Expresión de genes en E.coli

Factores que influyen en la elección de un sistema de expresión

• tamaño de la proteína

• cantidad de proteína necesaria

• proteína activa

Promotores más utilizados

• lac (or lacUV5)

• trc

• tac

• phage T7 gene 10

Promotor tac (trc)

• Híbrido de promotores lac y trp región -35 de trp region -10 de lac– separados por 16bp = promotor tac – separados por 17bp = promotor trc

• Regulado por el represor lac • 3x más fuerte que trp • 10x más fuerte que lac

Promotor del gen 10 del fago T7

• Todos los promotores del fago T7 (incluído el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa para expresarse

– El gen de la T7 RNA Pol puede estar bajo el control del promotor lac en cél de E.coli

– El gen de interés puede estar bajo el control del promotor del gen 10

Promotor del gen 10 del fago T7

lac pro T7 RNA Pol

g10 pro gene of interest

Protein of Interest

Inducer T7 RNA Pol

T7 RNA Pol

Para aumentar la expresión de la proteína

1) Promotor

3) Secuencia de Shine Dalgarno

4) Localización celular (secretada)

5) Estabilidad de la proteína

6) Organismo húesped

7) Número de copias del gen clonado

Para aumentar la traducción

• Un promotor fuerte producirá mucho mRNA

• Será necesaria una efectiva traducción para obtener mucha proteína

• DNA RNA Proteína

Para aumentar la traducción

• En procariotas – La señal de traducción es RBS: Ribosome

Binding Site– Secuencia de Shine-Dalgarno – 6-8 nt – Localizada a corta distancia (~10nt)

upstream del codón de iniciación de la traducción AUG

Shine Dalgarno

• Secuencia complementaria a región en 16S rRNA de la subunidad pequeña del ribosoma

UAAGGAGGAUUCCUCC

AUG5’ 3’

mRNA

3’ 5’16S rRNA

small ribosomal subunit

Evitar estructura secundaria

Región del codón de iniciación AUG en extremo 5’ del mRNA

no debe ser complementaria a sí misma

podría bloquear el movimiento del ribosoma y evitar la traducción

Uso de codones

• Utilización de codones– varios codones para cada aminoácido– algunos codones usados poco frecuentemente – bajas cantidades de los correspodientes tRNAs

• Organismos diferentes pueden usar diferentes codones a diferentes frecuencias

Codon Usage in E. coli & humans

Estrategias para optimizar el uso de codones

• Sintetizar químicamente un nuevo gen– Alterar la secuencia del gen de interés– Elegir codones que sean los más usados en el

organismo húesped

• Expresar en un húesped diferente– Elegir húesped con el mismo uso de codones

• Usar una célula húesped modificada – Sobreexprese tRNAs de baja abundancia

Vector de expresión pKK233-2

selectable markertac promoterRBSunique REase sitesTxn terminators

not shown:ori of replication