cordero
Beta Gamma Gamma Gamma
Sensibilidad a la optoquina
NR NR Resistente NR
Solubilidad en NR NR Negativa NR
51
bilis
Bilis esculina NR NR Positiva Positiva
Crecimiento en NaCl 6.5%
NR NR Positivo Positivo
NR: No se realizó
TABLA No 2. RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM POSITIVOS
Listeria monocytogenes B. subtilis
Colonias características en Agar Columbia
Colonias pequeñas redondas, elevadas, levemente convexas.
Colonias altamente irregulares, brillantes.
Morfología en tinción de Gram
Bacilo corto delgado Gram positivo
Bacilo Gram positivo esporulado
Catalasa Positiva Positiva
Hemólisis en Agar Sangre de Cordero
Beta Beta
Crecimiento en NaCl 6.5% Negativo Positivo
Movilidad
25ºC
37ºC
Positiva
Negativa
Negativa
Positiva
Bilis esculina Positiva Positiva
52
TABLA No 3. RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS
E. coli Salmonella spp Shigella spp Klebsiella spp Pseudomonas aeruginosa
Pasteurella multocida
Colonias características en medio EMB
Colonias circulares,
convexas de borde continuo o ligeramente
ondulado, con brillo verde
metálico, lactosa positivas.
Colonias mucosas
circulares, planas, convexas
de borde continuo, color púrpura claro o
semitranslúcidas, lactosa negativas.
Colonias redondas
brillantes de borde continuo,
mucosas de color púrpura claro o
semitranslúcidas, lactosa negativas.
Colonias circulares, de
borde continuo o ligeramente
ondulado, con brillo verde
metálico, lactosa positivas.
Colonias mucosas,
brillantes, de borde continuo, color púrpura claro, lactosa
negativas.
No crece
Morfología en tinción de Gram
Bacilos Gram negativos
Bacilos Gram negativos
Bacilos Gram negativos
Bacilos Gram negativos
Bacilos Gram negativos
Bacilos Gram negativos
OXIDASA Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo
TSI A/A K/A K/A A/A K/K K/K
H2S/GAS (-) / (+) (+) / (+) (-) / (-) (-) / (+) (-)/(-) (-)/(-)
LIA K/K K/K K/A K/K K/K K/K
CITRATO Negativo Positivo Negativo Posit ivo Positivo Negativo
UREA Negativa Negativa Negativa Positiva Positiva Negativo
INDOL Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo
53
MOTILIDAD (+) / (-) (+) (-) (-) (+) (-)
RM Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo
VP Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
54
TABLA No 4 PORCENTAJES DE RECUPERACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS EN LOS MÉTODOS EMPLEADOS POSTERIOR A UNA INCUBACIÓN
DE 24 HORAS A 37ºC.
LECHE 10% GLICEROL 3% GELATINA 10%
Mes 01 Me s 02 Mes 03 Mes 01 Mes 02 Mes 03 Mes 01 Mes 02 Mes 03
St.aureus 13.80% 15.85% 40.70% 7.72% 5.64% 3.32% 7.10% 8.23% 14.50% St.epidermidis 14% 22.40% 58.76% 7.59% 6.65% 4.37% 6.76% 9.67% 10.96%
E.faecium 12.71% 14.26% 33.94% 8.08% 7.46% 8.12% 7.43% 9.87% 15.16%
St.mutans 13.77% 14.62% 24.30% 9.51% 8.66% 8.26% 8.24% 8.60% 10.99%
L.monocytogenes 15.64% 20.62% 73.75% 8.69% 8.15% 7.22% 4.87% 6.91% 2.89%
B.subtilis 11.84% 12.21% 14.13% 6.91% 7.40% 8.88% 5.82% 6.30% 2.31%
E.coli 14.49% 14.65% 46.52% 9.69% 9 .39% 8.53% 6.34% 26.42% 30.99%
Shigella sp 16.12% 46.98% 74.84% 12.19% 10.69% 9.015 7.18% 23.60% 29.41%
Salmonella sp 15.40% 27.33% 46.93% 12.49% 9.08% 8.44% 5.81% 17.26% 14.34%
Klebsiella sp 11.02% 10.71% 10.17% 9.03% 8.585 8.41% 6.21% 6.33% 3.00%
Ps aeruginosa 16.18% 19.62% 25.79% 8.70% 8.67% 6.76% 10.57% 26.00% 1.76%
P multocida 12.83% 20.97% 40.21% 9.09% 8.00% 7.32% 8.58% 26.05% 2.66%
6.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos obtenidos se analizaron por el test de esfericidad de Bartlett´s en el programa
Start View 4.0 para establecer la correlación de los diferentes métodos de
mantenimiento aplicados; los valores significativos obtenidos se muestra en la tabla
No.5.
