ESTABILIDAD DE POLIGALACTURONASA DE Aspergillus níger A LA

ULTRAFILTRACIÓN Y LIOFILIZACIÓN.

IDENTIFICACIÓN ELECTROFORÉTICA

Memoria del período de investigación de Cursos de Doctorado presentada por: Javier Álvarez

Díaz

Heteropolisacáridos complejos compuestos principalmente de unidades de ácido D-galacturónico, parcialmente metoxiladas.

Clasificación:

• Pectinas: ácidos poligalacturónicos con grupos metil-éster.

• Ácidos pécticos: ácidos poligalacturónicos libres de grupos metil-éster.

SUSTANCIAS PÉCTICAS

CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS PECTINOLÍTICAS

ENZIMAS DESESTERIFICANTES

• Pectinesterasa (PE)

ENZIMAS

DESPOLIMERIZANTES

• Polimetilgalacturonasas (PMG)

• Poligalacturonasas (PG)

• Polimetilgalacturonato liasas (PMGL)

• Poligalacturonato liasas (PGL)

POLIGALACTURONASA

ENDOPOLIGALACTURONASA EXOPOLIGALACTURONASA

•Plantas, bacterias, levaduras y hongos

•pM (36-60 Kda)

•pH óptimo (4-5,5)

•pI (3,2-5,4)

•Plantas, hongos, bacterias, insectos

•pM (47-68 Kda)

•pH óptimo (4,6)

•pI (6,2-8,3)

APLICACIONES DE ENZIMAS PECTINOLÍTICAS

• Clarificación de zumos de frutas

• Maceración

• Licuefacción

• Conservación de la madera

• Producción de oligogalacturónidos OGAs

JUSTIFICACIÓN

•La producción de PG está afectada por las condiciones de crecimiento del microorganismo productor

•Las preparaciones comerciales de enzimas pécticas contienen niveles reducidos de concentración de enzimas. Se necesita el desarrollo de concentrados con alta actividad

•El seguimiento de PG a lo largo de procesos de purificación requiere de técnicas de identificación de la enzima

OBJETIVOS

•Comprobar como influyen distintas condiciones de crecimiento de A. niger en la producción de PG

•Evaluar los efectos de la ultrafiltración y la liofilización sobre la actividad de PG y la concentración de proteínas

•Optimizar la técnica de revelado de PG con rojo de rutenio en geles de poliacrilamida NATIVE-PAGE y SDS-PAGE

ULTRAFILTRACIÓN

•Método de concentración y purificación enzimática

•Ultrafiltración tangencial o flujo cruzado. Sistema Minitan (Millipore)

•4 Membranas de polisulfonato, 10.000 NMW

•Muestras concentradas 2 y 10 veces

LIOFILIZACIÓN

•Concentración proteica en forma de polvo seco

•Congelación a –20 ºC

•Liofilización a –40 ºC, 24 horas. Liofilizador “CRYODOS” (Telstar)

•Liofilizado resuspendido en tampón acético-acetato pH 4,2

•Muestra concentrada 20 veces

CULTIVO DE A. NIGER

•Cepa Aspergillus niger CECT Nº 2088

•Medio de cultivo Czapex-Dox

•Concentración de esporas inoculadas 6,62 105 esporas/ml

•Inductor, pectina de cítrico al 1%

•Incubación:

•Estática a 30ºC, 72 horas

•Estática a 30ºC, 96 horas

•Estatica a 30ºC (72 h) + Agitación (24 h)

ZIMOGRAMA

Método de detección enzimática en geles de poliacrilamida basado en el revelado de los geles en función de la actividad enzimática de las enzimas a separar

Revelado de PG con rojo rutenio

Tipos:

•Sustrato incorporado en el gel de separación

•Técnica cup-plate

•Contacto enzima-sustrato después de la separación electroforética:

•Inmersión del gel en una solución de sustrato

•Transferencia a geles con sustrato incorporado

NATIVE-PAGE

•Geles planos al 10 % de poliacrilamida. Método de Davis

•El TEMED actúa sobre el PSA formando radicales libres que inician la polimerización de los monómeros de acrilamida

•Las cadenas de poliacrilamida se unen mediante la bisacrilamida

•Zimogramas:

