Exámen del Esputo PARTE II

Contenido a revisar

Tinción de Gram

Cultivo No BAAR

Baciloscopia

Cultivo BAAR (Lowenstein Jensen, Ogawa Kudoh, Gen Xpert)

Hongos: Pneumocitosis, Histoplasmosis, Coccidiodomicosis,Criptococosis, Aspergilosis broncopulmonar

Tinciones para hongos

Cultivo para hongos

Parásitos: Protozoarios: amibiasis

Nematelmintos: áscaris, estrongiloidiasis

Platermintos: paragonimiasis, equinococosis

Cuidados en el manejo de las muestras

Tinción de Gram

Fundamentos Teóricos

Tinción: Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a

una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los

microorganismos y poder realizar la observación en microscopioóptico.

Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contrastecon el medio en el cual se encuentran suspendidas y no puedenobservarse claramente sin algún tratamiento previo.

De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos detinción:

a) Tinción simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

b) Tinción diferencial:

El colorante utilizado pone de manifiesto diferenciasentre células bacterianas o entre partes de unamisma célula. Estas técnicas utilizan mas de uncolorante o bien ciertos reactivos complementariospara la tinción.

Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.

La pared celular de la mayoría delas bacterias es única, rígida y conuna capa de peptidoglicanos.

Tinción de Gram: es basada en laretención bioquímica del tinte enel exterior de la capa.

GRAM POSITIVAS: tienen unagran cantidad de peptidoglicanos.

GRAM NEGATIVAS: tienenescasa cantidad depeptidoglicanos.

Coloración de Zeel Nelsen

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacteriascontienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadenalarga (50 a 90 átomos de carbono) que les confierenla propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.

Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes.

El frotis se tiñe durante unos 5 min con Fucsinafenicada aplicando calor suave.

Lavar con agua.

Coloración de Zeel Nelsen

Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClHconcentrado.

Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul deMetileno (color de contraste). Lavar y secar.

Resultados:

Bacterias Acido Resistentes: color rojo

Bacterias No acido resistentes: color azul

Medios de Cultivo

Fundamentos Teóricos

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en unmedio de cultivo artificial debe reunir una serie decondiciones como son:

Temperatura

Grado de humedad

Presión de oxígeno adecuadas

Grado correcto de acidez o alcalinidad.

Un medio de cultivo debe contener los nutrientes yfactores de crecimiento necesarios y debe estarexento de todo microorganismo contaminante.

Fundamentos Teóricos

El agar es un elementosolidificante muy empleadopara la preparación demedios de cultivo.

Se licúa completamente a latemperatura del aguahirviendo y se solidifica alenfriarse a 40 grados.

Con mínimas excepciones notiene efecto sobre elcrecimiento de las bacterias yno es atacado por aquellasque crecen en él.

Medios de Cultivo comunes

AGAR NUTRITIVO:

El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmentecomo rutina para todo tipo de bacteria. Es muy util porquepermanece solido incluso a relativas altas temperaturas.Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en lasuperficie, por lo que se distinguen mejor las coloniaspequeñas.

En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, yaparece como una sustancia espesa, con colonias difícilmenteobservables.

Agar Nutritivo

Agar Sangre

Es un medio enriquecido que se utiliza además parala investigación de los diversos tipos dehemólisis(α, ß ó gamma ). Se utiliza para elcrecimiento de estreptococos.

Agar Chocolate

Se obtiene calentando la sangre antes de adicionarlaal medio base. Por esta razón el agar chocolatecontiene hemoglobina, que aporta al medio unimportante elemento para el crecimiento: el factor Xo hemina termoestable.

El agar chocolate es un 15 medio destinadoprincipalmente al aislamiento de Neisserias(gonococos y meningococos) yHaemophilus, pero en él pueden crecer muchosotros microorganismos exigentes.

Agar C.L.E.D

El medio C.L.E.D. (Cistina LactosaElectrólito Deficiente) estárecomendado para el recuento eidentificación presuntiva de losmicroorganismos de las víasurinarias. Su bajo contenido enelectrolitos evita la invasión de loscultivos por Proteus.