Leche descremada 10% Glicerol 3% Gelatina 10%
1 mes <.0001 <.0001 <.0001
2 mes <.0001 <.0001 <.0001
3 mes .0007 .0007 <.0001
Valor p <.0001 <.0001 <.0001
7. DISCUSIÓN
55
La preservación de cepas bacterianas tiene por objetivo mantener por un largo periodo
de tiempo a los microorganismos viables, puros, sin variaciones ni mutaciones, ya que
estas cepas se emplean generalmente para investigación y educación. Existen muchos
métodos de preservación bacteriana, pero no todas las cepas se comportan en forma
similar cuando son sometidas al mismo proceso, por esta razón se hace necesario probar
varias técnicas para poder establecer la mejor para los distintos géneros bacterianos
(Kirsop y Snell, 1984).
En el proceso de congelación a –20ºC ocurren algunos fenómenos como la formación
de cristales de hielo y el aumento de la concentración de electrolitos que hacen que se
afecte la integridad celular que conducen a la muerte de las bacterias; para evitar la
perdida de viabilidad ocasionada por la congelación, se adicionan a las suspensiones
bacterianas sustancias crioprotectoras que evitan dichos fenómenos, como el Glicerol y
la Leche Descremada (Gao et al, 1994) y desecantes como el Silica Gel (Perkins, 1962);
otro riesgo que ocurre en los procesos de preservación es la contaminación , la cual
puede terminar en pérdida de la cepa original por selección de cepas contaminantes;
para prevenir este riesgo, se debe verificar la pureza de los cultivos bacterianos antes de
montar las técnicas mediante la realización de pruebas bioquímicas, el material
empleado debe ser previamente esterilizado, la manipulación debe ser adecuada y las
instalaciones donde se realiza la manipulación deben ser desinfectadas y trabajar
preferiblemente en cámaras de flujo laminar (Kirsop et al, 1984).
7.1 EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD BACTERIANA POSTERIOR A LA
CONSERVACIÓN EN CADA TÉCNICA.
56
En el primer mes de preservación bacteriana a –20ºC en Leche Descremada al 10% se
alcanzó la mayor concentración de microorganismos recuperados para las cepas:
St.aureus, E.faecium, St.mutans y B.subtilis, mientras que al tercer mes de preservación
fue para B.subtilis y Klebsiella sp. En la preservación a -20ºC en Caldo Tripticasa Soya
con adición de Glicerol al 3% se alcanzó la mayor concentración de microorganismos
recuperados en el primer mes para: St.aureus, E.faecium y B.subtilis, mientras que al
tercer mes de preservación fue para: St.aureus, y E.faecium. Finalmente, en la
preservación a –20ºC posterior a la desecación sobre Silica Gel en Discos de Gelatina al
10%, la mayor concentración de microorganismos recuperados en el primer mes fue
para: B. subtillis y Klebsiella sp, y transcurridos los tres meses continuó igual. Como se
observa (Fig.1-12), las cepas de St.aureus, E.faecium y B.subtilis respondieron
satisfactoriamente a las tres técnicas empleadas en este estudio y estas bacterias tienen
en común ser Gram positivas, sugiriendo que su sobrevivencia se deba a la
composición de su pared que consta principalmente de un 60% de peptidoglicano, que
es una molécula con un alto contenido de azúcar extensivamente entrecruzada para
formar una red polimérica gruesa (mosaico) que rodea a la célula completamente;
ácidos teicóicos, que son polímeros de ribitol fosfato o glicerol fosfato que se unen entre
sí a través de enlaces fosfodiester, estos polímeros se hallan asociados a la membrana
celular, pared o cápsula y están ligados covalentemente al peptidoglicano a través de
ácidos murámicos, relación que interviene en la rigidez de la pared celular; y
lipopolisacáridos en baja proporción, que confieren una capa gruesa y rígida que le
otorga a las células protección frente al proceso de congelación (Moat, A.G. y Foster,
J.W., 1988).
57
7.2 EVALUACIÓN DEL PORCENTAJE DE MUERTE BACTERIANA
En el método de congelación a – 20ºC en Leche Descremada al 10% observamos que el
porcentaje de muerte para las cepas de St.aureus, St.epidermidis, E.faecium, St.mutans,
B.subtilis y Klebsiella sp es similar entre el primero y segundo mes, y entre el segundo
y tercer mes, aclarando que para las cuatro primeras cepas St.aureus, St.epidermidis,
E.faecium, St.mutans el porcentaje es de 74,1 %, y para las dos cepas siguientes
B.subtilis y Klebsiella sp es del 27 %. Para las cepas de Shigella sp, Salmonella sp,
Pseudomonas aeruginosa y Pasteurella multocida, la muerte se desacelera entre el
segundo y tercer mes, pasando de un 56,8% entre el primero y el segundo mes a un
50,9 % entre el segundo y tercer mes. Se resalta que las cepas de Listeria
monocytogenes y E.coli, aceleran su muerte entre el segundo y tercer mes pasando de un
29 % entre el primero y segundo mes, a un 75,8 % entre el segundo y tercer mes de
preservación (Fig.1-12).