•gel con ácido poligalacturónico

•gel sin ácido poligalacturónico

SDS - PAGE

•Técnica descrita por Laemli: sistema de tampón discontinuo Ornstein-Davis

•Agentes desnaturalizantes:

•SDS los polipéptidos se rodean de cargas – y migran en el gel en función del tamaño

•Ditiotreitol ruptura de puentes disulfuro

•Zimograma

•Los geles incorporan ácido poligalacturónico al 0,1%

•Renaturalización de PG con Tritón X-100

ACTIVIDAD PG EN FUNCIÓN DE LAS CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE A. NIGER

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

72 h estático 96 horas estático 72 h estático+24 hagitación

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a (u

g ác

ido

gala

ctur

ónic

o/m

l h)

ESTABILIDAD DE PG FRENTE A LA ULTRAFILTRACIÓN

MuestrasActividad

enzimáticaa

Concentración proteínasb

Actividad específicac

Proteínas totalesd Actividad totale Rendimiento

Extracto. crudo 1308,346 991 1404,365 495,5 654173,278 100%

Ultrafiltrado * 2 2242,88 1108 2024,26 306,916 621277,76 94,97%

Ultrafiltrado. *10 929,588 3714 250,293 186 46479,4 7,11%

ag ácido galacturónico ml-1 h-1

bppmcUnidades mg-1 de proteínadmgeUnidades

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

Extracto crudo Ultrafiltrado * 2 Ultrafiltrado *10

Activ

idad

tota

l (U)

Actividad total del extracto crudo y de las muestras concentradas por ultrafiltración

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Extracto crudo Ultrafiltrado * 2 Ultrafiltrado *10

Pro

teín

as (p

pm)

Concentración de proteína para el extracto crudo y las muestras

concentradas por ultrafiltración

ESTABILIDAD PG FRENTE A LA LIOFILIZACIÓN

MuestrasActividad

enzimáticaa

Concentración proteínasb

Actividad específicac

Proeínas totalesd Actividad total Rendimiento

Extracto crudo 1308,346 991 1404,365 495,5 654173,278 100%

Liofilizado *20 2931,17 15315 191,034 382,875 73279,25 11,20%

ag ácido galacturónico ml-1 h-1

bppmcUnidades mg-1 de proteínadmgeUnidades

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

Extracto crudo Liofilizado *20

Activ

idad t

otal (U

)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

Extracto crudo Liofilizado *20

Prot

eína

s (p

pm)

Valores de concentración de proteína para el extracto crudo y la muestra concentrada

por liofilización.

Actividad total del extracto crudo y de la muestra concentrada por liofilización.

IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA NATIVE-PAGE

Con ácido poligalacturónico

Sin ácido poligalacturónico

IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA SDS-PAGE CON ÁCIDO POLIGALACTURÓNICO

PROTOCOLO OPTIMIZADO DE IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA NATIVE-PAGE CON ÁCIDO

POLIGALACTURÓNICO

•Solución de ácido málico 0,1M: 1 hora en agitación. Crea un cambio gradual de pH

•Solución de incubación acetato de Na 20 mM pH 5,5: 40´en agitación

•Agua destilada: 5´

•Rojo de rutenio 0,03% en agua: 1 h en agitación

PROTOCOLO OPTIMIZADO DE IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA SDS-PAGE CON ÁCIDO

POLIGALACTURÓNICO

•Solución de Triton X-100 al 2,5% en tampón acetato de Na 20 mM pH 5,5: 2 horas. Renaturalización enzimática

•Solución de ácido málico 0,1M: 1 h en agitación

•Solución de incubación acetato de Na 20 mM pH 5,5: toda la noche

•Agua destilada: 5´

•Rojo de rutenio 0,03% en agua: 1 h en agitación

CONCLUSIONES

•La agitación del medio de crecimiento de A. niger mantiene los niveles de producción de PG

•La ultrafiltración es una técnica adecuada para concentrar el extracto crudo al 50% sin que se observe una disminución de la actividad de PG. La concentración al 10% del volumen original resultó en una pérdida de actividad enzimática del 92,9%

CONCLUSIONES

•La incubación de los geles de poliacrilamida, tanto en condiciones nativas como desnaturalizantes con SDS, con ácido málico, es necesaria para la resolución de las bandas indicativas de actividad PG.

•El detergente Tritón X-100 provoca una renaturalización incompleta de la poligalacturonasa.