La presencia de lactosa en sucomposición le confiere el carácterde medio diferencial, aunque lainterpretación sea diferente alanterior medio por la incorporaciónde otro indicador: el azul debromotimol.

Las colonias lactosa positivasaparecerán de color amarillo y laslactosa negativas lo harán con uncolor verdoso, blanco o azulado.

Agar medio de Kligler

El agar medio de Kligler (TSI, Triple Sugar Iron) esun medio diferencial que puede ayudarnos adistinguir entre especies de enterobacterias deacuerdo a su capacidad (o falta de ella) para:

a. Metabolizar lactosa, sacarosa o ambas

b. Producir acido mediante fermentación

c. Producir gas durante la fermentación

d. Generar acido sulfhídrico

Agar Cetrimida. Agar King

Medio de cultivo selectivo para el aislamiento de Pseudomonasaeruginosa a partir de diversas muestras.

Agar Schaedler

Es un medio con sangrey vitamina K muyadaptado para el cultivode anaerobios.

E s e l e x á m e n d i r e c t o d e c u a l q u i e r m a t e r i a l o r g á n i c o e n b u s c a d e m i c o b a c t e r i a s ( B a c i l o s

a c i d o a l c o h o l res i s t en tes ” .

Baciloscopia

Soporte de la técnica

El alto contenido de lípidos de la paredcelular de las Micobacterias hacen queresistan a la decoloración por solución dealcohol ácido después de la tinción.

Generalidades

Técnica de elección en el diagnóstico de la TB, en países con escasos y medianos recursos económicos.

Ventajas:

Accesible (entrenamiento sencillo, equipo e instrumentos comunes y medidas de bioseguridad)

Económica (insumos de bajo costo)

Rápida (preparación: 20 minutos. Lectura: 15 A 20 minutos)

Reproducible

Desventajas: Sensibilidad, Especificidad.

Usos: Diagnóstico e implementación del tratamiento, seguimiento

de casos y orienta la efectividad del Tx.

Limitante técnica: expectoración de 5,000 – 10,000 bac/mL

La viabilidad de los bacilos de una muestra bienrecogida y transportada, es de 48 horas.

No distingue microorganismos viables de no viables.

Todas las micobacterias se ven igual (necesariocultivar para Dx. de certeza)

No diferencia M. Tb farmacosensibles de resistentes

Sensibilidad de la pruba

Relativamente baja: un resultado negativo no descarta laenfermedad.(Existencia de FN).

Factores que influyen en la sensibilidad.1) Avance de la enfermedad (S elevada 80-90% cuando

existen patrones cavitarios y decrece 50-80% en Tb quesolo tienen infiltrados en la radiografía de tórax.

2) Calidad de la muestra y la técnica

3) Tiempo dedicado a la microscopia de la lámina. (100campos = 1% del extendido, 200 campos = 2% y elobserva 300 campos puede suponer de 15 – 20 minutos.Las negativas son el mayor número de láminas ymínimas las francas positivas).

INFORME DE RESULTADOS.

NÚMERO DE BACILOS

ENCONTRADOS

CAMPOS DE

INMERSIÓN

OBSERVADOS

REPORTE

No se observan BAAR

en

100 campos Negativo

De 1 a 9 BAAR en 100 Campos Número exacto

de bacilos

observados en

los 100 campos *

DE 0 -1 BAAR por

campo en

100 campos

+

DE 1 –10 BAAR por

campo en

50 campos ++

Más de10 BAAR por

campo en

20 campos +++

Medios de Cultivo BAAR

Generalidades

Cultivos Líquidos a base de Huevo

Mayor sensibilidad

Menor tiempo para el diagnóstico

Cultivo Ogawa Kudoh

Composición del medio de cultivo OGAWA-KUDOH x 1000 ml

Solución de Sales 500 ml

Homogenizado de huevo 1000 ml

Verde de malaquita al 2% 20 ml

pH final 6.