En la técnica de congelación a –20ºC en caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol
al 3%, podemos ver que las doce cepas bacterianas mueren a un ritmo constante entre el
primer y tercer mes de preservación, sin embargo, se exceptúa la cepa de Pasteurella
multocida, en la que disminuye la pérdida entre el segundo y tercer mes, ya que pasa de
un 17,4 % entre el primero y segundo mes, a un 8,4 % entre el segundo y tercer mes.
También podemos resaltar, que para la cepa de St.aureus, el porcentaje de muerte entre
el primer y el tercer mes de preservación es tan solo de 4,9 %, mientras que para
St.epidermidis, E.faecium, St.mutans, B.subtilis, Listeria monocytogenes, E.coli y
Klebsiella sp, el porcentaje de muerte entre el primer y tercer mes es de 21,7 %, y para
58
Shigella sp, Salmonella y Pseudomonas aeruginosa, el porcentaje de muerte del primer
al tercer mes es de 32,9 % (Fig. 1-12).
En la técnica de congelación a –20ºC en discos de gelatina al 10% desecados sobre
Silica Gel encontramos que para St.aureus, E.faecium, St.mutans y B.subtilis, se acelera
la muerte en un 69 % entre el segundo y el tercer mes , mientras que para E.coli,
Shigella sp, Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa y Pasteurella multocida la
pérdida es de 64,9 % entre el segundo y el tercer mes de preservación, y para
St.epidermidis, Listeria monocytogenes y Klebsiella sp, la pérdida entre el segundo y el
tercer mes es similar al de la pérdida entre el primero y segundo mes que corresponde a
74,4 % (Fig. 1-12).
Se concluye, que las doce cepas bacterianas estudiadas, mueren a medida que va
transcurriendo el tiempo en las tres técnicas empleadas, pero el porcentaje de muerte es
mayor en gelatina al 10% y menor en Glicerol al 3%. El efecto de glicerol se debe a que
es un compuesto químico de bajo peso molecular, no tóxico, capaz de penetrar la
membrana celular y unirse a cualquiera de los electrolitos que se aumentan durante la
congelación y las moléculas de agua que demoran esta misma; atribuyéndosele su gran
papel crioprotector descubierto por Pollee, Smith y Parkes en 1949.
A pesar de los porcentajes de muerte obtenidos en los métodos de leche descremada al
10% y discos de gelatina al 10% sobre silica gel, se puede determinar que estos métodos
fueron eficaces para el mantenimiento de las doce cepas bacterianas estudiadas en esta
investigación.
59
7.3 EVALUACIÓN DE CADA TÉCNICA DE MANTENIMIENTO EN LOS
GRUPOS BACTERIANOS (Gram positivos y Gram negativos)
Al comparar los grupos bacterianos: Cocos Gram Positivos, Bacilos Gram Positivos y
Bacilos Gram negativos en cada una de las técnic as evaluadas (fig. 13,14 y 15), se
observa una mayor recuperación para el grupo de Cocos Gram Positivos en la técnica de
congelación a –20ºC en Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3% a lo largo
del proceso.
En la congelación a –20ºC en Leche Descremada al 10%, en el grupo de Cocos Gram
Positivos se obtuvo una mayor recuperación en el primer mes, sin embargo en el
segundo y tercer mes la recuperación para este grupo fue disminuyendo, siendo
superada por el grupo de los Bacilos Gram Positivos.
En la congelación a –20ºC en Discos de Gelatina al 10% desecados sobre Silica Gel,
se obtuvo una mayor recuperación en el grupo de los Bacilos Gram Positivos a lo largo
del estudio, seguido por el grupo de los Cocos Gram positivos; como se mencionó
anteriormente es probable que esto se deba a la composición de su pared que consta de
péptidoglicanos, ácidos teicoicos y lipopolisacáridos, que los hace resistir al proceso de
congelación (Moat y Foster, 1988).
60
7.4 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A UNA INCUBACIÓN
DE 24h A 37ºC.
