ESTABILIDAD DE POLIGALACTURONASA DE Aspergillus níger A LA
ULTRAFILTRACIÓN Y LIOFILIZACIÓN.
IDENTIFICACIÓN ELECTROFORÉTICA
Memoria del período de investigación de Cursos de Doctorado presentada por: Javier Álvarez
Díaz
Heteropolisacáridos complejos compuestos principalmente de unidades de ácido D-galacturónico, parcialmente metoxiladas.
Clasificación:
• Pectinas: ácidos poligalacturónicos con grupos metil-éster.
• Ácidos pécticos: ácidos poligalacturónicos libres de grupos metil-éster.
SUSTANCIAS PÉCTICAS
CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS PECTINOLÍTICAS
ENZIMAS DESESTERIFICANTES
• Pectinesterasa (PE)
ENZIMAS
DESPOLIMERIZANTES
• Polimetilgalacturonasas (PMG)
• Poligalacturonasas (PG)
• Polimetilgalacturonato liasas (PMGL)
• Poligalacturonato liasas (PGL)
POLIGALACTURONASA
ENDOPOLIGALACTURONASA EXOPOLIGALACTURONASA
•Plantas, bacterias, levaduras y hongos
•pM (36-60 Kda)
•pH óptimo (4-5,5)
•pI (3,2-5,4)
•Plantas, hongos, bacterias, insectos
•pM (47-68 Kda)
•pH óptimo (4,6)
•pI (6,2-8,3)
APLICACIONES DE ENZIMAS PECTINOLÍTICAS
• Clarificación de zumos de frutas
• Maceración
• Licuefacción
• Conservación de la madera
• Producción de oligogalacturónidos OGAs
JUSTIFICACIÓN
•La producción de PG está afectada por las condiciones de crecimiento del microorganismo productor
•Las preparaciones comerciales de enzimas pécticas contienen niveles reducidos de concentración de enzimas. Se necesita el desarrollo de concentrados con alta actividad
•El seguimiento de PG a lo largo de procesos de purificación requiere de técnicas de identificación de la enzima
OBJETIVOS
•Comprobar como influyen distintas condiciones de crecimiento de A. niger en la producción de PG
•Evaluar los efectos de la ultrafiltración y la liofilización sobre la actividad de PG y la concentración de proteínas
•Optimizar la técnica de revelado de PG con rojo de rutenio en geles de poliacrilamida NATIVE-PAGE y SDS-PAGE
ULTRAFILTRACIÓN
•Método de concentración y purificación enzimática
•Ultrafiltración tangencial o flujo cruzado. Sistema Minitan (Millipore)
•4 Membranas de polisulfonato, 10.000 NMW
•Muestras concentradas 2 y 10 veces
LIOFILIZACIÓN
•Concentración proteica en forma de polvo seco
•Congelación a –20 ºC
•Liofilización a –40 ºC, 24 horas. Liofilizador “CRYODOS” (Telstar)
•Liofilizado resuspendido en tampón acético-acetato pH 4,2
•Muestra concentrada 20 veces
CULTIVO DE A. NIGER
•Cepa Aspergillus niger CECT Nº 2088
•Medio de cultivo Czapex-Dox
•Concentración de esporas inoculadas 6,62 105 esporas/ml
•Inductor, pectina de cítrico al 1%
•Incubación:
•Estática a 30ºC, 72 horas
•Estática a 30ºC, 96 horas
•Estatica a 30ºC (72 h) + Agitación (24 h)
ZIMOGRAMA
Método de detección enzimática en geles de poliacrilamida basado en el revelado de los geles en función de la actividad enzimática de las enzimas a separar
Revelado de PG con rojo rutenio
Tipos:
•Sustrato incorporado en el gel de separación
•Técnica cup-plate
•Contacto enzima-sustrato después de la separación electroforética:
•Inmersión del gel en una solución de sustrato
•Transferencia a geles con sustrato incorporado
NATIVE-PAGE
•Geles planos al 10 % de poliacrilamida. Método de Davis
•El TEMED actúa sobre el PSA formando radicales libres que inician la polimerización de los monómeros de acrilamida
•Las cadenas de poliacrilamida se unen mediante la bisacrilamida
•Zimogramas:
•gel con ácido poligalacturónico
•gel sin ácido poligalacturónico
SDS - PAGE
•Técnica descrita por Laemli: sistema de tampón discontinuo Ornstein-Davis
•Agentes desnaturalizantes:
•SDS los polipéptidos se rodean de cargas – y migran en el gel en función del tamaño