Metodología

El método de Kudoh consiste en impregnar unescobillón estéril con la partícula útil de la muestrade esputo, introducir en un tubo con hidróxido desodio al 4%, durante dos minutos exactos e inocularpor presión y rotación del escobillón en el medio deOgawa. E

Cultivo Lowenstein Jensen

La formulación de este medio esrelativamente simple, requiere desuplementos para el soporte decrecimiento de micobacterias.

La mezcla de glicerol y huevo sonadicionados para espesar el medio.

Estas sustancias proporcionanproteínas y ácidos grasos necesariospara el metabolismo de lasmicobacterias. La coagulación de laalbúmina del huevo durante elproceso de esterilizaciónproporciona un medio sólido para lainoculación de muestras.

El verde de malaquita inhibeparcialmente el desarrollobacteriano.

Informe del Resultado

Contaminado Todos los tubos inoculados con la

muestra se han contaminado

Negativo Sin desarrollo luego de la inspección de

la octava semana de inoculación

Numero de Colonias

exacto

Entre 1 y 19 colonias en el total de

medios sembrados

+ 20 a 100 colonias

++ Mas de 100 colonias (Colonias

separadas)

+++ Colonias incontables (Colonias

confluentes)

Gen Xpert

Generalidades

Prueba molecular automática para identificar MTB yresistencia a R

Usa un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)En tiempo real anidado para amplificar una secuencia especificadel gen rpoB del MTB.

Se realiza en una plataforma que integra el procesamientode las muestras y el PCR al interior de un cartucho plásticoconteniendo todos los reactivos necesarios para realizar la lisisBacteriana a extracción de ácido nucléico, amplificación ydetección del amplicon.

Ventajas

Tiempo de entrega de resultados: 2 horas

Detección de Resistencia a la Rifampicina

Mayor sensibilidad que la baciloscopia

Descentralización de la prueba (siempre que se garantice temperatura y electricidad)

No genera aerosoles ( no se necesitan áreas especiales)

Bioseguridad = baciloscopía

Desventajas

Costos

Sensibilidad

91% a partir de un cultivo

• 99 % muestra positiva

• 72 % muestra negativa

95% resistencia a R

Especificidad

99% para TB

98.4% para resistencia a R

L a n e u m o c i s t o s i s e s u n a i n f e c c i ó n c a u s a d a p o r e lh o n g o o p o r t u n i s t a p n e u m o c y s t i s j i r o v e c i i . E s u n ae n f e r m e d a d c o s m o p o l i t a y a f e c t a p r i n c i p a l m e n t e ap a c i e n t e s i n m u n o c o m p r o m e t i d o s , s o b r e t o d o a a q u e l l o si n f e c t a d o s p o r e l v i r u s d e l a i n m u n o d e f i c i e n c i ah u m a n a ( V I H ) . A u n q u e u s u a l m e n t e e l h o n g o s ee n c u e n t r a r e s t r i n g i d o a l o s p u l m o n e s , s e h ad e m o s t r a d o s u p r e s e n c i a e n ó r g a n o s c o m o g a n g l i o sl i n f á t i c o s , b a z o , h í g a d o , m é d u l a ó s e a y c o r a z ó n .

Neumocistosis

Etiología

Pneumocystis jirovecii es un hongo unicelular,extracelular, que difícilmente se desarrolla encultivos celulares y no es cultivable en mediossintéticos.

Una característica estructural de interés y que lodiferencia del resto de los hongos, es la presencia decolesterol en la membrana celular. La ausencia deergosterol explica su resistencia natural a laanfotericina B y a los azólicos.

Diagnóstico Microbiológico

P. jirovecii no es cultivable in vitro.

La base para el diagnóstico de laneumocistosis es la visualización de lasformas tróficas y quísticas de este patógenoen las muestras obtenidas de los pacientes.

Los productos útiles son líquido de lavadobroncoalveolar (LBA), esputo espontáneo o inducidoy la biopsia pulmonar o de otro tejido en caso desospecha de una infección extra-pulmonar.