Después de la aplicación de cada técnica se evaluó la recuperación bacteriana posterior
a una incubación de 24 horas a 37ºC en intervalos mensuales durante tres meses, los
aspectos más relevantes fueron por ejemplo: para la cepa de St.aureus en la
congelación a –20ºC en Leche Descremada al 10 %, se observa una recuperación
progresiva entre el primero, segundo y tercer mes de un 13.8 %, 15.85 % y un
40.73 % respectivamente (Tabla No 4) , en la congelación a –20ºC en caldo Tripticasa
Soya, la recuperación entre el primero, segundo y tercer mes de preservación es de 7.72
%, 5.64 % y 3,32 % (Tabla No 4), en la congelación a –20ºC en Discos de Gelatina al
10% sobre Silica Gel la recuperación fue de 7.10 %, 8.23 % y 14.54 % (Tabla No 4),
aclarando que estos porcentajes parten de la comparación entre la lectura a los 30
minutos de incubación a 37ºC después de retirar de la congelación y la lectura realizada
a las 24 horas de incubación a 37ºC; podemos concluir que tanto en Le che como en
Gelatina los porcentajes de recuperación fueron aumentando mes a mes indicando que
las cepas fueron adquiriendo una mayor capacidad de recuperación a medida que el
tiempo fue pasando, lo contrario que sucedió en el medio de glicerol que a me dida que
fue transcurriendo el tiempo su capacidad de recuperación fue disminuyendo, dicho
fenómeno presumimos que se deba a que el Glicerol tiene efecto sobre las células para
impedir este proceso, en el ejemplo solo se menciona la cepa de St.aureus, pero este
fenómeno sucedió en la mayoría de las cepas, excepto con la cepa de B.subtilis donde
los porcentajes de recuperación en Glicerol fueron aumentando mes a mes 6,91 %, 7,40
% y 8,88 % respectivamente, este hecho sugiere que tal vez se deba a la producción de
61
esporas de las cepas que se forman en condiciones adversas como la congelación que
evitan que el Glicerol penetre las células; ver (fig. 16, 17 y 18) y (tabla No 4).
7.5 DETERMINACIÓN DE IDENTIDAD Y PUREZA BACTERIANA.
En esta etapa la pureza se verificó sobre las cajas de cultivo mediante la realización de
pruebas bioquímicas utilizando las guías de identificación de Koneman (1999); los
resultados obtenidos son presentados en las tablas 1,2 y 3 y fueron constantes a lo largo
de nuestro estudio , demostrando así la pureza de cada una de las cepas en los tres
métodos de preservación. Este aspecto nos permitió establecer la eficacia de los
métodos empleados, ya que los datos arrojados no fueron falseados por la presencia de
colonias contaminantes, por otra parte al terminar nuestro estudio pudimos recuperar las
cepas inicialmente preservadas, esto quiere decir que los métodos son confiables, que la
manipulación, las instalaciones y el material de trabajo fueron adecuados.
Finalmente se puede establecer una relación entre las variables planteadas en este
trabajo dados los valores p<.0001 obtenidos en el análisis estadístico por el test de
esfericidad de Bartlett´s (tabla No.5) permitiendo aceptar la hipótesis alterna, es decir
que existe un vínculo entre el tiempo de preservación, técnica usada y concentración de
bacterias recuperadas en cada especie.
62
8. CONCLUSIONES
La viabilidad de las bacterias se pierde a medida que transcurre el tiempo de
preservación, por esta razón es necesario emplear altas concentraciones iniciales de las
suspensiones bacterianas.
Las cepas Gram positivas respondieron satisfactoriamente a las tres técnicas empleadas en este estudio sugiriendo que su sobrevivencia se debe a la composición de su pared.
Las doce cepas bacterianas estudiadas se conservaron y se recuperaron en los tres
métodos, pero el porcentaje de muerte es mayor en Gelatina al 10% y menor en Glicerol
al 3%.
Los métodos estudiados se pueden implementar en el Laboratorio de Microbiología Especial de la Pontificia Universidad Javeriana, ya que son económicos y se evita la necesidad de hacer repiques cada 15 días para mantener las cepas puras y viables para fines docentes y de investigación.
La pureza de las cepas bacterianas conservadas en los distintos métodos se logró cumpliendo las normas de esterilidad en el laboratorio.
9. RECOMENDACIONES
Las cepas bacterianas estudiadas fueron recuperadas vivas y puras en las tres técnicas
durante el tiempo de evaluación, sin embargo, los datos arrojados sugieren que el mejor
método de preservación es la Congelación a –20ºC en Caldo Tripticasa Soya con
adición de Glicerol al 3%.
Se deben evaluar otros grupos bacterianos en estos métodos para verificar la eficacia y
funcionamiento de los mismos.
Este estudio debe realizarse por un tiempo mayor a tres meses, para determinar cual es el tiempo máximo
en el cual las cepas se pueden preservar viables y puras.
63
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