•Ditiotreitol ruptura de puentes disulfuro
•Zimograma
•Los geles incorporan ácido poligalacturónico al 0,1%
•Renaturalización de PG con Tritón X-100
ACTIVIDAD PG EN FUNCIÓN DE LAS CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE A. NIGER
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
72 h estático 96 horas estático 72 h estático+24 hagitación
Act
ivid
ad e
nzim
átic
a (u
g ác
ido
gala
ctur
ónic
o/m
l h)
ESTABILIDAD DE PG FRENTE A LA ULTRAFILTRACIÓN
MuestrasActividad
enzimáticaa
Concentración proteínasb
Actividad específicac
Proteínas totalesd Actividad totale Rendimiento
Extracto. crudo 1308,346 991 1404,365 495,5 654173,278 100%
Ultrafiltrado * 2 2242,88 1108 2024,26 306,916 621277,76 94,97%
Ultrafiltrado. *10 929,588 3714 250,293 186 46479,4 7,11%
ag ácido galacturónico ml-1 h-1
bppmcUnidades mg-1 de proteínadmgeUnidades
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
Extracto crudo Ultrafiltrado * 2 Ultrafiltrado *10
Activ
idad
tota
l (U)
Actividad total del extracto crudo y de las muestras concentradas por ultrafiltración
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Extracto crudo Ultrafiltrado * 2 Ultrafiltrado *10
Pro
teín
as (p
pm)
Concentración de proteína para el extracto crudo y las muestras
concentradas por ultrafiltración
ESTABILIDAD PG FRENTE A LA LIOFILIZACIÓN
MuestrasActividad
enzimáticaa
Concentración proteínasb
Actividad específicac
Proeínas totalesd Actividad total Rendimiento
Extracto crudo 1308,346 991 1404,365 495,5 654173,278 100%
Liofilizado *20 2931,17 15315 191,034 382,875 73279,25 11,20%
ag ácido galacturónico ml-1 h-1
bppmcUnidades mg-1 de proteínadmgeUnidades
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
Extracto crudo Liofilizado *20
Activ
idad t
otal (U
)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
Extracto crudo Liofilizado *20
Prot
eína
s (p
pm)
Valores de concentración de proteína para el extracto crudo y la muestra concentrada
por liofilización.
Actividad total del extracto crudo y de la muestra concentrada por liofilización.
IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA NATIVE-PAGE
Con ácido poligalacturónico
Sin ácido poligalacturónico
IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA SDS-PAGE CON ÁCIDO POLIGALACTURÓNICO
PROTOCOLO OPTIMIZADO DE IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA NATIVE-PAGE CON ÁCIDO
POLIGALACTURÓNICO
•Solución de ácido málico 0,1M: 1 hora en agitación. Crea un cambio gradual de pH
•Solución de incubación acetato de Na 20 mM pH 5,5: 40´en agitación
•Agua destilada: 5´
•Rojo de rutenio 0,03% en agua: 1 h en agitación
PROTOCOLO OPTIMIZADO DE IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA SDS-PAGE CON ÁCIDO
POLIGALACTURÓNICO
•Solución de Triton X-100 al 2,5% en tampón acetato de Na 20 mM pH 5,5: 2 horas. Renaturalización enzimática
•Solución de ácido málico 0,1M: 1 h en agitación
•Solución de incubación acetato de Na 20 mM pH 5,5: toda la noche
•Agua destilada: 5´
•Rojo de rutenio 0,03% en agua: 1 h en agitación
CONCLUSIONES
•La agitación del medio de crecimiento de A. niger mantiene los niveles de producción de PG
•La ultrafiltración es una técnica adecuada para concentrar el extracto crudo al 50% sin que se observe una disminución de la actividad de PG. La concentración al 10% del volumen original resultó en una pérdida de actividad enzimática del 92,9%
CONCLUSIONES
•La incubación de los geles de poliacrilamida, tanto en condiciones nativas como desnaturalizantes con SDS, con ácido málico, es necesaria para la resolución de las bandas indicativas de actividad PG.
•El detergente Tritón X-100 provoca una renaturalización incompleta de la poligalacturonasa.