Frotis e Histopatología

Las preparaciones fijas de extendidos (frotes), las citologías o los cortes histológicos, deben ser teñidos con tinciones como Azul de toluidina (muestra afinidad por los componentes de

la pared de las formas quísticas, coloreándolas de violeta rojizo),

Giemsa (identifica tanto formas tróficas como quísticas, coloreando los núcleos de rosado los núcleos contrastando con el azul que adquiere el citoplasma) o

Gomori-Grocott (que tiñe de color marrón oscuro la pared de ambas morfologías) y es una técnica considerada de referencia para la identificación de P. jirovecii en los líquidos broncoalveolares

H i s t o p l a s m a c a p s u l a t u m , h o n g o d i m ó r f i c o , e s e la g e n t e e t i o l ó g i c o d e h i s t o p l a s m o s i s , u n a m i c o s i ss i s t é m i c a e n d é m i c a e n z o n a s t r o p i c a l e s ,s u b t r o p i c a l e s y t e m p l a d a s . E l h o n g o s e d e s a r r o l l ae n s u e l o s c o n a b u n d a n t e m a t e r i a o r g á n i c a -e x c r e m e n t o d e a v e s ( e n t r e e s t a s p o l l o s , g a n s o s ,p a v o s , a l g u n a s a v e s m i g r a t o r i a s ) y g u a n o d em u r c i é l a g o s e n a m b i e n t e s c e r r a d o s , t a l e s c o m om i n a s , c u e v a s , c a v e r n a s , t ú n e l e s , c r i p t a s d e i g l e s i a sy c a s a s a b a n d o n a d a s , o e n e s p a c i o s a b i e r t o s , e n t r ee l l o s p a r q u e s y p a s e o s p ú b l i c o s .

HISTOPLASMOSIS

Morfología

Histoplasma capsulatum es un hongo dimófico termodependiente:crece en forma filamentosa a 25°C y en forma de levadura a 37°C,por lo que las características morfológicas varían según latemperatura en la que se desarrolle el hongo:A 25°C y en agar dextrosa Sabouraud, las colonias crecenlentamente y van de una apariencia granular a algodonosa.

El color es blanco inicialmente (colonias tipo A) y por lo general setransforman en marrón claro con la edad (colonias tipo B);

En el reverso la colonia puede presentar un color que va delamarillo al anaranjado.

El hongo es resistente a la cicloheximida, por lo que losmedios de cultivo podrán contener ese antimicrobiano.

El desarrollo de H. capsulatum se ve favorecido en agarinfusión cerebro-corazón

L a c o c c i d i o i d o m i c o s i s o f i e b r e d e l v a l l e d e s a nj o a q u í n e s u n a m i c o s i s s i s t é m i c a c a u s a d a p o r l o sh o n g o s d i m o r f o s c o c c i d i o i d e s i m m i t i s o C .P o s a d a s i i . S e a d q u i e r e p o r i n h a l a c i ó n d ea r t r o c o n i d i o s y e s u n a i n f e c c i ó n u s u a l m e n t eb e n i g n a , p e r o e n a q u e l l o s p a c i e n t e s c u y a i n m u n i d a de s t á c o m p r o m e t i d a , e s s e v e r a y f a t a l . A d e m á s d ee n f e r m e d a d p u l m o n a r , l a c o c c i d i o i d o m i c o s i s p u e d ed i s e m i n a r s e y c a u s a r i n f e c c i o n e s e n p r á c t i c a m e n t ec u a l q u i e r ó r g a n o , p e r o c o n m a y o r f r e c u e n c i a i n v a d es i s t e m a n e r v i o s o c e n t r a l ( S N C ) , h u e s o s ( e n e s p e c i a la r t i c u l a c i o n e s ) , t e j i d o s u b c u t á n e o y p i e l .

COCCIDIOIDOMICOSIS

Morfología

Es un hongo dimórfico.

La fase micelial con producción de artroconidios sonlas estructuras que se encuentran en la naturaleza(forma infectante), en los cultivos de laboratorio einfrecuentemente en tejidos del hospedero infectado.

Exámen Microbiológico

Examen directo en fresco. Puede efectuarse aclarando el esputo con KOH al 15% durante

10 min u observando directamente productos como líquido de lavado bronquial, líquido cefalorraquídeo o líquido purulento producto de la fistulización de nódulos subcutáneos.

La observación al microscopio de esférulas con endosporas en su interior, es confirmatoria de la micosis.

Cultivo : agar dextrosa Sabouraud con cicloheximida,incubándose a 25-30°C y en siete días podrán observarse las siguientes características:

—Macroscopía. Al tercer día la colonia es glabra, después vellosa y luego francamente algodonosa, de color blanco grisáceo o amarillento.

L a c r i p t o c o c o s i s e s u n a m i c o s i s s i s t é m i c a a g u d a ,s u b a g u d a o c r ó n i c a , i n i c i a l m e n t e p u l m o n a r c a u s a d ap r i n c i p a l m e n t e p o r c r y p t o c o c c u sn e o f o r m a n s ( v a r s . N e o f o r m a n s y g r u b i i )y c r y p t o c o c c u s g a t t i i . L a f o r m a p u l m o n a r e sg e n e r a l m e n t e t r a n s i t o r i a , l e v e y n o r e c o n o c i d a .

CRIPTOCOCOSIS

Estado anamorfo(asexual)

Estado Teleomorfo

Diagnóstico Microbiológico

Examen directo en fresco con tinta china onigrosina.

Revela una clara aureola, imagen debida a la cápsula, entorno a las células de Cryptococcus. Muy ocasionalmentepueden observarse seudomicelios.

El esputo y el pus, pueden mezclarse con una solución al10% de hidróxido de sodio antes del examen. En unespécimen apropiadamente preparado, las células delpus y desechos celulares digeridos delinean la cápsula, lacual es resistente al hidróxido.

Cultivo. Cryptococcusneoformans/C. gattii sonfáciles de cultivar en losmedios convencionales(Sabouraud dextrosa,malta dextrosa, papadextrosa), adicionadoscon cloranfenicol y sincicloheximida.

Los cultivos se mantienen a30ºC y a 37ºC, al menosdurante una semana.

El cultivo levaduriforme esinicialmente blanco, peroposteriormente se torna beigey marrón-amarillo.

Aspergilosis Pulmonar

Diagnóstico Microbiológico

Si hay exudados se debe hacer examen directo, frotis y cultivo.

El examen directo aclarado con hidróxido de potasio o teñido con un colorante simple, en ocasiones permite visualizar las hifas hialinas y septadas y las cabezas aspergilares.

Tinción para Hongos

L o s m e d i o s d e c u l t i v o m á s e m p l e a d o s e nm i c o l o g í a p u e d e n a g r u p a r s e e n d o s c a t e g o r í a se n f u n c i ó n d e s u u t i l i d a d :

A i s l a m i e n t o e I d e n t i f i c a c i ó n .

Cultivo para hongos

Aislamiento

la utilización de 3-4 medios prácticamente cubre todas las necesidades:

-AGS con/sin antimicrobianos;

- Un medio con cicloheximida

- Agar infusión cerebro corazón, para las micosis sistémicas endémicas.

Identificación

Puede ser necesario un número mayor de mediosque dependerá del número de muestras, lasetiologías más probables en la zona geográfica, lasposibilidades del laboratorio y el nivel diagnósticoesperable según el tipo de centro.

IMPORTANTE

El cultivo se tarda en dar resultados en 3-4 semanas.

En promedio las colonias pueden verse alrededor de los 7 días.

En ocasiones es necesario cultivar más de una muestra debido a que puede ser contaminada, incluso con especies de Candida.

Medios de Cultivo

• Se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos,especialmente Aspergillus spp. y Pe-nicillium spp. Es elmedio de referencia para la identificación deAspergillus spp.

Agar CzapekDox

• Se utiliza para la estimulación de la formación deproducción de pigmentos: rojo en Trichosporumrubrum, rosa salmón en Microsporum audouinii yamarillo en Microsporum canis.

Agar de papadextrosa

• Utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puedemodificarse añadiendo clo-ranfenicol o biencloranfenicol y cicloheximida.

Agar Dixon modificado

• Es el medio estándar para el aislamiento, esporulación y conservación de muchos hongos. Agar Sabouraud +

Glucosa modificado por Emmons:

• Puede utilizarse como medio enriquecido para facilitar el crecimiento de C. neoformans a partir de muestras.

• En general, está indicado para el aislamiento de una gran variedad de patógenos, incluyendo levaduras, mohos y bacterias como Nocardia.

Agar infusión de cerebro corazón

• Se utiliza en el aislamiento de hongos sensibles a la cicloheximida ( Cryptococcus, zigo-micetos, etc.) a partir de muestras contaminadas.

• Permite el desarrollo de la mayoría de los mohos y de las levaduras

Agar inhibidor de mohos

• Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de hongos patógenos a partir de muestras muy contaminadas con hongos saprofitos y bacterias.

• Inhibe algunas especies de hongos de interés médico ( Candida no albicans, Aspergillus, zigomicetos, C. neofor-mans, etc.).

Agar Sabouraudcon cicloheximida

y cloranfenicol:

• Se utiliza en la identificación de algunos dermatofitos, especialmente y de algunas levaduras ( C. neoformansTri-chophyton rubrum de Trichophyton mentagrophytes).

Agar urea de Christensen

• Cromocandida contienen diversos sustratos enzimáticos que están unidos a compuestos cromogénicos. Muy útil para el estudio de levaduras.

Medios cromogénicos para levaduras

• Medio utilizado para el aislamiento de dermatofitos en muestras muy contaminadas, proporcionando una identificación presuntiva.

Dermatophyte test medium

• Se utiliza en el cultivo y diferenciación de especies de Candida basándose en las características miceliales.

Agar harina de maíz con/sin

Tween 80:

• Medio conteniendo leche, harina de trigo, y miel. Además contiene inhibidores lo que impide el desarrollo de Bacterias :(E.Coli y cocáceas : S.aureus)

Agar Lactrimel

Parásitos

Identificación directa del microorganismo

Ameba AscarisLumbricoides

Estrongiloides

Identificación Directa del Microorganismo

Paragonimus Equinocococis

Lavado de dientes y enjuague de la boca y la orofaringe.

Recoger solo el material que provenga de las vías aéreas inferiores.

Inicialmente la muestra debe de observarse con tinción de Wright, para establecer si se trata de una muestra adecuada.

Una muestra representativa contiene <10 células epiteliales y >25 PMN.

La presencia de flora mixta abundante sugiere contaminación.

La ausencia de neutrófilos y bacterias de una muestra representativa, sugiere infección no bacteriana.

CUIDADOS EN EL MANEJO DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO.

La forma de recoger el esputo depende de la finalidad perseguida.

Para la investigación microbiológica debe de ser recogido en un frasco de boca ancha, estéril, provisto de tapa esmerilada.

Conviene que antes la persona realice en cepillado de la cavidad de los dientes y el lavado de la boca.

Este requisito es indispensable si se investigan espirilos y hongos.

CUIDADOS EN EL MANEJO DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO.

El material deberá ser enviado lo más pronto posible.

En niños es necesario recurrir a maniobras especiales.

Para la investigación de células neoplásicas por el método de inclusión del esputo, la técnica es la siguiente:

Lavado y cepillado de la boca.

Recolectar de 60-100 cm³ en un frasco de boca ancha.

El frasco debe contener 96 ˚ de alcohol.

Deben desecharse los primeros esputos de la mañana.

CUIDADOS EN EL MANEJO DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO.

GRACIAS!!!!!!!!!!!!!!!